Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

En protokol til transkranial Photobiomodulation terapi i mus

doi: 10.3791/59076 Published: November 18, 2018

Summary

Photobiomodulation terapi er en innovativ noninvasive modalitet til behandling af en lang række neurologiske og psykiatriske lidelser og kan også forbedre sund hjernefunktion. Denne protokol indeholder en trinvis vejledning til udførelse af hjernen photobiomodulation i mus af transkranial lys levering, der kan tilpasses til brug i andre laboratoriet gnavere.

Abstract

Transkranial photobiomodulation er en potentiel innovative noninvasive terapeutisk tilgang for at forbedre hjerne bioenergetik, hjernefunktion i en bred vifte af neurologiske og psykiatriske lidelser, og hukommelse ekstraudstyr i aldersrelaterede kognitive tilbagegang og neurodegenerative sygdomme. Vi beskriver et laboratorium protokol for transkranial photobiomodulation terapi (PBMT) i mus. Alderen BALB/c mus (18 måneder) er behandlet med en 660 nm laser transcranially, én gang dagligt i 2 uger. Laser transmittans data viser, at ca. 1% af det indfaldende rød lys på hovedbunden når en 1 mm dybde fra den kortikale overflade, gennemtrængende dorsale hippocampus. Behandlingsresultater er vurderet af to metoder: en Barnes labyrint-test, som er en hippocampus-afhængige rumlige indlæring og hukommelse opgaven vurderingen, og måle hippocampus ATP niveauer, der anvendes som en bioenergetik indeks. Resultaterne fra Barnes opgave viser en forbedring af den fysiske hukommelse i laser-behandlede alderen mus i forhold til alder-matchede kontrol. Biokemiske analyser efter Laserbehandling angiver øget hippocampus ATP niveauer. Vi postulere, at styrkelsen af hukommelse ydeevne er potentielt en forbedring i hippocampus energimetabolisme induceret af den røde laserbehandling. Observationer i mus kunne udvides til andre dyremodeller, da denne protokol ville potentielt kunne tilpasses til andre arter, der ofte anvendes i translationel neurovidenskab, som kanin, kat, hund eller abe. Transkranial photobiomodulation er en sikker og omkostningseffektiv modalitet, som kan være et lovende terapeutisk tilgang i aldersrelaterede kognitiv svækkelse.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

PBMT eller lavt niveau laserlys terapi (LLLT), er en generel term, der henviser til terapeutiske metoder baseret på stimulering af biologisk væv af lysenergi fra lasere eller lysemitterende dioder (lysdioder). Næsten alle PBMT behandlinger anvendes med rød til nær-infrarødt (NIR) lys ved bølgelængder fra 600 til 1100 nm, en udgangseffekt, lige fra 1 til 500 mW, og en fluens spænder fra < 1 til > 20 Jørgensen/cm2 (Se Chung et al.1).

Transcranial PBMT er en noninvasiv lys leveringsmetode, der er udført af bestråling af hovedet ved hjælp af en ekstern lyskilde (laser eller lysdioder)2. For animalsk applikationer omfatter denne metode kontakt eller noncontact placering af LED eller laser sonden på dyrets hoved. Afhængigt af det terapeutiske område af interesse, kan en lys sonden placeres enten over hele hovedet (for at dække alle områderne i hjernen) eller en bestemt del af hovedet, som den præfrontale, frontal eller parietal region. Delvis overførsel af rød/NIR lys gennem hovedbunden, kraniet og dura mater kan nå det kortikale overflade niveau og giver en mængde af photon energi nok til at producere terapeutiske fordele. Efterfølgende, ville den leverede lys fluens på den kortikale plan blive formeret på grå og hvid hjerne sagen indtil det når de dybere strukturer i hjernen3.

Lys i de spektrale bands på røde far-red region (600-680 nm) og tidlig NIR regionen (800-870 nm) svarer til absorptionsspektrum af cytokrom c oxidase, terminal enzymet af mitokondrie respiratorisk kæde4. Det er en hypotese, at PBMT i rød/NIR spektrum forårsager photodissociation af nitrogenoxid (NO) fra cytokrom c oxidase, hvilket resulterer i en stigning i mitokondrie elektron transport, og i sidste ende, øget ATP generation5. Med hensyn til neuronal programmer, de potentielle neurostimulatory fordele ved brain PBMT ved hjælp af transkranial bestråling metoder er blevet rapporteret i en bred vifte af prækliniske undersøgelser, herunder gnavere modeller af traumatisk hjerne skade (TBI)6, akut slagtilfælde7, Alzheimers sygdom (AD)8, Parkinsons sygdom (PD)9, depression10og aldring11.

