Summary
טיפול Photobiomodulation יכול גם לשפר את תפקוד המוח בריא, והיא מודאליות לא פולשנית חדשניות לטיפול במגוון רחב של הפרעות נוירולוגיות, פסיכיאטרית. פרוטוקול זה כולל מדריך צעד אחר צעד כדי ביצוע המוח photobiomodulation בעכברים על ידי משלוח אור טראנס, אשר ניתן להתאים לשימוש בחולדות מעבדה אחרות.
Abstract
Photobiomodulation טראנס היא פוטנציאל חדשני לא פולשנית גישה טיפולית לשיפור ביואנרגיה המוח, תפקוד המוח במגוון רחב של הפרעות נוירולוגיות, פסיכיאטרית, שיפור זיכרון הקשורות לגיל ירידה קוגניטיבית מחלות ניווניות. אנו מתארים פרוטוקול מעבדה לטיפול photobiomodulation טראנס (PBMT) בעכברים. BALB/c בגילאי עכברים (בן 18 חודשים) מטופלים עם 660 ננומטר לייזר transcranially, פעם ביום למשך שבועיים. לייזר להדמיה הנתונים מראה כי כ- 1% התקרית אור אדום על הקרקפת מגיע לעומק 1 מ מ מעל פני השטח קורטיקלית, חודרת של ההיפוקמפוס הגבי. תוצאות הטיפול הם מוערך על ידי שתי שיטות: בארנס מבוך, בדיקה, אשר ההיפוקמפוס תלויי מרחבי למידה וזיכרון פעילות הערכה, של מדידת רמות ATP בהיפוקמפוס, אשר משמש ליצירת אינדקס ביואנרגיה. תוצאות הפעילות בארנס מראים שיפור של הזיכרון המרחבי שטופלו לייזר בגילאי עכברים בהשוואה עם פקדים מתאימים-גיל. אנליזה ביוכימית לאחר טיפול לייזר מציין גדל רמות ATP בהיפוקמפוס. אנחנו בקביעתו כי שיפור ביצועי זיכרון הוא פוטנציאל עקב שיפור חילוף החומרים האנרגיה בהיפוקמפוס המושרה על ידי טיפול לייזר אדום. אפשרות להאריך התצפיות בעכברים אחרים מודלים בבעלי חיים מאז פרוטוקול זה יכול פוטנציאלית להיות מותאם מינים אחרים נעשה שימוש תכוף ב- neuroscience translational, כמו ארנב, החתול, הכלב או קוף. Photobiomodulation טראנס הוא חסכוני ובטוח מודאליות אשר עשוי להיות גישה טיפולית מבטיח ב פגיעה קוגניטיבית הקשורות לגיל.
Introduction
PBMT, או טיפול באור לייזר ברמה נמוכה (תראפיה), הוא מונח כללי המתייחס משיטות טיפול המבוסס על הגירוי של רקמות ביולוגיות של אנרגיית האור לייזרים או דיודות פולטות אור (נוריות). כמעט כל הטיפולים PBMT עם אדום-סגול (ניר) אור באורכי גל מ 600 חלות 1100 nm, כוח פלט בין 1 ל 500 mW, ואת הכשרון החל < 1 > J/cm 202 (ראה צ'ונג ואח1).
טראנס PBMT היא שיטה לא פולשנית משלוח אור זה מבוצע על ידי הקרנה של הראש באמצעות של ממקור אור חיצוני (לייזר או נוריות)2. עבור יישומים בעלי חיים, שיטה זו כוללת קשר או אסטמה של השמה של המכשיר LED או לייזר על הראש של החיה. תלוי באזור טיפולית עניין, מכשיר בדיקה קלה ניתן להציב על הראש כולו (עבור מכסה את כל התחומים המוח) או על חלק מסוים של הראש, כגון האזור הקדם חזיתית, חזיתית או הקודקוד. השידור חלקית של אור אדום/ניר דרך הקרקפת, הגולגולת, הדורה יכול להגיע אל פני השטח קורטיקלית ולספק כמות הפוטונים אנרגיה מספקת להפיק יתרונות טיפולית. לאחר מכן, הכשרון אור ונמסרו ברמת בקליפת המוח להיות מופצות בנושא המוח אפור ולבן עד שהוא מגיע המבנים עמוק יותר של המוח3.
אור הלהקות ספקטרלי האדום מרחיקת אדום אזור (600-680 ננומטר) ואזור מוקדם ניר (800 870 ננומטר) מקביל ספקטרום הבליעה של ציטוכרום c אוקסידאז, האנזים מסוף של שרשרת הנשימה מיטוכונדריאלי4. זה זה שיערו כי PBMT בספקטרום אדום/ניר גורם פוטוליזה של תחמוצת החנקן (NO) של ציטוכרום c אוקסידאז, וכתוצאה מכך העלאות תחבורה אלקטרון מיטוכונדריאלי והגדילה, בסופו של דבר, ATP דור5. לגבי יישומים עצביים, היתרונות neurostimulatory הפוטנציאליים של המוח PBMT באמצעות הקרנה טראנס שיטות דווחו במגוון רחב של מחקרים פרה, כולל דגמים מכרסם של מוח טראומטית (TBI) פגיעה6, קו חריפה7, מחלת אלצהיימר (AD)8, מחלת פרקינסון (PD)9, דיכאון10והזדקנות11.
