Summary

Метод микроэлектрода Impalement для записи Мембраны Потенциал из канналедированной средней мозговой артерии

Published: July 02, 2019
doi:

Summary

Основная цель этой статьи заключается в предоставлении подробной информации о том, как записывать мембранный потенциал (Vм) из средней мозговой артерии с помощью метода микроэлектрода impalement. Каннулированная средняя мозговая артерия уравновешивают, чтобы получить миогенный тон, и стенка сосуда пронзили с помощью микроэлектродов высокого сопротивления.

Abstract

Мембранныйпотенциал (V м) сосудистых гладких мышечных клеток определяет тонус сосудов и, таким образом, приток крови к органу. Изменения в экспрессии и функции ионных каналов и электрогенных насосов, которые регулируют Vм в условиях заболевания потенциально может изменить Vм,сосудистый тон, и кровоток. Таким образом, необходимо базовое понимание электрофизиологии и методов, необходимых для точной записи Vм в здоровых и больных состояниях. Этот метод позволит модулировать Vm с помощью различных фармакологических агентов для восстановления Vм. Хотя Есть несколько методов, каждый со своими преимуществами и недостатками, эта статья предоставляет протоколы для записи Vм из каннуляющих сосудов сопротивления, таких как средняя мозговая артерия с помощью метода микроэлектродов impalement. Средние мозговые артерии могут получить миогенный тон в миографической камере, а стенка сосуда пронзили с помощью микроэлектродов высокого сопротивления. Сигнал Vm собирается с помощью электрометра, оцифровывается и анализируется. Этот метод обеспечивает точное считывание Vм стенки сосуда, не повреждая клетки и не изменяя мембранное сопротивление.

Introduction

Мембранный потенциал (Vм) клетки относится к относительной разнице ионного заряда по плазменной мембране и относительной проницаемости мембраны к этим ионам. Vm генерируется дифференциальным распределением ионов и поддерживается ионными каналами и насосами. Ионные каналы, такие как Kq, Na,и Clй внести существенный вклад в отдых Vм. Сосудистые гладкие мышечные клетки (VSMCs) выражают более четырех различных типов Каналов Kи 1, два типа напряжения-gated Ca2 “каналов (VGCC)2, более двух типов Cl каналы3, 4 , 5, магазин-управляемые каналы Ca2 ‘6, растяжечныеканалы катионов7,8,и электрогенные насосы натрия-калия ATPase9 в их плазменных мембранах, все из которых могут быть участвует в регулировании Vм.

Vм VSMCs зависит от давления промена. В ненагерметиковых судах Vm варьируется от -50 до -65 мВ, однако в герметике артериальных сегментов В м колеблется от -37 до -47 мВ10. Повышение внутрисосудистого давления приводит к деполяризации ВСМК11,снижает порог открытия VGCC, и увеличивает приток кальция, способствующий развитию миногенного тона12. Напротив, в пассивных или ненагерметизированных сосудах мембранная гиперполяризация, из-за высокой активности канала K, предотвратит открытие VGCC, что приведет к ограниченному входу кальция и уменьшению внутриклеточного кальция, способствуя меньшему сосудистый тон13. Таким образом, Vm из-за изменений давления промена, как представляется, играют важную роль в развитии тонусов сосудов, и как VGCC и Kq каналы играют решающую роль в регулировании Vм.

Vm варьируется между типом судна и видом. Vм -54 – 1,3 мВ у морских свинок superior мезентериальных артериальных полос14, -45 и 1 мВ в крысиных средних мозговых артериях при давлении просвета60 мм рт. ст.12,и -35 – 1 мВ в крысиных паранхмальных артериях при давлении 40 мм рт. ст. Отдых Vм записано в нерастянутой крысиной лимфатической мышце -48 и 2 мВ16. Vм церебральных VSMCs является более негативным, чем в периферических артериях. Для сравнения, кошачьих средних мозговых артерий, как сообщается, Vм около -70 мВ, в то время как мезентерические и коронарные артерии, как сообщается, -49 и -58 мВ, соответственно17,18. Различия в Vм через сосудистые кровати могут отражать различия в экспрессии и функции ионных каналов и электрогенных натриево-калийных насосов.

Увеличение и уменьшение ВМ называют мембранной деполяризацией и гиперполярализацией, соответственно. Эти изменения в Vм играют центральную роль во многих физиологических процессах, включая ион-канал gating, сигнализация клеток, сокращение мышц, и действия потенциального распространения. При фиксированном давлении, многие эндогенные и синтетические сосудорасширяющие соединения, которые активируют каналы Kи вызывают мембранную гиперполяризацию, в результате чего вазодилатация1,13. И наоборот, устойчивая деполяризация мембран имеет жизненно важное значение в агонист-индуцированной или рецепторо-опосредованного сосудосуживание19. Vm является критической переменной, которая не только регулирует приток Ca2 “через VGCC13, но и влияет на выпуск Ca2″ из внутренних магазинов20,21 и Ca 2“чувствительность контрактный аппарат22.

