Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Een Protocol voor transcraniale Photobiomodulation therapie bij muizen

Published: November 18, 2018 doi: 10.3791/59076
Automatic Translation
1,2, 3, 4,5,6, 1, 1, 7, 8,9,10, 1
1Neurosciences Research Center, Tabriz University of Medical Sciences, 2ProNeuroLIGHT LLC, 3LiteCure LLC, 4Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 5Depression Clinical and Research Program, Department of Psychiatry, Massachusetts General Hospital, 6Center for Anxiety and Traumatic Stress Disorders, Department of Psychiatry, Massachusetts General Hospital, 7Research Institute for Applied Physics and Astronomy, University of Tabriz, 8Department of Medical Physics, Tabriz University of Medical Sciences, 9Department of Medical Bioengineering, Tabriz University of Medical Sciences, 10School of Medical Sciences, University of Aberdeen

Summary

Photobiomodulation therapie is een innovatieve noninvasive modaliteit voor de behandeling van een breed scala van neurologische en psychiatrische aandoeningen en ook gezonde hersenfunctie kan verbeteren. Dit protocol bevat een stapsgewijze handleiding voor het uitvoeren van hersenen photobiomodulation in muizen door transcraniale lichte levering, die aangepast voor gebruik in andere laboratorium-knaagdieren worden kan.

Abstract

Transcraniële photobiomodulation is een potentiële noninvasive innovatieve therapeutische benadering voor de verbetering van de hersenen Bioenergetica, hersenfunctie in een breed scala van neurologische en psychiatrische aandoeningen en geheugenuitbreiding in leeftijd gerelateerde cognitieve achteruitgang en neurodegeneratieve ziekten. We beschrijven een laboratorium protocol voor transcraniale photobiomodulation therapie (PBMT) in muizen. Leeftijd BALB/c muizen (18 maanden oud) worden behandeld met een 660 nm laser transcranially, eenmaal daags gedurende 2 weken. Laser doorlating gegevens blijkt dat ongeveer 1% van het invallende licht rood op de hoofdhuid een 1 mm diepte van de corticale oppervlak, dringen de dorsale hippocampus bereikt. Resultaten van de behandeling worden beoordeeld op twee manieren: een Barnes doolhof test, die is een zeepaardje-afhankelijke ruimtelijke leren en geheugen taak evaluatie, en meet hippocampal ATP-niveaus, die wordt gebruikt als een Bioenergetica-index. De resultaten van de Barnes taak blijkt een verbetering van het ruimtelijke geheugen in laser behandeld leeftijd muizen in vergelijking met leeftijd-matched controles. Biochemische analyse na laserbehandeling geeft aan verhoogde hippocampal ATP niveaus. We postuleren dat de verhoging van de prestaties van het geheugen mogelijk te wijten aan een verbetering van de hippocampal energiemetabolisme geïnduceerd door de rode laserbehandeling is. De opmerkingen in muizen kunnen worden uitgebreid tot andere diermodellen, aangezien dit protocol konden potentieel worden aangepast aan andere soorten die vaak worden gebruikt voor translationele neurowetenschappen, zoals konijn, kat, hond of aap. Transcraniële photobiomodulation is een veilig en kostenefficiënt modaliteit die een veelbelovende therapeutische benadering in leeftijd gerelateerde cognitieve stoornissen wellicht.

Introduction

PBMT of laag niveau laser licht therapie (LLLT), is een algemene term die naar therapeutische methoden gebaseerd op het stimuleren van biologische weefsels van lichtenergie van lasers of lichtgevende dioden (LEDs verwijst). Bijna alle PBMT behandelingen worden toegepast met rood (NIR) nabij-infrarood licht bij golflengten van 600 tot 1100 nm, een vermogen variërend van 1 tot 500 mW en een fluentie variërend van < 1 tot > 20 J/cm2 (Zie Chung et al.1).

Transcranial PBMT is een noninvasive lichte leveringsmethode die is uitgevoerd door bestraling van het hoofd met behulp van een externe lichtbron (laser of LED's)2. Voor dierlijke toepassingen omvat deze methode contact of noncontact plaatsing van de LED of laser sonde op kop van het dier. Afhankelijk van de therapeutische regio van belang, kan een lichte sonde worden geplaatst over het hele hoofd (voor de dekking van alle hersengebieden) of over een specifiek gedeelte van het hoofd, zoals de prefrontale, pariëtale of frontale regio. De gedeeltelijke overdracht van rood/NIR licht via de hoofdhuid, de schedel, en de dura mater kunt bereiken de corticale oppervlakteniveau en een hoeveelheid energie volstaat om therapeutische voordelen bieden. De geleverde lichte fluentie corticale niveau zou vervolgens worden doorgegeven in de hersenen van de grijze en witte materie, totdat zij de diepere structuren van de hersenen-3 tot.