הזדקנות המוח נחשב מצב שתלמידים המשפיעה לרעה על תפקודים קוגניטיביים מסוימים, כגון למידה וזיכרון12. המיטוכונדריה הם organelles הראשי אחראי על ייצור ATP, ביואנרגיה עצביים. תפקוד מיטוכונדריאלי ידוע להיות מזוהה עם גירעונות הקשורות לגיל באזורי המוח הקשורים ניווט מרחבי זיכרון, כמו ההיפוקמפוס ה13. כי הטיפול הגולגולת האדומה/ניר אור בעיקר מעשים על-ידי אפנון של ביואנרגיה מיטוכונדריאלי, ונמסרו אור מינון ההיפוקמפוס יכול לגרום לשיפור הזיכרון המרחבי תוצאות14.
המטרה של פרוטוקול הנוכחית היא כדי להדגים את הפרוצדורה PBMT טראנס בעכברים, באמצעות רמות נמוכות של אור אדום. המדידות אור לייזר הנדרשים דרך הרקמות ראש של עכברים בגילאי מתוארים. בנוסף, מבוך בארנס, כמו למידה מרחבית ההיפוקמפוס תלויי זיכרון המשימות ואת רמות ATP בהיפוקמפוס, בתור אינדקס ביואנרגיה, משמשים עבור הערכה של ההשפעה טיפול בבעלי חיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הנהלים בוצעו בהתאם המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של המכון הלאומי לבריאות (NIH; פרסום מס 85-23, תוקן 1985) ואושרו על-ידי ועדת האתיקה האזורי של תבריז האוניברסיטה למדעי הרפואה.
התראה: פרוטוקול זה כולל את היישום של מכשירים לייזר Class 3B, דורשים הכשרה מתאימה תוך היצמדות להנחיות הבטיחות. Class 3B לייזרים יכול לגרום נזק חמור בעיניים וחום בעור. Class 3B לייזרים לא נחשב סיכון כוויות. חובה לחבוש משקפי הגנה העין בכל עת בהפעלה את מכשיר הלייזר.
1. לייזר אור ניסויים
הערה: להשתמש כאן שלושה בת 18 חודש זכר BALB/c עכברים התקבלו מהמתקן בעלי חיים של תבריז האוניברסיטה למדעי הרפואה. לייזר mW 60 (660 ננומטר) עם קרן מעגלית הצורה של 2.5 מ מ קוטר משמש מקור האור. מקור הלייזר מייצר אור מקוטב באופן מעגלי עם פרופיל בעוצמה לפי עקומת גאוס ומופעל במצב מתמשך wave. מד כוח פוטודיודה מסחרי עם רזולוציה nW 10, אזור פעיל של2 פוטודיודה 1 ס מ מרובע טווח התגובה ספקטרלי מ- 400 1100 nm משמש כדי למדוד את השלטון אור משודרים באמצעות הדגימות.
-
הכנת הדוגמא
- על מנת לקבל דגימות טריות, עמוק עזים ומתנגד את העכבר עם תערובת של קטאמין (100 מ ג/ק ג) חריגות השירותים הווטרינריים (10 מ"ג/ק"ג).
- לנתח את הראש של העכבר במספריים רגילים, החל מהנקודה הממוקמת מעל הכתפיים.
- לסובב את הראש כך הצד הבטני של הלסת פונה למעלה. החלק בזווית חיתוך מספריים בצורה חלקה דרך חלל הפה עד ההתנגדות של הצומת הלסת הוא הבחין. לחתוך כל השרירים גדול מקשר את עצם הלסת התחתונה לגולגולת וזורקים אותם.
- הסר את העצמות הפלטינית, באמצעות מספריים בזווית לנתיחה.
- להתעלם כל בשר המקיפים את הגולגולת, באמצעות מלקחיים מעוקל.
- לנתח את החלק התחתון של הגולגולת, לאחר מכן, לקחת בזהירות את מוחי העצם הגולגולת הנותרים, עם מרית מעוקל.
- לתקן את רקמת המוח ללא פגע ג'ל agarose 2% כך הרקמה תהיה מתאימה עם פרוסות.
הערה: על מנת להשיג של הגולגולת שלם וגם הקרקפת מדגם רקמת המוח יש להסיר מן הצד הבטני של הראש של החיה ללא כל נזק לחלק הגבי של הראש.
-
המוח עם פרוסות הליך
- מורחים טיפה של דבק מגע (~0.05 מ"ל) על פני הרחוב הרכבה vibratome.
- בזהירות לצרף את הבלוק agarose vibratome הרכבה בלוק כך השטח הגחוני של המוח היא עם הפנים, והתאם את מיקומו.
- מעט להתאים את הלהב vibratome השטח העליון של הרחוב agarose ולהקליט את הערך קאטר כרמת העיקרי.
- למלא את מיכל vibratome עם תמיסת מלח רגיל קר כקרח.
- להתאים את הפרמטרים vibratome (למשל, עובי הפרוסה [1 מ מ מהירות [מתוך 5 ביחידה התקן], תדר הרטט [מתוך 5 ביחידה התקן]) כדי להשיג עם פרוסות משביע רצון.
- לחתוך את המוח באופן רוחבי פרוסה עם עובי 1,000 מיקרומטר.
