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Neuroscience

Ein Protokoll für die transkranielle Photobiomodulation Therapie bei Mäusen

doi: 10.3791/59076 Published: November 18, 2018

Summary

Photobiomodulation Therapie ist eine innovative nicht-invasive Modalität für die Behandlung einer Vielzahl von neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen und auch gesunde Gehirnfunktion verbessern kann. Dieses Protokoll enthält eine schrittweise Anleitung zum Durchführen von Gehirn Photobiomodulation bei Mäusen durch transkranielle Lichtleitung, die für den Einsatz in anderen Labors Nagetiere angepasst werden können.

Abstract

Transkranielle Photobiomodulation ist eine mögliche innovative nicht-invasive therapeutische Ansatz zur Verbesserung der Gehirn Bioenergetik, Gehirnfunktion in einer Vielzahl von neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen und Gedächtnisverbesserung in altersbedingte kognitive Abnahme und Neurodegenerative Erkrankungen. Wir beschreiben eine Laborprotokoll für transkranielle Photobiomodulation Therapie (PBMT) bei Mäusen. Im Alter von BALB/c Mäuse (18 Monate) sind mit einem 660 nm Laser Transcranially, einmal täglich für 2 Wochen behandelt. Laserdaten Durchlässigkeit zeigt, dass etwa 1 % des einfallenden Lichts rot auf der Kopfhaut eine 1 mm Tiefe von der kortikalen Oberfläche Eindringen des dorsalen Hippocampus erreicht. Behandlungsergebnisse werden durch zwei Methoden bewertet: eine Barnes Labyrinth-Test, der eine Hippocampus-abhängige räumliche lernen und Gedächtnis Aufgabe Bewertung und hippocampal ATP Messhöhen, die als Bioenergetik-Index verwendet wird. Die Ergebnisse von Barnes Aufgabe zeigen eine Erweiterung des räumlichen Gedächtnisses laserbehandelten im Alter von Mäusen im Vergleich zu Kontrollen Alter abgestimmt. Biochemische Analyse nach Laserbehandlung gibt an erhöhten hippocampal ATP Niveaus. Wir postulieren, dass die Verbesserung der Gedächtnisleistung möglicherweise durch eine Verbesserung der hippocampalen Energiestoffwechsel induziert durch die roten Laser-Behandlung ist. Die Beobachtungen bei Mäusen könnte auf anderen Tiermodellen ausgeweitet werden, da dieses Protokoll möglicherweise auf andere Arten häufig verwendet in den translationalen Neurowissenschaften, wie Kaninchen, Katze, Hund oder Affe angepasst werden könnte. Transkranielle Photobiomodulation ist eine sichere und kostengünstige Modalität, die eine vielversprechende Therapieansatz bei altersbedingten kognitiven Beeinträchtigung sein kann.

Introduction

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PBMT oder Low-Level-Laser-Licht-Therapie (LLLT), ist ein allgemeiner Begriff, der zu therapeutischen Methoden basierend auf die Stimulation von biologischen Geweben von Lichtenergie von Laser oder Leuchtdioden (LEDs). Fast alle PBMT Behandlungen gelten mit roten Nahinfrarot (NIR) Licht im Wellenlängenbereich von 600 bis 1100 nm, eine Ausgangsleistung von 1 bis 500 mW und einer Fluenz von < 1 bis > 20 J/cm2 (siehe Chung Et Al.1).

Transcranial PBMT ist eine nicht-invasive Lichtleitung-Methode, die durch Bestrahlung des Kopfes mit einer externen Lichtquelle (Laser oder LED)2durchgeführt wird. Für Tier-Applikationen beinhaltet diese Methode Kontakt oder berührungslose Platzierung der LED oder Laser-Sonde auf den Kopf des Tieres. Abhängig von der therapeutischen Region von Interesse kann eine leichte Sonde über den ganzen Kopf (zur Deckung der Hirnareale) oder einen bestimmten Teil des Kopfes, wie z. B. der präfrontalen, frontalen und parietalen Region platziert werden. Die teilweise Übertragung von rot/NIR Licht durch die Kopfhaut, die Schädel und die Dura Mater erreichen die kortikalen Oberflächenniveau und bieten eine Menge an Photonen-Energie ausreicht, um die therapeutischen Vorteile bringen. Anschließend würde der gelieferten leichte Fluence auf kortikale Ebene in der grauen und weißen Hirnsubstanz weitergegeben, bis sie die tieferen Strukturen des Gehirns3erreicht.

Licht in die spektrale Bänder an die rote bis dunkelrote Region (600-680 nm) und frühen NIR (800-870 nm) entspricht dem Absorptionsspektrum von Cytochrom C Oxidase, das terminal Enzym der mitochondrialen Atmungskette4. Es wird vermutet, dass PBMT in rot/NIR-Spektrum gelangen von Stickstoffmonoxid (NO) von Cytochrom C Oxidase verursacht, was zu Erhöhungen der mitochondrialen Elektronentransport und letztlich ATP Generation5 erhöht. In Bezug auf neuronale Anwendungen Gehirn das Potenzial der Neurostimulatory der PBMT mit transkranielle Bestrahlung, die Methoden in einer Vielzahl von präklinischen Studien, einschließlich der Nager-Modelle von Schädel-Hirn-Verletzungen (SHT)-6gemeldet wurden, akuten Schlaganfalls7, Alzheimer-Krankheit (AD)8, Parkinson-Krankheit (PD)9, Depression10und Alterung11.

Hirnalterung gilt eine neuropsychologische Bedingung, die einige kognitive Funktionen wie lernen und Gedächtnis12beeinträchtigt. Mitochondrien sind die primären Organellen verantwortlich für ATP Produktion und neuronale Bioenergetik. Mitochondriale Dysfunktion tritt bekanntermaßen altersbedingte Defizite in Hirnarealen zugeordnet werden, die räumliche Navigation Speicher, z. B. der Hippocampus13verknüpft sind. Da kraniale Behandlung mit rot/NIR Licht in erster Linie Handlungen durch Modulation der mitochondrialen Bioenergetik, kann genügend gelieferten Lichtdosis zu Hippocampus bei der Verbesserung des räumlichen Gedächtnisses Ergebnisse14führen.

Das aktuelle Protokoll soll die transkranielle PBMT Verfahren bei Mäusen, die mit niedrigen Niveaus der Rotlicht nachgewiesen werden. Die erforderliche Lichtdurchlässigkeit Lasermessungen durch den Kopf Geweben des gealterten Mäusen werden beschrieben. Darüber hinaus Barnes Labyrinth als Hippocampus-abhängige räumliche Lern- und Gedächtnis-Aufgabe und hippocampal ATP-Werte als Bioenergetik-Index dienen für eine Bewertung der Auswirkungen der Behandlung bei Tieren.

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Protocol

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Alle Verfahren wurden im Einklang mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren von den National Institutes of Health (NIH; durchgeführt Publikation Nr. 85-23, revidiert 1985) und genehmigt durch die regionalen Ethik-Kommission der Tabriz Universität der medizinischen Wissenschaften.

Achtung: Dieses Protokoll umfasst die Anwendung der Klasse 3 b Laser Instrumente und erfordern angemessene Ausbildung und Einhaltung der Sicherheitsrichtlinien. Klasse 3 b Laser können die Augen schädigen und können die Haut erhitzen. Klasse 3 b Laser gelten nicht als eine Verbrennungsgefahr. Auge Schutzbrillen getragen werden müssen zu allen Zeiten beim Betrieb des Laser-Gerätes.

(1) Laser-Licht-Transmission-Experimente

Hinweis: Hier verwendet wurden drei 18-Monate-alten männlichen BALB/c Mäuse aus der Tierhaltung von Tabriz Universität der medizinischen Wissenschaften erhalten. Ein 60 mW Laser (660 nm) mit einem kreisförmigen Strahl von 2,5 mm Durchmesser wird als Lichtquelle verwendet. Die Laserquelle erzeugt ein Zirkular polarisiertes Licht mit einem "glockenförmig" Intensität Profil und in kontinuierliche Welle Modus betrieben wird. Ein kommerzielle Photodiode Leistungsmesser mit einer 10 nW-Auflösung, ein Quadrat 1 cm2 Photodiode aktive Fläche und einem spektrale Bereich von 400 bis 1100 nm wird verwendet, um die übertragenen Lichtleistung durch die Proben zu messen.

  1. Vorbereitung der Probe
    1. Um frische Proben zu erhalten, zu betäuben Sie tief die Maus mit einer Mischung aus Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg).
    2. Die Maus-Kopf mit normalen Schere, ab dem Punkt direkt oberhalb der Schultern zu sezieren.
    3. Drehen Sie den Kopf, so dass die ventrale Seite des Kiefers nach oben zeigt. Schieben Sie abgewinkelten Dissektion Schere glatt durch die Mundhöhle, bis der Widerstand des Unterkiefers Kreuzung bemerkt wird. Schneiden Sie alle große Muskeln, die Verknüpfung des Unterkiefer-Knochens der Schädel und verwerfen.
    4. Entfernen Sie die Pfälzer Gräten, mit abgewinkelten Dissektion Schere.
    5. Entsorgen Sie alle Fruchtfleisch umgibt den Schädel, mit gebogenen Pinzette.
    6. Sezieren Sie den unteren Teil des Schädels zu, und nehmen Sie dann vorsichtig das Gehirn aus dem restlichen Schädelknochen mit einem gebogenen Spatel.
    7. Befestigen Sie das intakte Hirngewebe in einem 2 % Agarose-Gel, damit das Gewebe zum Schneiden verwendbar sind.
      Hinweis: Um zu erhalten eine intakte Schädel sowie Kopfhaut Probe, sollte das Hirngewebe der ventralen Seite der Kopf des Tieres ohne Schaden an der dorsalen Teil des Kopfes entnommen werden.
  2. Gehirn schneiden Verfahren
    1. Einen Tropfen Sekundenkleber (~0.05 mL) auf der Oberfläche der Vibratome Befestigungsblock zu verbreiten.
    2. Vorsichtig legen Sie die Agarose-Block auf der Vibratome Montage Block, so dass die ventrale Oberfläche des Gehirns unten ist, und stellen Sie seine Position.
    3. Etwas Spiel Vibratome Klinge auf der oberen Fläche der Agarose-Block und nehmen Sie den Fräser-Wert als der Primarstufe.
    4. Füllen Sie die Vibratome mit eiskalten normalen Kochsalzlösung.
    5. Passen Sie die Vibratome Parameter (z. B. die Scheibendicke [1 mm] Geschwindigkeit [5 von 5 auf Gerät] und Schwingungsfrequenz [5 von 5 auf Gerät]) um zufrieden stellende schneiden zu erhalten.
    6. Schneiden Sie das Gehirn quer in eine Scheibe mit einer 1.000 µm Dicke.
      Hinweis: Die Scheibe ist der Teil des Hirngewebes abgegrenzt durch die kortikalen Oberfläche und eine Ebene positioniert 1.000 µm der kortikalen Oberfläche (dorsale Hippocampus) unterlegen.
    7. Geben Sie einen Tropfen des Wassers (~0.05 mL) auf der Oberfläche von optischem Glas und lege die Gehirn-Scheibe oben drauf. Dann geben Sie einen Tropfen Wasser auf den Gehirn-Scheibe und legen Sie vorsichtig das zweite optische Glas oben drauf.
      Hinweis: Ein Tropfen Wasser sollte auf die Probe Glas Grenzen hinzugefügt werden, um Gewebe trocknen und Lichtstreuung von rauen Oberflächen zu vermeiden.
  3. Messung der Lichttransmission durch den Kopf Gewebe
    1. Optische Geräte, einschließlich das Lasergerät reflektiert, Spiegel und Power-Meter-Einheit eingerichtet.
      Achtung: Setzen Sie auf schützende Auge Brille vor dem Einschalten des Lasers.
    2. In Ermangelung einer Probe auf das Powermeter das Lasergerät einschalten und Fokus des Laserstrahls auf dem Spiegel, der den richtigen Abstand zur Führung des Strahls senkrecht auf die Fotodiode aktiven Bereich befindet.
      Hinweis: Lichtdurchlässigkeit Messungen müssen in einer Dunkelkammer bei Raumtemperatur (23-25 ° C), durchgeführt werden, innerhalb von 30 min nach dem Kopf Gewebe extrahiert wurden.
    3. Messungen Sie auf den in Scheiben geschnittenen Hirngewebe.
      1. Legen Sie zwei leere Gläser auf die Oberfläche des Leistungsmessers.
      2. Lesen Sie die übertragene Lichtleistung (ich0) aus des Leistungsmessers Anzeigeschirm und notieren Sie den Wert.
      3. Sanft legen Sie die Gehirn-Probe, die umgeben ist von zwei optische Gläser, auf der Oberfläche des Leistungsmessers, konzentrieren Sie den Strahl auf die jeweiligen Gewebebereich zu, lesen Sie die übertragene Leistung und notieren Sie den Wert.
    4. Messungen Sie auf den Schädel und die Kopfhaut.
      1. Legen Sie ein leeres optisches Glas auf die Oberfläche des Leistungsmessers.
      2. Lesen Sie die übertragene Lichtleistung (ich0) aus des Leistungsmessers Anzeigeschirm und notieren Sie den Wert.
      3. Leicht platzieren Sie ein optisches Glas mit frischen Schädel plus Kopfhaut-Gewebe auf der Oberfläche des Leistungsmessers, entsprechen den Lichtstrahl auf die Bregma Zone, lesen die übertragene Leistung und notieren Sie den Wert.
      4. Um das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren, wiederholen Sie die Lichtdurchlässigkeit Messung mindestens 3 X für alle Proben.
        Hinweis: Die Bregma Zone befindet sich einer ca. 3 mm rostral zu einer Linie durch die vordere Basis der Ohren. Die Dicke des Schädels sowie Kopfhaut Gewebes wird durch eine standard-Bremssattel gemessen.

2. Photobiomodulation Therapie (PBMT)

Hinweis: 45 männliche BALB/c Mäusen drei Gruppen von 15 Mäuse zugewiesen wurden verwendet. Die Gruppen bestanden aus jungen-Kontroll-Mäusen (2 Monate alt), die Schein-PBMT erhalten, im Alter-Kontroll-Mäusen (18 Monate), die Schein-PBMT erhalten, und im Alter-PBMT Mäuse (18 Monate), die PBMT erhielten. Die Schein-PBMT-Behandlung bestand aus Behandlung identisch mit der PBMT Gruppe, aber mit dem Laser inaktiv. Mäusen stammen aus der Tierhaltung von Tabriz Universität der medizinischen Wissenschaften und im Tier halten Einheit der Neurowissenschaften Research Center (BSFZ) bei 24-25 ° C und 55 % relativer Luftfeuchtigkeit, mit einem 12 h Licht und 12 h dunkel Photoperiode untergebracht waren. Nahrung und Wasser wurden Ad Libitumzur Verfügung gestellt. Alle Mäuse waren für mindestens 1 Woche vor der Behandlung akklimatisiert.

  1. Laser-Behandlung-Verfahren
    Hinweis: Ein GaAlAs Diodenlaser mit kontinuierliche Welle Modus bei 660 nm Wellenlänge diente transkranielle PBMT Behandlung. Die Laser-Gerät wurde auf eine Ausgangsleistung von 200 ± 2 mW und eine Bestrahlungsstärke von 6,66 W/cm2, mit einer Spotgröße von 0,03 cm2betrieben. Eine durchschnittliche Fluenz von 99,9 J/cm2 pro Sitzung lieferte an die Kopfhaut Oberfläche für 15 s der Bestrahlung. Die Bestrahlung war verabreichten 1 X täglich für 2 Wochen.
    1. Therapieraum, ca. 20 min vor Beginn der Behandlung bringen Sie die Mäuse in ihren Käfigen nach Hause.
    2. Einen elektrische Beschützer an die Steckdose anschließen.
    3. Stecken Sie den Laser Gerätestecker in eine elektrische Beschützer.
    4. Decken Sie die Spitze der Laser-Sonde mit einem transparenten Nylon Film um zu verhindern, dass Kratzer auf der Oberfläche ab.
    5. Schließen Sie sorgfältig die Sonde auf den Kanal des Laser-Gerät.
    6. Das Lasergerät einschalten und warten ein paar Sekunden zum Aufwärmen.
    7. Einstellen Sie die Laserbehandlung/Parameter, einschließlich der Bestrahlung Zeit und Betriebs-Modus.
    8. Bestimmen Sie in Abwesenheit von Proben die durchschnittliche Leistung des Lasers durch Kontaktaufnahme mit der Spitze der Sonde in den aktiven Bereich des Leistungsmessers auf dem Lasergerät. Notieren Sie den Wert.
    9. Wiederholen Sie die Kalibrierung (Schritt 2.1.8) mindestens 5 X zu lesen, den Vorfall Kräfte aus des Leistungsmessers Bildschirm, und zeichnen Sie die Werte.
    10. Vorsichtig eine Maus durch die dorsale Haut von den Hals des Tieres in der Handfläche einer Hand zu halten und den Kopf zu immobilisieren.
      Hinweis: In das aktuelle Protokoll der Lasersonde auf der Bregma Zone befindet sich ~ 3 mm rostral, eine Linie zwischen der internen Basis der Ohren ist.
    11. Legen Sie die Sondenspitze leicht direkt auf die Kopfhaut auf der Mittellinie, ca. 3 mm rostral zu einer Linie durch die vordere Basis der Ohren.
      Hinweis: Halten Sie die Sonde in einem ca. 45° Winkel zur Ebene des Bauches.
    12. Zur Vermeidung von direkten Einstrahlung auf das Tier Augen zuerst wenden Sie sich an die Spitze der Sonde auf den Kopf, und schalten Sie dann das Lasergerät.
    13. Schalten Sie den Laser und halten Sie die Sonde bis zum Abschluss der Bestrahlung stabil zu.
    14. Nach dem Ende der Therapie der Kopf der Lasersonde entziehen und sanft die Maus zu seinen Käfig zurückkehren.
    15. Schalten Sie den Lasergerät und trennen Sie die Sonde aus dem Gerät.
    16. Reinigen Sie die Laser-Probe mit einer entsprechenden optischen Reiniger.
    17. Übertragen Sie die Mäuse auf der Tierstation.

(3) Verhaltens Aufgaben

  1. Open-Feldtest
    1. Bewerten der Bewegungsorgane Aktivität jeder Maus durch die insgesamt zurückgelegte Strecke während einer offenen Feldversuch als zuvor beschriebenen15.
  2. Barnes Labyrinth Aufgabe
    1. Apparat
      Hinweis: Die räumliche lernen und Gedächtnis Aufgabe erfolgt in einem Barnes Labyrinth16. Das Gerät für diese Neurobehavioral Aufgabe besteht aus einer runden Plattform aus schwarzem Holz (95 cm Durchmesser) mit 20 gleich weit entfernt, 5 cm Durchmesser Runde Löcher, die auf der Plattform, 3 cm vom Umkreis befinden. Der Apparat ist erhöhte 50 cm über dem Boden zu verhindern, dass das Tier nach unten klettern. Eine bewegliche schwarze Kunststoff-Flucht-Box (20 x 15 cm x 5 cm) befindet sich unter dem Loch zu entkommen. Ein schwarzes Labyrinth ist weiße Mäuse zu Testzwecken verwendet, und eine schwarze Matte sollte unter dem Labyrinth gesetzt werden, wenn eine Software tracking-System verwendet wird.
      1. Legen Sie die Labyrinth-Vorrichtung, in der Mitte ein ruhiges Zimmer mit hellen Beleuchtung.
      2. Setzen Sie ein Zeichen "Geben Sie" auf der Außenseite der Tür Aufgabe.
      3. Befestigen Sie visuell-räumlich Hinweise an den Umfassungswänden.
      4. Positionieren Sie eine digitale Videokamera über der Labyrinth-Plattform.
      5. Reinigen Sie die Oberfläche der Labyrinth-Plattform mit 70 % Ethanol, unerwünschte olfaktorische Signale zu entfernen.
      6. Fügen Sie eine kleine Menge an Einstreu aus das Tier nach Hause Käfig an der Innenseite des Feldes Flucht als eine olfaktorische Cue dienen.
    2. Anpassung-Sitzung
      1. Bringen Sie jede Maus Aufgabe Zimmer ca. 30 min vor Beginn des Experiments, in Reihenfolge für die Maus gewöhnt werden.
      2. Entfernen Sie die Maus aus seinem Käfig und legen Sie das Tier vorsichtig in die Flucht-Box für 1 min.
    3. Trainingseinheit
      Hinweis: Das Training ist für jede Maus an 4 aufeinander folgenden Tagen wiederholt.
      1. Entfernen Sie vorsichtig die Maus aus Feld zu entkommen.
      2. Platzieren Sie den Mauszeiger in die Mitte der Arena; dann setzen Sie die Start-Kammer auf die Maus.
      3. Entfernen Sie die Start-Kammer nach 10 s, und lassen Sie die Maus, um die Arena für 3 min zu erkunden.
      4. Bewegen Sie leise auf den Computerbereich und setzen auf Noise-Cancelling-Kopfhörer.
      5. Lösen Sie eine negative auditive Anregung bestehend aus ein lautes Geräusch von White von etwa 80 dB auf der Bahnsteigebene aus und beginnen Sie, Videoaufnahmen der Maus.
      6. Schalten Sie das weiße Rauschen und stoppen Sie Videoaufnahmen betritt die Maus Feld Flucht zu. Lassen Sie das Tier in der Box für 1 min ungestört bleiben.
      7. Entfernen Sie die Maus aus dem Feld zu entkommen, und setzen Sie es wieder in seinen Käfig.
      8. Wiederholen Sie die Schritte 3.4.2 durch 3.4.7 4 X pro Tag, mit 3 min Intervalle zwischen den wiederholten versuchen.
        Hinweis: Zwischen allen Prüfungen entfernen Sie Urin oder Kot von der Arena-Oberfläche zu und reinigen Sie das Labyrinth mit 70 % Ethanol.
    4. Sonde Probetraining
      1. Im Anschluss an die letzte Ausbildung Prüfung entfernen 24 h später Feld Flucht aus dem Labyrinth-Plattform und wiederholen Sie die Schritte 3.4.2 durch 3.4.5.
      2. Schalten Sie nach 3 min das weiße Rauschen und Videoaufnahmen zu stoppen. Entfernen Sie die Maus von der Labyrinth-Arena und setzen Sie es wieder in seinen Käfig.
      3. Nachdem alle Tiere getestet haben, reinigen Sie die Labyrinth-Plattform und die Start-Kammer. Schalten Sie das Raumlicht und entfernen Sie das Zeichen "Geben Sie" von der Tür.
      4. Speichern Sie die Videoaufnahmen aus der Testsitzungen auf eine externe Festplatte zur weiteren Analyse.
      5. Richten Sie die Video-Tracking-Software-Programm und Extrakt der Parameter von Interesse aus den aufgezeichneten Videos, darunter die Latenzzeit, die Ziel-Loch während 4 Tagen Trainingseinheiten zu finden und die Zeit in der Ziel-Quadranten während die Sonde Probetraining verbrachte.

(4) biochemische Bewertung

  1. ATP-Werte im hippocampus
    1. Jede Maus mit einer intraperitonealen Injektion einer Mischung von Ketamin (100 mg pro Gramm Körpergewicht) und Xylazin (10 mg pro Gramm Körpergewicht) tief zu betäuben.
    2. Enthaupten Sie das Tier zu und entfernen Sie schnell das Hirngewebe aus dem Schädel.
    3. Sezieren Sie, Hippocampus und homogenisieren Sie das Gewebe im eiskalten Probenpuffer (bereitgestellt durch das Kit) mit einem Gewebe-Homogenisator zu.
    4. Zentrifugieren Sie sofort das Homogenat bei 2.000 X g für 3 min bei 4 ° C.
    5. Übertragen des Überstands in ein sauberes Röhrchen.
    6. Bewerten der hippocampal ATP Niveaus, mit die photometrische Methode wie oben beschrieben11.

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Representative Results

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Statistische Analysen

Die statistische Auswertung der Daten aus den Barnes Schulungen wurde von zwei-Wege-ANOVA analysiert; die anderen Verhaltensstörungen Tests und Analyse der hippocampalen ATP-Werte zwischen den Gruppen wurden durch einfache ANOVA, gefolgt von Tukey post-hoc-Test durchgeführt. Alle Daten werden ausgedrückt als ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM), bedeutet mit Ausnahme der Laser Übertragung von Daten, die gezeigt werden, wie ± Standardabweichung (SD) bedeutet. Das Signifikanzniveau wurde auf p < 0,05 festgelegt.

Laser-Licht-transmission

Das Licht des Lasers (660 nm) Übertragung durch den Schädel sowie Kopfhaut Gewebe (mit einer Probendicke von 0,85 ± 0,09 mm) der gealterte Mäuse war 15.67 % ± 0,87 %, wenn ein Laserstrahl auf die Bregma (Abbildung 1) gerichtet war. Basierend auf diesem Lichtdurchlässigkeit, da der erste Fluence auf der Oberfläche der Kopfhaut 99,9 J/cm2 (6,66 [W/cm2] x 15 [s]) war, konnte es geschätzt, dass eine ungefähre Fluence von 16 J/cm2 die kortikale Oberfläche erreicht.

Die Laser-Transmission durch eine 1 mm Scheibe im Alter von Hirngewebe, war 10.10 % ± 0,95 % (Abbildung 1). Aus diesen Werten kann geschätzt werden, dass der leichte Fluence von 16 J/cm2 Ebene der Großhirnrinde Gewebe auf etwa 1,6 J/cm2 1 mm Tiefe von der kortikalen Oberfläche verringert.

Freiland-test

Es gab keine statistisch signifikanten Unterschiede im lokomotorischen Tätigkeit in der offenen Feldversuch unter allen experimentellen Gruppen (Abbildung 2).

Barnes Labyrinth Aufgabe

Wenn die Flucht-Latenz in den 4 Tagen der Ausbildung und mit experimentellen Gruppen während der Barnes Labyrinth Aufgabe analysiert wurde, offenbart eine zwei-Wege-ANOVA signifikante Effekte des Tages (p < 0,001) und Gruppe (p < 0,001), aber keine Gruppe x Tag (p (= 0,47). Eine interfraktionelle Arbeitsgruppe Analyse der Daten zeigte, dass die Latenzzeiten der alten Kontrolltiere deutlich länger als die der jungen-Kontrollgruppe auf der dritten (p < 0,01) und vierte (p < 0,001) Tagen nach der Trainingseinheit. Die Latenzzeiten der PBMT behandelt Alter Mäuse waren jedoch deutlich kürzer, am vierten Tag (p < 0,05), verglichen mit den im Alter-Kontroll-Mäusen (p < 0,01) (Abbildung 3). In der Sonde Probetraining verbrachte im Alter-Kontroll-Mäusen deutlich kürzere Zeiten in der Ziel-Quadrant, verglichen mit den jung-Kontroll-Mäusen (p < 0,01). Jedoch die PBMT behandelt im Alter von Mäusen verbrachte deutlich längere Zeiten im Ziel-Quadranten im Vergleich zu alten-Kontroll-Mäusen (p < 0,05) (Abbildung 4).

Hippocampal ATP-Werte

Im Alter-Kontroll-Mäusen hatte eine signifikante Abnahme der hippocampalen ATP-Werte im Vergleich zu jungen-Kontroll-Mäusen (p < 0,05). Die mittlere ATP-Inhalte im Hippocampus der Alter-PBMT Mäuse waren jedoch deutlich größer als die in der alt-Kontroll-Mäusen (p < 0,05) (Abbildung 5).

Figure 1
Abbildung 1 : Laser-Licht Übertragung von Daten durch den Schädel sowie Kopfhaut und das Hirngewebe. Daten werden ausgedrückt als Mittelwert ± SD SD = Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Bewegungsapparates Aktivitätsdaten aus dem Open-Field-Test Daten sind als Mittelwert ± SEM PBMT ausgedrückt = Photobiomodulation Therapie; SEM = Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Wartezeit für Mäuse Gruppen während der 4 Tage des Trainings zu entkommen. Werte repräsentieren den Mittelwert ± SEM. **p < 0,01 und ***p < 0,001, verglichen mit den jung-Kontroll-Mäusen. # p < 0,05, im Vergleich mit den im Alter-Kontroll-Mäusen. PBMT = Photobiomodulation Therapie; SEM = Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Verweildauer in der Ziel-Quadrant in der Sonde Sitzung in unterschiedlichen Gruppen. Werte repräsentieren den Mittelwert ± SEM. **p < 0,01, verglichen mit den jung-Kontroll-Mäusen. # p < 0,05, im Vergleich mit den im Alter-Kontroll-Mäusen. PBMT = Photobiomodulation Therapie; SEM = Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : ATP Inhalt im Hippocampus Gewebe. Werte repräsentieren den Mittelwert ± SEM. *p < 0,05, im Vergleich mit den jung-Kontroll-Mäusen. # p < 0,05, im Vergleich mit den im Alter-Kontroll-Mäusen. PBMT = Photobiomodulation Therapie; SEM = Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

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Wir beschreiben ein Protokoll für die Durchführung einer transkranielle PBMT Verfahren bei Mäusen. Dieses Protokoll ist gezielt für Neurowissenschaften Laboratorien, die Photobiomodulation Forschung konzentrierte sich auf Nagetiere durchführen. Jedoch kann dieses Protokoll zu anderen Versuchstieren angepasst werden, die häufig im Bereich Neurowissenschaften wie Kaninchen, Katze, Hund oder Affe verwendet werden.

Derzeit gibt es verstärktes Interesse bei der Untersuchung transkranielle PBMT mit rot/NIR Laser und LEDs. Um den gesamten Behandlungsablauf bei Nagetieren erfolgreich durchführen zu können, gibt es ein paar wesentliche Schritte zu prüfen.

Erstens ist es wichtig, dass vor dem Versuch keine Behandlungen mit lebenden Tieren, die Lichtdurchlässigkeit genau durch den Kopf Tiergewebe gemessen wird um eine optimale Photon Dosierung (J/cm2) liefern.

Zweitens müssen basierend auf welche Hirnregionen betroffen Pathologie und gezielt für die Behandlung sind, mehrere Parameter optimiert werden, um maximale Lichtdurchlässigkeit und erhöhen die Wahrscheinlichkeit einer positiven Ergebnissen. Dazu gehören Bestrahlungszeit, Behandlungsintervall, angewandte Bestrahlungsstärke und Fluence. Beispielsweise ist es in dem Alter Tiermodellen entscheidend zu eine ausreichenden Strahlungsdosis auf das Gehirn Hippocampus und frontalen Kortex zu liefern, weil diese Regionen mit altersbedingten Krankheiten2verknüpft sind. Eine optimale Fluenz Rate im Zielgewebe ist ein weiterer wichtiger Faktor in PBMT. Die meisten Forscher diskutieren Faktoren, die Einfluss auf Lichtdurchlässigkeit, aber vernachlässigen oft zu berücksichtigen, dass eine biphasische Reaktion im Gehirn Zielgewebe nicht nur für Fluenz (J/cm2), sondern auch für die Rate der Fluence Lieferung vorhanden ist. Das heißt, entspricht einer Fluenz 1 J/cm2 geliefert über 1 min nicht 1 J/cm2 geliefert über 1 s17,18.

Es gibt mehrere weitere Faktoren, die berücksichtigt werden sollten, vor der Ausführung transkranielle PBMT Studien. Transcranial PBMT bei Nagetieren wird häufig angewendet, mit Laser oder LED-Sonden mit der Sonde Spitzengröße skaliert, der Größe des Tieres Gehirn. Für den Einsatz in Nagetieren, mäßig-Power-Laser (mit einer Leistung von ≤ 500 mW) liefern eine große Menge an Lichtenergie in kurzer Zeit und reduzieren Behandlungszeit und Stress bei der Behandlung auf das Tier. Klasse 3 b Laser müssen, zwar nicht signifikante photothermische Wirkung in PBMT Dosierung reicht (≤20 J/cm2) ist die Kühlfläche der Kopfhaut mit einer transparenten optischen Substanz, wie Eis oder Gel, während transkranielle Anwendung empfohlen.

In einigen experimentellen transkranielle PBMT Studien wird Glasfaser statt einem Laser- oder LED-Sonde, wegen seiner Vorteile für die Bestrahlung von einem bestimmten kleinen Bereich auf dem Kopf verwendet. Für Beispiel, fokalen ischämischen Schlaganfall, SHT, und PD-Modelle, eine präzise Bestrahlung des beschädigten Bereich gerechtfertigt ist. Optische Fasern haben jedoch in der Regel einen kleinen Strahl-Bereich wirken sich die Gesamtmenge der Energie geliefert in einer Sitzung und benötigen Forscher das Verfahren an mehr als einer Stelle zum Ausgleich der verminderten Bereich wiederholen. Bestrahlung des Kopfes ist im alert, unanesthetized Tier in experimentellsten transkranielle PBMT Studien durchgeführt. Zur tierischen Stabilität zu gewährleisten, werden manuelle Kopf halten und die Verwendung von Rückhaltemittel empfohlen. In der Hand halten Methode, aufgrund der Tatsache, dass das Tier plötzlich bewegen könnte und möglicherweise bewegt seinen Kopf von der Bestrahlung Zone entfernt, ein Teil des bestrahlten Licht verschwendet werden könnte. Darüber hinaus könnte beide Methoden können zusätzlichen Stress für das Tier zu induzieren und eine mögliche verwirrende Faktor. In einigen Fällen erfolgt die Bestrahlung Verfahren in einem narkotisierten Tier. Es sei darauf hingewiesen, dass zu viel Anästhesie die experimentellen Ergebnisse in Neurowissenschaften Studien negativ beeinflussen kann. Daher sollte ein kürzeres Intervall Bestrahlung in diesen Arten von Experimenten sorgfältig abgewogen werden.

In der vorliegenden Studie wir zunächst die Übertragung von Licht durch den Schädel vermessen sowie Kopfhaut von männlichen BALB/c im Alter von Mäusen um 660 nm Laser Energiemenge zu bestimmen, die die kortikale Oberfläche erreicht. Die Ergebnisse zeigten, dass 16 % des ursprünglichen Lichts auf der Oberfläche der unrasierten Kopfhaut durch an das Gehirn übertragen wurde. Übertragung von Daten aus anderen Labors bei männlichen BALB/c Mäusen haben gezeigt, dass nur 1,2 % von 670 nm Laserlicht intakt Schädel19eindringen konnte. Es wurde auch berichtet, dass etwa 90 % von 670 nm-LED-Licht im Inneren der Maus Schädel20gedämpft wird.

Die effektive Neurostimulatory Dosierung des roten Lasers auf der Ebene der kortikalen Gewebe wurde in einer früheren Studie, durchgeführt in unserem Labor11bestätigt. Wir zeigten, dass eine tägliche kortikalen Fluence ein 8 J/cm2 Laser bei 660 nm Procognitive wirkt in einer Maus Alterung Modell11. Im Abschnitt "Therapie" der aktuellen Studie etwa liefern 16 J/cm2 an die kortikalen Oberfläche mussten wir den Laser hinterlassen für 15 s, die von den Mäusen toleriert wurde. In der vorliegenden Arbeit haben wir auch die Lichtleistung, die an der Oberfläche Hippokampus erhielt gemessen. Basierend auf den Ergebnissen des Experiments, ein Richtwert von 10 % wurde gemessen, wie laser-Transmission durch eine 1 mm Scheibe im Alter von Gehirn, entspricht einer leichten Fluence von ca. 1,6 J/cm2 1 mm Tiefe von der kortikalen Oberfläche zu erreichen. Daten aus anderen Studien mit BALB/c Mausgehirn haben eine Ermäßigung von 65 % von 670 nm LED Lichtstärke über jeden Millimeter der zerebralen Gewebe21ergeben. Es hat auch gezeigt, dass ca. 2,5 % von 670 nm-LED-Licht eine Tiefe in das Hirngewebe von 5 mm, der Abstand von der Oberfläche der Schädel in der Substantia Nigra Compacta (SNc) Bereich22erreicht.

Der Hippocampus spielt eine maßgebliche Rolle bei der Festigung des räumlichen Gedächtnisses23. In der Tat ist die hippocampale Bioenergetik Kapazität verbunden mit räumlicher Navigation Gedächtnis und lernen. Die hier vorgestellten Ergebnisse legen nahe, dass eine leichte Dosierung von ca. 1,6 J/cm2 Ebene der Hippocampus ausreichen, um eine Verbesserung der räumlichen Gedächtnisses Ergebnisse in Alter Mäuse produzieren sein könnte. Es könnte vermutet werden, dass eine Verbesserung der Gedächtnisleistung in der kognitiv-verhaltenstherapeutischen Aufgabe (Barnes Labyrinth) könnte durch eine Verbesserung der hippocampalen Energiestoffwechsel, die scheinbar von einem roten Laser bei einer bestimmten Wellenlänge von 660 induziert werden nm.

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Disclosures

Die P.C. Gehalt wurde unterstützt von der Harvard-Psychiatrie-Abteilung (Dupont-Warren Fellowship und Livingston Award), durch das Gehirn und Verhalten Research Foundation (NARSAD Young Investigator Award) und von der Photothera Inc. uneingeschränkten Grant. Die Droge Spende kam von TEVA. Reisekostenerstattung kam von Pharmacia Upjohn. P.C. erhielt Beratungsgebühren von Janssen Forschung und Entwicklung. P.C. hat mehrere Patente im Zusammenhang mit der Verwendung von Nah-Infrarot-Licht in der Psychiatrie. PhotoMedex, Inc. gelieferten vier Geräte für eine klinische Studie. P.C. wird finanziell uneingeschränkten von Litecure Inc., eine Studie über transkranielle Photobiomodulation für die Behandlung von großen depressive Störungen und zur Durchführung einer Studie an gesunden Probanden. P.C. gründeten eine Unternehmen (Niraxx-Licht-Therapie) konzentriert sich auf die Entwicklung der neuen Modalitäten der Behandlung aufgrund der Nah-Infrarot-Licht; Er ist auch ein Berater für das gleiche Unternehmen. P.C. finanziell unterstützt von zerebralen Wissenschaften zur Durchführung einer Studie über die transkranielle Photobiomodulation für generalisierte Angststörung. Die anderen Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus den Tabriz Universität der medizinischen Wissenschaften (gewähren Nr. 61019) S.S-e. und Veröffentlichung von LiteCure LLC, Newark, DE, USA, L.D.T. Die Autoren möchten die Abteilung Immunologie und Education Development Center (EDC) der Tabriz Universität der medizinischen Wissenschaften für ihre freundliche Unterstützung bedanken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Alfasan #1608234-01
Xylazine Alfasan #1608238-01
Agarose Sigma #A4679
Superglue Quickstar
Vibratome Campden Instruments #MA752-707
Optical glass Sail Brand #7102
Power meter Thor labs #PM100D
Photodiode detector Thor labs #S121C
Caliper Pittsburgh
GaAlAs laser Thor Photomedicine
Etho Vision Noldus
Centrifuge Froilabo #SW14R
Earmuffs Blue Eagle
Digital camera Visionlite #VCS2-E742H
Sterio amplifier Sony
Ethanol Hamonteb #665.128321
Barnes maze Costom-made
ATP assay kit Sigma #MAK190
Elisa reader Awareness #Stat Fax 2100

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References

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Ein Protokoll für die transkranielle Photobiomodulation Therapie bei Mäusen
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Salehpour, F., De Taboada, L., Cassano, P., Kamari, F., Mahmoudi, J., Ahmadi-Kandjani, S., Rasta, S. H., Sadigh-Eteghad, S. A Protocol for Transcranial Photobiomodulation Therapy in Mice. J. Vis. Exp. (141), e59076, doi:10.3791/59076 (2018).More

Salehpour, F., De Taboada, L., Cassano, P., Kamari, F., Mahmoudi, J., Ahmadi-Kandjani, S., Rasta, S. H., Sadigh-Eteghad, S. A Protocol for Transcranial Photobiomodulation Therapy in Mice. J. Vis. Exp. (141), e59076, doi:10.3791/59076 (2018).

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