Хотя существует несколько методов записи Vм из различных типов клеток, данные, собранные из метода микроэлектрода прокола канналесора, как представляется, более физиологические, чем данные, полученные из изолированных VSMCs. При записи из изолированных VSMC с использованием текущих методов зажима, Vm рассматривается как спонтанные переходные гиперполяризации в VSMCs24. Изолированные VSMCs не находятся в синцитии, и изменения в устойчивости серии могут способствовать колебационному поведению Vm. С другой стороны, колебальное поведение не наблюдается, когда Vm записывается из нетронутых сосудов, вероятно, из-за контакта клеток между VSMCs, которые находятся в синцитии в артерии и суммируются по всему сосуду, ведущей к стабильной Vм 24. Таким образом, измерение Vм из под давлением сосудов с использованием стандартной методики микроэлектрода impalement относительно близко к физиологическим условиям.

Запись Vм из каннаулированных сосудов может обеспечить жизненно важную информацию, так как Vм VSMCs, которые находятся в синхронизации является одним из основных детерминантов сосудистого тона и кровотока, и модуляция Vм может обеспечить способ для разбавлять или сужают кровеносные сосуды. Таким образом, важно понимать методологию, связанную с записью Vm. В этой статье описывается внутриклеточная запись Vм из каннулялизных средних мозговых артерий (MCAs) с помощью метода микроэлектрода impalement. Этот протокол будет описывать, как подготовить MCAs, микроэлектроды, настроить электрометр и выполнить метод impalement для записи Vм. Также обсуждаются репрезентативные данные, общие проблемы, возникшие при использовании этого метода, и потенциальные проблемы.

Protocol

Самцы крыс были размещены в центре по уходу за животными в УГМК, который одобрен Ассоциацией по оценке и аккредитации лабораторного ухода за животными (AAALAC). На протяжении всего исследования животные имели свободный доступ к пище и воде. Звери содержались в контролируемой среде с темпе?…

Representative Results

Представленный метод можно надежно использовать для записи Vм в каниulated сосудах. Краткая процедура, описывающая, как изолировать MCA от мозга представлена на рисунке 1A. После отделения мозга от черепа, MCA был расчленен и помещен в чашку Петри, содер?…

Discussion

Эта статья предоставляет необходимые шаги о том, как использовать острый метод микроэлектрода impalement для записи Vм от консервированной подготовки судна. Этот метод широко используется и предлагает высококачественные, последовательные записи Vm, которые отвечают на широкий ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была частично поддержана грантами от программы интрамуральной поддержки (IRSP) от УГМК, Грантом развития ученых AHA (13SDG14000006), присужденными Малликарджуне Р. Паббиди.

Materials

Dissection instruments
Aneshetic Vaporiser Parkland scientific V3000PK
Dissection microscope Nikon Instruments Inc., NY Eclipse Ti-S
Kleine Guillotine Type 7575 Harvard Apparatus, MA 73-198
Littauer Bone Cutter Fine science tools 16152-15
Moria MC40 Ultra Fine Forceps Fine science tools 11370-40
Surgical scissors Sharp-Blunt Fine science tools 14008-14
Suture Harvard Apparatus 72-3287
Vannas Spring Scissors Fine science tools 15018-10
Electrophysiology Instruments
Charge-coupled device camera Qimaging, , BC Retiga 2000R
Differential electrometer amplifier WPI FD223A
In-line pressure transducer Harvard Apparatus, MA MA1 72-4496
Micromanipulator Thor labs PCS-5400
Microelectrodes Warner Instruments LLC, CT G200-6,
Micro Fil (Microfiber syringe) WPI MF28G67-5
Microelectrode holder WPI MEH1SF
Myograph Living Systems Instrumentation, VT CH-1-SH
Puller Sutter Instrument, San Rafael, CA P-97
Vibration-free table TMC 3435-14
Softwares
Clampex 10 Molecular devices
p Clamp 10 Molecular devices
Imaging software Nikon, NY NIS-elements
Chemicals
NaCl Sigma S7653
KCl Sigma P4504
MgSO4 Sigma M7506
CaCl2 Sigma C3881
HEPES Sigma H7006
Glucose Sigma G7021
NaH2PO4 Sigma S0751
NaHCO3 Sigma S5761