הערה: הפרוסה הוא החלק של רקמת המוח לפי השטח קורטיקלית וממוקמים מטוס נחות השטח בקליפת המוח (ההיפוקמפוס הגבי) 1,000 מיקרומטר. - להוסיף טיפה של מים (~0.05 מ"ל) על משטח זכוכית אופטית ולשים את המוח הפרוסה על גבי זה. לאחר מכן, להוסיף טיפה של מים on המוח פרוסה, בזהירות המקום הזכוכית אופטי השני מעליו.
הערה: ירידה של מים יש להוסיף לגבולות זכוכית לדוגמה כדי למנוע רקמות ייבוש ואור פיזור משטחים קשים.
-
מדידה של העברת האור דרך הרקמות, ראש
- להגדיר את ציוד אופטי, כולל את מכשיר הלייזר, המשקף מראות ויחידת מד הכוח.
התראה: לשים משקפי מגן עיניים לפני הפעלת הלייזר. - בהיעדר מדגם במד חשמל, להדליק את מכשיר הלייזר ולהתמקד קרן הלייזר על המראה הממוקמת במרחק נאות להדרכת בניצב אזור פעיל של פוטודיודה הקורה.
הערה: מדידות אור חייב להתבצע בתוך חדר חשוך בטמפרטורת החדר (23-25 ° C), בתוך 30 דקות לאחר הרקמות ראש חולצו. - בצע מדידות רקמת המוח הפרוס.
- במקום שתי כוסות אופטי ריק על פני השטח של מד הכוח.
- לקרוא את הכוח אור המשודרת (אני0) מ של מד הכוח להציג מסך ולהקליט את הערך.
- בעדינות למקם את הדגימה במוח, אשר הוא הקיף על ידי שתי כוסות אופטי, על פני השטח של מד הכוח, ממקדים את הקרן על שטח בהתאמה של הרקמה, לקרוא את הכוח המשודרת ולהקליט את הערך.
- בצע מדידות הגולגולת וגם הקרקפת.
- במקום כוס אופטי ריק על פני השטח של מד הכוח.
- לקרוא את הכוח אור המשודרת (אני0) מ של מד הכוח להציג מסך ולהקליט את הערך.
- בקלילות מקום של זכוכית אופטית עם הגולגולת טריים בתוספת בקרקפת רקמות על פני השטח של מד הכוח, להתאים אלומת האור על אזור bregma, לקרוא את הכוח המשודרת ולהקליט את הערך.
- על מנת למקסם את יחס אות לרעש, חזור על המדידה אור לפחות 3 x עבור כל הדגימות.
הערה: אזור bregma נמצא במחלקה כ 3 מ מ rostral ל קו שצויר באמצעות הבסיס הקדמי של האוזניים. העובי של הרקמה הגולגולת וגם הקרקפת נמדד על ידי caliper סטנדרטי.
- להגדיר את ציוד אופטי, כולל את מכשיר הלייזר, המשקף מראות ויחידת מד הכוח.
2. טיפול Photobiomodulation (PBMT)
הערה: 45 עכברים BALB/c זכר שהוקצו שלוש קבוצות של 15 עכברים שימשו. הקבוצות חוברו של עכברים צעירים-control (בן חודשיים) שקיבלו המזויפים-PBMT, בגילאי-בקרת עכברים (בן 18 חודשים) אשר קיבל המזויפים-PBMT ועכברים בגילאי-PBMT (בן 18 חודשים) אשר קיבל PBMT. הטיפול המזויפים-PBMT כללה טיפול זהה PBMT הקבוצה, אבל עם לייזר לא פעיל. עכברים התקבלו מהמתקן בעלי חיים של תבריז האוניברסיטה למדעי הרפואה, שוכנו החיה מחזיק יחידה של מרכז מחקר מדעי המח (NSRC)-לחות יחסית 24-25 ° C ו- 55%, עם 12 שעות אור, photoperiod כהה 12 שעות. מזון ומים נמסרו ad libitum. כל העכברים היו התאקלם במשך לפחות שבוע לפני טיפול.
-
נוהל טיפול לייזר
הערה: GaAlAs דיודת לייזר עם מצב מתמשך wave-660 ננומטר גל שימש לטיפול PBMT טראנס. מכשיר הלייזר הופעל כוח פלט של 200 mW ± 2, אחידות irradiance של 6.66 W/cm2, עם נקודה בגודל של ס מ 0.03 נקודות2. הכשרון הממוצע של J/cm 99.92 לכל כל מושב נמסרו על פני הקרקפת 15 s של הקרנה. ההקרנות היה מנוהל 1 x מדי יום במשך שבועיים רצופים.- להביא את העכברים בכלובים שלהם הביתה לחדר הטיפולים, כ 20 דקות לפני תחילת הטיפול.
- להתחבר עם מגן חשמלי בקיר.
- הכנס את התקע מכשיר לייזר לתוך מגן חשמלי.
- מכסים את קצה המכשיר לייזר עם סרט ניילון שקוף כדי למנוע כל גירוד אל פני השטח.
- בזהירות לחבר את המכשיר הערוץ של מכשיר הלייזר.
- הפעל את מכשיר הלייזר ולאחר המתן מספר שניות על זה כדי להתחמם.
- כוונן את הפרמטרים לייזר/טיפול, כולל מצב זמן ותפעול הקרנה.
- בהיעדר דוגמיות, לקבוע את עוצמת הלייזר הממוצע על-ידי פנייה אל קצהו של החללית אל אזור פעיל של מד צריכת החשמל במכשיר לייזר. להקליט את הערך.
- חזור על התהליך כיול (שלב 2.1.8 תגובה על) לפחות 5 x, לקרוא סמכויות התקרית של מד הכוח להציג מסך, ולהקליט את הערכים.
- בעדינות להחזיק עכבר בעור הגבי הצוואר של החיה בכף יד, לשתק את ראשו.
הערה: בפרוטוקול הנוכחי, הלייזר מושם על אזור bregma, אשר הוא ~ 3 מ"מ rostral לקו הנמתחים בין הבסיס הפנימי של האוזניים. - בקלילות המקום קצה המכשיר ישירות על הקרקפת בקו האמצע, כ 3 מ מ rostral ל קו שצויר באמצעות הבסיס הקדמי של האוזניים.
הערה: להחזיק את המכשיר בבית כ 45° זווית למטוס של הבטן. - כדי להימנע הקרנה ישירה לעיניים של החיה, פנה הטיפ של המכשיר על הראש, ולאחר מכן, הפעל את מכשיר הלייזר.
- הפעל את הלייזר ולאחר stably להחזיק את המכשיר עד להשלמת ההקרנות.
- לאחר תום הטיפול, לסגת הלייזר מהראש ולחזור בעדינות את העכבר בכלוב.
- כבה את מכשיר הלייזר ונתק החללית מההתקן.
- ניקוי המכשיר לייזר עם שואב האבק אופטי המתאים.
- להעביר את העכברים המתקן בעלי חיים.
3. משימות התנהגותית
-
מבחן בשדה פתוח
- להעריך את גינקולוגיות הפעילות של כל העכבר על ידי המרחק הכולל נסע במהלך מבחן בשדה פתוח, כפי שתואר לעיל15.
-
פעילות מבוך בארנס
-
המנגנון.
הערה: מרחבי למידה וזיכרון הפעילות מתבצעת בתוך מבוך בארנס16. המנגנון המשמש עבור משימה זו neurobehavioral מורכב משטח עגול עשוי מעץ שחור (95 ס מ קוטר) עם 20 קו מקביל, 5 ס מ קוטר חורים עגולים הממוקמים על הרציף, 3 ס מ מסביב. המנגנון הוא מוגבה 50 ס מ מן הרצפה כדי למנוע את החיה יטפס למטה. תיבה מטלטלין לברוח פלסטיק שחור (20 ס"מ על 15 ס"מ x 5 ס מ) ממוקמת תחת החור לברוח. מבוך שחור משמש לבדיקת עכברים לבנים, שטיח שחור צריך להיות ממוקם תחת במבוך כאשר תוכנת מערכת מעקב.- מקם את המנגנון מבוך במרכז חדר שקט עם תאורה בהירה תקורה.
- במקום שלט "לא להכנס" על החלק החיצוני של הדלת של חדר פעילות.
- לצרף רמזים חזותי מרחבי קירות המתחם.
- הצב מצלמת וידאו דיגיטלית מעל הרציף מבוך.
- לנקות את השטח של פלטפורמת מבוך עם 70% אתנול להסיר רמזים חוש הריח לא רצויים.
- להוסיף כמות קטנה של מצעים מהכלוב בבית של החיה בתוך תיבת לברוח כדי לשמש את הסימן חוש הריח.
-
הסתגלות הפעלה
- להביא כל עכבר פעילות החדר כ-30 דקות לפני תחילת הניסוי, על מנת העכבר כדי להפוך בלתי.
- להסיר את העכבר מכלובה ומניחים בעדינות את החיה בתיבת ' לברוח ' 1 דקות.
-
אימון
הערה: האימון עצמו חוזר על עצמו עבור כל עכבר על 4 ימים רצופים.- הסר בעדינות את העכבר מהתיבה לברוח.
- הנח את העכבר במרכז הזירה; אז, במקום תא התחל על העכבר.
- להסיר תא התחל לאחר 10 s, ולאפשר את העכבר כדי לחקור את הזירה למשך 3 דקות.
- בשקט להעביר המחשב ואל במקום על האוזניות אוטמות הרעש.
- לעורר גירוי שמיעתי שלילי בהיקף של רעש לבן חזק של 80 dB ברמת פלטפורמה ולהתחיל לצלם את העכבר.
- כבה את הרעש הלבן ואת להפסיק לצלם כאשר העכבר נכנס בתיבת לברוח. לאפשר את החיה להישאר ללא הפרעה בתיבה עבור 1 דקות.
- להסיר את העכבר מהתיבה לברוח ולמקם אותו בחזרה לתוך הכלוב שלה.
- חזור על שלבים 3.4.2 דרך 3.4.7 4 x ליום, עם מרווחי זמן 3 דקות בין מבחנים חוזרים ונשנים.
הערה: בין כל המבחנים, מסיר שתן או צואה מהמשטח ארנה ולנקות את המבוך עם 70% אתנול.
-
מפגש ניסיון בדיקה
- בעקבות שעבר הכשרה המשפט, 24 שעות מאוחר יותר, הסר את תיבת לברוח פלטפורמה מבוך וחזור על שלבים 3.4.2 דרך ' ר 3.4.5.