Hjernens ældning anses en Neuropsykologisk tilstand, der negativt påvirker nogle kognitive funktioner, såsom læring og hukommelse12. Mitokondrier er de primære ansvarlige for ATP produktion og neuronal bioenergetik organeller. Mitokondriel dysfunktion er kendt for at være forbundet med aldersrelaterede underskud i hjernen områder, der er knyttet til rumlige navigation hukommelse, såsom hippocampus13. Fordi kraniel behandling med rød/NIR lys primært handlinger ved graduering af mitokondrie bioenergetik, kan tilstrækkelig leverede lys dosering til hippocampus resultere i en forbedring af rumlig hukommelse resultater14.

Den nuværende protokol sigter mod at påvise transkranial PBMT procedure i mus, ved hjælp af lave niveauer af rødt lys. Kræves laser lys transmission målinger gennem hovedet væv i alderen mus er beskrevet. Derudover Barnes labyrint, som en hippocampus-afhængige rumlige læring og hukommelse opgave og hippocampus ATP niveauer, som en bioenergetik indeks, der bruges til en evaluering af behandling virkning på dyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle procedurer blev gennemført i overensstemmelse med vejledningen til pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health (NIH; Publikation nr. 85-23, revideret i 1985) og godkendt af den regionale etiske komité i Tabriz University of Medical Sciences.

Advarsel: Denne protokol omfatter anvendelsen af klasse 3B laser instrumenter og vil kræve passende uddannelse og overholdelse af retningslinjer for sikkerhed. Klasse 3B lasere alvorligt kan skade øjne og kan varme huden. Klasse 3B lasere anses ikke for en burn hazard. Eye protection briller skal bæres på alle tidspunkter ved brug af laser enheden.

1. laser lys transmission eksperimenter

Bemærk: Bruges her var tre 18-måned-forhenværende mandlige BALB/c mus fremstillet af Dyrefacilitet af Tabriz University of Medical Sciences. En 60 mW laser (660 nm) med en cirkulær stråle form af 2,5 mm i diameter bruges som lyskilde. Laserkilde giver et cirkulært polariseret lys med en profil, Gaussisk intensitet og drives i kontinuert bølge mode. En kommerciel fotodiode power meter med en 10 nW opløsning, en firkantet 1 cm2 fotodiode aktive område og en spektrale reaktion spænder fra 400 til 1100 nm bruges til at måle den overførte lys magt gennem prøverne.

  1. Forberedelse af prøver
    1. For at få friske prøver, dybt bedøver mus med en blanding af ketamin (100 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg).
    2. Dissekere musens hoved med regelmæssige saks, fra punktet ligger lige over skuldrene.
    3. Dreje hovedet, så den ventrale side af kæben vender opad. Skub vinklet dissektion saks glat gennem mundhulen, indtil modstanden i mandibular krydset er bemærket. Skære alle store muskler forbinder mandiblen knogle til kraniet og kassere dem.
    4. Fjerne palatine knoglerne, ved hjælp af vinklet dissektion saks.
    5. Kassér alle kød omkring kraniet, bruger buet pincet.
    6. Dissekere den nederste del af kraniet, og derefter forsigtigt tager hjernen ud af de resterende kraniet ben, med en buet spatel.
    7. Fastsætte det intakte hjernevæv i en 2%-agarosegel, så vævet vil være egnet til udskæring.
      Bemærk: For at opnå en intakt kraniet plus hovedbund prøve, hjernevæv bør fjernes fra den ventrale side af dyrets hoved uden skader til den dorsale del af hovedet.
  2. Hjernen udskæring procedure
    1. Sprede en dråbe superglue (~0.05 mL) på overfladen af vibratome montering blok.
    2. Omhyggeligt tillægger vibratome montering blok, således at den ventrale overflade af hjernen er scannerens Agarosen blok, og justere dens position.
    3. Lidt match vibratome klinge til den øvre overflade af Agarosen blok og optage cutter værdi som det primære niveau.
    4. Fyld vibratome tank med iskold normale saltopløsning.
    5. Justere parametrene vibratome (f.eks. den skive tykkelse [1 mm] hastighed [5 ud af 5 på enhed enhed] og vibrationer hyppigheden [5 ud af 5 på enhed enhed]) for at opnå tilfredsstillende udskæring.
    6. Skær hjernen paa tvaers i en skive med 1.000 µm tykkelse.
      Bemærk: Skive er del af hjernevæv afgrænset af de kortikale overflade og et fly placeret 1.000 µm ringere end den kortikale overflade (dorsale hippocampus).
    7. Tilføj en dråbe vand (~0.05 mL) på optisk barometer overflade og satte hjernen skive på toppen af det. Derefter tilsættes en dråbe vand on the brain skive og omhyggeligt placere den anden optisk glas på toppen af det.
      Bemærk: En dråbe vand bør tilføjes til prøven glas grænser for at forhindre væv tørring og lys spredning fra ru overflader.
  3. Måling af lys transmission gennem hovedet væv
    1. Oprettet den optisk udstyr, herunder laserenhed, som afspejler spejle og power meter enhed.
      Forsigtig: Sat på beskyttende øje beskyttelsesbriller forud for at aktivere laser.
    2. I mangel af en stikprøve på wattmeteret, tænde laserenhed og fokusere laserstrålen på spejlet, der er placeret på den korrekt afstand for at vejlede strålen vinkelret på den fotodiode aktive område.
      Bemærk: Lystransmission målinger skal udføres i et mørkekammer ved stuetemperatur (23-25 ° C), inden for 30 min efter hoved væv er blevet udvundet.
    3. Udfør målinger på de skivede hjernevæv.
      1. Placer to tomme optisk glas på overfladen af wattmeteret.
      2. Læs den overførte lys magt (jeg0) fra wattmeterets skærm og optage værdien.
      3. Forsigtigt hjernen prøven, som er omfattet af to optiske glas, anbringes på overfladen af wattmeteret, fokusere strålen på det væv respektive område, læse den overførte effekt og optage værdien.
    4. Udfør målinger på kraniet plus hovedbunden.
      1. Placer en tom optisk glas på overfladen af wattmeteret.
      2. Læs den overførte lys magt (jeg0) fra wattmeterets skærm og optage værdien.
      3. Let Placer en optiske glas med frisk kraniet plus hovedbunden væv på overfladen af wattmeteret, matche lysstrålen på bregma zonen, læse den overførte effekt og optage værdien.
      4. For at maksimere signal til støjforhold, Gentag lystransmission måling mindst 3 x for alle prøver.
        Bemærk: Bregma zonen er placeret i en ca. 3 mm rostralt for en streg gennem den forreste base af ørerne. Tykkelse af kraniet plus hovedbunden væv er målt af en standard caliper.