References

  1. Nelson, M. T., Quayle, J. M. Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscle. American Journal of Physiology. 268, C799-C822 (1995).
  2. Hughes, A. D. Calcium channels in vascular smooth muscle cells. Journal of Vascular Research. 32 (6), 353-370 (1995).
  3. Large, W. A., Wang, Q. Characteristics and physiological role of the Ca(2+)-activated Cl- conductance in smooth muscle. American Journal of Physiology. 271 (2 Pt 1), C435-C454 (1996).
  4. Nelson, M. T., Conway, M. A., Knot, H. J., Brayden, J. E. Chloride channel blockers inhibit myogenic tone in rat cerebral arteries. Journal of Physiology. 502 (Pt 2), 259-264 (1997).
  5. Yamazaki, J., et al. Functional and molecular expression of volume-regulated chloride channels in canine vascular smooth muscle cells. Journal of Physiology. 507 (Pt 3), 729-736 (1998).
  6. Gibson, A., McFadzean, I., Wallace, P., Wayman, C. P. Capacitative Ca2+ entry and the regulation of smooth muscle tone. Trends in Pharmacol Sciences. 19 (7), 266-269 (1998).
  7. Davis, M. J., Donovitz, J. A., Hood, J. D. Stretch-activated single-channel and whole cell currents in vascular smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 262 (4 Pt 1), C1083-C1088 (1992).
  8. Setoguchi, M., Ohya, Y., Abe, I., Fujishima, M. Stretch-activated whole-cell currents in smooth muscle cells from mesenteric resistance artery of guinea-pig. Journal of Physiology. 501 (Pt 2), 343-353 (1997).
  9. Shelly, D. A., et al. Na(+) pump alpha 2-isoform specifically couples to contractility in vascular smooth muscle: evidence from gene-targeted neonatal mice. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), C813-C820 (2004).
  10. Coca, A., Garay, R. . Ionic Transport in Hypertension New Perspectives. , (1993).
  11. Harder, D. R. Pressure-dependent membrane depolarization in cat middle cerebral artery. Circulation Research. 55 (2), 197-202 (1984).
  12. Knot, H. J., Nelson, M. T. Regulation of arterial diameter and wall [Ca2+] in cerebral arteries of rat by membrane potential and intravascular pressure. Journal of Physiology. 508 (Pt 1), 199-209 (1998).
  13. Nelson, M. T., Patlak, J. B., Worley, J. F., Standen, N. B. Calcium channels, potassium channels, and voltage dependence of arterial smooth muscle tone. American Journal of Physiology. 259, C3-C18 (1990).
  14. Harder, D. R., Sperelakis, N. Action potentials induced in guinea pig arterial smooth muscle by tetraethylammonium. American Journal of Physiology. 237 (1), C75-C80 (1979).
  15. Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).
  16. Yvonder Weid, P., Lee, S., Imtiaz, M. S., Zawieja, D. C., Davis, M. J. Electrophysiological properties of rat mesenteric lymphatic vessels and their regulation by stretch. Lymphatic Research and Biology. 12 (2), 66-75 (2014).
  17. Harder, D. R. Comparison of electrical properties of middle cerebral and mesenteric artery in cat. American Journal of Physiology. 239 (1), C23-C26 (1980).
  18. Harder, D. R. Heterogeneity of membrane properties in vascular muscle cells from various vascular beds. Federation Proceedings. 42 (2), 253-256 (1983).
  19. Cogolludo, A., et al. Serotonin inhibits voltage-gated K+ currents in pulmonary artery smooth muscle cells: role of 5-HT2A receptors, caveolin-1, and KV1.5 channel internalization. Circulation Research. 98 (7), 931-938 (2006).
  20. Ganitkevich, V., Isenberg, G. Membrane potential modulates inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated Ca2+ transients in guinea-pig coronary myocytes. Journal of Physiology. 470, 35-44 (1993).
  21. Yamagishi, T., Yanagisawa, T., Taira, N. K+ channel openers, cromakalim and Ki4032, inhibit agonist-induced Ca2+ release in canine coronary artery. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 346 (6), 691-700 (1992).
  22. Okada, Y., Yanagisawa, T., Taira, N. BRL 38227 (levcromakalim)-induced hyperpolarization reduces the sensitivity to Ca2+ of contractile elements in caninse coronary artery. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 347 (4), 438-444 (1993).
  23. Xia, J., Little, T. L., Duling, B. R. Cellular pathways of the conducted electrical response in arterioles of hamster cheek pouch in vitro. American Journal of Physiology. 269 (6 Pt 2), H2031-H2038 (1995).
  24. Jaggar, J. H., Porter, V. A., Lederer, W. J., Nelson, M. T. Calcium sparks in smooth muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 278 (2), C235-C256 (2000).

Play Video

Cite This Article
Reed, J. T., Sontakke, S. P., Pabbidi, M. R. Microelectrode Impalement Method to Record Membrane Potential from a Cannulated Middle Cerebral Artery. J. Vis. Exp. (149), e59072, doi:10.3791/59072 (2019).

View Video