- לאחר 3 דקות, לכבות את רעש לבן, להפסיק לצלם. להסיר את העכבר מן הזירה מבוך ולמקם אותו בחזרה לתוך הכלוב שלה.
- לאחר כל החיות נבדקו, לנקות את הפלטפורמה מבוך ואת תא התחל. לכבות את האורות בחדר ולהסיר את השלט "אין להזין" מהדלת.
- אחסן את הקלטות וידאו מהפעלות בדיקה על כונן קשיח חיצוני לצורך ניתוח נוסף.
- להגדיר את מעקב וידאו תוכנה ולחלץ הפרמטרים של ריבית מן קטעי וידאו מוקלט, כולל את זמן השהיה כדי למצוא את החור המטרה במהלך 4 ימי הדרכות וזמן בילה ברביע היעד במהלך הפעלת המשפט בדיקה.
-
המנגנון.
4. הערכת הביוכימי
-
רמות ATP בהיפוקמפוס
- עמוק עזים ומתנגד לכל עכבר עם זריקה בקרום הבטן של תערובת של קטאמין (100 מ ג לגרם של משקל הגוף) חריגות השירותים הווטרינריים (10 מ ג לגרם של משקל הגוף).
- לערוף את החיה, במהירות להסיר את רקמת מוח הגולגולת.
- שווייץ ההיפוקמפוס, homogenize הרקמה במאגר לדוגמה קרה כקרח (שסופק על-ידי ערכת) עם מהמגן רקמות.
- מיד centrifuge את homogenate ב x 2,000 g עבור מינימום 3-4 מעלות צלזיוס.
- להעביר את תגובת שיקוע צינור נקי.
- להעריך את רמות ATP בהיפוקמפוס, באמצעות spectrophotometric את השיטה כפי שתואר לעיל11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתוחים סטטיסטיים
ניתוח סטטיסטי של נתונים המתקבלים בארנס ההדרכות נותחה על ידי ANOVA דו-כיווני; מבחנים התנהגותיים האחר ו ניתוח של רמות ATP בהיפוקמפוס בקרב קבוצות בוצעו על ידי חד-כיווני אנובה, ואחריו מבחן לאחר הוק של Tukey. כל הנתונים באים לידי ביטוי כפי שאומר ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM), למעט לייזר שידור הנתונים, מוצגות כפי שאומר ± סטיית התקן (SD). רמת המובהקות הוגדר ב- p < 0.05.
העברת אור לייזר
אור הלייזר (660 ננומטר) שידור דרך הרקמות הגולגולת וגם הקרקפת (עם עובי מדגם של 0.85 ± מ מ 0.09) של העכברים בגילאי היה 15.67% ± 0.87% כאשר קרן לייזר היה ממוקד של bregma (איור 1). על סמך התמסורת אור, מאז הכשרון הראשונית על פני הקרקפת הייתה 99.9 J/cm2 (6.66 [W/cm2] x 15 [s]), יכול להיות ההערכה כי הכשרון משוער של J/cm 162 הגיע השטח קורטיקלית.
להדמיה לייזר, דרך פרוסה 1 מ"מ של רקמת המוח בגיל העמידה, היה 10.10% ± 0.95% (איור 1). בין ערכים אלה, יכול להיות ההערכה כי הכשרון אור ירד מ J/cm 162 ברמת רקמת קליפת המוח כ 1.6 J/cm2 בעומק 1 מ"מ מהמשטח קורטיקלית.
בדיקת שדה פתוח
היו אין הבדלים משמעותיים סטטיסטית בפעילות גינקולוגיות במבחן בשדה פתוח בין כל הקבוצות ניסיוני (איור 2).
פעילות מבוך בארנס
בעת ההשהיה לברוח נותחו במהלך 4 ימים של הכשרה, עם קבוצות הניסוי במהלך הפעילות מבוך בארנס, ANOVA דו-כיווני חשפה תופעות משמעותיות של היום (p < 0.001) וקבוצה (0.001 <p ), אבל לא קבוצה x יום (p = 0.47). ניתוח בין-קבוצתית של הנתונים הראו כי הזמנים השהיה של החיות בגילאי-פקד היו באופן משמעותי יותר מאשר אלה של קבוצת צעירים-הביקורת השלישית (0.01 <p ) ו- (p < 0.001) הרביעית, ימי האימון עצמו. אולם הזמנים השהיה של העכברים בגילאי שטופלו PBMT היו נמוך באופן משמעותי ביום הרביעי (p < 0.05), בהשוואה עם העכברים בגילאי-control (p < 0.01) (איור 3). הפעלת המשפט בדיקה, בגילאי-בקרת עכברים בילה פעמים נמוך באופן משמעותי ברביע היעד, בהשוואה לעכברים צעירים-control (0.01 <p ). עם זאת, PBMT שטופלו בגילאי עכברים בילה פעמים באופן משמעותי יותר ברביע היעד לעומת בגילאי-בקרת עכברים (p < 0.05) (איור 4).
רמות ATP בהיפוקמפוס
העכברים בגילאי-פקד הייתה ירידה משמעותית ברמות ATP בהיפוקמפוס, לעומת עכברים צעירים-control (p < 0.05). עם זאת, התוכן ATP כלומר בהיפוקמפוס של העכברים בגילאי-PBMT היו גדול יותר באופן משמעותי מאשר אלה בעכברים בגילאי-control (p < 0.05) (איור 5).
איור 1 : לייזר אור שידור נתונים דרך הגולגולת פלוס בקרקפת, על רקמת המוח. נתונים מבוטא זאת אומרת ± SD. SD = סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : פעילות גינקולוגיות נתונים ילדי בשדה פתוח נתונים מבוטא זאת אומרת ± ב- SEM. PBMT = photobiomodulation טיפול; SEM = שגיאת התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : לברוח השהיה לקבוצות עכברים במהלך 4 ימי הדרכות. ערכים מייצגים את זאת אומרת ± ב- SEM. * *p < 0.01 ו * * *p < 0.001, לעומת עכברים צעירים-control. # p < 0.05, לעומת העכברים בגילאי-control. PBMT = photobiomodulation טיפול; SEM = שגיאת התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : הזמן בילה ברביע היעד הפעלת המכשיר, לקבוצות שונות. ערכים מייצגים את זאת אומרת ± ב- SEM. * *p < 0.01, לעומת עכברים צעירים-control. # p < 0.05, לעומת העכברים בגילאי-control. PBMT = photobiomodulation טיפול; SEM = שגיאת התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : ATP תוכן בתוך הרקמה ההיפוקמפוס. ערכים מייצגים את זאת אומרת ± ב- SEM *p < 0.05, לעומת עכברים צעירים-control. # p < 0.05, לעומת העכברים בגילאי-control. PBMT = photobiomodulation טיפול; SEM = שגיאת התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מתארים פרוטוקול לביצוע הליך PBMT טראנס בעכברים. פרוטוקול זה מכוון במיוחד למעבדות מדעי המוח לבצע מחקר photobiomodulation התמקדו מכרסמים. עם זאת, ניתן להתאים פרוטוקול זה חיות מעבדה אחרות נפוצים בתחום מדעי המוח, כמו ארנב, החתול, הכלב או קוף.
כיום, יש עניין גדל בחקירת טראנס PBMT עם לייזרים אדומים/ניר ונוריות. כדי לבצע בהצלחה את ההליך כולו טיפול במכרסמים, ישנם כמה צעדים חיוניים שיש לקחת בחשבון.
קודם כל, זה קריטי, לפני שתנסה לבצע טיפול בבעלי חיים, החדירה אור בדיוק נמדדת דרך הרקמות ראש בעלי חיים על מנת לספק מינון של פוטון אופטימלית (J/cm2).
שנית, על סמך באילו אזורים במוח מושפע פתולוגיה, לפלח לטיפול, מספר פרמטרים צריך כדי להיות ממוטבים, להגדיל את החדירה אור להגביר את הסבירות של תוצאות חיוביות. אלה כוללים זמן הקרנה, טיפול מרווח, irradiance יישומית, הכשרון. לדוגמה, במודלים בבעלי חיים גיל, זה הכרחי לספק מינון הקרינה מספיק ההיפוקמפוס המוח ואת החזיתית כי אזורים אלה מקושרים פתולוגיות הקשורות לגיל2. שיעור הכשרון אופטימלית ברקמות היעד הוא גורם חשוב נוסף ב- PBMT. רוב החוקרים דנים גורמים משפיעים על אור, אך לעתים להזניח לשקול כי לתגובה biphasic ברקמות המוח היעד קיימת לא רק עבור הכשרון (J/cm2), אלא גם עבור קצב משלוח הכשרון. במילים אחרות, הכשרון של 1 J/cm2 משלוח מעל 1 דקות אינה שוות ערך ל- 1 J/cm2 נמסר s 1 מעל17,18.
ישנם מספר גורמים נוספים הנחשבות גם לפני ביצוע מחקרים PBMT טראנס. טראנס PBMT בחולדות מוחל בדרך כלל באמצעות לייזר או נוריות רגשים עם גודל קצה המקדח לשינוי גודל המוח של החיה. עבור יישום בחולדות, בינוני-power לייזרים (עם כוח תפוקה של עד 500 mW) יכולה לספק כמות גדולה של אנרגיית האור בתוך זמן קצר ולהפחית בזמן הטיפול והן הקשורות לטיפול הלחץ לחיה. למרות Class 3B לייזרים אין תופעות photothermal משמעותי בטווחי מינון PBMT (≤20 J/cm2), קירור פני הקרקפת עם חומר אופטי שקוף, כמו קרח או ג'ל, מומלץ במהלך היישום טראנס.
בכמה מחקרים PBMT טראנס ניסיוני, סיב אופטי משמש במקום לייזר או בדיקה LED, בשל היתרונות עבור הקרנה של אזור מסוים קטן על הראש. עבור דוגמה, ב מוקד שבץ איסכמי, TBI, ומודלים PD, הקרנה מדויק של האזור הפגוע היא מוצדקת. עם זאת, סיבים אופטיים יש בדרך כלל אזור הקורה קטן, אז זה ישפיע על הסכום הכולל של אנרגיה מועברת בהפעלה אחת ולא יחייב חוקרים לחזור על התהליך במקום אחד או יותר כדי לפצות על האזור ירד. מחקרים PBMT טראנס הכי ניסיוני, הקרנה של הראש מתנהל לחיה ערני, unanesthetized. על מנת להבטיח יציבות בעלי חיים, מחזיק ראש ידני ושימוש של התקני ריסון מומלצים. ב מחזיקים באופן ידני השיטה, בשל העובדה כי החיה עשויות לעבור לפתע, ואולי התרחקות ראשו אזור הקרנה, חלק אור לקרינה עלול לבזבז. יתר על כן, שתי השיטות יכול לגרום ללחץ נוסף לחיה, יכול להיות גורם מבלבלים פוטנציאל. במקרים מסוימים, מתבצע ההליך הקרנה בחיה anesthetized. יצוין, כי הרדמה מדי עלולה להשפיע לרעה התוצאות ניסיוני בלימודי מדעי המוח. לכן, למרווח זמן הקרנה קצר יותר יש לשקול בזהירות בסוגים אלה של ניסויים.
במחקר הנוכחי, תחילה מדדנו את השידור של אור דרך הגולגולת פלוס הקרקפת של זכר BALB/c בגילאי עכברים כדי לקבוע את כמות האנרגיה לייזר 660 ננומטר שהגיעו השטח קורטיקלית. התוצאות הראו, כי 16% מן האור הראשוני על פני הקרקפת לא מגולח מועברת באמצעות למוח. שידור נתונים ממעבדות אחרים בעכברים BALB/c זכר הראו כי רק 1.2% של 670 ננומטר לייזר אור היה מסוגל לחדור את הגולגולת שלם19. גם דווח כי כ-90% 670 nm נורית היא הקלוש בתוך הגולגולת העכבר20.
המינון neurostimulatory יעיל לייזר אדום על רמת הרקמה קורטיקלית אושר במחקר הקודם שנערך במעבדה שלנו11. הראינו כי על הכשרון קורטיקלית יומי של לייזר2 8 J/cm-660 ננומטר יש תופעות procognitive של עכבר ההזדקנות. דגם11. באזור ' טיפול ' של המחקר הנוכחי, כדי לספק כ J/cm 162 אל פני השטח קורטיקלית, היינו צריכים לעזוב את הלייזר על 15 s, אשר היה נסבל על ידי העכברים. בשנת העבודה הנוכחית, מדדנו גם כוח האור המתקבלים על פני ההיפוקמפוס. בהתבסס על תוצאות הניסוי, ערך משוער של 10% נמדדה כמו לייזר להדמיה דרך פרוסה 1 מ"מ המוח בגיל המתאים הכשרון קלים של 1.6 J/cm2 להגיע עמוק ממשטח קורטיקלית 1 מ"מ. נתונים ממחקרים אחרים באמצעות מוח העכבר BALB/c נחשפו ירידה 65% של 670 nm LED עוצמת האור על פני כל מילימטר של רקמה מוחית21. גם הוכח כי כ- 2.5% של 670 nm הנורית מגיע לעומק ברקמות המוח של 5 מ מ, המרחק מפני הקרקע הגולגולת הסובסטנציה ניגרה compacta (SNc) אזור22.
ההיפוקמפוס תפקיד הקרדינל לגיבוש זיכרון מרחבי23. למעשה, היכולת ביואנרגיה בהיפוקמפוס מזוהה עם ניווט מרחבי זיכרון ולמידה. הממצאים המוצגים כאן מראים כי מינון אור של 1.6 J/cm2 ברמת ההיפוקמפוס יכול להיות מספיק כדי לייצר שיפור של זיכרון מרחבי התוצאות בעכברים בגילאי. זה יכול להניח כי שיפור הביצועים זיכרון בפעילות קוגניטיבי-התנהגותי (מבוך ברנס) יכול להיות עקב שיפור של חילוף החומרים האנרגיה בהיפוקמפוס שנראה להיגרם על ידי לייזר אדום-גל מסוים של 660 ננומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
השכר של פי. סי נתמכה על ידי הארוורד פסיכיאטריה המחלקה (מלגת דופונט-וורן, ליווינגסטון פרס), על ידי המוח ואת קרן מחקר התנהגות (פרס החוקר הצעיר NARSAD), על ידי inc Photothera בלתי מוגבלת גרנט. התרומה סמים הגיעה טבע. החזר נסיעות הגיעה Pharmacia-אפג'ון. פי. סי קיבלה דמי ייעוץ Janssen מחקר ופיתוח. פי. סי הגיש מספר פטנטים הקשורים לשימוש של אור אינפרא אדום בפסיכיאטריה. PhotoMedex, inc. סיפקו ארבעה מכשירי מחקר קליני. פי. סי קיבל בלתי מוגבלת למימון Litecure inc. כדי לערוך מחקר על טראנס photobiomodulation לטיפול של הפרעות דיכאון, לערוך מחקר בנושאים בריא. פי. סי הקים חברה (Niraxx אור הרפוי) התמקד בפיתוח של שיטות חדשות של הטיפול מבוסס על אור אינפרא אדום; הוא גם יועץ באותה חברה. פי. סי קיבל מימון מדעי המוח לערוך מחקר על טראנס photobiomodulation עבור להפרעת חרדה כללית. המחברים אחרים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מ תבריז האוניברסיטה למדעי הרפואה (מענק מס 61019) אל-אס-אי ו מענק הפרסום של LiteCure LLC, ניוארק, דה, ארה ב כדי L.D.T. המחברים רוצה להודות אימונולוגיה בחוג ויחס מרכז פיתוח החינוך (EDC) של תבריז האוניברסיטה למדעי הרפואה לקבלת סיוע נדיב שלהם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Alfasan | #1608234-01 | |
| Xylazine | Alfasan | #1608238-01 | |
| Agarose | Sigma | #A4679 | |
| Superglue | Quickstar | ||
| Vibratome | Campden Instruments | #MA752-707 | |
| Optical glass | Sail Brand | #7102 | |
| Power meter | Thor labs | #PM100D | |
| Photodiode detector | Thor labs | #S121C | |
| Caliper | Pittsburgh | ||
| GaAlAs laser | Thor Photomedicine | ||
| Etho Vision | Noldus | ||
| Centrifuge | Froilabo | #SW14R | |
| Earmuffs | Blue Eagle | ||
| Digital camera | Visionlite | #VCS2-E742H | |
| Sterio amplifier | Sony | ||
| Ethanol | Hamonteb | #665.128321 | |
| Barnes maze | Costom-made | ||
| ATP assay kit | Sigma | #MAK190 | |
| Elisa reader | Awareness | #Stat Fax 2100 |
References
- Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of Biomedical Engineering. 40 (2), 516-533 (2012).
- Salehpour, F., et al. Brain Photobiomodulation Therapy: a Narrative Review. Molecular Neurobiology. , 1-36 (2018).
- Hamblin, M. R. Shining light on the head: photobiomodulation for brain disorders. BBA Clinical. 6, 113-124 (2016).
- Karu, T. I., Pyatibrat, L. V., Kolyakov, S. F., Afanasyeva, N. I. Absorption measurements of a cell monolayer relevant to phototherapy: reduction of cytochrome c oxidase under near IR radiation. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 81 (2), 98-106 (2005).
- de Freitas, L. F., Hamblin, M. R. Proposed mechanisms of photobiomodulation or low-level light therapy. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 22 (3), 348-364 (2016).
- Xuan, W., Vatansever, F., Huang, L., Hamblin, M. R. Transcranial low-level laser therapy enhances learning, memory, and neuroprogenitor cells after traumatic brain injury in mice. Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 108003 (2014).
- DeTaboada, L., et al. Transcranial application of low-energy laser irradiation improves neurological deficits in rats following acute stroke. Lasers in Surgery and Medicine: The Official Journal of the American Society for Laser Medicine and Surgery. 38 (1), 70-73 (2006).
- De Taboada, L., et al. Transcranial laser therapy attenuates amyloid-β peptide neuropathology in amyloid-β protein precursor transgenic mice. Journal of Alzheimer’s Disease. 23 (3), 521-535 (2011).
- Oueslati, A., et al. Photobiomodulation suppresses alpha-synuclein-induced toxicity in an AAV-based rat genetic model of Parkinson’s disease. PloS One. 10 (10), e0140880 (2015).
- Xu, Z., et al. Low-level laser irradiation improves depression-like behaviors in mice. Molecular Neurobiology. 54 (6), 4551-4559 (2017).
- Salehpour, F., et al. Transcranial low-level laser therapy improves brain mitochondrial function and cognitive impairment in D-galactose–induced aging mice. Neurobiology of Aging. 58, 140-150 (2017).
- Grady, C. The cognitive neuroscience of ageing. Nature Reviews Neuroscience. 13 (7), 491 (2012).
- Beal, M. F. Mitochondria take center stage in aging and neurodegeneration. Annals of Neurology. Official Journal of the American Neurological Association and the Child Neurology Society. 58 (4), 495-505 (2005).
- Lu, Y., et al. Low-level laser therapy for beta amyloid toxicity in rat hippocampus. Neurobiology of Aging. 49, 165-182 (2017).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. C. Use of the open field maze to measure locomotor and anxiety-like behavior in mice. Journal of Visualized Experiments. (96), e52434 (2015).
- Rosenfeld, C. S., Ferguson, S. A. Barnes maze testing strategies with small and large rodent models. Journal of Visualized Experiments. (84), e51194 (2014).
- Huang, Y. Y., Chen, A. C. H., Carroll, J. D., Hamblin, M. R. Biphasic dose response in low level light therapy. Dose Response. 7 (4), 358-383 (2009).
- Mohammed, H. S. Transcranial low-level infrared laser irradiation ameliorates depression induced by reserpine in rats. Lasers in Medical Science. 31 (8), 1651-1656 (2016).
- Zhang, Y., Zhang, C., Zhong, X., Zhu, D. Quantitative evaluation of SOCS-induced optical clearing efficiency of skull. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 5 (1), 136 (2015).
- Shaw, V. E., et al. Neuroprotection of midbrain dopaminergic cells in MPTP-treated mice after near-infrared light treatment. Journal of Comparative Neurology. 518 (1), 25-40 (2010).
- Moro, C., et al. Photobiomodulation inside the brain: a novel method of applying near-infrared light intracranially and its impact on dopaminergic cell survival in MPTP-treated mice. Journal of Neurosurgery. 120 (3), 670-683 (2014).
- Reinhart, F., et al. The behavioural and neuroprotective outcomes when 670 nm and 810 nm near infrared light are applied together in MPTP-treated mice. Neuroscience Research. 117, 42-47 (2017).
- Sadowski, M., et al. Amyloid-β deposition is associated with decreased hippocampal glucose metabolism and spatial memory impairment in APP/PS1 mice. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 63 (5), 418-428 (2004).