2. Photobiomodulation terapi (PBMT)

Bemærk: 45 mandlige BALB/c mus tildelt tre grupper af 15 mus blev brugt. Grupperne blev sammensat af unge-kontrol mus (2 måneder), der modtog sham-PBMT, alderen-kontrol mus (18 måneder), der modtog sham-PBMT og alderen-PBMT mus (18 måneder), der modtog PBMT. Humbug-PBMT behandling bestod af behandling identisk med PBMT gruppe men med laser inaktive. Mus blev indhentet fra de dyr facilitet i Tabriz University of Medical Sciences og blev huset i dyret holde enhed af neurovidenskab Research Center (NSRC) på 24-25 ° C og 55% relativ luftfugtighed, med en 12-timers lys og 12 h mørke lysperiode. Mad og vand blev leveret ad libitum. Alle mus blev akklimatiseret til mindst 1 uge før behandling.

  1. Laser behandling procedure
    Bemærk: En diode GaAlAs laser med kontinuert bølge mode på 660 nm bølgelængde blev brugt til transkranial PBMT behandling. Laserenhed blev drevet på en udgangseffekt på 200 ± 2 mW og en irradians 6,66 W/cm2, med en spot størrelse på 0,03 cm2. En gennemsnitlig fluens 99,9 Jørgensen/cm2 pr. hver session blev leveret til hovedbunden overfladen for 15 s af bestråling. Bestråling blev administreret 1 x dagligt i 2 uger i træk.
    1. Bringe mus i deres hjem bure til terapi værelse, ca 20 min før begynder behandlingen.
    2. Slutte en elektrisk protector til stikkontakten i væggen.
    3. Indsæt laser enhed stik i en elektrisk protector.
    4. Dække spidsen af laser-sonden med en gennemsigtig nylon film for at forhindre eventuelle ridser på overfladen.
    5. Nøje tilsluttes sonden kanal af laserenhed.
    6. Slår laser enheden og vent et par sekunder for at varme op.
    7. Justere parametrene laser-behandling, herunder bestråling tid og drift tilstand.
    8. I mangel af nogen prøver, bestemme laser gennemsnitlige magt ved at kontakte spidsen af sonde til det aktive område af wattmeteret på laserenhed. Optage værdien.
    9. Gentag kalibrering proces (trin 2.1.8) mindst 5 x, læse de hændelse beføjelser fra wattmeterets skærm, og optage værdierne.
    10. Forsigtigt holde en mus i dorsale huden af dyrets hals i en hule hånd og immobilisere sit hoved.
      Bemærk: I den nuværende protokol, laser sonden er placeret på den bregma zone, som er ~ 3 mm rostralt for en linje trukket mellem den indre base af ørerne.
    11. Let placere spidsen af prøvetagningssonden direkte på hovedbunden på midterlinjen, ca 3 mm rostralt for en streg gennem den forreste base af ørerne.
      Bemærk: Hold sonden på en cirka 45° vinkel ud til flyet i maven.
    12. For at undgå direkte bestråling til dyrets øjne, første kontakt spidsen af sonden på hovedet, og tænd derefter, laserenhed.
    13. Drej på laser og stabilt hold sonden indtil afslutningen af bestråling.
    14. Efter afslutningen af behandlingen, trække laser sonden fra hovedet og forsigtigt returnere musen til sit bur.
    15. Slår laser enheden, og frakobl sonden fra enheden.
    16. Ren laser sonden med en passende optisk renere.
    17. Overføre mus til det animalsk facilitet.

3. adfærdsmæssige opgaver

  1. Open-felttest
    1. Vurdere den bevægeapparatet aktivitet i hvert mus af den samlede afstand under en open-field test, som beskrevet tidligere15.
  2. Barnes labyrint opgave
    1. Apparater
      Bemærk: Den rumlige indlæring og hukommelse opgave er udført i en Barnes labyrint16. De apparater, der anvendes til denne neurobehavioral opgave består af en rund platform lavet af sort træ (95 cm i diameter) med 20 ækvidistante, 5 cm-diameter cirkulære huller, der er placeret på platformen, 3 cm fra kanten. Apparatet er hævet 50 cm fra gulvet til at forhindre, at dyret klatring. En bevægelig sort plast undslippe boks (20 cm x 15 cm x 5 cm) er placeret under flugt hul. En sort labyrint anvendes til afprøvning af hvide mus, og en sort mat skal placeres under labyrinten, når en software tracking system anvendes.
      1. Placer apparatet labyrint midt i et stille rum med lyse ovenlyset.
      2. Placere et "Ikke indtaste" tegn på ydersiden af døren opgave.
      3. Tillægge bymuren visual-spatial stikord.
      4. Placer en digital video kamera over labyrint platform.
      5. Rengøre overfladen på labyrint platformen med 70% ethanol til at fjerne uønskede olfaktoriske stikord.
      6. Tilføje en lille mængde af sengetøj fra dyrets hjem bur til indersiden af boksen flugt til at tjene som en olfaktoriske cue.
    2. Tilpasning session
      1. Bringe hver mus til opgave værelse ca 30 min før begynder eksperiment, i rækkefølge for at musen kan blive vant.
      2. Fjerne musen fra sit bur og forsigtigt placere dyret i boksen flugt for 1 min.
    3. Træningspasset
      Bemærk: Træningspasset gentages for hver musen på 4 dage i træk.
      1. Forsigtigt fjerne musen fra boksen undslippe.
      2. Placer musen på midten af arenaen; Anbring start salen på toppen af musen.
      3. Fjerne start salen efter 10 s, og lad musen til at udforske arena i 3 min.
      4. Stille og roligt gå til computer område og sat på støjreducerende hovedtelefoner.
      5. Udløse en negativ auditiv stimulering består af en kraftig hvid støj på ca 80 dB på niveauet platform og begynde videooptagelser musen.
      6. Sluk hvid støj og stoppe videooptagelser når musen ind boksen undslippe. Tillade, at dyr skal forblive uforstyrret i feltet efter 1 min.
      7. Fjerne musen fra boksen flugt og læg det tilbage i sit bur.
      8. Gentag trin 3.4.2 gennem 3.4.7 4 x om dagen, med 3 min. mellemrum mellem gentagne forsøg.
        Bemærk: Mellem alle forsøg, fjerne urin eller afføring fra arena overflade og rense labyrint med 70% ethanol.
    4. Sonden retssag session
      1. Efter sidste træning retssagen fjerne 24 timer senere, boksen flugt fra labyrint platform og gentage trin 3.4.2 gennem 3.4.5.
      2. Efter 3 min, sluk hvid støj og stoppe videooptagelser. Fjerne musen fra labyrint arena og læg det tilbage i sit bur.
      3. Efter alle dyr er blevet testet, rene labyrint platform og start kammer. Slå værelse lys og fjerne tegnet "Ikke ind" fra døren.
      4. Gemme videooptagelser fra de test sessioner til en ekstern harddisk til yderligere analyse.
      5. Konfigurer den video-tracking softwareprogram og ekstrakt parametre af interesse fra de optagede videoer, herunder den tid at finde målet hullet i løbet af 4 dage af uddannelsesmøder og tid tilbragt i target quadrant under sonde retssag session.

4. biokemiske vurdering

  1. ATP niveauer i hippocampus
    1. Dybt bedøver hver mus med en intraperitoneal injektion af en blanding af ketamin (100 mg pr. gram af kropsvægt) og xylazin (10 mg per gram af kropsvægt).
    2. Hug hovedet af dyret og hurtigt fjerne hjernevæv fra kraniet.
    3. Dissekere ud hippocampus og homogeniseres væv i iskold prøvebuffer (forudsat af sættet) med et væv homogeniseringsapparat.
    4. Straks centrifugeres homogenatet på 2.000 x g i 3 min. ved 4 ° C.
    5. Overføre supernatanten til en ren rør.
    6. Vurdere de hippocampus ATP niveauer, ved hjælp af en Spektrofotometrisk metode som tidligere beskrevet11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Statistiske analyser

Den statistiske analyse af data indhentet fra Barnes træningssessioner blev analyseret af to-vejs ANOVA; andre adfærdsmæssige test og analyse af hippocampus ATP niveauer blandt grupper blev udført af en-vejs ANOVA, efterfulgt af Tukey's post hoc test. Alle data er udtrykt som middel ± standardafvigelsen på middelværdien (SEM), med undtagelse af laser transmission data, der er vist som middel ± standardafvigelse (SD). Signifikansniveauet blev sat på p < 0,05.

Laser lys transmission

Laserlys (660 nm) transmission gennem kraniet plus hovedbunden væv (med en prøve tykkelse af 0.85 ± 0,09 mm) i alderen mus var 15.67% ± 0.87% når en laserstråle var fokuseret på bregma (figur 1). Baseret på denne lystransmission, siden den oprindelige fluens på hovedbunden overfladen var 99,9 Jørgensen/cm2 (6,66 [W/cm2] x 15 [s]), kunne det anslås, at en omtrentlig fluens 16 J/cm2 nåede den kortikale overflade.

Laser transmittans, gennem en 1 mm skive af alderen hjernevæv, var 10.10% ± 0,95% (figur 1). Fra disse værdier, kan det anslås, at lys fluensen faldt fra 16 J/cm2 på hjernebarken væv plan til ca 1,6 Jørgensen/cm2 1 mm dybde fra den kortikale overflade.

Open field test

Der var ingen statistisk signifikant forskel i bevægeapparatet aktivitet i open-field test blandt alle eksperimentelle grupper (figur 2).

Barnes labyrint opgave

Når undslippe latency blev analyseret i løbet af 4 dage af uddannelse og med eksperimentelle grupper under Barnes labyrint opgave, en to-vejs ANOVA afsløret betydelige virkninger i dag (p < 0,001) og gruppen (p < 0,001), men ikke en gruppe x dag (p = 0,47). En tværpolitisk gruppe analyse af data viste, at latency tider med alderen-kontroldyr var betydeligt længere end de af unge til kontrolgruppe på tredje (p < 0,01) og fjerde (p < 0,001) dage af træningspasset. Latency gange af de PBMT-behandlet alderen mus var imidlertid væsentligt kortere på den fjerde dag (p < 0,05), sammenlignet med alderen-kontrol mus (p < 0,01) (figur 3). I samlingen sonde retssag tilbragte alderen-kontrol mus betydeligt kortere gange i target kvadrant, sammenlignet med unge-kontrol mus (p < 0,01). Dog PBMT-behandlet alderen mus brugt betydeligt længere gange i target kvadrant sammenlignet med alderen-kontrol mus (p < 0,05) (figur 4).

Hippocampus ATP niveauer

Alderen-kontrol mus havde en betydelig nedgang i hippocampus ATP niveauer, sammenlignet med unge-kontrol mus (p < 0,05). Men de gennemsnitlige ATP indholdet i hippocampus af alderen-PBMT mus var betydeligt større end dem i alderen-kontrol mus (p < 0,05) (figur 5).

Figure 1
Figur 1 : Laser lys transmission data gennem kraniet plus hovedbunden og hjernevæv. Data er udtrykt i gennemsnit ± SD. SD = standardafvigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Bevægeapparatet aktivitetsdata fra open-felt test. Data er udtrykt i den gennemsnit ± SEM. PBMT = photobiomodulation terapi; SEM = standard fejl af middelværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Undslippe ventetid for mus grupper i 4 dage af uddannelsesmøder. Værdierne repræsenterer de gennemsnit ± SEM. **p < 0,01 og ***p < 0,001, sammenlignet med unge-kontrol mus. # p < 0,05, sammenlignet med alderen-kontrol mus. PBMT = photobiomodulation terapi; SEM = standard fejl af middelværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Brugt tid i målet kvadrant i sonde-session i forskellige grupper. Værdierne repræsenterer de gennemsnit ± SEM. **p < 0,01, sammenlignet med unge-kontrol mus. # p < 0,05, sammenlignet med alderen-kontrol mus. PBMT = photobiomodulation terapi; SEM = standard fejl af middelværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : ATP indholdet i hippocampus væv. Værdierne repræsenterer de gennemsnit ± SEM. *p < 0,05, sammenlignet med unge-kontrol mus. # p < 0,05, sammenlignet med alderen-kontrol mus. PBMT = photobiomodulation terapi; SEM = standard fejl af middelværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi beskriver en protokol til at foretage en transkranial PBMT procedure i mus. Denne protokol er specifikt målrettet til neurovidenskab laboratorier, der udfører photobiomodulation forskning fokuseret på gnavere. Men denne protokol kan tilpasses andre forsøgsdyr, der ofte bruges i feltet neurovidenskab, som kanin, kat, hund eller abe.

I øjeblikket, er der stigende interesse for at undersøge transkranial PBMT med rød/NIR lasere og lysdioder. For at gennemføre hele behandlingen procedure i gnavere, er der et par væsentlige skridt til at overveje.

For det første er det kritisk, at, før du forsøger eventuelle behandlinger med levende dyr, den lysgennemtrængning netop måles gennem hovedet dyrevæv for at levere en optimal photon dosering (J/cm2).

Andet, baseret på hvilke områder af hjernen er påvirket af patologi og målrettet behandling, flere parametre skal skal optimeres, at maksimere lys penetration og øge sandsynligheden for positive resultater. Disse omfatter bestråling tid, behandling interval, anvendt irradians og fluens. For eksempel, i de ældre dyremodeller er det afgørende at levere tilstrækkelig strålingsdosis til hjernen hippocampus og frontale cortex, fordi disse regioner er knyttet til aldersbetingede patologier2. En optimal fluens sats i målvæv er en anden vigtig faktor i PBMT. De fleste forskere drøfte faktorer, der påvirker lystransmission men ofte forsømmer at overveje at et bifasisk respons i hjerne målvæv findes ikke kun for fluens (J/cm2), men også for satsen af fluens levering. Med andre ord er en fluens 1 J/cm2 leveret mere end 1 min ikke svarer til 1 J/cm2 leveret over 1 s17,18.

Der er flere yderligere faktorer, der bør også overvejes før den udfører transkranial PBMT undersøgelser. Transcranial PBMT i gnavere er almindeligt anvendt ved hjælp af laser eller lysdioder sonder med sonden tip størrelse skaleret til dyrets hjerne størrelse. Til anvendelse i gnavere, moderat-power lasere (med en effekt på ≤ 500 mW) kan levere en stor mængde af lys energi på kort tid og reducere indvirkningstid og behandling vedrørende stress til dyret. Selvom klasse 3B lasere ikke har betydelig photothermal effekter i PBMT dosering intervaller (≤20 Jørgensen/cm2), anbefales køling hovedbunden overfladen med et gennemsigtigt optisk stof, såsom is eller gel, under transkranial ansøgning.

I nogle eksperimentelle transkranial PBMT undersøgelser bruges optisk fiber istedet for en laser eller en LED sonden, på grund af dens fordele for bestråling af en bestemt lille område på hovedet. For eksempel, i fokale iskæmisk slagtilfælde, TBI, og PD modeller, en nøjagtig bestråling af det beskadigede område er berettiget. Optiske fibre har dog generelt en lille stråle område, så dette vil påvirke den samlede energi leveret i én session og vil kræve forskere til at gentage denne procedure på mere end ét sted at kompensere for nedsat området. Mest eksperimenterende transkranial PBMT undersøgelser gennemføres bestråling af hovedet i alert, sig dyret. For at sikre dyrs stabilitet, anbefales manuel hoved besiddelse og brug af fastholdelsesanordninger. I den manuelt holding metode, på grund af det faktum, at dyr flytter pludselig og eventuelt flytte hovedet fra zonen bestråling, en del af bestrålede lys kan være spildt. Desuden, begge metoder kan fremkalde ekstra stress til dyret og kunne være en potentiel konfunderende faktor. I nogle tilfælde er bestråling procedure udført i et bedøvede dyr. Det skal bemærkes, at for meget anæstesi kan påvirke de eksperimentelle resultater i neurovidenskab undersøgelser. Derfor bør et kortere interval på bestråling overvejes nøje i disse typer af forsøg.

I den foreliggende undersøgelse, vi først målte transmission af lys gennem kraniet plus hovedbunden af mandlige BALB/c alderen mus for at bestemme mængden af 660 nm laser energi, der nåede den kortikale overflade. Resultaterne viste, at 16% af den oprindelige lys på overfladen af unshaved hovedbunden blev overført gennem til hjernen. Transmission data fra andre laboratorier i mandlige BALB/c mus har vist, at kun 1,2% af 670 nm laserlys var i stand til at trænge ind intakt kraniet19. Det er også blevet rapporteret, at omkring 90% af 670 nm LED lys er svækket inde i musen kranium20.

Den effektive neurostimulatory dosis af den røde laser på niveauet kortikale væv blev bekræftet i en tidligere undersøgelse udført i vores laboratorium11. Vi viste, at en daglig kortikale fluens af en 8 J/cm2 laser på 660 nm har procognitive virkninger i en mus aldersfordelte model11. I afsnittet behandling af den aktuelle undersøgelse for at levere ca 16 J/cm2 kortikale overflade, vi skulle forlade laser på 15 s, som blev tolereret af mus. I det foreliggende arbejde målt vi også lys magt modtaget på hippocampus overflade. Baseret på resultaterne af eksperimentet, en tilnærmet værdi af 10% blev målt som laser transmittans gennem en 1 mm skive af alderen hjerne, svarende til en lys fluens ca 1,6 Jørgensen/cm2 nåede 1 mm dybe fra den kortikale overflade. Data fra andre undersøgelser ved hjælp af BALB/c mus hjerne har afsløret en 65% reduktion af 670 nm LED lysintensitet på tværs af hver millimeter af cerebral væv21. Det har også vist at ca. 2,5% af 670 nm LED lys når en dybde i hjernevæv af 5 mm, afstanden fra kraniet overflade til substantia nigra compacta (SNc) område22.

Hippocampus spiller en kardinal rolle i konsolideringen af rumlig hukommelse23. I virkeligheden, er hippocampus bioenergetik kapacitet forbundet med rumlige navigation hukommelse og indlæring. Resultaterne præsenteres her tyder på, at en lys dosering af ca 1,6 Jørgensen/cm2 på hippocampus plan kunne være tilstrækkelig til at medføre en forbedring af rumlig hukommelse resultater i alderen mus. Det kan formodes, at en forbedring af hukommelse ydeevne i kognitiv-adfærdsmæssige opgaven (Barnes labyrint) kunne være på grund af en forbedring af hippocampus energi stofskifte, der synes at være fremkaldt af en rød laser med en bestemt bølgelængde på 660 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

P.C.'s løn blev støttet af Harvard psykiatri afdeling (Dupont-Warren Fellowship og Livingston Award), af hjerne og opførsel Research Foundation (NARSAD Young Investigator Award), og af Photothera Inc. ubegrænset grant. Drug donation kom fra TEVA. Rejse godtgørelse kom fra Pharmacia-Upjohn. P.C. har modtaget høring gebyrer fra Janssen forskning og udvikling. P.C. har indgivet flere patenter relateret til brugen af nær-infrarødt lys i psykiatri. PhotoMedex, Inc. leveres fire enheder for en klinisk undersøgelse. P.C. har fået ubegrænset finansiering fra Litecure Inc. til at gennemføre en undersøgelse af transkranial photobiomodulation til behandling af større depressive lidelser og at foretage en undersøgelse på raske forsøgspersoner. P.C. cofounded et selskab (Niraxx lys Therapeutics) fokuseret på udviklingen af nye retningslinjer for behandling baseret på nær-infrarødt lys; Han er også en konsulent til samme virksomhed. P.C. modtaget støtte fra Cerebral videnskaber til at gennemføre en undersøgelse om transkranial photobiomodulation for generaliseret angst. Andre forfattere har ingen interessekonflikter at videregive.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Tabriz University of Medical Sciences (Giv nr. 61019) til S.S.-E. og en publikation tilskud fra LiteCure LLC, Newark, DE, USA til L.D.T. Forfatterne vil gerne takke immunologi Institut og uddannelse udvikling Center (EDC) i Tabriz University of Medical Sciences for deres venlige assistance.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Alfasan #1608234-01
Xylazine Alfasan #1608238-01
Agarose Sigma #A4679
Superglue Quickstar
Vibratome Campden Instruments #MA752-707
Optical glass Sail Brand #7102
Power meter Thor labs #PM100D
Photodiode detector Thor labs #S121C
Caliper Pittsburgh
GaAlAs laser Thor Photomedicine
Etho Vision Noldus
Centrifuge Froilabo #SW14R
Earmuffs Blue Eagle
Digital camera Visionlite #VCS2-E742H
Sterio amplifier Sony
Ethanol Hamonteb #665.128321
Barnes maze Costom-made
ATP assay kit Sigma #MAK190
Elisa reader Awareness #Stat Fax 2100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of Biomedical Engineering. 40, (2), 516-533 (2012).
  2. Salehpour, F., et al. Brain Photobiomodulation Therapy: a Narrative Review. Molecular Neurobiology. 1-36 (2018).
  3. Hamblin, M. R. Shining light on the head: photobiomodulation for brain disorders. BBA Clinical. 6, 113-124 (2016).
  4. Karu, T. I., Pyatibrat, L. V., Kolyakov, S. F., Afanasyeva, N. I. Absorption measurements of a cell monolayer relevant to phototherapy: reduction of cytochrome c oxidase under near IR radiation. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 81, (2), 98-106 (2005).
  5. de Freitas, L. F., Hamblin, M. R. Proposed mechanisms of photobiomodulation or low-level light therapy. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 22, (3), 348-364 (2016).
  6. Xuan, W., Vatansever, F., Huang, L., Hamblin, M. R. Transcranial low-level laser therapy enhances learning, memory, and neuroprogenitor cells after traumatic brain injury in mice. Journal of Biomedical Optics. 19, (10), 108003 (2014).
  7. DeTaboada, L., et al. Transcranial application of low-energy laser irradiation improves neurological deficits in rats following acute stroke. Lasers in Surgery and Medicine: The Official Journal of the American Society for Laser Medicine and Surgery. 38, (1), 70-73 (2006).
  8. De Taboada, L., et al. Transcranial laser therapy attenuates amyloid-β peptide neuropathology in amyloid-β protein precursor transgenic mice. Journal of Alzheimer’s Disease. 23, (3), 521-535 (2011).
  9. Oueslati, A., et al. Photobiomodulation suppresses alpha-synuclein-induced toxicity in an AAV-based rat genetic model of Parkinson’s disease. PloS One. 10, (10), e0140880 (2015).
  10. Xu, Z., et al. Low-level laser irradiation improves depression-like behaviors in mice. Molecular Neurobiology. 54, (6), 4551-4559 (2017).
  11. Salehpour, F., et al. Transcranial low-level laser therapy improves brain mitochondrial function and cognitive impairment in D-galactose–induced aging mice. Neurobiology of Aging. 58, 140-150 (2017).
  12. Grady, C. The cognitive neuroscience of ageing. Nature Reviews Neuroscience. 13, (7), 491 (2012).
  13. Beal, M. F. Mitochondria take center stage in aging and neurodegeneration. Annals of Neurology. Official Journal of the American Neurological Association and the Child Neurology Society. 58, (4), 495-505 (2005).
  14. Lu, Y., et al. Low-level laser therapy for beta amyloid toxicity in rat hippocampus. Neurobiology of Aging. 49, 165-182 (2017).
  15. Seibenhener, M. L., Wooten, M. C. Use of the open field maze to measure locomotor and anxiety-like behavior in mice. Journal of Visualized Experiments. (96), e52434 (2015).
  16. Rosenfeld, C. S., Ferguson, S. A. Barnes maze testing strategies with small and large rodent models. Journal of Visualized Experiments. (84), e51194 (2014).
  17. Huang, Y. Y., Chen, A. C. H., Carroll, J. D., Hamblin, M. R. Biphasic dose response in low level light therapy. Dose Response. 7, (4), 358-383 (2009).
  18. Mohammed, H. S. Transcranial low-level infrared laser irradiation ameliorates depression induced by reserpine in rats. Lasers in Medical Science. 31, (8), 1651-1656 (2016).
  19. Zhang, Y., Zhang, C., Zhong, X., Zhu, D. Quantitative evaluation of SOCS-induced optical clearing efficiency of skull. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 5, (1), 136 (2015).
  20. Shaw, V. E., et al. Neuroprotection of midbrain dopaminergic cells in MPTP-treated mice after near-infrared light treatment. Journal of Comparative Neurology. 518, (1), 25-40 (2010).
  21. Moro, C., et al. Photobiomodulation inside the brain: a novel method of applying near-infrared light intracranially and its impact on dopaminergic cell survival in MPTP-treated mice. Journal of Neurosurgery. 120, (3), 670-683 (2014).
  22. Reinhart, F., et al. The behavioural and neuroprotective outcomes when 670 nm and 810 nm near infrared light are applied together in MPTP-treated mice. Neuroscience Research. 117, 42-47 (2017).
  23. Sadowski, M., et al. Amyloid-β deposition is associated with decreased hippocampal glucose metabolism and spatial memory impairment in APP/PS1 mice. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 63, (5), 418-428 (2004).
En protokol til transkranial Photobiomodulation terapi i mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Salehpour, F., De Taboada, L., Cassano, P., Kamari, F., Mahmoudi, J., Ahmadi-Kandjani, S., Rasta, S. H., Sadigh-Eteghad, S. A Protocol for Transcranial Photobiomodulation Therapy in Mice. J. Vis. Exp. (141), e59076, doi:10.3791/59076 (2018).More

Salehpour, F., De Taboada, L., Cassano, P., Kamari, F., Mahmoudi, J., Ahmadi-Kandjani, S., Rasta, S. H., Sadigh-Eteghad, S. A Protocol for Transcranial Photobiomodulation Therapy in Mice. J. Vis. Exp. (141), e59076, doi:10.3791/59076 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter