Summary
العلاج فوتوبيومودوليشن هو طريقة noninvasive مبتكرة لمعالجة طائفة واسعة من الاضطرابات العصبية والنفسية، ويمكن أيضا تحسين وظيفة المخ السليمة. ويشمل هذا البروتوكول دليل خطوة بخطوة لأداء فوتوبيومودوليشن الدماغ في الفئران بتسليم transcranial الخفيفة، التي يمكن تكييفها للاستخدام في قوارض المختبرات الأخرى.
Abstract
Transcranial photobiomodulation نهج علاجي موسع مبتكرة محتملة لتحسين الاستقلاب الدماغ، وظيفة المخ في طائفة واسعة من الاضطرابات العصبية والنفسية، وتعزيز الذاكرة في انخفاض المعرفية المتعلقة بالسن وأمراض الأعصاب. يمكننا وصف بروتوكول مختبر للعلاج photobiomodulation transcranial (ببمت) في الفئران. العمر بالب/ج الفئران (18 شهرا) تعامل مع 660 نانومتر ليزر ترانسكرانيالي، مرة واحدة يوميا لمدة أسبوعين. وتبين البيانات منافذه الليزر أن حوالي 1% الضوء الأحمر الحادث في فروة الرأس تصل إلى عمق 1 مم من سطح القشرية، اختراق الحصين الظهرية. يتم تقييم نتائج العلاج بطريقتين: بارنز المتاهة الاختبار الذي تقييم مهمة الحصين-تعتمد على التعلم والذاكرة مكانية، وقياس مستويات ATP هيبوكامبال، الذي يستخدم كمؤشر الاستقلاب. إظهار النتائج من مهمة بارنز تعزيزا للذاكرة المكانية في الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين المعالجة بالليزر بالمقارنة مع العمر مطابقة عناصر التحكم. تحليل الكيمياء الحيوية بعد العلاج بالليزر يشير إلى زيادة هيبوكامبال ATP. نحن مسلمة أن تحسين أداء الذاكرة يحتمل أن تكون نتيجة لحدوث تحسن في التمثيل الغذائي هيبوكامبال الطاقة الناجمة عن العلاج بالليزر الأحمر. ويمكن تمديد الملاحظات في الفئران إلى نماذج حيوانية أخرى منذ هذا البروتوكول يمكن أن يحتمل أن يمكن تكييفه مع الأنواع الأخرى المستخدمة بكثرة في علم الأعصاب متعدية الجنسيات، مثل الأرنب أو القط أو الكلب أو القرد. فوتوبيومودوليشن Transcranial هو طريقة آمنة وفعالة من حيث التكلفة التي قد يكون نهج علاجية واعدة في الإعاقة المعرفية المتعلقة بالسن.
Introduction
ببمت، أو العلاج بالليزر منخفض المستوى الضوء (للت)، هو مصطلح عام يشير إلى الأساليب العلاجية استناداً إلى تحفيز الأنسجة البيولوجية بالطاقة الضوئية من أشعة الليزر أو الضوء – ينبعث الثنائيات (LEDs). يتم تطبيق تقريبا جميع ببمت العلاج مع الأحمر بالقرب من الأشعة تحت الحمراء (الجرد) الضوء عند أطوال موجية من 600 إلى 1100 نانومتر، إنتاج طاقة تتراوح من 1 إلى 500 ميغاواط، وفلوينس تتراوح < 1 إلى > 20 ي/سم2 (انظر تشونغ et al.1).
ببمت Transcranial هو أسلوب تسليم خفيفة موسع يجري تشعيع الرأس باستخدام مصدر ضوء خارجي (الليزر أو المصابيح)2. للتطبيقات الحيوانية، ويتضمن هذا الأسلوب الاتصال أو التنسيب noncontact المسبار الصمام أو ليزر على رأس الحيوان. تبعاً لمنطقة الفائدة العلاجية، يمكن وضع مجس ضوء أما على الرأس كله (لتغطي جميع مجالات الدماغ) أو على جزء محدد من الرأس، مثل منطقة بريفرونتال أو أمامي أو الجدارية. نقل جزئي للضوء الأحمر/الجرد عن طريق فروة الرأس، الجمجمة، والأم الجافية يمكن أن تصل إلى مستوى السطح القشرية وتوفير كمية من الطاقة فوتون كافية لإنتاج الفوائد العلاجية. في وقت لاحق، أن نشر فلوينس الخفيفة تم تسليمها على مستوى القشرية في المسألة الدماغ الأبيض والرمادي حتى تصل إلى أعمق هياكل الدماغ3.
الضوء في النطاقات الطيفية في الأحمر لمنطقة استعملنا (600-680 nm) ونير المبكر (800 870 nm) يناظر طيف امتصاص الفسفرة التأكسدية، الإنزيم الطرفي من سلسلة التنفس المتقدرية4. هو الافتراض بأن ببمت في الطيف الأحمر/الجرد يسبب فوتوديسوسييشن أكسيد النيتريك (لا) من الفسفرة التأكسدية، أدى إلى زيادات في الميتوكوندريا الإلكترون النقل، وفي نهاية المطاف، زيادة توليد ATP5. فيما يتعلق بتطبيقات الخلايا العصبية، نيوروستيمولاتوري الفوائد المحتملة للدماغ ببمت استخدام التشعيع transcranial أبلغ الأساليب في مجموعة متنوعة من الدراسات السريرية، بما في ذلك نماذج القوارض من الدماغ إصابة (تبي)6، السكتة الدماغية الحادة7ومرض الزهايمر (AD)8، ومرض باركنسون (PD)9، والاكتئاب10، والشيخوخة11.
وتعتبر الشيخوخة الدماغ شرط العصبية التي تؤثر تأثيراً سلبيا على بعض الوظائف المعرفية، مثل التعلم والذاكرة12. الميتوكوندريا هي العضيات الرئيسية المسؤولة عن إنتاج ATP والاستقلاب العصبية. ومن المعروف خلل mitochondrial مرتبطة بالعجز المرتبطة بالسن في مناطق الدماغ التي ترتبط بالذاكرة التنقل المكاني، مثل الحصين13. لأن العلاج الجمجمة مع الأحمر/الجرد الضوء أساسا من الأفعال بتحوير الاستقلاب المتقدرية، يمكن أن يؤدي كافية الجرعة الخفيفة تم تسليمها إلى الحصين في تحسين الذاكرة المكانية نتائج14.
وهدف البروتوكول الحالي إظهار الإجراء ببمت transcranial في الفئران، باستخدام مستويات منخفضة من الضوء الأحمر. ويرد وصف القياسات نقل الضوء الليزر المطلوبة من خلال أنسجة الرأس من الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين. بالإضافة إلى ذلك، المتاهة بارنز، كتعلم تعتمد على الحصين مكانية والذاكرة المهمة، ومستويات ATP هيبوكامبال، كمؤشر الاستقلاب، وتستخدم لتقييم تأثير العلاج في الحيوانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الإجراءات نفذت وفقا للدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية "معاهد الصحة الوطنية" (المعاهد الوطنية للصحة؛ تنقيح المنشور رقم 85-23، 1985) وأقرته لجنة الأخلاقيات الإقليمية من تبريز جامعة للعلوم الطبية.
تنبيه: هذا البروتوكول يتضمن تطبيق فئة 3B الليزر الصكوك وسوف تتطلب التدريب السليم والالتزام بإرشادات السلامة. فئة 3B أشعة الليزر يمكن أن يلحق بها ضررا بالغا العيون، ويمكن تسخين الجلد. ولا تعتبر فئة 3B الليزر خطرا على حرق. يجب ارتداء نظارات حماية العين في جميع الأوقات عند تشغيل جهاز الليزر.
1-ليزر تجارب نقل الضوء
ملاحظة: يستخدم هنا كان عمره 18 شهرا ثلاثة ذكور الفئران بالب/ج الحصول من مرفق الحيوان من تبريز جامعة للعلوم الطبية. ليزر 60 ميغاواط (660 نانومتر) مع شعاع دائري الشكل من 2.5 ملم في القطر كمصدر الضوء. مصدر الليزر ينتج ضوء مستقطب دائريا مع ملف تعريف كثافة ضبابي وهو يعمل في وضع موجات مستمرة. مقياس طاقة الضوئي تجارية مع قرار nW 10 ومنطقة نشطة الضوئي2 مربع 1 سم، ونطاق استجابة طيفية من 400 إلى 1100 نانومتر يستخدم لقياس قوة الضوء المنقولة عن طريق العينات.
-
إعداد نموذج
- من أجل الحصول على عينات جديدة، تخدير عميق الماوس مع خليط من الكيتامين (100 مغ/كغ) وإكسيلازيني (10 مغ/كغ).
- تشريح الرأس للماوس مع المقص المنتظمة، بدءاً من نقطة تقع فوق الأكتاف.
- استدارة الرأس حيث أن يواجه الجانب البطني من الفك. الشريحة مقص تشريح الزاوية بسلاسة من خلال تجويف الفم حتى هي لاحظت مقاومة مفرق الفك السفلي. قطع جميع عضلات كبيرة تربط بين عظم الفك السفلي للجمجمة وتجاهلها.
- إزالة العظام حنكي، استخدام مقص تشريح الزاوية.
- تجاهل جميع اللحم المحيطة الجمجمة، واستخدام الملقط منحنية.
- تشريح الجزء السفلي من الجمجمة، ومن ثم، بعناية اتخاذ الدماغ من عظم الجمجمة المتبقية، مع ملعقة منحنية.
- إصلاح أنسجة المخ سليمة في 2% [اغروس] هلام حيث ستكون مناسبة لتشريح الأنسجة.
ملاحظة: بغية الحصول جمجمة سليمة بالإضافة إلى فروة الرأس عينة، أنسجة المخ يجب إزالة من الجانب البطني للرأس للحيوان دون أي ضرر على الجزء الظهرية للرأس.
-
الدماغ التقطيع الداخلي
- انتشار قطره superglue (~0.05 مل) على السطح لمنع تصاعد فيبرتوم.
- عناية إرفاق الكتلة [اغروس] فيبرتوم تصاعد كتلة حيث يكون السطح البطني للدماغ فاسيدوون، وتعديل موقفها.
- قليلاً مباراة فيبرتوم النصل إلى السطح العلوي من الكتلة [اغروس] وسجل القيمة كتر كمستوى التعليم الابتدائي.
- ملء خزان فيبرتوم مع المحلول الملحي العادي المثلج.
- ضبط معلمات فيبرتوم (مثلاً، شريحة سمك [1 مم]، وسرعة [5 5 على جهاز وحدة]، وتواتر الاهتزاز [5 5 على جهاز وحدة]) للحصول على تشريح مرضية.
- قطع المخ العرض إلى شريحة مع سمك 1,000 ميكرومتر.
ملاحظة: الشريحة هي جزء أنسجة المخ محدد بواسطة سطح القشرية وطائرة في وضع أدنى من السطح القشرية (الحصين الظهرية) 1,000 ميكرومتر. - أضف قطره من الماء (~0.05 مل) على سطح الزجاج البصري ووضع شريحة الدماغ على أعلى من ذلك. ثم إضافة قطره من الماء على الدماغ شريحة ووضع بعناية على الزجاج البصري الثانية على أعلى من ذلك.
ملاحظة: تضاف قطره الماء إلى حدود الزجاج عينة منعا لتجفيف الأنسجة وتناثر من الأسطح الخام الخفيف.
-
قياس نقل الضوء من خلال أنسجة الرأس
- قم بإعداد المعدات البصرية، بما في ذلك جهاز الليزر، مما يعكس مرايا، ووحدة عداد الطاقة.
تنبيه: وضعت على نظارات واقية العين قبل تشغيل الليزر. - نظراً لغياب عينة على مقياس الطاقة، قم بتشغيل جهاز الليزر وتركيز شعاع الليزر على النسخة المتطابقة التي تقع على مسافة مناسبة لتوجيه شعاع عمودي على الضوئي منطقة نشطة.
ملاحظة: يجب إجراء قياسات نقل الضوء في غرفة مظلمة في درجة حرارة الغرفة (23-25 درجة مئوية)، خلال 30 دقيقة بعد أن تم استخراج أنسجة الرأس. - إجراء قياسات على أنسجة المخ شرائح.
- ضع النظارات البصرية فارغة اثنين على سطح مقياس الطاقة.
- قراءة السلطة الخفيفة المنقولة (أنا0) من مقياس الطاقة عرض الشاشة وسجل القيمة.
- بلطف ضع العينة الدماغ، التي تشمل باثنين من النظارات البصرية، على سطح مقياس الطاقة وتركيز الشعاع على الأنسجة منطقة كل منها، قراءة السلطة المنقولة، وسجل القيمة.
- إجراء القياسات في الجمجمة بالإضافة إلى فروة الرأس.
- ضع زجاج بصري فارغة على سطح مقياس الطاقة.
- قراءة السلطة الخفيفة المنقولة (أنا0) من مقياس الطاقة عرض الشاشة وسجل القيمة.
- طفيفة مكان زجاج بصري مع جمجمة جديدة بالإضافة إلى فروة الرأس الأنسجة على سطح مقياس الطاقة وتطابق شعاع الضوء على منطقة بريجما وقراءة السلطة المنقولة وسجل القيمة.
- من أجل تعظيم نسبة الإشارة إلى الضجيج، كرر قياس نقل الضوء على الأقل 3 x لجميع العينات.
ملاحظة: يتم وضعها في منطقة بريجما في روسترال إلى خط مرسوم من خلال قاعدة الأمامي في آذان 3 مم تقريبا. سمك الأنسجة الجمجمة بالإضافة إلى فروة الرأس يقاس قدمه ذات الورنيّة قياسية.
- قم بإعداد المعدات البصرية، بما في ذلك جهاز الليزر، مما يعكس مرايا، ووحدة عداد الطاقة.
2-العلاج فوتوبيومودوليشن (ببمت)
ملاحظة: استخدمت خمسة وأربعون من ذكور الفئران بالب/ج المعينة لثلاث مجموعات من الفئران 15 كل. المجموعات التي تتألف من الشباب لمكافحة الفئران (2 أشهر من العمر) التي تلقت شام-ببمت، سن لمكافحة الفئران (18 شهرا) التي تلقت شام-ببمت، والمسنين-ببمت الفئران (18 شهرا) التي تلقت ببمت. علاج ببمت الشام تتكون من معاملة مماثلة ببمت المجموعة ولكن مع الليزر غير نشط. فئران تم الحصول عليها من مرفق الحيوان من تبريز جامعة للعلوم الطبية، ويقيمون في الحيوان عقد الوحدة من مركز أبحاث علوم الأعصاب (يجب) في 24-25 درجة مئوية ونسبة 55% من الرطوبة النسبية، مع الضوء ح 12 وكبيرة مظلمة ح 12. تم توفير الغذاء والمياه libitum الإعلانية. كانت أقلمة جميع الفئران لمدة أسبوع واحد على الأقل قبل العلاج.
-
الليزر العلاج الداخلي
ملاحظة: استخدمت ليزر صمام ثنائي جالس مع وضع موجات مستمرة في الطول الموجي نانومتر 660 transcranial ببمت العلاج. تم تشغيل جهاز الليزر إنتاج طاقة من 200 ± 2 ميغاواط والإشعاع 6.66 ث/سم2، مع حجم بقعة من 0.03 سم2. تم تسليمها فلوينس متوسط 99.9 ي/سم2 في كل دورة إلى سطح فروة الرأس لمدة 15 ثانية التشعيع. التشعيع كانت تدار 1 x يوميا لمدة أسبوعين على التوالي.- جلب الفئران في اقفاصها المنزل إلى غرفة العلاج، حوالي 20 دقيقة قبل البدء في العلاج.
- قم بتوصيل حامي كهربائية مقبس الحائط.
- إدراج المكونات جهاز ليزر حامي كهربائية.
- تغطية غيض مسبار الليزر مع فيلم نايلون شفافة بغية منع أي خدش على السطح.
- بعناية قم بتوصيل المجس قناة جهاز الليزر.
- قم بتشغيل جهاز الليزر وانتظر بضع ثوان للاحماء.
- ضبط المعلمات/العلاج بالليزر، بما في ذلك وضع الوقت وعملية التشعيع.
- في غياب أي عينات، تحدد قوة الليزر متوسط عن طريق الاتصال غيض التحقيق إلى منطقة نشطة من مقياس الطاقة على جهاز الليزر. سجل القيمة.