Licht in de spectrale banden in het rood tot far-red (600-680 nm) en vroege NIR regio (800-870 nm) komt overeen met het absorptiespectrum van cytochroom c oxidase, het terminal enzym van de mitochondriale respiratoire ketting4. Het is dat er PBMT in het rood/NIR-spectrum fotolyse van stikstofmonoxide (NO) van cytochroom c oxidase veroorzaakt, resulterend in een verhoging mitochondriaal elektronentransport en, uiteindelijk, verhoogd ATP generatie5hypothetische. Met betrekking tot de neuronale toepassingen, de potentiële voordelen van de neurostimulatory van brain PBMT met behulp van Transcraniële bestraling methoden zijn gemeld in een verscheidenheid van preklinische studies, met inbegrip van knaagdier modellen van traumatische brain injury (TBI)6, acute beroerte7, de ziekte van Alzheimer (AD)8, Parkinson's disease (PD)9, depressie10en veroudering11.

Veroudering van de hersenen wordt beschouwd als een neuropsychologische aandoening die negatief sommige cognitieve functies, zoals leren en geheugen12 beïnvloedt. Mitochondriën zijn de primaire organellen die verantwoordelijk is voor de productie van ATP en neuronale Bioenergetica. Mitochondriale dysfunctie is bekend dat gepaard gaan met leeftijdsgebonden tekorten in de hersengebieden die zijn gekoppeld aan ruimtelijke navigatie geheugen, zoals de hippocampus13. Omdat craniale behandeling met rood/NIR licht vooral handelingen door de modulatie van de mitochondriale Bioenergetica, voldoende geleverde lichte dosering aan de hippocampus kan leiden tot de verbetering van de ruimtelijke geheugen resultaten14.

Het doel van het huidige protocol is om de procedure PBMT transcranial in muizen, met lage niveaus van rood licht te demonstreren. De vereiste laser lichttransmissie metingen via de hoofd weefsels van leeftijd muizen worden beschreven. Daarnaast Barnes doolhof, als een zeepaardje-afhankelijke ruimtelijke leren en geheugen taak, en de hippocampal ATP niveaus, als een Bioenergetica-index, worden gebruikt voor een evaluatie van het effect van de behandeling van dieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren van het National Institutes of Health (NIH; Publicatie nr. 85-23, herziene versie van 1985) en goedgekeurd door de regionale ethische commissie van Tabriz Universiteit van medische wetenschappen.

Let op: Dit protocol omvat de toepassing van klasse 3B laser instrumenten en vergt goede opleiding en aanhankelijkheid aan veiligheidsrichtlijnen. Klasse 3B Laser kunnen ernstige schade aan de ogen en de huid kunnen verhitten. Klasse 3B lasers worden niet beschouwd als een gevaar voor branden. Oog bescherming bril moeten worden gedragen te allen tijde wanneer de laser toestel bedienen.

1. laser lichttransmissie experimenten

Opmerking: Gebruikt hier zijn drie 18-maand-oude mannelijke BALB/c muizen verkregen van het dier faciliteit van Tabriz Universiteit van medische wetenschappen. Een 60 mW laser (660 nm) met een cirkelvormige lichtbundel vorm van 2,5 mm diameter wordt gebruikt als de lichtbron. De laserbron produceert een circulair gepolariseerd licht met een intensiteit van de Gauss-profiel en wordt beheerd in de continuous wave modus. Een commerciële fotodiode Energiemeter met een resolutie van 10 nW, een vierkante 1 cm2 fotodiode actief gebied en een bereik van de spectrale respons van 400 tot 1100 nm wordt gebruikt voor het meten van de doorvallend licht macht door middel van de monsters.

  1. Bereiding van de monsters
    1. Met het oog op een verse monsters, diep anesthetize de muis met een mengsel van ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg).
    2. Ontleden van de muis hoofd met een gewone schaar, vanaf het punt vlak boven de schouders.
    3. Draai het hoofd zo dat de ventrale zijde van de kaak omhoog gezichten. Schuif schuine dissectie schaar soepel door de mondholte tot de weerstand van de mandibulaire junction is opgemerkt. Knip alle grote spieren, het bot van de onderkaak met de schedel verbinden en deze verwijderen.
    4. Verwijder de Palatijnse botten, met behulp van schuine dissectie schaar.
    5. Gooi alle vlees rondom de schedel, met behulp van gebogen pincet.
    6. Ontleden van het onderste gedeelte van de schedel, en dan zorgvuldig het nemen van de hersenen uit het resterende bot van de schedel, met een gebogen spatel.
    7. Corrigeer de intact hersenweefsel in een 2% agarose gel zodat het weefsel geschikt voor het snijden zijn zal.
      Opmerking: Om het verkrijgen van een intact schedel plus hoofdhuid monster, het hersenweefsel moet worden verwijderd uit de ventrale zijde van het hoofd van het dier zonder enige schade aan het dorsale gedeelte van het hoofd.
  2. Hersenen snijden procedure
    1. Een druppel lijm (~0.05 mL) verspreid op het oppervlak van de montage blok van vibratome.
    2. Zorgvuldig hechten van het agarose blok aan de vibratome montage blok, zodat het ventrale oppervlak van de hersenen naar beneden, en haar positie aanpassen.
    3. Iets overeenkomen met het blad van de vibratome aan de bovenkant van het blok agarose en opnemen van de cutter waarde als het primaire niveau.
    4. Vul de tank vibratome met ijskoude normale zoutoplossing.
    5. Aanpassen van de parameters van de vibratome (bijvoorbeeld het segment dikte [1 mm] snelheid [5 van 5 op apparaat eenheid] en vibratie frequentie [5 van 5 op apparaat eenheid]) om te verkrijgen bevredigend snijden.
    6. Snijd de hersenen dwars in een segment met een dikte van 1.000 µm.
      Opmerking: Het segment is het gedeelte van het hersenweefsel begrensd door de corticale oppervlak en een vliegtuig gepositioneerd 1.000 µm inferieur aan de corticale oppervlak (de dorsale hippocampus).
    7. Voeg een druppel water (~0.05 mL) op het oppervlak optisch glas en zet van het segment van de hersenen op de top van het. Daarna, voeg een druppel water on the brain slice en zorgvuldig plaats de tweede optisch glas op de top van het.
      Opmerking: Een druppel water moet worden toegevoegd aan de steekproef glas grenzen om weefsel drogen en licht verstrooiing van ruwe oppervlakken te voorkomen.
  3. Meting van de lichtdoorlating via de hoofd weefsels
    1. Instellen van de optische apparatuur, met inbegrip van de laser, als gevolg van spiegels en aggregaat meter.
      Let op: Zet op beschermende eye bril vóór het inschakelen van de laser.
    2. Bij het ontbreken van een monster op de Energiemeter, schakel het apparaat laser en richten de laserstraal op de mirror die is gelegen op de juiste afstand voor de begeleiding van de lichtbundel loodrecht op de fotodiode het actieve gebied.
      Opmerking: Lichttransmissie metingen moeten worden verricht in een donkere kamer bij kamertemperatuur (23-25 ° C), binnen 30 minuten nadat de hoofd weefsels zijn uitgepakt.
    3. Metingen op de gesneden hersenweefsel uitvoeren.
      1. Plaats twee lege inzetglazen op het oppervlak van de Energiemeter.
      2. Lees de doorvallend licht macht (ik0) van de Energiemeter scherm weergeven en opnemen van de waarde.
      3. Zachtjes plaatsen van het monster van de hersenen, die is omsloten door twee optische glazen, op het oppervlak van de Energiemeter, richten van de straal op de respectieve gebied van het weefsel, lees de uitgezonden kracht en opnemen de waarde.
    4. Uitvoeren van metingen op de schedel plus de hoofdhuid.
      1. Plaats een lege optisch glas op het oppervlak van de Energiemeter.
      2. Lees de doorvallend licht macht (ik0) van de Energiemeter scherm weergeven en opnemen van de waarde.
      3. Licht plaats een optisch glas met verse schedel plus hoofdhuid weefsel op het oppervlak van de Energiemeter, overeenkomen met de lichtbundel op de bregma zone, lees de uitgezonden kracht en opnemen van de waarde.
      4. Om te maximaliseren de signal-to-noise verhouding, herhaal de meting van de lichtdoorlating minstens 3 x voor alle monsters.
        Opmerking: De bregma-zone ligt in een ongeveer 3 mm rostraal van een lijn via de voorste voet van de oren. De dikte van het weefsel schedel plus hoofdhuid wordt gemeten door een standaard remklauw.

2. Photobiomodulation therapie (PBMT)

Opmerking: Vijfenveertig mannelijke muizen van de BALB/c toegewezen aan drie groepen van elk 15 muizen werden gebruikt. De groepen zijn samengesteld uit jonge-control muizen (2 maanden oud) die sham-PBMT, ontvangen leeftijd-control muizen (18 maanden oud) die ontvangen sham-PBMT en leeftijd-PBMT muizen (18 maanden oud), die PBMT ontvangen. De sham-PBMT behandeling bestond uit behandeling identiek aan de PBMT groep, maar met de laser inactief. Muizen zijn verkregen van het dier faciliteit van Tabriz Universiteit van medische wetenschappen en gehuisvest waren in het dier houden van eenheid van de neurowetenschappen Research Center (sinds) op 24-25 ° C en 55% relatieve vochtigheid, met een 12 uur licht en 12 uur donker fotoperiode. Voedsel en water werden ad libitumverstrekt. Alle muizen werden geacclimatiseerd voor ten minste 1 week vóór de behandeling.

  1. Laser behandeling procedure
    Opmerking: Een diodelaser GaAlAs met continuous wave modus bij 660 nm golflengte werd gebruikt voor transcraniale PBMT behandeling. De laser-apparaat werd geopereerd op een uitgangsvermogen van 200 ± 2 mW en een bestralingssterkte van 6.66 W/cm2, met een plek grootte van 0.03 cm2. Een gemiddelde fluentie van 99,9 J/cm2 per elke sessie werd geleverd aan de oppervlakte van de hoofdhuid voor 15 s van bestraling. De bestraling werd door de overheid gereguleerde 1 x daags gedurende 2 opeenvolgende weken.
    1. Breng de muizen in hun huis kooien aan de therapie kamer, ongeveer 20 min voorafgaand aan het begin van de behandeling.
    2. Een elektrische beschermer sluit aan op het stopcontact.
    3. Stop de laser apparaat stekker in een elektrische beschermer.
    4. Betrekking hebben op het uiteinde van de sonde van de laser met een transparante nylon film om te voorkomen dat eventuele krassen op het oppervlak.
    5. Sluit zorgvuldig de sonde naar het kanaal van de laser-apparaat.
    6. Schakel het apparaat laser en wacht een paar seconden voor het om op te warmen.
    7. De laserbehandeling/parameters, waaronder de bestraling tijd en operatie-modus aanpassen.
    8. Bij het ontbreken van monsters, bepalen het gemiddeld vermogen van laser door contact met het uiteinde van de sonde naar het actieve gebied van de Energiemeter op de laser-apparaat. Record de waarde.
    9. Herhaal het kalibratieproces (stap 2.1.8) minstens 5 x, lees het incident krachten uit de Energiemeter scherm weergeven en opnemen van de waarden.
    10. Zachtjes Houd een muis door de dorsale huid van de nek van het dier in de palm van een hand en zijn hoofd te immobiliseren.
      Opmerking: In het huidige protocol, de laser-sonde is geplaatst op de bregma-zone, die is van ~ 3 mm rostraal van een lijn tussen de interne basis van de oren.
    11. Licht plaats het uiteinde van de sonde rechtstreeks op de hoofdhuid op de middellijn, ongeveer 3 mm rostraal van een lijn via de voorste voet van de oren.
      Opmerking: Houd de sonde in een hoek van ongeveer 45° op het vlak van de buik.
    12. Om te voorkomen dat directe bestraling voor de ogen van het dier, eerst contact opnemen met het uiteinde van de sonde op het hoofd en, vervolgens, schakel het apparaat laser.
    13. Zet de laser en stabiel houden van de sonde tot aan de beëindiging van de bestraling.
    14. Na het einde van de therapie, de laser-sonde uit het hoofd terugtrekken en de muis voorzichtig terug te keren naar zijn kooi.
    15. De laser-apparaat uitschakelen en de sonde te verbreken van het apparaat.
    16. Reinig de sonde van de laser met een passende optische reiniger.
    17. De muizen overbrengen in het dier faciliteit.

3. gedrags taken

  1. Open-veld test
    1. Beoordelen van de motorische activiteit van elke muis door de totale afgelegde tijdens een open-veld test, als eerder beschreven15.
  2. Barnes doolhof taak
    1. Apparaat
      Opmerking: De ruimtelijke taak voor leren en geheugen wordt uitgevoerd in een Barnes doolhof16. De apparatuur die wordt gebruikt voor deze taak neuro bestaat uit een cirkelvormig platform gemaakt van zwart hout (95 cm in diameter) met 20 equidistante, 5 cm-diameter ronde gaten die zich op het platform, 3 cm van de omtrek bevinden. Het apparaat is verhoogde 50 cm van de vloer om te voorkomen dat het dier naar beneden klimmen. Een beweegbare zwarte kunststof ontsnappen doos (20 x 15 cm x 5 cm) wordt geplaatst onder het gat ontsnappen. Een zwarte doolhof wordt gebruikt voor het testen van witte muizen, en een zwarte mat moet worden geplaatst onder het labyrint, wanneer een tracking systeem software wordt gebruikt.
      1. Plaats het apparaat van de doolhof in het midden van een rustige kamer met felle overhead verlichting.
      2. Plaats een "Niet openen" teken op de buitenkant van de deur van de kamer taak.
      3. Sluit de visual-spatial cues aan de ommuring.
      4. Plaatst een digitale videocamera boven de doolhof-platform.
      5. Reinig het oppervlak van het platform van de doolhof met 70% ethanol te verwijderen van ongewenste olfactorische signalen.
      6. Voeg een kleine hoeveelheid beddengoed uit de kooi van het dier aan de binnenkant van de doos ontsnappen om te dienen als een olfactorische cue.
    2. Aanpassing sessie
      1. Breng elke muis aan de taak kamer ongeveer 30 min voorafgaand aan het begin van het experiment, om de muis te worden gewend.
      2. Verwijder de muis uit haar kooi en voorzichtig Schakel het dier in escape voor 1 min.
    3. Trainingssessie
      Opmerking: De trainingssessie wordt herhaald voor elke muis op 4 opeenvolgende dagen.
      1. Verwijder voorzichtig de muis uit het vak ontsnappen.
      2. Plaats de muis in het midden van de arena; de start kamer bovenop de muis dan te plaatsen.
      3. De start kamer verwijderen na 10 s, en laat de muis om te verkennen van de arena gedurende 3 minuten.
      4. Rustig naar de computerzaal en put op lawaai-annulerende hoofdtelefoons te verplaatsen.
      5. Leiden tot een negatieve auditieve stimulus die bestaat uit een luide ruis voor ongeveer 80 dB op het niveau van het platform en beginnen de muis video-opnamen.
      6. Uitschakelen van de witte ruis en stoppen van video-opnamen wanneer de muis het ontsnappen vak invoert. Laat de dieren ongestoord blijven in het vak voor 1 min.
      7. Verwijder de muis uit het vak ontsnappen en plaats het terug in zijn kooi.
      8. Herhaal stap 3.4.2 via 3.4.7 4 x per dag, met 3 min interval tussen herhaalde proeven.
        Opmerking: Tussen alle proeven, verwijderen van urine of ontlasting van het oppervlak van de arena en reinig de doolhof met 70% ethanol.
    4. Sonde proef sessie
      1. Na de laatste opleiding proef, 24 h later verwijderen het vak ontsnappen uit het doolhof platform en herhaal stap 3.4.2 via 3.4.5.
      2. Na 3 min, schakelt u de witte ruis en stoppen van video-opnamen. Verwijder de muis uit de doolhof-arena en plaats het terug in zijn kooi.
      3. Nadat alle dieren zijn getest, reinig de doolhof-platform en de start kamer. Uitschakelen van de kamer lichten en verwijder het "Niet openen"-teken uit de deur.
      4. De video-opnames van de test sessies naar een externe harde schijf voor verdere analyse worden opgeslagen.
      5. De video-tracking softwareprogramma en extract de parameters van de belangstelling van de opgenomen video's, met inbegrip van de latentie tijd te vinden de doelstelling gat gedurende 4 dagen van trainingen en de tijd in het kwadrant doel tijdens de sonde proef sessie doorgebracht instellen.

4. biochemische beoordeling

  1. ATP niveaus in de hippocampus
    1. Diep anesthetize elke muis met een intraperitoneale injectie van een mengsel van ketamine (100 mg per gram lichaamsgewicht) en xylazine (10 mg per gram lichaamsgewicht).
    2. Decapitate van het dier en snel het verwijderen van het hersenweefsel van de schedel.
    3. Ontleden uit de hippocampus en meng het weefsel in ijskoud sample buffer (geleverd door de kit) met een homogenizer weefsel.
    4. Centrifugeer onmiddellijk het homogenaat bij 2.000 x g gedurende 3 min bij 4 ° C.
    5. Het supernatant overbrengen in een schone buis.
    6. Beoordelen van de hippocampal ATP-niveaus, met behulp van de spectrofotometrische methode zoals eerder beschreven11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Statistische analyses

De statistische analyse van de gegevens die zijn verkregen uit de trainingen Barnes werd geanalyseerd door two-way ANOVA; de andere gedrags proeven en analyse van hippocampal ATP niveaus tussen groepen werden uitgevoerd door one-way ANOVA, gevolgd door de Tukey post hoc test. Alle gegevens zijn uitgedrukt betekent ± de standaardfout van het gemiddelde (SEM), met uitzondering van de laser-transmissie gegevens, die worden weergegeven als middel van ± de standaarddeviatie (SD). Het significantieniveau op basis werd vastgesteld op p < 0.05.

Laser lichttransmissie

Het laserlicht (660 nm) transmissie via de schedel plus hoofdhuid weefsel (met een dikte van het monster van 0,85 ± 0.09 mm) van de leeftijd muizen was 15.67% ± 0,87% toen een laserstraal was gericht op de bregma (Figuur 1). Gebaseerd op deze lichttransmissie, sinds de eerste fluentie op het oppervlak van de hoofdhuid was 99,9 J/cm2 (6,66 [W/cm2] x 15 [s]), kan worden geschat dat een geschatte fluentie van 16 J/cm2 de corticale oppervlak bereikt.

De laser doorlating, via een 1 mm segment van leeftijd hersenweefsel, was 10.10% ± 0,95% (Figuur 1). Van deze waarden kan worden geschat dat de lichte fluentie van 16 J/cm2 op de hersenschors weefsel niveau tot ongeveer 1.6 J/cm2 op een diepte van 1 mm van de corticale oppervlak daalde.

Open veldtest

Er waren geen statistisch significante verschillen in motorische activiteit in de open-veld test onder alle experimentele groepen (Figuur 2).

Barnes doolhof taak

Wanneer de ontsnapping latentie werd geanalyseerd tijdens de 4 dagen van opleiding en met experimentele groepen tijdens de taak van de doolhof Barnes, een two-way ANOVA bleek significante effecten van dag (p < 0.001) en groep (p < 0.001), maar niet groep x dag (p = 0,47). Een interfractiewerkgroep analyse van de gegevens bleek dat de tijden van de latentie van de leeftijd-controledieren aanzienlijk langer dan die van de jonge-controlegroep op de derde (p < 0,01) en vierde (p < 0.001) dagen voor de trainingssessie waren. De tijden van de latentie van de PBMT behandelde leeftijd muizen waren echter aanzienlijk korter op de vierde dag (p < 0,05), vergeleken met de leeftijd-control muizen (p < 0,01) (Figuur 3). In de sonde proef sessie bracht leeftijd-control muizen aanzienlijk kortere tijden in het doel-Kwadrant, vergeleken met de jonge-control muizen (p < 0,01). Echter de PBMT behandelde leeftijd muizen bracht aanzienlijk langere tijden in het kwadrant van de doelstelling ten opzichte van leeftijd-control muizen (p < 0,05) (Figuur 4).

Hippocampal ATP niveaus

De leeftijd-control muizen hadden een significante afname in hippocampal ATP niveaus, in vergelijking met jonge-control muizen (p < 0,05). De gemiddelde inhoud van de ATP in de hippocampus van de leeftijd-PBMT muizen waren echter aanzienlijk groter zijn dan die in de leeftijd-control muizen (p < 0,05) (Figuur 5).

Figure 1
Figuur 1 : Laser lichttransmissie gegevens via de schedel plus hoofdhuid en het hersenweefsel. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. SD = standaardafwijking. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Motorische activiteitsgegevens van de open-veld test Gegevens worden uitgedrukt als de gemiddelde ± SEM. PBMT = photobiomodulation therapie; SEM = standaardafwijking van het gemiddelde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Ontsnappen latentie voor muizen groepen tijdens de 4 dagen van trainingssessies. Waarden vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM. **p < 0.01 en ***p < 0.001, vergeleken met de jonge-control muizen. # p < 0,05, vergeleken met de leeftijd-control muizen. PBMT = photobiomodulation therapie; SEM = standaardafwijking van het gemiddelde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Tijd doorgebracht in het doel-Kwadrant in de sonde sessie, in verschillende groepen. Waarden vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM. **p < 0,01, vergeleken met de jonge-control muizen. # p < 0,05, vergeleken met de leeftijd-control muizen. PBMT = photobiomodulation therapie; SEM = standaardafwijking van het gemiddelde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : ATP inhoud in het weefsel van de hippocampus. Waarden vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM. *p < 0,05, vergeleken met de jonge-control muizen. # p < 0,05, vergeleken met de leeftijd-control muizen. PBMT = photobiomodulation therapie; SEM = standaardafwijking van het gemiddelde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Beschrijven we een protocol voor het uitvoeren van een transcraniale PBMT procedure in muizen. Dit protocol is specifiek gericht op neurowetenschap laboratoria die onderzoek van photobiomodulation gericht op knaagdieren. Dit protocol kan echter worden aangepast aan andere proefdieren die vaak op het gebied van de neurowetenschappen, zoals konijn, kat, hond of aap gebruikt worden.

Momenteel is er een toegenomen belangstelling voor onderzoek naar transcraniale PBMT met rood/NIR lasers en LED's. Om met succes de hele behandeling procedure bij knaagdieren uit te voeren, zijn er een paar essentiële stappen te overwegen.

Ten eerste is het essentieel dat, voordat u probeert de eventuele behandelingen in levende dieren, de lichte penetratie precies via de dierlijke hoofd weefsels gemeten is teneinde te komen tot een optimale foton dosering (J/cm2).

Ten tweede, op basis van welke hersengebieden zijn getroffen door pathologie en die voor de behandeling wordt gericht, verschillende parameters moeten worden geoptimaliseerd, maximaliseren van lichte penetratie en verhoogt de kans op positieve resultaten. Het gaat hierbij om bestraling tijd, behandeling interval, toegepaste bestralingssterkte en fluentie. Bijvoorbeeld, in de leeftijd diermodellen is het van cruciaal belang om een voldoende stralingsdosis te leveren aan de hersenen hippocampus en de frontale cortex, omdat deze regio's zijn gekoppeld aan de leeftijd gerelateerde pathologieën2. Een optimale fluentie percentage in onderzoeken weefsels is een andere belangrijke factor in de PBMT. De meeste onderzoekers bespreken factoren die van invloed zijn op lichtdoorlatendheid maar vaak verwaarlozing te overwegen dat een tweefase reactie in hersenen onderzoeken weefsels niet alleen voor fluentie (J/cm2), maar ook voor het tempo van de fluentie levering bestaat. Met andere woorden, is een fluentie 1 J/cm,2 meer dan 1 min geleverd niet gelijk aan 1 J/cm2 geleverd van meer dan 1 s17,18.

Er zijn verschillende bijkomende factoren die u ook overwegen moeten voordat transcraniale PBMT studies wordt uitgevoerd. Transcranial PBMT in knaagdieren wordt vaak toegepast met behulp van laser of LEDs sondes met de sonde tip grootte geschaald naar de grootte van de hersenen van het dier. Voor toepassing in knaagdieren, matig-vermogen lasers (met een vermogen van niet meer dan 500 mW) kunnen leveren van een grote hoeveelheid lichtenergie in een korte tijd en zowel behandeltijd en behandeling-gerelateerde stress verminderen aan het dier. Hoewel Klasse 3B lasers hebben geen significante photothermal effecten in PBMT dosering bereiken (≤20 J/cm2), wordt de oppervlakte van de hoofdhuid met een transparante optische stof, zoals ijs of gel, koeling aangeraden tijdens transcraniale toepassing.

In sommige experimentele transcraniale PBMT studies, wordt optische vezel gebruikt in plaats van een laser of LED sonde, vanwege zijn voordelen voor doorstraling van een specifieke klein gebied op het hoofd. Voor bijvoorbeeld in focal ischemische beroerte, TBI, en PD modellen, een nauwkeurige bestraling van het beschadigde gedeelte gerechtvaardigd is. Optische vezels in het algemeen wel een kleine bundel gebied, dus dit zal invloed hebben op de totale hoeveelheid energie geleverd in één sessie en onderzoekers te herhalen van de procedure in meer dan één vlek ter compensatie van de verminderde ruimte vergt. In de meest experimentele transcraniale PBMT studies, wordt bestraling van het hoofd uitgevoerd in het alert, unanesthetized dier. Met het oog op een dierlijke stabiliteit, worden handmatige hoofd bedrijf en het gebruik van terughoudendheid apparaten aanbevolen. In de handmatig holding methode, te wijten aan het feit dat dat dier plotseling kan verplaatsen en eventueel afgestapt van zijn hoofd de bestraling zone, een deel van bestraalde licht kan worden verspild. Bovendien, beide methoden kunnen induceren extra stress bij het dier en zou een potentiële storende factor. In sommige gevallen, wordt de procedure van de bestraling uitgevoerd in een narcose dier. Opgemerkt moet worden dat teveel verdoving nadelig de experimentele resultaten in onderzoek neurowetenschap beïnvloeden kan. Daarom moet een korter interval voor de bestraling zorgvuldig worden overwogen in dit soort experimenten.

In de huidige studie, we eerst de transmissie van licht via de schedel gemeten plus scalp van mannelijke BALB/c leeftijd muizen om te bepalen van het bedrag van 660 nm laser energie die bereikt de corticale oppervlak. De resultaten aangegeven dat 16% van het eerste licht op het oppervlak van de unshaved hoofdhuid door naar de hersenen werd overgebracht. Transmissie gegevens van andere laboratoria in mannelijke BALB/c muizen hebben aangetoond dat slechts 1,2% van 670 nm laserlicht kon penetreren de intacte schedel19. Het is ook gemeld dat ongeveer 90% van 670 nm LED licht binnen de muis schedel20is verzwakt.

De dosering van de effectieve neurostimulatory van de rode laser op het niveau van de corticale weefsel werd bevestigd in een eerdere studie uitgevoerd in ons laboratorium11. We toonden dat een dagelijkse corticale fluentie van een 8 J/cm2 laser op 660 nm heeft procognitive effecten in een muis veroudering model11. In de sectie van de therapie van de huidige studie, om ongeveer 16 J/cm2 aan de corticale oppervlakte, we moesten verlaten van de laser op voor 15 s, die werd getolereerd door de muizen. In het huidige werk, we ook de lichte kracht ontvangen aan het oppervlak van de hippocampus gemeten. Op basis van de resultaten van het experiment, een geschatte waarde van 10% werd gemeten als laser doorlating via een 1 mm segment van leeftijd hersenen, overeenkomt met een lichte fluentie voor ongeveer 1.6 J/cm2 1 mm diep van de corticale oppervlak bereiken. Gegevens uit andere studies met behulp van de BALB/c muis hersenen is gebleken dat een verlaging van 670 nm lichtsterkte van de LED 65% over elke millimeter van cerebrale weefsel21. Het heeft ook aangetoond dat ongeveer 2,5% van 670 nm LED licht een diepte in het hersenweefsel van 5 mm, de afstand van het oppervlak van de schedel tot de substantia nigra compacta (SNc) gebied22 bereikt.

De hippocampus speelt een kardinale rol bij de consolidatie van ruimtelijke geheugen23. In feite, is de capaciteit van de hippocampal Bioenergetica geassocieerd met ruimtelijke navigatie geheugen en leren. De hier gepresenteerde bevindingen suggereren dat een lichte dosering van ongeveer 1.6 J/cm2 op het niveau van de hippocampus volstaat om een verbetering van de ruimtelijke geheugen resultaten in leeftijd muizen zou kunnen zijn. Er kan van worden uitgegaan dat een verhoging van de prestaties van het geheugen in de gedragstherapeutisch taak (Barnes doolhof) wijten zijn aan een verbetering van de hippocampal energiemetabolisme dat lijkt te kan te worden veroorzaakt door een rode laser met een specifieke golflengte van 660 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

P.C. van salaris werd gesteund door de Harvard psychiatrie afdeling (Dupont-Warren Fellowship en Livingston Award), de hersenen en gedrag Research Foundation (NARSAD Young Investigator Award), en door de Photothera Inc onbeperkt subsidie. De drug-donatie kwam van TEVA. Reizen vergoeding vandaan Pharmacia-Upjohn. P.C. heeft overleg vergoedingen ontvangen van Janssen onderzoek en ontwikkeling. P.C. heeft octrooien verschillende gerelateerd aan het gebruik van het nabij-infrarood licht in de psychiatrie. PhotoMedex, Inc. geleverde vier apparaten voor een klinische studie. P.C. heeft onbeperkte financiering ontvangen van Litecure Inc. aan een onderzoek op transcraniale photobiomodulation voor de behandeling van grote depressieve stoornissen en een onderzoek op gezonde proefpersonen te verrichten. P.C. samen een bedrijf (Niraxx licht Therapeutics) gericht op de ontwikkeling van nieuwe modaliteiten van behandeling op basis van nabij-infrarood licht; Hij is ook een consultant voor hetzelfde bedrijf. P.C. financiering ontvangen van cerebrale wetenschappen aan een onderzoek op transcraniale photobiomodulation voor gegeneraliseerde angststoornis. De andere auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door een subsidie uit de Tabriz Universiteit van medische wetenschappen (verlenen nr. 61019) met S.S.-E. en een subsidie van de publicatie van LiteCure LLC, Newark, DE, Verenigde Staten L.D.T. De auteurs bedank de afdeling van de immunologie en onderwijs ontwikkeling centrum (EDC) van Tabriz Universiteit van medische wetenschappen voor hun vriendelijke hulp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Alfasan #1608234-01
Xylazine Alfasan #1608238-01
Agarose Sigma #A4679
Superglue Quickstar
Vibratome Campden Instruments #MA752-707
Optical glass Sail Brand #7102
Power meter Thor labs #PM100D
Photodiode detector Thor labs #S121C
Caliper Pittsburgh
GaAlAs laser Thor Photomedicine
Etho Vision Noldus
Centrifuge Froilabo #SW14R
Earmuffs Blue Eagle
Digital camera Visionlite #VCS2-E742H
Sterio amplifier Sony
Ethanol Hamonteb #665.128321
Barnes maze Costom-made
ATP assay kit Sigma #MAK190
Elisa reader Awareness #Stat Fax 2100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of Biomedical Engineering. 40 (2), 516-533 (2012).
  2. Salehpour, F., et al. Brain Photobiomodulation Therapy: a Narrative Review. Molecular Neurobiology. , 1-36 (2018).
  3. Hamblin, M. R. Shining light on the head: photobiomodulation for brain disorders. BBA Clinical. 6, 113-124 (2016).
  4. Karu, T. I., Pyatibrat, L. V., Kolyakov, S. F., Afanasyeva, N. I. Absorption measurements of a cell monolayer relevant to phototherapy: reduction of cytochrome c oxidase under near IR radiation. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 81 (2), 98-106 (2005).
  5. de Freitas, L. F., Hamblin, M. R. Proposed mechanisms of photobiomodulation or low-level light therapy. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 22 (3), 348-364 (2016).
  6. Xuan, W., Vatansever, F., Huang, L., Hamblin, M. R. Transcranial low-level laser therapy enhances learning, memory, and neuroprogenitor cells after traumatic brain injury in mice. Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 108003 (2014).
  7. DeTaboada, L., et al. Transcranial application of low-energy laser irradiation improves neurological deficits in rats following acute stroke. Lasers in Surgery and Medicine: The Official Journal of the American Society for Laser Medicine and Surgery. 38 (1), 70-73 (2006).
  8. De Taboada, L., et al. Transcranial laser therapy attenuates amyloid-β peptide neuropathology in amyloid-β protein precursor transgenic mice. Journal of Alzheimer’s Disease. 23 (3), 521-535 (2011).
  9. Oueslati, A., et al. Photobiomodulation suppresses alpha-synuclein-induced toxicity in an AAV-based rat genetic model of Parkinson’s disease. PloS One. 10 (10), e0140880 (2015).
  10. Xu, Z., et al. Low-level laser irradiation improves depression-like behaviors in mice. Molecular Neurobiology. 54 (6), 4551-4559 (2017).
  11. Salehpour, F., et al. Transcranial low-level laser therapy improves brain mitochondrial function and cognitive impairment in D-galactose–induced aging mice. Neurobiology of Aging. 58, 140-150 (2017).
  12. Grady, C. The cognitive neuroscience of ageing. Nature Reviews Neuroscience. 13 (7), 491 (2012).
  13. Beal, M. F. Mitochondria take center stage in aging and neurodegeneration. Annals of Neurology. Official Journal of the American Neurological Association and the Child Neurology Society. 58 (4), 495-505 (2005).
  14. Lu, Y., et al. Low-level laser therapy for beta amyloid toxicity in rat hippocampus. Neurobiology of Aging. 49, 165-182 (2017).
  15. Seibenhener, M. L., Wooten, M. C. Use of the open field maze to measure locomotor and anxiety-like behavior in mice. Journal of Visualized Experiments. (96), e52434 (2015).
  16. Rosenfeld, C. S., Ferguson, S. A. Barnes maze testing strategies with small and large rodent models. Journal of Visualized Experiments. (84), e51194 (2014).
  17. Huang, Y. Y., Chen, A. C. H., Carroll, J. D., Hamblin, M. R. Biphasic dose response in low level light therapy. Dose Response. 7 (4), 358-383 (2009).
  18. Mohammed, H. S. Transcranial low-level infrared laser irradiation ameliorates depression induced by reserpine in rats. Lasers in Medical Science. 31 (8), 1651-1656 (2016).
  19. Zhang, Y., Zhang, C., Zhong, X., Zhu, D. Quantitative evaluation of SOCS-induced optical clearing efficiency of skull. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 5 (1), 136 (2015).
  20. Shaw, V. E., et al. Neuroprotection of midbrain dopaminergic cells in MPTP-treated mice after near-infrared light treatment. Journal of Comparative Neurology. 518 (1), 25-40 (2010).
  21. Moro, C., et al. Photobiomodulation inside the brain: a novel method of applying near-infrared light intracranially and its impact on dopaminergic cell survival in MPTP-treated mice. Journal of Neurosurgery. 120 (3), 670-683 (2014).
  22. Reinhart, F., et al. The behavioural and neuroprotective outcomes when 670 nm and 810 nm near infrared light are applied together in MPTP-treated mice. Neuroscience Research. 117, 42-47 (2017).
  23. Sadowski, M., et al. Amyloid-β deposition is associated with decreased hippocampal glucose metabolism and spatial memory impairment in APP/PS1 mice. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 63 (5), 418-428 (2004).

Tags

Retractie kwestie 141 Transcraniële photobiomodulation low-level lasertherapie rood licht optische eigenschappen veroudering leren geheugen hippocampus muis
Een Protocol voor transcraniale Photobiomodulation therapie bij muizen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Salehpour, F., De Taboada, L.,… More

Salehpour, F., De Taboada, L., Cassano, P., Kamari, F., Mahmoudi, J., Ahmadi-Kandjani, S., Rasta, S. H., Sadigh-Eteghad, S. A Protocol for Transcranial Photobiomodulation Therapy in Mice. J. Vis. Exp. (141), e59076, doi:10.3791/59076 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter