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Neuroscience

Un protocolo de Transcranial Photobiomodulation terapia en ratones

Published: November 18, 2018 doi: 10.3791/59076
Automatic Translation
1,2, 3, 4,5,6, 1, 1, 7, 8,9,10, 1
1Neurosciences Research Center, Tabriz University of Medical Sciences, 2ProNeuroLIGHT LLC, 3LiteCure LLC, 4Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 5Depression Clinical and Research Program, Department of Psychiatry, Massachusetts General Hospital, 6Center for Anxiety and Traumatic Stress Disorders, Department of Psychiatry, Massachusetts General Hospital, 7Research Institute for Applied Physics and Astronomy, University of Tabriz, 8Department of Medical Physics, Tabriz University of Medical Sciences, 9Department of Medical Bioengineering, Tabriz University of Medical Sciences, 10School of Medical Sciences, University of Aberdeen

Summary

Photobiomodulation terapia es una innovadora modalidad no invasiva para el tratamiento de una amplia gama de trastornos neurológicos y psiquiátricos y también puede mejorar la función cerebral saludable. Este protocolo incluye a una guía paso a paso a realizar photobiomodulation de cerebro en ratones por entrega luz transcranial, que puede ser adaptada para su uso en otros roedores de laboratorio.

Abstract

Fotobiomodulación transcraneal es un enfoque terapéutico no invasivo innovador potencial para mejorar la bioenergética cerebral, función del cerebro en una amplia gama de trastornos neurológicos y psiquiátricos y mejorar la memoria en deterioro cognitivo relacionados con la edad y enfermedades neurodegenerativas. Se describe un protocolo de laboratorio para transcraneal photobiomodulation terapia (PBMT) en ratones. De ratones BALB/c (18 meses) se tratan con un 660 nm láser transcranially, una vez al día durante 2 semanas. Datos de transmitancia láser muestran que aproximadamente el 1% de la luz incidente de rojo en el cuero cabelludo alcanza una profundidad de 1 mm de la superficie cortical, penetrando el hipocampo dorsal. Los resultados del tratamiento se evaluaron mediante dos métodos: un Barnes laberinto de prueba, que es un dependiente de hipocampo espacial memoria y el aprendizaje tarea evaluación, y medición hipocampales niveles de ATP, que se utiliza como un índice de bioenergética. Los resultados de la tarea de Barnes muestran una mejora de la memoria espacial en ratones tratados con láser envejecidos en comparación con controles pareados por edad. Análisis bioquímico después de tratamiento con láser puede indicar aumento de los niveles de ATP hippocampal. Postulamos que la mejora de rendimiento de memoria es potencialmente debido a una mejora en el metabolismo de energía hipocampo inducida por el tratamiento de láser rojo. Las observaciones en los ratones podrían extenderse a otros modelos animales ya que este protocolo potencialmente podría ser adaptado a otras especies usadas con frecuencia en Neurociencia traslacional, como mono, conejo, perro o gato. Photobiomodulation transcraneal es una modalidad segura y rentable que puede ser un enfoque terapéutico prometedor en deterioro cognitivo relacionados con la edad.

Introduction

PBMT, o terapia de luz láser de bajo nivel (LLLT), es un término general que se refiere a los métodos terapéuticos basados en la estimulación de tejidos biológicos de energía de la luz de los láseres o diodos emisores de luz (LEDs). Casi todos los tratamientos PBMT se aplican con rojo a la luz de infrarrojo cercano (NIR) en longitudes de onda de 600 a 1100 nm, una potencia de salida desde 1 hasta 500 mW y un fluence de < 1 a > 20 J/cm2 (ver Chung et al.1).

Transcranial PBMT es un método de suministro de luz no invasiva que se lleva a cabo por la irradiación de la cabeza utilizando una fuente de luz externa (láser o LED)2. Para aplicaciones de animal, este método incluye contacto o sin contacto de la sonda láser o LED en la cabeza del animal. Dependiendo de la región terapéutica de interés, puede colocarse una sonda suave sobre toda la cabeza (para cubrir todas las áreas del cerebro) o sobre una parte específica de la cabeza, como la región prefrontal, frontal o parietal. La transmisión parcial de luz roja/NIR por el cuero cabelludo, el cráneo y la duramadre puede alcanzar el nivel de la superficie cortical y proporcionar una cantidad de energía fotónica suficiente para producir beneficios terapéuticos. Posteriormente, el fluence luz entregado a nivel cortical se propaga en la materia gris y blanca del cerebro hasta alcanzar las estructuras profundas del cerebro3.

Luz en las bandas espectrales en el rojo a far-red región (600-680 nm) y la región NIR temprano (800-870 nm) se corresponde con el espectro de absorción del citocromo c oxidasa, la enzima terminal de la cadena respiratoria mitocondrial4. Se presume que PBMT en el espectro rojo/NIR provoca photodissociation de óxido nítrico (NO) de la citocromo c oxidasa, dando por resultado aumentos en el transporte de electrones mitocondrial y, en última instancia, aumento de la generación de ATP5. Con respecto a aplicaciones neuronales, los beneficios potenciales de la neurostimulatory de cerebro PBMT usando irradiación de transcranial métodos se han divulgado en una variedad de estudios preclínicos, incluyendo roedores modelos de Lesion traumatica cerebral6 accidente cerebrovascular agudo7,8de la enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP)9, depresión10y envejecimiento11.

Envejecimiento del cerebro se considera una condición neurofisiológica que negativamente afecta algunas funciones cognitivas como el aprendizaje y la memoria12. Las mitocondrias son los orgánulos primarios responsables de la producción de ATP y bioenergética neuronal. La disfunción mitocondrial se sabe para ser asociada a déficits relacionados con la edad en áreas del cerebro que están vinculadas a la memoria de la navegación espacial, tales como el hipocampo13. Porque el tratamiento craneal con rojo/NIR luz principalmente los actos por la modulación de la bioenergética mitocondrial, suficiente dosis de luz entregada al hipocampo pueden resultar en la mejora de la memoria espacial de los resultados14.

El protocolo actual pretende demostrar el procedimiento PBMT transcraneal en ratones, con bajos niveles de luz roja. Describen las mediciones de transmisión de la luz láser requiere a través de los tejidos de la cabeza de ratones envejecidos. Además, laberinto de Barnes, como un aprendizaje espacial dependiente del hipocampo y tarea de la memoria e hipocampales niveles de ATP, como un índice de bioenergética, se utilizan para la evaluación de los efectos del tratamiento en animales.

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Protocol

Todos los procedimientos se llevaron a cabo conforme a la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los institutos nacionales de salud (NIH; Publicación no. 85-23, revisada en 1985) y aprobado por el Comité de ética regional de Tabriz Universidad de ciencias médicas.

PRECAUCIÓN: Este protocolo incluye la aplicación de instrumentos de láser de clase 3B y requerirá una formación adecuada y la adherencia a pautas de seguridad. Láseres de clase 3B pueden dañar gravemente los ojos y pueden calentar la piel. Láseres de clase 3B no se consideran un riesgo de quemaduras. Anteojos de protección deben llevarse en todo momento cuando el funcionamiento del aparato de láser.

1. experimentos de transmisión de la luz laser

Nota: Utiliza aquí tres ratones BALB/c machos de 18 meses de edad se obtuvieron de Animalario de Tabriz Universidad de ciencias médicas. Un láser mW 60 (660 nm) con una viga circular forma de 2,5 mm de diámetro se utiliza como fuente de luz. La fuente láser produce una luz circular polarizada con un perfil gaussiano de intensidad y se opera en modo de onda continua. Un medidor de potencia de fotodiodo comercial con una resolución de nW 10, un área activa de cuadrado 1 cm2 fotodiodo y un rango de respuesta espectral de 400 a 1100 nm se utiliza para medir la potencia de luz transmitida a través de las muestras.

  1. Preparación de la muestra
    1. Con el fin de obtener muestras frescas, profundamente anestesiar el ratón con una mezcla de ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg).
    2. Disecar la cabeza del ratón con tijeras regulares, a partir del punto situado justo encima de los hombros.
    3. Gire la cabeza para que quede el lado ventral de la mandíbula hacia arriba. Deslice tijeras disección angulada suavemente a través de la cavidad bucal hasta que se nota la resistencia de la Unión de la mandíbula. Cortar todos los músculos grandes que une el hueso de la mandíbula con el cráneo y deshacerse de ellos.
    4. Quitar los huesos palatinos, con tijeras de disección angulada.
    5. Deseche toda la carne que rodea el cráneo, usando fórceps curvado.
    6. Disecar la parte inferior del cráneo y luego tomar cuidadosamente el cerebro fuera queda de hueso del cráneo, con una espátula curvada.
    7. Fijar el tejido cerebral intacto en un gel de agarosa al 2% por lo que será conveniente para cortar el tejido.
      Nota: Para obtener un cráneo intacto y muestra en el cuero cabelludo, el tejido cerebral debe retirarse el lado ventral de la cabeza del animal sin ningún daño a la porción dorsal de la cabeza.
  2. Procedimiento de corte de cerebro
    1. Extender una gota de superglue (~0.05 mL) en la superficie del bloque de montaje de vibratome.
    2. Con cuidado coloque el bloque de agarosa en el vibratome bloque de montaje para que la superficie ventral del cerebro es boca abajo y ajustar su posición.
    3. Ligeramente la patilla el vibratome a la superficie superior del bloque de agarosa y registre el valor de corte como el nivel primario.
    4. Llene el tanque de vibratome con solución salina normal helada.
    5. Ajustar los parámetros de vibratome (p. ej., el grosor de corte [1 mm], velocidad [5 de 5 en la unidad de dispositivo] y frecuencia [5 de 5 en la unidad de dispositivos]) para obtener corte satisfactorio.
    6. Cortar transversalmente el cerebro en una rebanada con un espesor de 1.000 μm.
      Nota: El segmento es la porción del tejido de cerebro delimitado por la superficie cortical y un plano colocado 1.000 μm inferior a la superficie cortical (el hipocampo dorsal).
    7. Añadir una gota de agua (~0.05 mL) en la superficie de vidrio óptico y poner la rebanada del cerebro en la parte superior. Luego, añadir una gota de agua en el cerebro rebanada y coloque con cuidado el segundo vidrio óptico en la parte superior.
      Nota: Una gota de agua debe añadirse a los límites de vidrio muestra para prevenir el secado del tejido y luz dispersión de superficies rugosas.
  3. Medición de la transmisión ligera a través de los tejidos de la cabeza
    1. Configurar el equipo óptico, incluyendo el dispositivo láser, reflejo de espejos y medidor de alimentación.
      PRECAUCIÓN: Poner gafas de protección ocular antes de encender el láser.
    2. En la ausencia de una muestra en el medidor de energía, encienda el dispositivo láser y enfocar el rayo láser en el espejo que se encuentra a la distancia adecuada para guiar el rayo perpendicular al área activa del fotodiodo.
      Nota: Las mediciones de transmisión de luz deben realizarse en un cuarto oscuro a temperatura ambiente (23-25 ° C), dentro de 30 minutos después de que se hayan extraído los tejidos de la cabeza.
    3. Realizar mediciones en el tejido cerebral en rodajas.
      1. Coloque dos vidrios ópticos en blanco sobre la superficie del medidor de energía.
      2. Leer la potencia de luz transmitida (I0) desde el medidor de energía de pantalla y registre el valor.
      3. Suavemente Coloque la muestra de cerebro, que está rodeada por dos vidrios ópticos, en la superficie del medidor de energía, enfocar el rayo en la zona respectiva de tejido, leer la potencia y el valor.
    4. Realizar mediciones en el cráneo y el cuero cabelludo.
      1. Coloque un vidrio óptico en blanco sobre la superficie del medidor de energía.
      2. Leer la potencia de luz transmitida (I0) desde el medidor de energía de pantalla y registre el valor.
      3. Ligeramente Coloque un vidrio óptico con cráneo fresco más tejido en la superficie del medidor de potencia en el cuero cabelludo, coincide con el haz de luz en la zona de vértice, leer la potencia y el valor.
      4. Con el fin de maximizar la relación señal a ruido, repita la medición de la transmisión de la luz por lo menos 3 x para todas las muestras.
        Nota: La zona de vértice se coloca en un rostral a una línea trazada a través de la base anterior de las orejas aproximadamente 3 mm. El espesor de los tejidos del cráneo y del cuero cabelludo se mide con un calibrador estándar.

2. Photobiomodulation terapia (PBMT)

Nota: Se utilizaron cuarenta y cinco ratones BALB/c machos asignados a tres grupos de 15 ratones. Los grupos estaban compuestos de ratones jóvenes-control (2 meses) que recibieron sham-PBMT, control de edad ratones (18 meses de edad) que recibieron tratamiento simulado-PBMT y ratones envejecidos-PBMT (18 meses de edad) que recibieron PBMT. El tratamiento de sham PBMT consistió en tratamiento idéntico a la PBMT grupo, pero con el láser inactivo. Ratones fueron obtenidos de Animalario de Tabriz Universidad de ciencias médicas y fueron alojados en el unidad del centro de investigación de Neurociencias (NSRC) animales a 24-25 ° C y 55% humedad relativa, con 12 h luz y fotoperíodo oscuro 12 h. Alimentos y el agua fueron proporcionados ad libitum. Todos los ratones fueron aclimatados durante al menos 1 semana antes del tratamiento.

  1. Procedimiento de tratamiento láser
    Nota: Un diodo láser de GaAlAs con modo de onda continua en longitud de onda de 660 nm se utilizó para el tratamiento de PBMT transcraneal. El dispositivo del laser fue funcionado en una potencia de 200 mW ± 2 y una irradiación de 6.66 W/cm2, con un tamaño de punto de 0,03 cm2. Una fluencia promedio de 99.9 J/cm2 por cada sesión se entregó a la superficie del cuero cabelludo durante 15 s de irradiación. La irradiación fue administrado 1 x día durante 2 semanas consecutivas.
    1. Llevar los ratones en sus jaulas hogar a la sala de terapia, aproximadamente 20 minutos antes de comenzar el tratamiento.
    2. Conecte un protector eléctrico a la toma de corriente.
    3. Inserte el enchufe del dispositivo de láser en un protector eléctrico.
    4. Cubrir la punta de la sonda de láser con una película de nylon transparente para evitar cualquier rasguño en la superficie.
    5. Conecte con cuidado la sonda en el canal del dispositivo láser.
    6. Encienda el dispositivo láser y esperar unos segundos para se caliente.
    7. Ajustar los parámetros de tratamiento de láser, incluyendo el modo de operación y tiempo de irradiación.
    8. En ausencia de cualquier muestra, determinar la potencia media de láser por ponerse en contacto con la punta de la sonda en la zona del medidor de energía activa en el dispositivo de láser. Registre el valor.
    9. Repita el proceso de calibración (paso 2.1.8) al menos 5 x, leer las energías incidentes desde el medidor de energía pantalla y registran los valores.
    10. Suavemente Sujete un ratón por la piel dorsal del cuello del animal en la palma de una mano e inmovilizar su cabeza.
      Nota: En el protocolo actual, la sonda láser se coloca sobre la zona de vértice, que es ~ 3 mm rostral a una línea trazada entre la base interna de las orejas.
    11. Coloque suavemente la punta de la sonda directamente en el cuero cabelludo en la línea media, aproximadamente de 3 mm de rostral a una línea trazada a través de la base anterior de las orejas.
      Nota: Sujete la sonda a un ángulo aproximado de 45° al plano del abdomen.
    12. Para evitar la irradiación directa a los ojos del animal, primero con la punta de la sonda en la cabeza y, luego, encienda el dispositivo laser.
    13. Encienda el láser y mantener estable la sonda hasta la finalización de la irradiación.
    14. Después del final de la terapia, retirar la sonda de láser de la cabeza y suavemente volver el ratón a su jaula.
    15. El dispositivo láser y desconecte la sonda del dispositivo.
    16. Limpiar la sonda de láser con un limpiador óptico apropiado.
    17. Transferencia de los ratones a un centro de animales.

3. comportamiento tareas

  1. Prueba de campo abierto
    1. Evaluar el aparato locomotor actividad de cada ratón por la distancia total recorrida durante una prueba de campo abierto, como describe previamente15.
  2. Tarea de laberinto de Barnes
    1. Aparato de
      Nota: La tarea de aprendizaje y la memoria espacial se realiza en un laberinto de Barnes16. El aparato utilizado para esta tarea de neurobehavioral consiste en una plataforma circular hecha de madera negra (95 cm de diámetro) con 20 equidistante, agujeros circulares de 5 cm de diámetro que se encuentran en la plataforma, 3 cm desde el perímetro. El aparato es elevada 50 cm del piso para evitar que el animal bajando. Una caja móvil escape plástico negro (20 x 15 cm x 5 cm) se coloca debajo del orificio de escape. Un laberinto negro se utiliza para pruebas de ratones blancos y un negro mat debe colocarse bajo el laberinto cuando se utiliza un software de sistema de seguimiento.
      1. Coloque el aparato de laberinto en el centro de una habitación tranquila con brillante iluminación cenital.
      2. Coloque un letrero de "No entrar" en el exterior de la puerta de la sala de tarea.
      3. Coloque señales visuales-espaciales en los muros perimetrales.
      4. Coloque una cámara de vídeo digital sobre la plataforma de laberinto.
      5. Limpie la superficie de la plataforma de laberinto con etanol al 70% para eliminar señales olfativas no deseados.
      6. Agregue una pequeña cantidad de ropa de cama de jaula casera del animal en el interior de la caja de escape para servir como una referencia olfativa.
    2. Sesión de adaptación
      1. Traer cada ratón a la tarea sala aproximadamente 30 min antes de comenzar el experimento, en orden para que el ratón de ser habituado.
      2. Quitar el ratón de su jaula y suavemente Coloque el animal en la caja de escape durante 1 minuto.
    3. Sesión de entrenamiento
      Nota: La sesión de entrenamiento se repite para cada ratón en 4 días consecutivos.
      1. Retire suavemente el ratón de la caja de escape.
      2. Coloque el ratón en el centro de la arena; Luego, coloque la cámara de inicio en la parte superior del ratón.
      3. Retire la cámara de inicio después de 10 s y el ratón para explorar la arena de 3 minutos.
      4. Tranquilamente hacia el área de la computadora y puesto en auriculares de cancelación de ruido.
      5. Desencadenar un estímulo auditivo negativo que consiste en un ruido blanco de aproximadamente 80 dB a nivel de la plataforma y comenzar a grabar el ratón.
      6. Apague el ruido blanco y dejar de grabar cuando el ratón entra en la caja de escape. Permite al animal permanecer inalterados en el cuadro de 1 minuto.
      7. Quite el ratón de la caja de escape y coloque en su jaula.
      8. Repita los pasos 3.4.2 por 3.4.7 4 veces por día, con intervalos de 3 minutos entre los ensayos repetidos.
        Nota: Entre todos los ensayos, quite cualquier orina o las heces de la superficie de la arena y limpiar el laberinto con etanol al 70%.
    4. Sesión de prueba de sonda
      1. Tras el último entrenamiento ensayo, 24 h después, quitar la casilla de escape de la plataforma de laberinto y repita los pasos 3.4.2 a través de 3.4.5.
      2. Después de 3 minutos, apagar el ruido blanco y deje de grabar. Quitar el ratón de la arena de laberinto y coloque en su jaula.
      3. Después de todos los animales han sido probados, limpie la plataforma del laberinto y la cámara de inicio. Apagar las luces de la habitación y quitar el letrero de "No entrar" de la puerta.
      4. Almacenar las grabaciones en vídeo de las sesiones de prueba a un disco duro externo para su posterior análisis.
      5. Configurar el programa seguimiento de video y extracto de los parámetros de interés de los vídeos grabados, incluyendo el tiempo de latencia para encontrar el agujero del objetivo durante 4 días de sesiones de entrenamiento y el tiempo gastados en el cuadrante de destino durante la sesión de prueba de sonda.

4. bioquímica evaluación

  1. Niveles de ATP en el hipocampo
    1. Anestesiar profundamente cada ratón con una inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina (100 mg por gramo de peso corporal) y xilacina (10 mg por gramo de peso corporal).
    2. Decapitar al animal y quitar rápidamente el tejido cerebral del cráneo.
    3. Disecar un hipocampo y homogeneizar el tejido en el tampón de muestra helada (proporcionado por el kit) con un homogeneizador de tejidos.
    4. Inmediatamente centrifugar el homogeneizado a 2.000 x g durante 3 min a 4 ° C.
    5. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio.
    6. Evaluar los niveles de ATP hippocampal, utilizando la lectura espectrofotométrica método descripto anteriormente11.

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Representative Results

Análisis estadísticos

El análisis estadístico de datos obtenidos de las sesiones de entrenamiento de Barnes se analizó mediante ANOVA de dos vías; la otras pruebas conductuales y análisis de niveles de ATP hipocampales entre los grupos se llevaron a cabo por ANOVA unidireccional, seguido de la prueba post-hoc de Tukey. Todos los datos se expresan como medios ± el error estándar de la media (SEM), excepto los datos de la transmisión de láser, que se muestran como medios ± la desviación estándar (SD). El nivel de significancia fue fijado en p < 0.05.

Transmisión de la luz láser

La luz láser (660 nm) transmisión a través del tejido del cráneo y del cuero cabelludo (con un espesor de muestra de 0,85 ± 0,09 mm) de los ratones envejecidos fue 15.67% ± 0,87% cuando un rayo láser se centra en el bregma (figura 1). Basado en esta transmisión de la luz, ya que la fluencia inicial en la superficie del cuero cabelludo era 99.9 J/cm2 (6.66 [W/cm2] x 15 [s]), podría estimarse que un fluence aproximado de 16 J/cm2 alcanza la superficie cortical.

La transmisión de láser, a través de una rebanada de 1 mm de tejido de cerebro, fue de 10.10% ± 0.95% (figura 1). De estos valores, se podría estimar que el fluence luz disminuyó de 16 J/cm2 en el nivel de tejido de la corteza cerebral a aproximadamente 1,6 J/cm2 a una profundidad de 1 mm de la superficie cortical.

Prueba de campo abierto

No hubo diferencias estadísticamente significativas en la actividad locomotora en la prueba de campo abierto entre todos los grupos experimentales (figura 2).

Tarea de laberinto de Barnes

Cuando la latencia de escape fue analizada durante los 4 días de entrenamiento y con grupos experimentales durante la tarea de laberinto de Barnes, un ANOVA de dos vías reveló efectos significativos del día (p < 0,001) y grupo (p < 0,001), pero no grupo x día (p = 0,47). Un análisis Intergrupo de los datos mostró que los tiempos de latencia de los animales de edad control fueron significativamente más largos que los del grupo control de jóvenes en la tercera (p < 0.01) y cuarto (p < 0,001) días de la sesión de entrenamiento. Sin embargo, los tiempos de latencia de los ratones edad tratados con PBMT fueron significativamente menos en el cuarto día (p < 0,05), en comparación con los ratones control de la edad (p < 0,01) (figura 3). En la sesión de prueba de sonda, control de edad ratones pasaron tiempos perceptiblemente más cortos en el cuadrante objetivo, en comparación con los ratones control de la joven (p < 0.01). Sin embargo, el Tratado de PBMT entre ratones pasó tiempos significativamente mayor en el cuadrante objetivo en comparación con ratones control de la edad (p < 0.05) (figura 4).

Niveles de ATP hipocampales

Los ratones de control de edad tenían una disminución significativa en los niveles de ATP hipocampales, en comparación con ratones control joven (p < 0.05). Sin embargo, el contenido medio de ATP en el hipocampo de los ratones envejecidos-PBMT fueron significativamente mayor que en los ratones control de la edad (p < 0.05) (figura 5).

Figure 1
Figura 1 : Datos de la transmisión de la luz a través del cráneo y del cuero cabelludo y el tejido cerebral del laser. Los datos se expresan como media ± SD SD = desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Datos de actividad locomotriz de los test de campo abierto Los datos se expresan como la media ± SEM. PBMT = photobiomodulation terapia; SEM = error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Escapar de latencia para los grupos de ratones durante los 4 días de sesiones de formación. Los valores representan la media ± SEM. **p < 0.01 y ***p < 0.001, en comparación con los ratones control de jóvenes. # p < 0.05, en comparación con los ratones control de edad. PBMT = photobiomodulation terapia; SEM = error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : El tiempo en el cuadrante blanco en la sesión de la sonda, en los diferentes grupos. Los valores representan la media ± SEM. **p < 0.01, en comparación con los ratones control de jóvenes. # p < 0.05, en comparación con los ratones control de edad. PBMT = photobiomodulation terapia; SEM = error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Contenido de ATP en el tejido del hipocampo. Los valores representan la media ± SEM. *p < 0.05, en comparación con los ratones control de jóvenes. # p < 0.05, en comparación con los ratones control de edad. PBMT = photobiomodulation terapia; SEM = error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Se describe un protocolo para la realización de un procedimiento PBMT transcraneal en ratones. Este protocolo está dirigido específicamente a los laboratorios de neurociencia que realizan investigación fotobiomodulación en roedores. Sin embargo, este protocolo puede ser adaptado a otros animales de laboratorio que se utilizan con frecuencia en el campo de la neurociencia, como mono, conejo, perro o gato.

En la actualidad hay creciente interés en la investigación de transcranial PBMT con LEDs y láseres rojo/NIR. Para realizar con éxito el procedimiento de tratamiento todo en roedores, hay unos pasos esenciales a tener en cuenta.

En primer lugar, es fundamental que, antes de cualquier tratamiento en animales vivos, la penetración de la luz es precisamente medida a través de los tejidos animales de cabeza para entregar una dosificación óptima del fotón (J/cm2).

Segundo, en que regiones del cerebro son afectadas por la patología y dirigidas para el tratamiento de base, tienen varios parámetros a optimizar, maximizar la penetración de la luz y aumentar la probabilidad de resultados positivos. Éstos incluyen tiempo de irradiación, los intervalos de tratamiento, radiación aplicada y fluence. Por ejemplo, en los modelos de animales, es fundamental entregar una dosis de radiación suficiente para el cerebro hipocampo y corteza frontal porque estas regiones están relacionadas con patologías relacionadas con la edad2. Una tasa de fluencia óptima en los tejidos Diana es otro factor importante en PBMT. Mayoría de los investigadores discute factores que afectan la transmisión de la luz, pero a menudo descuidan a considerar que una respuesta bifásica en los tejidos diana de cerebro existe no sólo para fluencia (J/cm2), sino también para la tasa de entrega de fluence. En otras palabras, un fluence de 1 J/cm2 entregada más de 1 minuto no es equivalente a 1 J/cm2 entregada 1 s17,18.

Hay varios factores adicionales que también deben ser considerados antes de ejecutar estudios PBMT transcraneal. PBMT Transcranial en roedores se aplica comúnmente mediante láser o LED sondas con el tamaño de punta de sonda escalado al tamaño del cerebro del animal. Para aplicación en roedores, láser de potencia moderada (con una potencia de salida ≤ 500 mW) puede ofrecer una gran cantidad de energía de la luz en poco tiempo y reducir el tiempo de tratamiento y el estrés relacionado con el tratamiento a los animales. Aunque los láseres de clase 3B no tienen efectos significativos fototérmica en rangos de dosis PBMT (≤20 J/cm2), enfriamiento de la superficie del cuero cabelludo con una sustancia óptica transparente, como hielo o gel, se recomienda durante la aplicación transcraneal.

En algunos estudios experimentales transcraneal PBMT de fibra óptica se utiliza en lugar de un láser o LED sonda, debido a sus ventajas para la irradiación de una específica área pequeña en la cabeza. Por ejemplo, en apoplejía isquémica focal, TBI y modelos de PD, una irradiación precisa de la zona dañada está garantizado. Sin embargo, las fibras ópticas tienen generalmente un área pequeña de la viga, así que esto afectará la cantidad total de energía entregada en una sola sesión y requiere investigadores repetir el procedimiento en más de un lugar para compensar el área disminuido. En los estudios más experimentales del PBMT de transcranial, irradiación de la cabeza se lleva a cabo en el animal alerta, sin anestesiar. Para garantizar la estabilidad del animal, se recomiendan sostener cabeza manual y el uso de dispositivos de retención. En la sujeción manual método, debido al hecho de que ese animal puede mover repentinamente y posiblemente moviendo su cabeza lejos de la zona de irradiación, una porción de la luz irradiada puede ser desperdiciada. Además, ambos métodos pueden inducir estrés extra a los animales y podrían ser un factor de confusión potencial. En algunos casos, el procedimiento de irradiación se realiza en un animal anestesiado. Cabe señalar que demasiada anestesia puede afectar negativamente los resultados experimentales de estudios de la neurociencia. Por lo tanto, un intervalo más corto de la irradiación debe considerarse cuidadosamente en estos tipos de experimentos.

En el presente estudio, en primer lugar medimos la transmisión de luz a través del cráneo y cuero cabelludo de BALB/c machos de edad ratones para determinar la cantidad de 660 nm láser energía que alcanza la superficie cortical. Los resultados indicaron que el 16% de la luz inicial de la superficie del cuero cabelludo unshaved fue transmitido a través al cerebro. Datos de la transmisión de otros laboratorios en ratones machos BALB/c han demostrado que sólo el 1.2% de 670 nm láser luz era capaz de penetrar el cráneo intacto19. También se ha reportado que aproximadamente el 90% de 670 nm de luz se atenúa dentro del cráneo de ratón20.

La dosificación eficaz neurostimulatory de láser rojo en el nivel de tejido cortical fue confirmada en un estudio anterior realizado en nuestro laboratorio11. Demostramos que un fluence cortical diario de un láser de2 J/cm 8 a 660 nm tiene efectos procognitivo en un ratón modelo11del envejecimiento. En la sección de tratamiento del estudio actual, para entregar aproximadamente 16 J/cm2 a la superficie cortical, necesitábamos dejar el láser 15 s, que fue tolerada por los ratones. En el presente trabajo, también medimos la potencia de luz recibida en la superficie del hipocampo. Basado en los resultados del experimento, se midió un valor aproximado de 10% como laser transmitancia a través de una rebanada de 1 milímetro de cerebro envejecido, correspondiente a un fluence luz de aproximadamente 1.6 J/cm2 a 1 mm de profundidad desde la superficie cortical. Datos de otros estudios utilizando ratones BALB/c ratón cerebro han revelado una reducción del 65% de 670 nm LED intensidad de luz en cada milímetro de tejido cerebral21. También se ha demostrado que aproximadamente el 2,5% de 670 nm LED luz alcanza una profundidad en el tejido cerebral de 5 mm, la distancia desde la superficie del cráneo hasta la sustancia negra compacta (SNc) zona22.

El hipocampo desempeña un papel cardinal en la consolidación de la memoria espacial23. De hecho, la capacidad bioenergética del hipocampo se asocia con la memoria de navegación espacial y el aprendizaje. Los resultados presentados aquí sugieren que una dosis de luz de aproximadamente 1,6 J/cm2 a nivel de hipocampo podría ser suficiente para producir una mejora de los resultados de la memoria espacial en ratones envejecidos. Podría presumirse que una mejora de rendimiento de memoria en la tarea cognitiva-conductual (laberinto de Barnes) podría deberse a una mejora del metabolismo energético hippocampal que parece ser inducido por un laser rojo en una determinada longitud de onda de 660 nm.

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Disclosures

Sueldo de P.C. fue apoyado por el Departamento de psiquiatría de Harvard (beca Dupont-Warren y Premio de Livingston), por el cerebro y la Fundación de investigación del comportamiento (NARSAD Young investigador Award) y por el Fototer Inc. irrestricto beca. La donación de medicamentos provenientes de TEVA. Reembolso de viajes vino de Pharmacia-Upjohn. P.C. ha recibido honorarios de consulta de Janssen investigación y desarrollo. P.C. ha presentado varias patentes relacionadas con el uso de la luz infrarroja en psiquiatría. PhotoMedex, Inc. suministra cuatro dispositivos para un estudio clínico. P.C. ha recibido fondos sin restricción de Litecure Inc. para llevar a cabo un estudio sobre fotobiomodulación transcraneal para el tratamiento de trastornos depresivos mayores y llevar a cabo un estudio en sujetos sanos. P.C. cofundó una empresa (Niraxx luz terapéutica) se centró en el desarrollo de nuevas modalidades de tratamiento basado en luz infrarroja; también es consultor para la misma empresa. P.C. recibió fondos de Ciencias cerebrales para llevar a cabo un estudio sobre photobiomodulation de transcranial para el trastorno de ansiedad generalizada. Otros autores no tienen conflictos de interés divulgar.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por una subvención de la Tabriz Universidad de ciencias médicas (concesión Nº 61019) a S.S.-E. y una donación de la publicación de LiteCure LLC, Newark, DE, USA a L.D.T. Los autores desean agradecer al Departamento de Inmunología y educación Development Center (EDC) de Tabriz Universidad de ciencias médicas por su amable asistencia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Alfasan #1608234-01
Xylazine Alfasan #1608238-01
Agarose Sigma #A4679
Superglue Quickstar
Vibratome Campden Instruments #MA752-707
Optical glass Sail Brand #7102
Power meter Thor labs #PM100D
Photodiode detector Thor labs #S121C
Caliper Pittsburgh
GaAlAs laser Thor Photomedicine
Etho Vision Noldus
Centrifuge Froilabo #SW14R
Earmuffs Blue Eagle
Digital camera Visionlite #VCS2-E742H
Sterio amplifier Sony
Ethanol Hamonteb #665.128321
Barnes maze Costom-made
ATP assay kit Sigma #MAK190
Elisa reader Awareness #Stat Fax 2100

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References

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Retracción número 141 Transcranial fotobiomodulación terapia baja del laser luz roja propiedades ópticas envejecimiento aprendizaje memoria hipocampo ratón
Un protocolo de Transcranial Photobiomodulation terapia en ratones
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Salehpour, F., De Taboada, L., Cassano, P., Kamari, F., Mahmoudi, J., Ahmadi-Kandjani, S., Rasta, S. H., Sadigh-Eteghad, S. A Protocol for Transcranial Photobiomodulation Therapy in Mice. J. Vis. Exp. (141), e59076, doi:10.3791/59076 (2018).

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