- كرر عملية المعايرة (الخطوة 2.1.8) على الأقل 5 س، قراءة صلاحيات الحادث من عداد الطاقة لعرض الشاشة، وتسجيل القيم.
- بلطف اضغط ماوس بالجلد الظهرية من الرقبة للحيوان في كف اليد وشل برأسه.
ملاحظة: في البروتوكول الحالي، يتم وضع مسبار الليزر في منطقة بريجما، وملم ~ 3 روسترال بخط بين القاعدة الداخلية للاذنين. - طفيفة مكان غيض التحقيق مباشرة في فروة الرأس في خط الوسط، روسترال إلى خط مرسوم من خلال قاعدة الأمامي في آذان 3 مم تقريبا.
ملاحظة: إجراء التحقيق في حوالي 45° زاوية لطائرة البطن. - تفاديا للإشعاع المباشر لعيون الحيوان، أول اتصال غيض التحقيق على رأسه، وثم قم بتشغيل على جهاز الليزر.
- قم بتشغيل الليزر وثابت إجراء التحقيق حتى انتهاء التشعيع.
- بعد انتهاء العلاج، سحب مسبار الليزر من الرأس والعودة بلطف الماوس إلى قفصة.
- إيقاف تشغيل الجهاز الليزر وقطع المسبار من الجهاز.
- تنظيف مسبار الليزر مع نظافة بصرية مناسبة.
- نقل الفئران إلى مرفق الحيوان.
3-السلوكية المهام
-
فتح حقل تجارب
- تقييم الحركي النشاط لكل ماوس من المسافة الإجمالية سافر أثناء إجراء اختبار حقل مفتوح، كما هو موضح مسبقاً15.
-
مهمة المتاهة بارنز
-
جهاز
ملاحظة: يتم تنفيذ مهمة التعلم والذاكرة المكانية في متاهة بارنز16. جهاز يستخدم لهذه المهمة السلوك العصبي ويتكون من منصة دائرية مصنوعة من الخشب الأسود (95 سم في القطر) مع 20 مسافة واحدة، 5 سم-قطر دائري الثقوب الموجودة على النظام الأساسي أو 3 سم من المحيط. الجهاز ارتفاع 50 سم من الكلمة لمنع الحيوان من التسلق إلى أسفل. مربع هروب بلاستيك أسود منقولة (20 سم × 15 سم × 5 سم) يوضع تحت الحفرة الهروب. متاهة أسود يستخدم لاختبار الفئران البيضاء، وحصيرة أسود ينبغي أن توضع تحت المتاهة عندما يتم استخدام برمجيات تتبع النظام.- ضع جهاز المتاهة، في وسط الغرفة هادئة مع الإضاءة الساطعة في النفقات العامة.
- ضع علامة على "عدم دخول" خارج باب الغرفة المهمة.
- إرفاق منبهات البصرية-المكانية على الجدران المحيطة.
- ضع كاميرا فيديو رقمية فوق منصة المتاهة.
- تنظيف سطح منصة المتاهة مع الإيثانول 70% لإزالة الإشارات حاسة الشم غير المرغوب فيها.
- إضافة كمية صغيرة من الفراش من قفص الحيوان المنزلية إلى داخل مربع الهروب بمثابة جديلة حاسة الشم.
-
دورة التكيف
- جعل الماوس كل دقيقة الغرفة ما يقرب من 30 مهمة قبل بداية التجربة، من أجل الماوس لتصبح اعتادوا.
- إزالة الماوس من قفصة ومكان الحيوان برفق في المربع الهروب لمدة 1 دقيقة.
-
دورة تدريبية
ملاحظة: يتم تكرار الدورة التدريبية لكل الماوس على 4 أيام متتالية.- إزالة الماوس من مربع الهروب بلطف.
- ضع الماوس في وسط الساحة؛ ثم، ضع الدائرة ابدأ على رأس الماوس.
- إزالة الدائرة ابدأ بعد 10 ثانية، والسماح بالماوس لاستكشاف الساحة لمدة 3 دقائق.
- حرك بهدوء إلى مجال الكمبيوتر ووضعت على سماعات إلغاء الضوضاء.
- يؤدي حافز سمعي سلبية تتكون من ضجيج أبيض مرتفع حوالي 80 ديسيبل على المستوى الأساسي والبدء في التصوير بالفيديو الماوس.
- إيقاف الضوضاء البيضاء وإيقاف تسجيل الفيديو عند إدخال الماوس مربع الهروب. تسمح للحيوان أن يبقى دون عائق في المربع ل 1 دقيقة.
- إزالة الماوس من مربع الهروب ووضعه مرة أخرى في قفصة.
- كرر الخطوات 3.4.2 من خلال رقم 3.4.7 x 4 يوميا، مع فترات 3 دقيقة بين التجارب المتكررة.
ملاحظة: بين جميع المحاكمات، إزالة أي البول أو البراز من على سطح الساحة وتنظيف المتاهة مع الإيثانول 70%.
-
التحقيق في جلسة المحاكمة
- عقب المحاكمة التدريب الأخير، إزالة 24 ساعة في وقت لاحق، مربع الهروب من منصة المتاهة وكرر الخطوات 3.4.2 عن طريق 3.4.5.
- وبعد 3 دقائق، إيقاف الضجيج الأبيض والتوقف عن التصوير بالفيديو. إزالة الماوس من الساحة المتاهة ووضعه مرة أخرى في قفصة.
- بعد أن تم اختبار جميع الحيوانات، تنظيف منصة المتاهة والدائرة ابدأ. إطفاء الأنوار الغرفة وإزالة علامة "عدم دخول" من الباب.
- تخزين تسجيلات الفيديو من دورات الاختبار إلى محرك قرص الثابت خارجي لمزيد من التحليل.
- قم بإعداد برنامج التعقب بالفيديو واستخراج معلمات الفائدة من أشرطة الفيديو المسجلة، بما في ذلك وقت الكمون لإيجاد ثقب الهدف خلال 4 أيام دورات التدريب والوقت ينفق في رباعي المستهدفة خلال جلسة المحاكمة التحقيق.
-
جهاز
4-التقييم الكيمياء الحيوية
-
مستويات ATP في الحصين
- تخدير عميق كل الفأرة مع حقن داخل خليط من الكيتامين (ملغ 100 جرام من وزن الجسم) وإكسيلازيني (ملغ 10 جرام من وزن الجسم).
- قطع رأس الحيوان وسرعة إزالة أنسجة المخ من الجمجمة.
- تشريح خارجاً الحصين ومجانسة الأنسجة في عينة المثلج المخزن المؤقت (المقدمة من المجموعة) مع الخالطون أنسجة.
- فورا الطرد المركزي هوموجيناتي في 2,000 س ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
- نقل المادة طافية إلى أنبوب نظيفة.
- تقييم مستويات ATP هيبوكامبال، في سبيكتروفوتوميتريك باستخدام الأسلوب كما هو موضح سابقا11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التحليلات الإحصائية
وقد تم تحليل التحليل الإحصائي للبيانات التي تم الحصول عليها من الدورات التدريبية بارنز باتجاهين ANOVA؛ أجريت الاختبارات السلوكية وتحليل مستويات ATP هيبوكامبال بين المجموعات الأخرى من قبل ANOVA أحادي الاتجاه، تليها الاختبار في توكي المخصص بعد. جميع البيانات يتم التعبير عن وسيلة ± الخطأ المعياري للوسط (SEM)، باستثناء البيانات نقل الليزر، والتي تظهر بشكل يعني ± الانحراف المعياري (SD). تم تعيين مستوى الأهمية في ف < 0.05.
نقل الضوء الليزر
ضوء الليزر (660 نانومتر) انتقال العدوى عن طريق الأنسجة الجمجمة بالإضافة إلى فروة الرأس (مع سماكة عينة 0.85 ± 0.09 ملم) من الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين كان ± 15.67% 0.87 في المائة عند شعاع ليزر وتركز على بريجما (الشكل 1). استناداً إلى هذا النقل الخفيفة، نظراً فلوينس الأولى على سطح فروة الرأس 99.9 ي/سم2 (6.66 [ث/سم2] × 15 [s])، يمكن أن يقدر أن فلوينس تقريبي 16 ي/سم2 وصلت إلى السطح القشرية.
منافذه الليزر، من خلال شريحة 1 مم من أنسجة المخ أعمارهم، كان 10، 10% ± 0.95 في المائة (الشكل 1). من هذه القيم، يمكن أن تقدر أن فلوينس الخفيفة قد انخفض من 16 ي/سم2 على مستوى الأنسجة قشرة الدماغ إلى حوالي 1.6 ي/سم2 على عمق 1 مم من سطح القشرية.
اختبار حقل مفتوح
كانت هناك لا فروق يعتد بها إحصائيا في النشاط الحركي في اختبار حقل مفتوح بين جميع المجموعات التجريبية (الشكل 2).
مهمة المتاهة بارنز
عندما تم تحليل الكمون الهروب خلال 4 أيام من التدريب ومع المجموعات التجريبية خلال مهمة المتاهة بارنز، ANOVA ثنائي الاتجاه كشف آثار هامة اليوم (ف < 0.001) ومجموعة (ف < 0.001)، ولكن ليس المجموعة x يوم (p = 0.47). تحليل انترجروب للبيانات أظهرت أن أوقات الكمون للمسنين لمراقبة الحيوانات أطول كثيرا من أولئك الشباب لمراقبة الفريق الثالث (ف < 0.01) والرابع (ف < 0.001) أيام من الدورة التدريبية. بيد أن أوقات الكمون الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين ببمت معاملة كانت أقصر بكثير في اليوم الرابع (ف < 0.05)، مقارنة مع الفئران لمراقبة المسنين (ف < 0.01) (الشكل 3). في جلسة المحاكمة المسبار، أمضى الفئران المسنين لمراقبة أوقات أقصر بكثير في رباعي المستهدفة، بالمقارنة مع الشباب لمكافحة الفئران (ف < 0.01). بيد ببمت معاملة تتراوح أعمارهم بين الفئران أمضى أوقات أطول بشكل ملحوظ في رباعي المستهدفة مقارنة بالمسنين لمكافحة الفئران (ف < 0.05) (الشكل 4).
هيبوكامبال ATP مستويات
وقد سن لمكافحة الفئران انخفاضا كبيرا في مستويات ATP هيبوكامبال، مقارنة مع الشباب لمكافحة الفئران (ف < 0.05). ومع ذلك، كانت محتويات ATP يعني في قرن آمون الفئران المسنين-ببمت أكبر بكثير من مثيلاتها في الفئران لمراقبة المسنين (ف < 0.05) (الشكل 5).
الشكل 1 : بيانات نقل الضوء من خلال الجمجمة بالإضافة إلى فروة الرأس وأنسجة المخ بالليزر- يتم التعبير عن البيانات كما يعني ± التنمية المستدامة التنمية المستدامة. = الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : بيانات النشاط الحركي من test. فتح مجال البيانات يتم التعبير عنها ك ± يعني sem. ببمت = فوتوبيومودوليشن العلاج؛ SEM = الخطأ المعياري للوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : الهروب الكمون لمجموعات الفئران خلال 4 أيام دورات التدريب- تمثل القيم ± يعني sem. * *ف < 0.01 و * * *ف < 0.001، مقارنة مع الشباب لمكافحة الفئران. # ف < 0.05، مقارنة مع الفئران السيطرة على المسنين. ببمت = فوتوبيومودوليشن العلاج؛ SEM = الخطأ المعياري للوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : الوقت المستغرق في رباعي المستهدفة في جلسة التحقيق، في مجموعات مختلفة- وتمثل القيم ± يعني sem. * *ف < 0.01، بالمقارنة مع الشباب لمكافحة الفئران. # ف < 0.05، مقارنة مع الفئران السيطرة على المسنين. ببمت = فوتوبيومودوليشن العلاج؛ SEM = الخطأ المعياري للوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : محتويات ATP في الأنسجة الحصين. وتمثل القيم ± يعني sem. *ف < 0.05، مقارنة مع الشباب لمكافحة الفئران. # ف < 0.05، مقارنة مع الفئران السيطرة على المسنين. ببمت = فوتوبيومودوليشن العلاج؛ SEM = الخطأ المعياري للوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكننا وصف بروتوكول للقيام بإجراء ببمت transcranial في الفئران. هذا البروتوكول هو موجهة خصيصا لمختبرات علم الأعصاب تؤدي البحوث فوتوبيومودوليشن التي ركزت على القوارض. ومع ذلك، يمكن تكييفها هذا البروتوكول للحيوانات المختبرية الأخرى التي تستخدم بشكل متكرر في مجال علم الأعصاب، مثل الأرنب أو القط أو الكلب أو القرد.
وهناك حاليا اهتماما متزايداً بالتحقيق transcranial ببمت مع الليزر الأحمر/الجرد والمصابيح. من أجل النجاح في تنفيذ إجراءات العلاج الكامل في القوارض، وهناك بضع خطوات أساسية للنظر.
أولاً، من الأهمية بمكان، قبل محاولة أي علاجات في الحيوانات الحية، تغلغل الضوء تحديداً يقاس من خلال أنسجة الرأس الحيوانية بغية الوفاء جرعة مثلى فوتون (J/سم2).
ثانيا، استناداً إلى أي مناطق الدماغ هي المتأثرة بالأمراض والمستهدفة للعلاج، تحتاج إلى العديد من المعلمات الأمثل، وأقصى حد اختراق الضوء وزيادة احتمال وقوع نتائج إيجابية. وتشمل هذه المرة التشعيع والفاصل الزمني للعلاج والإشعاع المطبقة وفلوينس. على سبيل المثال، في نماذج حيوانية أعمارهم، من المهم تقديم جرعة إشعاع كافية إلى الدماغ قرن آمون والقشرة الأمامية لهذه المناطق ترتبط بالأمراض المرتبطة بالسن2. معدل فلوينس أمثل في الأنسجة المستهدفة عامل هام آخر في ببمت. معظم الباحثين بحث العوامل التي تؤثر على نقل الضوء ولكن كثيرا ما تهمل النظر في وجود استجابة ثنائية الطور في الأنسجة المستهدفة الدماغ ليس فقط فلوينس (J/سم2) ولكن أيضا لمعدل تنفيذ فلوينس. وبعبارة أخرى، فلوينس 1 ي/سم2 تسليم أكثر من 1 دقيقة لا يعادل 1 ي/سم2 تسليم ما يزيد على 1 s17،18.
وهناك العديد من العوامل الإضافية التي يجب أن تعتبر أيضا قبل تنفيذ دراسات ببمت transcranial. ببمت Transcranial في القوارض يتم عادة تطبيق استخدام الليزر أو المصابيح تحقيقات مع حجم تلميح مسبار تحجيمها إلى حجم الدماغ للحيوان. للتطبيق في القوارض، الليزر طاقة متوسطة (مع إنتاج طاقة من ≤ 500 ميغاواط) يمكن تسليم كمية كبيرة من الطاقة الضوئية في فترة زمنية قصيرة وتقليل وقت المعالجة والمتعلقة بمعالجة الإجهاد للحيوان. على الرغم من أن لم يكن لديك فئة 3B الليزر آثار photothermal كبيرة في نطاقات جرعة ببمت (دي تو زيرو ي/سم2)، تبريد سطح فروة الرأس بمادة بصرية شفافة، مثل الجليد أو هلام، ينصح أثناء تطبيق transcranial.
وفي بعض الدراسات التجريبية transcranial ببمت، يستخدم الألياف الضوئية بدلاً من الليزر أو LED التحقيق، نظراً لمزاياها للإشعاع لمنطقة صغيرة محددة على رأسه. للمثال، تركيز السكتة الدماغية، تبي، ونماذج PD، تشعيع دقيقة للمنطقة المتضررة ما يبرره. بيد أن الألياف الضوئية عموما من منطقة شعاع صغير، حتى هذا سيؤثر على المبلغ الإجمالي للطاقة الموردة في دورة واحدة، وسيحتاج الباحثون تكرار الإجراء في بقعة واحدة أو أكثر للتعويض عن انخفاض المنطقة. دراسات ببمت transcranial الأكثر تجريبية، تجري تشعيع الرأس في الحيوان التنبيه، أونانيسثيتيزيد. ضمانا لاستقرار الحيوان، يوصي بعقد رئيس اليدوي واستخدام أجهزة ضبط النفس. في عقد يدوياً الأسلوب، يرجع ذلك إلى حقيقة أن هذا الحيوان قد نقل فجأة وربما الابتعاد برأسه منطقة الإشعاع، قد يضيع جزء من الضوء المشع. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يؤدي إلى إجهاد إضافي للحيوان كلا الأسلوبين ويمكن أن تكون عاملاً من عوامل الخلط محتملة. وفي بعض الحالات، يتم تنفيذ الإجراء التشعيع في حيوان أنيسثيتيزيد. تجدر الإشارة إلى أن الكثير من التخدير يمكن أن يؤثر سلبا على نتائج تجريبية في دراسات علم الأعصاب. ولذلك، فاصل زمني أقصر تشعيع وينبغي أن ينظر بعناية في هذه الأنواع من التجارب.
في هذه الدراسة، قمنا أولاً بقياس انتقال الضوء من خلال الجمجمة بالإضافة إلى سن فروة الرأس للذكور بالب/ج الفئران لتحديد مبلغ 660 nm طاقة الليزر التي وصلت إلى السطح القشرية. أشارت النتائج إلى أن 16% الضوء الأولى على سطح فروة الرأس أونشافيد كان ينتقل عن طريق الدماغ. وقد أظهرت بيانات الإرسال من مختبرات أخرى في الفئران الذكور بالب/ج أن 1.2 في المائة فقط من 670 نانومتر الليزر قادرة على اختراق الجمجمة سليمة19. وأفيد أيضا أن حوالي 90% من 670 نانومتر الصمام الخفيفة هو تخفيف داخل الجمجمة الماوس20.
وأكد الجرعة الفعالة نيوروستيمولاتوري من الليزر الأحمر على مستوى الأنسجة القشرية في دراسة سابقة أجريت في المختبر لدينا11. أظهرنا أن فلوينس القشرية يومية الليزر2 سم ي/8 في 660 nm آثار بروكوجنيتيفي في ماوس الشيخوخة نموذج11. في قسم العلاج من الدراسة الحالية، تقديم حوالي 16 ي/سم2 إلى السطح القشرية، وإننا بحاجة إلى ترك الليزر على 15 s، والذي كان يسمح بالفئران. في هذا العمل، نحن أيضا قياس قوة الضوء الواردة على السطح الحصين. استناداً إلى نتائج هذه التجربة، وتم قياس قيمة تقريبية بنسبة 10% بالليزر منافذه عبر شريحة 1 مم من المخ أعمارهم، تناظر فلوينس خفيفة لما يقرب من 1.6 ي/سم2 تصل إلى 1 مم العميقة من السطح القشرية. كشفت بيانات من دراسات أخرى استخدام الدماغ الماوس بالب/ج تخفيض 65% من 670 نانومتر الصمام ضوء كثافة عبر كل ملليمتر من الأنسجة الدماغية21. كما تبين أن حوالي 2.5% من 670 نانومتر الصمام الخفيفة تصل إلى عمق في أنسجة المخ 5 مم، المسافة من سطح الجمجمة إلى المنطقة الرمادية في الدماغ المكتنزة (SNc)22.
الحصين دور الكاردينال في توطيد الذاكرة المكانية23. وفي الواقع، قدرة الاستقلاب هيبوكامبال يرتبط بالذاكرة المكانية التنقل والتعلم. وتوحي النتائج المعروضة هنا أن جرعة خفيفة من حوالي 1.6 ي/سم2 على مستوى قرن آمون يمكن أن تكون كافية لإنتاج تحسين نتائج الذاكرة المكانية في الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين. فإنه يمكن أن يفترض أنه يمكن تحسين أداء الذاكرة في المهمة المعرفي السلوكي (المتاهة بارنز) نظراً لتحسن الأيض الطاقة هيبوكامبال التي يبدو أن يتسبب بليزر أحمر على موجه محددة من 660 نانومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
المرتب P.C. لتدعمها إدارة الطب النفسي جامعة هارفارد (زمالة ارن دوبون وجائزة ليفينغستون)، الدماغ و "مؤسسة أبحاث السلوك" (جائزة المحقق الشاب نارساد)، وشركة فوتوثيرا غير مقيد منحة. وجاء التبرع بالمخدرات من تيفا. وجاء رد السفر من فارماسيا وآبجون. تلقت P.C. رسوم التشاور من يانسن للبحث والتنمية. وقد قدم P.C. العديد من براءات الاختراع المتعلقة باستخدام الضوء القريبة من الأشعة تحت الحمراء في الطب النفسي. فوتوميديكس، وشركة إمداد الأجهزة الأربعة لدراسة سريرية. وقد تلقي P.C. التمويل غير المقيد من شركة ليتيكوري إجراء دراسة بشأن photobiomodulation transcranial لعلاج اضطرابات الاكتئاب الرئيسية وإجراء دراسة بشأن مواضيع صحية. P.C. تأسيسه شركة (نركس الضوء المداواة) وركزت على تطوير طرائق جديدة للمعاملة القائمة على ضوء القريبة من الأشعة تحت الحمراء؛ وأيضا خبير استشاري للشركة نفسها. P.C. تلقت تمويلاً من "العلوم الدماغية" إجراء دراسة بشأن photobiomodulation transcranial لاضطراب القلق العام. مؤلفين آخرين قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.
Acknowledgments
يؤيد هذا العمل بمنحه من تبريز جامعة للعلوم الطبية (منح رقم 61019) إلى س. س.-هاء ومنحة منشور من ليتيكوري LLC، نيوآرك، دي، الولايات المتحدة الأمريكية إلى L.D.T. الكتاب يود أن يشكر إدارة علم المناعة ومركز تطوير التعليم (EDC) من تبريز جامعة للعلوم الطبية على مساعدتهم الطيبة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Alfasan | #1608234-01 | |
| Xylazine | Alfasan | #1608238-01 | |
| Agarose | Sigma | #A4679 | |
| Superglue | Quickstar | ||
| Vibratome | Campden Instruments | #MA752-707 | |
| Optical glass | Sail Brand | #7102 | |
| Power meter | Thor labs | #PM100D | |
| Photodiode detector | Thor labs | #S121C | |
| Caliper | Pittsburgh | ||
| GaAlAs laser | Thor Photomedicine | ||
| Etho Vision | Noldus | ||
| Centrifuge | Froilabo | #SW14R | |
| Earmuffs | Blue Eagle | ||
| Digital camera | Visionlite | #VCS2-E742H | |
| Sterio amplifier | Sony | ||
| Ethanol | Hamonteb | #665.128321 | |
| Barnes maze | Costom-made | ||
| ATP assay kit | Sigma | #MAK190 | |
| Elisa reader | Awareness | #Stat Fax 2100 |
References
- Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of Biomedical Engineering. 40 (2), 516-533 (2012).
- Salehpour, F., et al. Brain Photobiomodulation Therapy: a Narrative Review. Molecular Neurobiology. , 1-36 (2018).
- Hamblin, M. R. Shining light on the head: photobiomodulation for brain disorders. BBA Clinical. 6, 113-124 (2016).
- Karu, T. I., Pyatibrat, L. V., Kolyakov, S. F., Afanasyeva, N. I. Absorption measurements of a cell monolayer relevant to phototherapy: reduction of cytochrome c oxidase under near IR radiation. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 81 (2), 98-106 (2005).
- de Freitas, L. F., Hamblin, M. R. Proposed mechanisms of photobiomodulation or low-level light therapy. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 22 (3), 348-364 (2016).
- Xuan, W., Vatansever, F., Huang, L., Hamblin, M. R. Transcranial low-level laser therapy enhances learning, memory, and neuroprogenitor cells after traumatic brain injury in mice. Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 108003 (2014).
- DeTaboada, L., et al. Transcranial application of low-energy laser irradiation improves neurological deficits in rats following acute stroke. Lasers in Surgery and Medicine: The Official Journal of the American Society for Laser Medicine and Surgery. 38 (1), 70-73 (2006).
- De Taboada, L., et al. Transcranial laser therapy attenuates amyloid-β peptide neuropathology in amyloid-β protein precursor transgenic mice. Journal of Alzheimer’s Disease. 23 (3), 521-535 (2011).
- Oueslati, A., et al. Photobiomodulation suppresses alpha-synuclein-induced toxicity in an AAV-based rat genetic model of Parkinson’s disease. PloS One. 10 (10), e0140880 (2015).
- Xu, Z., et al. Low-level laser irradiation improves depression-like behaviors in mice. Molecular Neurobiology. 54 (6), 4551-4559 (2017).
- Salehpour, F., et al. Transcranial low-level laser therapy improves brain mitochondrial function and cognitive impairment in D-galactose–induced aging mice. Neurobiology of Aging. 58, 140-150 (2017).
- Grady, C. The cognitive neuroscience of ageing. Nature Reviews Neuroscience. 13 (7), 491 (2012).
- Beal, M. F. Mitochondria take center stage in aging and neurodegeneration. Annals of Neurology. Official Journal of the American Neurological Association and the Child Neurology Society. 58 (4), 495-505 (2005).
- Lu, Y., et al. Low-level laser therapy for beta amyloid toxicity in rat hippocampus. Neurobiology of Aging. 49, 165-182 (2017).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. C. Use of the open field maze to measure locomotor and anxiety-like behavior in mice. Journal of Visualized Experiments. (96), e52434 (2015).
- Rosenfeld, C. S., Ferguson, S. A. Barnes maze testing strategies with small and large rodent models. Journal of Visualized Experiments. (84), e51194 (2014).
- Huang, Y. Y., Chen, A. C. H., Carroll, J. D., Hamblin, M. R. Biphasic dose response in low level light therapy. Dose Response. 7 (4), 358-383 (2009).
- Mohammed, H. S. Transcranial low-level infrared laser irradiation ameliorates depression induced by reserpine in rats. Lasers in Medical Science. 31 (8), 1651-1656 (2016).
- Zhang, Y., Zhang, C., Zhong, X., Zhu, D. Quantitative evaluation of SOCS-induced optical clearing efficiency of skull. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 5 (1), 136 (2015).
- Shaw, V. E., et al. Neuroprotection of midbrain dopaminergic cells in MPTP-treated mice after near-infrared light treatment. Journal of Comparative Neurology. 518 (1), 25-40 (2010).
- Moro, C., et al. Photobiomodulation inside the brain: a novel method of applying near-infrared light intracranially and its impact on dopaminergic cell survival in MPTP-treated mice. Journal of Neurosurgery. 120 (3), 670-683 (2014).
- Reinhart, F., et al. The behavioural and neuroprotective outcomes when 670 nm and 810 nm near infrared light are applied together in MPTP-treated mice. Neuroscience Research. 117, 42-47 (2017).
- Sadowski, M., et al. Amyloid-β deposition is associated with decreased hippocampal glucose metabolism and spatial memory impairment in APP/PS1 mice. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 63 (5), 418-428 (2004).
