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Neuroscience

चूहों में Transcranial Photobiomodulation थेरेपी के लिए एक प्रोटोकॉल

doi: 10.3791/59076 Published: November 18, 2018

Summary

Photobiomodulation चिकित्सा स्नायविक और मनोरोग विकारों की एक विस्तृत श्रृंखला के उपचार के लिए एक अभिनव इनवेसिव मोडल है और यह भी स्वस्थ मस्तिष्क समारोह में सुधार कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल transcranial प्रकाश वितरण, जो अंय प्रयोगशाला कुतर में इस्तेमाल के लिए अनुकूलित किया जा सकता द्वारा चूहों में प्रदर्शन मस्तिष्क photobiomodulation के लिए एक कदम दर कदम गाइड भी शामिल है ।

Abstract

Transcranial photobiomodulation मस्तिष्क में सुधार के लिए एक संभावित अभिनव इनवेसिव चिकित्सीय दृष्टिकोण है, मस्तिष्क संबंधी विकार की एक विस्तृत श्रृंखला में दिमाग समारोह, और उम्र से संबंधित संज्ञानात्मक गिरावट में स्मृति वृद्धि और neurodegenerative रोगों । हम चूहों में transcranial photobiomodulation थेरेपी (PBMT) के लिए एक प्रयोगशाला प्रोटोकॉल का वर्णन । बालब आयु वर्ग के चूहों (18 महीने पुराने) एक ६६० एनएम लेजर transcranially के साथ इलाज कर रहे हैं, एक बार दैनिक 2 सप्ताह के लिए । लेजर संप्रेषण डेटा से पता चलता है कि घटना लाल बत्ती के लगभग 1% खोपड़ी पर cortical सतह से एक 1 मिमी गहराई तक पहुंचता है, पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस मर्मज्ञ । उपचार के परिणाम दो तरीकों से मूल्यांकन कर रहे हैं: एक बार्ंस भूलभुलैया परीक्षण है, जो एक हिप्पोकैम्पस निर्भर स्थानिक सीखने और स्मृति कार्य मूल्यांकन है, और हिप्पोकैम्पस एटीपी स्तर है, जो एक के रूप में इस्तेमाल किया जाता है को मापने के सूचकांक । बार्ंस टास्क से परिणाम लेजर में स्थानिक स्मृति का एक वृद्धि दिखाने के वृद्ध चूहों का इलाज जब आयु मिलान नियंत्रण के साथ तुलना में । लेजर उपचार के बाद जैव रासायनिक विश्लेषण में वृद्धि हुई हिप्पोकैम्पस एटीपी के स्तर को इंगित करता है । हम मांगना है कि स्मृति प्रदर्शन की वृद्धि संभावित हिप्पोकैम्पस ऊर्जा लाल लेजर उपचार द्वारा प्रेरित चयापचय में सुधार की वजह से है । चूहों में टिप्पणियों के बाद से इस प्रोटोकॉल संभावित अक्सर ऐसे खरगोश, बिल्ली, कुत्ते, या बंदर के रूप में अनुवाद तंत्रिका विज्ञान में इस्तेमाल किया अन्य प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है के बाद से अन्य पशु मॉडलों के लिए बढ़ाया जा सकता है । Transcranial photobiomodulation एक सुरक्षित और लागत प्रभावी तरीका है जो उंर में एक होनहार चिकित्सकीय दृष्टिकोण-संज्ञानात्मक हानि से संबंधित हो सकता है ।

Introduction

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PBMT, या निंन स्तर के लेजर लाइट थेरेपी (LLLT), एक सामांय शब्द है जो चिकित्सीय लेजर या प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एल ई डी) से प्रकाश ऊर्जा द्वारा जैविक ऊतकों की उत्तेजना के आधार पर तरीकों को संदर्भित करता है । लगभग सभी PBMT उपचार के लिए लाल के साथ लागू कर रहे हैं के पास-अवरक्त (NIR) प्रकाश की तरंग दैर्ध्य पर ६०० से ११०० एनएम, एक उत्पादन 1 से ५०० मेगावाट तक बिजली, और एक < 1 से लेकर > 20 J/cm2 (देखें चुंग एट अल.1) ।

Transcranial PBMT एक बाहरी प्रकाश स्रोत (लेजर या एल ई डी)2का उपयोग कर सिर के विकिरण द्वारा आयोजित किया जाता है कि एक इनवेसिव प्रकाश वितरण विधि है । पशु अनुप्रयोगों के लिए, इस पद्धति में पशु के सिर पर एलईडी या लेजर जांच के संपर्क या संपर्क प्लेसमेंट शामिल हैं । ब्याज की चिकित्सीय क्षेत्र पर निर्भर करता है, एक प्रकाश जांच या तो पूरे सिर पर रखा जा सकता है (सभी मस्तिष्क क्षेत्रों को कवर करने के लिए) या सिर के एक विशिष्ट हिस्से पर, इस तरह के आकडे, ललाट, या पार्श्विका क्षेत्र के रूप में । खोपड़ी, खोपड़ी, और बाडी मेटर के माध्यम से लाल/NIR प्रकाश का आंशिक संचरण cortical सतह स्तर तक पहुँच सकते हैं और चिकित्सीय लाभों का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त फोटॉन ऊर्जा की मात्रा प्रदान करते हैं । बाद में, cortical स्तर पर दिया प्रकाश को प्रभावित ग्रे और सफेद मस्तिष्क मामले में प्रचारित किया जाएगा जब तक यह मस्तिष्क3की गहरी संरचनाओं तक पहुंचता है ।

लाल पर वर्णक्रमीय बैंड में प्रकाश तक लाल क्षेत्र (600-680 एनएम) और जल्दी NIR क्षेत्र (800-870 एनएम) cytochrome सी oxidase, mitochondrial श्वसन श्रृंखला4के टर्मिनल एंजाइम के अवशोषण स्पेक्ट्रम से मेल खाती है । यह कल्पना की है कि लाल/NIR स्पेक्ट्रम में PBMT cytochrome सी oxidase से नाइट्रिक ऑक्साइड (सं) के photodissociation का कारण बनता है, mitochondrial इलेक्ट्रॉन परिवहन में वृद्धि में जिसके परिणामस्वरूप और, अंत में, एटीपी जनरेशन5वृद्धि हुई है । न्यूरॉन अनुप्रयोगों के संबंध में, transcranial विकिरण के तरीकों का उपयोग कर मस्तिष्क PBMT के संभावित neurostimulatory लाभ के लिए नैदानिक अध्ययन की एक किस्म में सूचित किया गया है, सहित दर्दनाक मस्तिष्क चोट (TBI) के कुतर मॉडल6, एक्यूट स्ट्रोक7, अल्जाइमर रोग (AD)8, पार्किंसंस रोग (पीडी)9, डिप्रेशन10, और उम्र बढ़ने11.

मस्तिष्क उम्र बढ़ने एक neuropsychological शर्त है कि नकारात्मक कुछ संज्ञानात्मक कार्यों, जैसे सीखने और स्मृति12को प्रभावित करता है माना जाता है । Mitochondria एटीपी उत्पादन और न्यूरॉन्स के लिए प्राथमिक organelles जिंमेदार हैं । Mitochondrial शिथिलता मस्तिष्क क्षेत्रों है कि स्थानिक नेविगेशन स्मृति, जैसे हिप्पोकैम्पस13से जुड़े हुए है में उंर से संबंधित घाटे के साथ जुड़े होने के लिए जाना जाता है । क्योंकि लाल/NIR प्रकाश के साथ कपाल उपचार मुख्य रूप से mitochondrial का मॉडुलन द्वारा कार्य करता है, हिप्पोकैम्पस के लिए पर्याप्त वितरित प्रकाश की खुराक स्थानिक स्मृति परिणामों के सुधार में परिणाम कर सकते हैं14.

वर्तमान प्रोटोकॉल का उद्देश्य चूहों में transcranial PBMT प्रक्रिया का प्रदर्शन, लाल बत्ती के निम्न स्तर का उपयोग करना है. वृद्ध चूहों के सिर के ऊतकों के माध्यम से आवश्यक लेजर प्रकाश संचरण मापन का वर्णन किया गया है. इसके अतिरिक्त, एक हिप्पोकैम्पस निर्भर स्थानिक सीखने और स्मृति कार्य के रूप में, बार्ंस भूलभुलैया, और हिप्पोकैम्पस एटीपी स्तर, एक के रूप में ऊर्जावान सूचकांक, पशुओं में उपचार के प्रभाव का मूल्यांकन के लिए उपयोग किया जाता है ।

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Protocol

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प्रक्रियाओं के सभी देखभाल और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड के अनुरूप में किया गया (NIH; प्रकाशन संख्या 85-23, संशोधित १९८५) और Tabriz विश्वविद्यालय चिकित्सा विज्ञान की क्षेत्रीय नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित ।

चेतावनी: इस प्रोटोकॉल कक्षा बी 12 लेजर उपकरणों के आवेदन भी शामिल है और उचित प्रशिक्षण और सुरक्षा के दिशा निर्देशों के पालन की आवश्यकता होगी । कक्षा बी सी पराबैंगनीकिरण गंभीरता से आंखों को नुकसान पहुंचा सकते हैं और त्वचा को गर्म कर सकते हैं । कक्षा बी सी पराबैंगनीकिरण एक जला खतरा नहीं माना जाता है । नेत्र सुरक्षा काले चश्मे हर समय पहना जाना चाहिए जब लेजर डिवाइस ऑपरेटिंग ।

1. लेजर प्रकाश संचरण प्रयोगों

नोट: यहां इस्तेमाल किया ३ १८ महीने पुराने पुरुष बालब/सी Tabriz चिकित्सा विज्ञान विश्वविद्यालय के पशु सुविधा से प्राप्त चूहों थे । व्यास में २.५ मिमी की एक परिपत्र बीम आकार के साथ एक ६० मेगावाट लेजर (६६० एनएम) प्रकाश स्रोत के रूप में प्रयोग किया जाता है । लेजर स्रोत एक गाऊसी तीव्रता प्रोफ़ाइल के साथ एक परिपत्र ध्रुवीय प्रकाश का उत्पादन और निरंतर तरंग मोड में संचालित है । एक 10 photodiode संकल्प के साथ एक वाणिज्यिक बिजली मीटर, एक वर्ग 1 सेमी2 photodiode सक्रिय क्षेत्र, और ४०० से ११०० एनएम के लिए एक वर्णक्रमीय प्रतिक्रिया रेंज नमूनों के माध्यम से संचारित प्रकाश शक्ति को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

  1. नमूना तैयारी
    1. ताजा नमूनों को प्राप्त करने के लिए, ketamine (१०० मिलीग्राम/किग्रा) और xylazine (10 मिलीग्राम/किग्रा) के मिश्रण से माउस को गहराई से anesthetize ।
    2. काटना नियमित कैंची से माउस के सिर, बस कंधों के ऊपर स्थित बिंदु से शुरू ।
    3. सिर को इतना घुमाएं कि जबड़े के ventral ओर चेहरे खिल जायें । स्लाइड angled विच्छेदन कैंची सुचारू रूप से मौखिक गुहा के माध्यम से जब तक mandibular जंक्शन के प्रतिरोध पर गौर किया है । सभी बड़े mandible हड्डी को खोपड़ी से जोड़ने की मांसपेशियों में कटौती और उंहें त्यागें ।
    4. तालव्य हड्डियों को दूर, angled विच्छेदन कैंची का उपयोग कर ।
    5. खोपड़ी आसपास के सभी मांस त्यागें, घुमावदार संदंश का उपयोग कर ।
    6. खोपड़ी के निचले हिस्से काटना, और फिर, ध्यान से शेष खोपड़ी की हड्डी से बाहर मस्तिष्क ले, एक घुमावदार रंग के साथ ।
    7. एक 2% agarose जेल में बरकरार मस्तिष्क ऊतक ठीक तो ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया के लिए उपयुक्त हो जाएगा ।
      नोट: आदेश में एक बरकरार खोपड़ी प्लस खोपड़ी नमूना प्राप्त करने के लिए, मस्तिष्क के ऊतकों सिर के पृष्ठीय हिस्से को किसी भी क्षति के बिना पशु के सिर के ventral ओर से हटाया जाना चाहिए ।
  2. मस्तिष्क टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया
    1. vibratome बढ़ते ब्लॉक की सतह पर superglue (~ ०.०५ एमएल) की एक बूंद फैला ।
    2. ध्यान से agarose ब्लॉक vibratome बढ़ते ब्लॉक ताकि मस्तिष्क की ventral सतह facedown है, और अपनी स्थिति को समायोजित करने के लिए संलग्न ।
    3. थोड़ा agarose ब्लॉक की ऊपरी सतह के लिए vibratome ब्लेड मैच और प्राथमिक स्तर के रूप में कटर मूल्य रिकॉर्ड ।
    4. बर्फ के साथ vibratome टैंक-ठंडा सामांय खारा समाधान भरें ।
    5. vibratome पैरामीटर समायोजित करें (उदा., स्लाइस मोटाई [1 mm], स्पीड [5 की 5 डिवाइस इकाई], और कंपन आवृत्ति [5 डिवाइस इकाई पर]) संतोषजनक टुकड़ा करने की क्रिया प्राप्त करने के लिए ।
    6. एक टुकड़ा में एक १,००० µm मोटाई के साथ मस्तिष्क transversely कट ।
      नोट: स्लाइस cortical सतह और एक विमान १,००० µm cortical सतह (पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस) को अवर तैनात द्वारा सीमांकित मस्तिष्क ऊतक के हिस्से है ।
    7. ऑप्टिकल ग्लास सतह पर पानी की एक बूंद (~ ०.०५ एमएल) जोड़ें और इसके बारे में शीर्ष पर मस्तिष्क टुकड़ा डाल दिया । फिर, मस्तिष्क स्लाइस पर पानी की एक बूंद जोड़ने और ध्यान से यह के शीर्ष पर दूसरा ऑप्टिकल ग्लास जगह है ।
      नोट: पानी की एक बूंद नमूना कांच सीमाओं में जोड़ा जाना चाहिए ताकि ऊतक सुखाने और किसी न किसी सतहों से प्रकाश बिखरने को रोकने के लिए ।
  3. सिर के ऊतकों के माध्यम से प्रकाश संचरण की माप
    1. ऑप्टिकल उपकरण, लेजर डिवाइस, प्रतिबिंबित दर्पण, और बिजली मीटर इकाई सहित सेट करें ।
      चेतावनी: लेजर पर चालू करने से पहले सुरक्षात्मक आंख काले चश्मे पर डाल दिया ।
    2. बिजली मीटर पर एक नमूना के अभाव में, लेजर डिवाइस पर बारी और दर्पण है कि photodiode सक्रिय क्षेत्र के लिए सीधा बीम मार्गदर्शन के लिए उचित दूरी पर स्थित है पर लेजर बीम ध्यान केंद्रित ।
      नोट: प्रकाश संचरण मापन कमरे के तापमान पर एक darkroom में किया जाना चाहिए (23-25 डिग्री सेल्सियस), सिर के ऊतकों को निकाला गया है के बाद 30 मिनट के भीतर.
    3. कटा हुआ मस्तिष्क ऊतक पर माप प्रदर्शन ।
      1. बिजली मीटर की सतह पर दो रिक्त ऑप्टिकल चश्मा लगाएं ।
      2. बिजली मीटर डिस्प्ले स्क्रीन से संचारित प्रकाश शक्ति (I0) पढ़ें और मूल्य रिकॉर्ड करें ।
      3. धीरे मस्तिष्क का नमूना है, जो दो ऑप्टिकल चश्मे से शामिल है जगह, बिजली मीटर की सतह पर, ऊतक संबंधित क्षेत्र पर बीम ध्यान केंद्रित, संचारित बिजली पढ़ें, और मूल्य रिकॉर्ड ।
    4. खोपड़ी प्लस खोपड़ी पर माप प्रदर्शन ।
      1. बिजली मीटर की सतह पर एक खाली ऑप्टिकल ग्लास रखें ।
      2. बिजली मीटर डिस्प्ले स्क्रीन से संचारित प्रकाश शक्ति (I0) पढ़ें और मूल्य रिकॉर्ड करें ।
      3. हल्के से बिजली मीटर की सतह पर ताजा खोपड़ी प्लस खोपड़ी ऊतक के साथ एक ऑप्टिकल ग्लास जगह, bregma क्षेत्र पर प्रकाश बीम मैच, संचारित बिजली पढ़ें, और मूल्य रिकॉर्ड ।
      4. सिग्नल-टू-शोर अनुपात को अधिकतम करने के लिए, सभी नमूनों के लिए न्यूनतम 3x में प्रकाश संचरण माप दोहराएँ ।
        नोट: bregma क्षेत्र कान के पूर्वकाल आधार के माध्यम से तैयार की एक लाइन के लिए लगभग 3 मिमी rostral में रखा गया है । खोपड़ी से अधिक खोपड़ी ऊतक की मोटाई एक मानक कैलिपर द्वारा मापा जाता है ।

2. Photobiomodulation थेरेपी (PBMT)

नोट: ४५ नर बालब/सी चूहों 15 चूहों के तीन समूहों को सौंपा प्रत्येक इस्तेमाल किया गया । समूह युवा नियंत्रण चूहों (2 महीने पुराने) से बना रहे थे कि प्राप्त अन्तर्वासना-PBMT, वृद्ध-नियंत्रण चूहों (18 महीने पुराने) कि प्राप्त शम-PBMT, और वृद्ध-PBMT चूहों (18 महीने पुराने) कि PBMT प्राप्त की. अन्तर्वासना-PBMT उपचार PBMT समूह के समान लेकिन लेजर निष्क्रिय के साथ उपचार शामिल हैं । चूहों Tabriz चिकित्सा विज्ञान विश्वविद्यालय के पशु सुविधा से प्राप्त किया गया था और एक 12 एच प्रकाश और 12 एच अंधेरे photoperiod के साथ, 24-25 डिग्री सेल्सियस और ५५% सापेक्षिक आर्द्रता में तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान केंद्र (NSRC) के पशु होल्डिंग इकाई में रखे गए थे । भोजन और पानी का ad libitumप्रदान किया गया । सभी चूहों को इलाज के लिए कम से पहले 1 सप्ताह के लिए acclimatized थे ।

  1. लेजर उपचार प्रक्रिया
    नोट: ६६० एनएम तरंग दैर्ध्य पर निरंतर तरंग मोड के साथ एक डायोड GaAlAs लेजर transcranial PBMT उपचार के लिए इस्तेमाल किया गया था । लेजर उपकरण २०० ± 2 मेगावाट के एक उत्पादन शक्ति और ६.६६ W/cm2के एक विकिरण ०.०३ सेमी2की एक जगह आकार के साथ, पर संचालित किया गया था । प्रत्येक सत्र प्रति ९९.९ J/मुख्यमंत्री2 के एक औसत प्रवाह 15 विकिरण के एस के लिए खोपड़ी की सतह के लिए दिया गया था । विकिरण दैनिक 2 लगातार सप्ताह के लिए 1x प्रशासित किया गया ।
    1. उनके घर पिंजरों में चूहों चिकित्सा कमरे में लाओ, लगभग 20 मिनट उपचार शुरू करने से पहले ।
    2. दीवार आउटलेट के लिए एक बिजली के रक्षक कनेक्ट ।
    3. एक इलेक्ट्रिक रक्षक में लेजर डिवाइस प्लग डालें ।
    4. सतह के लिए किसी भी खरोंच को रोकने के क्रम में एक पारदर्शी नायलॉन फिल्म के साथ लेजर जांच की नोक को कवर ।
    5. ध्यान से लेजर डिवाइस के चैनल के लिए जांच कनेक्ट ।
    6. लेजर डिवाइस चालू करें और इसे गर्म करने के लिए कुछ सेकंड प्रतीक्षा करें ।
    7. विकिरण समय और आपरेशन मोड सहित लेजर/उपचार पैरामीटर, समायोजित करें ।
    8. किसी भी नमूने के अभाव में, लेजर डिवाइस पर बिजली मीटर के सक्रिय क्षेत्र के लिए जांच की नोक से संपर्क करके लेजर औसत शक्ति का निर्धारण । मान रिकॉर्ड है ।
    9. अंशांकन प्रक्रिया को दोहराएँ (step 2.1.8) कम से 5x, बिजली मीटर की डिस्प्ले स्क्रीन से घटना शक्तियों पढ़ें, और मूल्यों को रिकॉर्ड.
    10. धीरे एक हाथ की हथेली में जानवर की गर्दन के पृष्ठीय त्वचा द्वारा एक माउस पकड़ और उसके सिर स्थिर ।
      नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल में, लेजर जांच bregma जोन है, जो ~ 3 मिमी कान के आंतरिक आधार के बीच तैयार की रेखा को rostral है पर रखा गया है ।
    11. हल्के से midline में खोपड़ी पर सीधे जांच की नोक जगह है, लगभग 3 मिमी एक लाइन कान के पूर्वकाल आधार के माध्यम से तैयार करने के लिए rostral ।
      नोट: पेट के विमान के लिए एक लगभग ४५ ° कोण पर जांच पकड़ो ।
    12. आदेश में पशु की आंखों के लिए प्रत्यक्ष विकिरण से बचने के लिए, पहले सिर पर जांच की नोक से संपर्क करें और फिर, लेजर डिवाइस पर बारी ।
    13. लेजर पर बारी और छुरा विकिरण के पूरा होने तक जांच पकड़ ।
    14. चिकित्सा के अंत के बाद, सिर से लेजर जांच को वापस लेने और धीरे से अपने पिंजरे में माउस वापस ।
    15. लेज़र डिवाइस बंद करें और डिवाइस से जांच को डिस्कनेक्ट कर दें ।
    16. एक उपयुक्त ऑप्टिकल क्लीनर के साथ लेजर जांच साफ ।
    17. चूहों को पशु सुविधा के लिए हस्तांतरित करें ।

3. व्यवहारिक कार्य

  1. ओपन फील्ड टेस्ट
    1. एक खुले क्षेत्र परीक्षण के दौरान कूच कुल दूरी द्वारा प्रत्येक माउस के हरकत गतिविधि का आकलन, जैसा कि पहले15वर्णित है ।
  2. बार्ंस भूलभुलैया कार्य
    1. उपकरण
      नोट: स्थानिक सीखने और स्मृति कार्य एक बार्ंस भूलभुलैया16में किया जाता है । इस neurobehavioral कार्य के लिए उपयोग किया जाने वाला उपकरण, परिधि से 3 सेमी, प्लेटफार्म पर स्थित हैं कि 20 equidistant, 5 सेमी व्यास परिपत्र छेद के साथ काले रंग की लकड़ी (व्यास में ९५ सेमी) से बना एक परिपत्र मंच के होते हैं । तंत्र नीचे चढ़ने से पशु को रोकने के लिए फर्श से ५० सेमी ऊंचा है । एक जंगम काले प्लास्टिक एस्केप बॉक्स (20 सेमी x 15 cm x 5 cm) एस्केप होल के अंतर्गत रखा जाता है । एक काले भूलभुलैया सफेद चूहों के परीक्षण के लिए प्रयोग किया जाता है, और एक काले चटाई भूलभुलैया के नीचे रखा जाना चाहिए जब एक सॉफ्टवेयर ट्रैकिंग प्रणाली का प्रयोग किया जाता है ।
      1. उज्ज्वल उपरि प्रकाश व्यवस्था के साथ एक शांत कमरे के केंद्र में भूलभुलैया उपकरण प्लेस ।
      2. प्लेस एक "प्रवेश नहीं" कार्य कमरे के दरवाजे के बाहर पर हस्ताक्षर ।
      3. दृश्य-स्थानिक संकेतों परिधि दीवारों को अनुलग्न करें ।
      4. भूलभुलैया मंच के ऊपर एक डिजिटल वीडियो कैमरा की स्थिति ।
      5. अवांछित घ्राण cues हटाने के लिए ७०% इथेनॉल के साथ भूलभुलैया मंच की सतह को साफ करें ।
      6. एक घ्राण क्यू के रूप में सेवा करने के लिए एस्केप बॉक्स के अंदर जानवर के घर पिंजरे से बिस्तर की एक छोटी राशि जोड़ें ।
    2. अनुकूलन सत्र
      1. कार्य कक्ष में प्रत्येक माउस को लगभग 30 मिनट पहले प्रयोग आरंभ करने के लिए लाएं, ताकि माउस के लिए आदत हो सके ।
      2. अपने पिंजरे से माउस निकालें और धीरे से 1 मिनट के लिए एस्केप बॉक्स में पशु जगह है ।
    3. प्रशिक्षण सत्र
      नोट: प्रशिक्षण सत्र लगातार 4 दिनों पर प्रत्येक माउस के लिए दोहराया है ।
      1. धीरे से एस्केप बॉक्स से माउस निकालें ।
      2. क्षेत्र के केंद्र में माउस प्लेस; फिर, माउस के शीर्ष पर प्रारंभ कक्ष रखें ।
      3. 10 एस के बाद शुरू चैंबर निकालें, और 3 मिनट के लिए क्षेत्र का पता लगाने के लिए माउस की अनुमति दें ।
      4. चुपचाप कंप्यूटर क्षेत्र में जाने के लिए और शोर पर डाल-रद्द headphones ।
      5. एक नकारात्मक श्रवण मंच के स्तर पर लगभग ८० dB के एक जोर से सफेद शोर से मिलकर उत्तेजना ट्रिगर और माउस videotaping शुरू करते हैं ।
      6. सफेद शोर बंद करें और माउस एस्केप बॉक्स में प्रवेश करती है जब videotaping बंद करो । पशु 1 मिनट के लिए बॉक्स में परेशान रहने के लिए अनुमति दें ।
      7. एस्केप बॉक्स से माउस निकालें और इसे वापस अपने पिंजरे में रखें ।
      8. दोहराया परीक्षणों के बीच 3 मिनट के अंतराल के साथ, प्रति दिन 3.4.7 4x के माध्यम से 3.4.2 चरणों को दोहराएँ ।
        नोट: सभी परीक्षणों के बीच, अखाड़ा सतह से किसी भी मूत्र या मल को हटाने और ७०% इथेनॉल के साथ भूलभुलैया साफ ।
    4. जांच परीक्षण सत्र
      1. पिछले प्रशिक्षण परीक्षण के बाद, 24 ज बाद में, भूलभुलैया मंच से एस्केप बॉक्स निकालें और 3.4.5 के माध्यम से 3.4.2 चरणों को दोहराएँ ।
      2. 3 मिनट के बाद, सफेद शोर बंद करो और videotaping बंद करो । भूलभुलैया क्षेत्र से माउस निकालें और इसे वापस अपने पिंजरे में जगह है ।
      3. सभी जानवरों का परीक्षण किया गया है के बाद, भूलभुलैया मंच और शुरू चैंबर साफ । कमरे रोशनी बंद करो और "प्रवेश नहीं" दरवाजे से हस्ताक्षर को हटा दें ।
      4. परीक्षण सत्रों से वीडियो रिकॉर्डिंग को आगे के विश्लेषण के लिए किसी बाहरी हार्ड ड्राइव पर संग्रहीत करें ।
      5. वीडियो ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर प्रोग्राम सेट अप करें और रिकॉर्ड किए गए वीडियो से ब्याज के मापदंडों को निकालने के लिए, विलंबता समय सहित प्रशिक्षण सत्रों के 4 दिनों के दौरान लक्ष्य छेद को खोजने के लिए और जांच परीक्षण सत्र के दौरान लक्ष्य चक्र में बिताए गए समय ।

4. जैव रासायनिक आकलन

  1. हिप्पोकैम्पस में एटीपी स्तर
    1. गहरा ketamine के एक मिश्रण का एक intraperitoneal इंजेक्शन के साथ प्रत्येक माउस anesthetize (१०० शरीर के वजन के प्रति ग्राम मिलीग्राम) और xylazine (10 शरीर के वजन के ग्राम प्रति मिलीग्राम) ।
    2. पशु Decapitate और तेजी से खोपड़ी से मस्तिष्क के ऊतकों को दूर ।
    3. काटना बाहर हिप्पोकैम्पस और homogenize बर्फ ठंडा नमूना बफर में ऊतक (किट द्वारा प्रदान की) एक ऊतक homogenizer के साथ ।
    4. तुरंत 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए २,००० x g पर homogenate केंद्रापसारक ।
    5. supernatant एक साफ ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।
    6. हिप्पोकैम्पस एटीपी स्तर का आकलन, पहले11वर्णित के रूप में स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विधि का उपयोग कर.

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Representative Results

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सांख्यिकीय विश्लेषण

बार्ंस प्रशिक्षण सत्रों से प्राप्त आंकड़ों के सांख्यिकीय विश्लेषण दो तरह ANOVA द्वारा विश्लेषण किया गया था; अंय व्यवहार परीक्षणों और समूहों के बीच हिप्पोकैम्पस एटीपी स्तर के विश्लेषण एक तरह से ANOVA द्वारा किए गए थे, Tukey के बाद हॉक परीक्षण के बाद । सभी डेटा अर्थ (SEM) के मानक त्रुटि ± मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं, लेजर संचरण डेटा, जो मानक विचलन (एसडी) ± के रूप में दिखाया जाता है के लिए छोड़कर । महत्व स्तर p < ०.०५ पर सेट किया गया था ।

लेजर प्रकाश संचरण

लेजर प्रकाश (६६० एनएम) खोपड़ी प्लस खोपड़ी ऊतक के माध्यम से (०.८५ ± ०.०९ मिमी की एक नमूना मोटाई के साथ) वृद्ध चूहों का संचरण १५.६७% ± ०.८७% था जब एक लेज़र बीम bregma (चित्रा 1) पर ध्यान केंद्रित किया गया था । इस प्रकाश संचरण के आधार पर, प्रारंभिक खोपड़ी की सतह पर प्रवाह के बाद से ९९.९ j/cm2 (६.६६ [W/cm2] x 15 [s]), यह अनुमान लगाया जा सकता है कि एक अनुमानित 16 j/cm2 का प्रवाह cortical सतह तक पहुंच गया ।

लेजर संप्रेषण, वृद्ध मस्तिष्क ऊतक के एक 1 मिमी टुकड़ा के माध्यम से, १०.१०% ± ०.९५% (चित्रा 1) था । इन मूल्यों से, यह अनुमान लगाया जा सकता है कि प्रकाश cortical सतह से 1 मिमी गहराई पर लगभग १.६ j/cm2 के लिए सेरेब्रल प्रांतस्था ऊतक के स्तर पर 16 जे/

ओपन फील्ड टेस्ट

सभी प्रयोगात्मक समूहों (चित्रा 2) के बीच खुले क्षेत्र की परीक्षा में हरकत गतिविधि में कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेद थे ।

बार्ंस भूलभुलैया कार्य

जब एस्केप विलंबता प्रशिक्षण के 4 दिनों के दौरान विश्लेषण किया गया था और बार्ंस भूलभुलैया कार्य के दौरान प्रयोगात्मक समूहों के साथ, एक दो तरह ANOVA दिन के महत्वपूर्ण प्रभाव से पता चला (p < ०.००१) और समूह (p < ०.००१), लेकिन नहीं समूह x दिन (p = ०.४७) । डेटा के एक समूह विश्लेषण से पता चला है कि वृद्ध-नियंत्रण वाले पशुओं की लेटेंसी समय की अपेक्षा युवा-नियंत्रण समूह के तृतीय (p < ०.०१) और चौथे (p < ०.००१) पर प्रशिक्षण सत्र के दिनों की तुलना में काफी अधिक थी. हालांकि, PBMT-व्यवहार वृद्ध चूहों के लेटेंसी समय काफी कम थे चौथे दिन (p < ०.०५), की तुलना में वृद्ध-नियंत्रण चूहों (p < ०.०१) (चित्रा 3). जांच परीक्षण सत्र में, वृद्ध नियंत्रण चूहों लक्ष्य चक्र में काफी कम समय बिताया, युवा नियंत्रण चूहों (p < ०.०१) के साथ तुलना में. हालांकि, PBMT-इलाज वृद्ध चूहों लक्ष्य चक्र में काफी लंबा समय बिताया के रूप में वृद्ध-नियंत्रण चूहों (p < ०.०५) (चित्रा 4) के साथ तुलना में ।

हिप्पोकैम्पस एटीपी स्तर

वृद्ध नियंत्रण चूहों हिप्पोकैम्पस एटीपी स्तर में एक महत्वपूर्ण कमी थी, युवा नियंत्रण चूहों के साथ तुलना में (p < ०.०५). हालांकि, वृद्ध-PBMT चूहों के हिप्पोकैम्पस में माध्य एटीपी सामग्री वृद्ध-नियंत्रण चूहों (p < ०.०५) (चित्रा 5) में उन लोगों से काफी अधिक थे.

Figure 1
चित्रा 1 : लेजर प्रकाश संचरण खोपड़ी प्लस खोपड़ी और मस्तिष्क ऊतक के माध्यम से डेटा । डेटा मतलब ± एसडी एसडी = मानक विचलन के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : खुले क्षेत्र परीक्षण से गतिविधि डेटा हरकत । डाटा अर्थ ± SEM. PBMT = photobiomodulation चिकित्सा के रूप में व्यक्त कर रहे हैं; SEM = मतलब की मानक त्रुटि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : प्रशिक्षण सत्रों के 4 दिनों के दौरान चूहों समूहों के लिए बच विलंबता. मान का प्रतिनिधित्व ± SEM. * *p < ०.०१ और * * *p < ०.००१, युवा नियंत्रण चूहों के साथ तुलना में । # p < ०.०५, वृद्ध-नियंत्रण चूहों की तुलना में । PBMT = photobiomodulation चिकित्सा; SEM = मतलब की मानक त्रुटि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : जांच सत्र में लक्ष्य चक्र में बिताए गए समय, विभिन्न समूहों में । मूल्य का प्रतिनिधित्व ± SEM. * *p < ०.०१, युवा नियंत्रण चूहों के साथ तुलना में । # p < ०.०५, वृद्ध-नियंत्रण चूहों की तुलना में । PBMT = photobiomodulation चिकित्सा; SEM = मतलब की मानक त्रुटि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : हिप्पोकैम्पस ऊतक में एटीपी सामग्री । मान मतलब ± SEM. *p < ०.०५, युवा नियंत्रण चूहों के साथ तुलना में प्रतिनिधित्व करते हैं । # p < ०.०५, वृद्ध-नियंत्रण चूहों की तुलना में । PBMT = photobiomodulation चिकित्सा; SEM = मतलब की मानक त्रुटि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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हम चूहों में एक transcranial PBMT प्रक्रिया के संचालन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । इस प्रोटोकॉल को विशेष रूप से तंत्रिका विज्ञान प्रयोगशालाओं कि photobiomodulation अनुसंधान को कुतर पर ध्यान केंद्रित प्रदर्शन करने के लिए लक्षित है । हालांकि, इस प्रोटोकॉल अंय प्रयोगशाला पशुओं कि अक्सर ऐसे खरगोश, बिल्ली, कुत्ते, या बंदर के रूप में तंत्रिका विज्ञान क्षेत्र में इस्तेमाल किया जाता है के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

वर्तमान में, वहां लाल/NIR पराबैंगनीकिरण और एल ई डी के साथ transcranial PBMT जांच में रुचि बढ़ी है । आदेश में सफलतापूर्वक पूरी उपचार प्रक्रिया को कुतर में ले जाने के लिए, वहां कुछ आवश्यक कदम पर विचार कर रहे हैं ।

सबसे पहले, यह महत्वपूर्ण है कि, जीवित पशुओं में किसी भी उपचार के प्रयास से पहले, प्रकाश प्रवेश ठीक पशु सिर के ऊतकों के माध्यम से मापा जाता है क्रम में एक इष्टतम फोटॉन खुराक(जे/

दूसरा, जिसके आधार पर मस्तिष्क क्षेत्रों विकृति विज्ञान से प्रभावित और उपचार के लिए लक्षित कर रहे हैं, कई मापदंडों के लिए अनुकूलित किया जा करने की आवश्यकता, प्रकाश पैठ को अधिकतम करने और सकारात्मक परिणामों की संभावना में वृद्धि । इन विकिरण समय, उपचार अंतराल, लागू विकिरण, और प्रवाह शामिल हैं । उदाहरण के लिए, वृद्ध पशु मॉडल में, यह मस्तिष्क हिप्पोकैम्पस और ललाट प्रांतस्था करने के लिए एक पर्याप्त विकिरण खुराक देने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि इन क्षेत्रों उम्र से संबंधित विकृतियों से जुड़े हुए हैं2. लक्ष्य के ऊतकों में एक इष्टतम प्रवाह दर PBMT में एक और महत्वपूर्ण कारक है । अधिकांश शोधकर्ताओं कारकों है कि प्रकाश संचरण को प्रभावित लेकिन अक्सर उपेक्षा पर विचार है कि मस्तिष्क के लक्ष्य के ऊतकों में एक biphasic प्रतिक्रिया न केवल प्रवाह (जे/मुख्यमंत्री2) के लिए मौजूद है लेकिन यह भी वितरण को प्रभावित करने की दर के लिए पर चर्चा । दूसरे शब्दों में, 1 से अधिक दिया 1 जे/सेमी 2 के बराबर 1 j/4 से अधिक दिया नहीं है 2 सेमी,18

वहां कई अतिरिक्त कारकों है कि transcranial PBMT अध्ययन को क्रियान्वित करने से पहले भी विचार किया जाना चाहिए रहे हैं । Transcranial PBMT में कुतर सामांयतः जांच टिप आकार के साथ लेजर या एल ई डी जांच का उपयोग कर लागू किया जाता है पशुओं के मस्तिष्क के आकार को स्केल । कुतर में आवेदन के लिए, उदारवादी बिजली पराबैंगनीकिरण (≤ ५०० मेगावाट की एक शक्ति उत्पादन के साथ) कम समय में प्रकाश ऊर्जा की एक बड़ी राशि प्रदान कर सकते हैं और पशु के लिए उपचार के समय और उपचार से संबंधित तनाव दोनों को कम । हालांकि कक्षा 3 बी पराबैंगनीकिरण PBMT खुराक पर्वतमाला (≤ 20 जे/मुख्यमंत्री2) में महत्वपूर्ण photothermal प्रभाव नहीं है, इस तरह के बर्फ या जेल के रूप में एक पारदर्शी ऑप्टिकल पदार्थ, के साथ खोपड़ी की सतह को ठंडा, transcranial आवेदन के दौरान सिफारिश की है ।

कुछ प्रयोगात्मक transcranial PBMT अध्ययन में, ऑप्टिकल फाइबर के बजाय एक लेज़र या एलईडी जांच, सिर पर एक विशिष्ट छोटे क्षेत्र के विकिरण के लिए अपने फायदे के कारण प्रयोग किया जाता है । उदाहरण के लिए, फोकल कोरोनरी स्ट्रोक, TBI, और पीडी मॉडल, क्षतिग्रस्त क्षेत्र का एक सटीक विकिरण में वारंट है । हालांकि, ऑप्टिकल फाइबर आम तौर पर एक छोटे से बीम क्षेत्र है, तो यह एक सत्र में दिया ऊर्जा की कुल राशि को प्रभावित करेगा और शोधकर्ताओं की आवश्यकता होगी एक से अधिक स्थान में प्रक्रिया दोहराने के लिए कम क्षेत्र के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए. सबसे प्रयोगात्मक transcranial PBMT अध्ययन में, सिर के विकिरण चेतावनी, unanesthetized पशु में आयोजित किया जाता है । आदेश में पशु स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए, मैनुअल सिर जोत और संयम उपकरणों के उपयोग की सिफारिश कर रहे हैं । मैन्युअल रूप से धारण विधि में, तथ्य यह है कि उस जानवर अचानक स्थानांतरित कर सकते हैं और संभवतः अपने सिर विकिरण क्षेत्र से दूर ले जाने के कारण, विकिरणित प्रकाश के एक हिस्से बर्बाद हो सकता है. इसके अलावा, दोनों तरीकों जानवर को अतिरिक्त तनाव पैदा कर सकते है और एक संभावित पाया कारक हो सकता है । कुछ मामलों में, विकिरण प्रक्रिया एक anesthetized जानवर में किया जाता है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि बहुत ज्यादा संज्ञाहरण प्रतिकूल तंत्रिका विज्ञान के अध्ययन में प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं । इसलिए, एक छोटी विकिरण अंतराल सावधानीपूर्वक इन प्रकार के प्रयोगों में माना जाना चाहिए ।

वर्तमान अध्ययन में, हम सबसे पहले cortical सतह तक पहुंच गया है कि ६६० एनएम लेजर ऊर्जा की मात्रा निर्धारित करने के लिए पुरुष बालब की खोपड़ी प्लस खोपड़ी के माध्यम से प्रकाश के संचरण मापा । परिणाम ने संकेत दिया कि 16% की सतह पर प्रारंभिक प्रकाश की खोपड़ी के माध्यम से मस्तिष्क के लिए प्रेषित किया गया था । पुरुष बालब/सी चूहों में अन्य प्रयोगशालाओं से पारेषण डेटा पता चला है कि ६७० एनएम लेजर प्रकाश का केवल १.२% बरकरार खोपड़ी घुसना करने में सक्षम था19. यह भी बताया गया है कि ६७० एनएम एलईडी लाइट के लगभग ९०% cranium20माउस के अंदर तनु है ।

cortical ऊतक स्तर पर लाल लेजर के प्रभावी neurostimulatory खुराक एक पिछले अध्ययन में पुष्टि की गई हमारी प्रयोगशाला11में प्रदर्शन किया । हमें पता चला है कि एक दैनिक cortical ६६० एनएम में एक 8 J/cm2 लेजर के प्रवाह एक माउस उंर बढ़ने मॉडल11में संज्ञानात्मक प्रभाव है । वर्तमान अध्ययन के चिकित्सा अनुभाग में, cortical सतह के लिए लगभग 16 जे/मुख्यमंत्री2 देने के लिए, हम 15 एस, जो चूहों द्वारा सहन किया गया था के लिए पर लेजर छोड़ने की जरूरत है । वर्तमान कार्य में हमने हिप्पोकैम्पस सतह पर प्राप्त प्रकाश शक्ति को भी मापा । प्रयोग के परिणामों के आधार पर, 10% की अनुमानित मूल्य वृद्ध मस्तिष्क का एक 1 मिमी टुकड़ा के माध्यम से लेजर संप्रेषण के रूप में मापा गया था, लगभग १.६ जे के एक प्रकाश को प्रभावित करने के लिए इसी cortical सतह से 1 मिमी गहरे तक पहुंचने2 / बालब/सी माउस मस्तिष्क का उपयोग कर अंय अध्ययनों से डेटा ६७० एनएम के एक ६५% कमी से पता चला है मस्तिष्क ऊतक21के प्रत्येक मिलीमीटर भर में प्रकाश की तीव्रता का नेतृत्व किया । यह भी दिखाया गया है कि ६७० एनएम एलईडी लाइट के लगभग २.५% 5 मिमी के मस्तिष्क के ऊतकों में एक गहराई तक पहुंचता है, खोपड़ी की सतह से दूरी substantia नाइग्रा compacta (SNc) क्षेत्र22

हिप्पोकैम्पस स्थानिक स्मृति23के समेकन में एक कार्डिनल भूमिका निभाता है । वास्तव में, हिप्पोकैम्पस ऊर्जा क्षमता स्थानिक नेविगेशन स्मृति और सीखने के साथ जुड़ा हुआ है । यहां प्रस्तुत निष्कर्षों का सुझाव है कि हिप्पोकैम्पस स्तर पर लगभग १.६ J/cm2 की एक हल्की खुराक वृद्ध चूहों में स्थानिक स्मृति परिणामों के एक सुधार का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त हो सकता है । यह माना हो सकता है कि संज्ञानात्मक व्यवहार कार्य में स्मृति प्रदर्शन की एक वृद्धि (बार्ंस भूलभुलैया) हिप्पोकैम्पस ऊर्जा चयापचय के एक सुधार के कारण हो सकता है कि प्रतीत होता है एक लाल लेजर से ६६० एनएम के एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य पर प्रेरित किया ।

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Disclosures

पीसी के वेतन का समर्थन किया गया था हार्वर्ड मनोरोग विभाग द्वारा (ड्यूपॉंट-वॉरेन फैलोशिप और Livingston पुरस्कार), द्वारा मस्तिष्क और व्यवहार अनुसंधान फाउंडेशन (NARSAD यंग अंवेषक पुरस्कार), और द्वारा Photothera इंक अप्रतिबंधित अनुदान । दवा दान तेवा से आया । यात्रा प्रतिपूर्ति Pharmacia से आया-जॉन । पीसी को Janssen रिसर्च एंड डेवलपमेंट से मशविरा फीस मिली है । पीसी ने मनोरोग में पास-इंफ्रारेड लाइट के इस्तेमाल से संबंधित कई पेटेंट दाखिल किए हैं. PhotoMedex, Inc एक नैदानिक अध्ययन के लिए चार उपकरणों की आपूर्ति की । पीसी Litecure इंक से अप्रतिबंधित धन प्राप्त किया है प्रमुख अवसादग्रस्तता विकारों के उपचार के लिए transcranial photobiomodulation पर एक अध्ययन करने के लिए और स्वस्थ विषयों पर एक अध्ययन का संचालन करने के लिए । पीसी cofounded एक कंपनी (Niraxx प्रकाश चिकित्सकीय) के पास के आधार पर उपचार के नए तरीकों के विकास पर ध्यान केंद्रित-अवरक्त प्रकाश; वह इसी कंपनी के लिए सलाहकार भी हैं । पीसी मस्तिष्क विज्ञान से धन प्राप्त करने के लिए सामान्यीकृत चिंता विकार के लिए transcranial photobiomodulation पर एक अध्ययन का संचालन । दूसरे लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई टकराव नहीं है.

Acknowledgments

यह काम चिकित्सा विज्ञान के Tabriz विश्वविद्यालय से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (अनुदान सं. ६१०१९) से एस॰एस॰-ई. और LiteCure LLC, Newark, DE, संयुक्त राज्य अमेरिका से L.D.T. के लिए एक प्रकाशन अनुदान लेखक अपनी तरह की सहायता के लिए चिकित्सा विज्ञान के Tabriz विश्वविद्यालय के इम्यूनोलॉजी विभाग और शिक्षा विकास केंद्र (EDC) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Alfasan #1608234-01
Xylazine Alfasan #1608238-01
Agarose Sigma #A4679
Superglue Quickstar
Vibratome Campden Instruments #MA752-707
Optical glass Sail Brand #7102
Power meter Thor labs #PM100D
Photodiode detector Thor labs #S121C
Caliper Pittsburgh
GaAlAs laser Thor Photomedicine
Etho Vision Noldus
Centrifuge Froilabo #SW14R
Earmuffs Blue Eagle
Digital camera Visionlite #VCS2-E742H
Sterio amplifier Sony
Ethanol Hamonteb #665.128321
Barnes maze Costom-made
ATP assay kit Sigma #MAK190
Elisa reader Awareness #Stat Fax 2100

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References

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चूहों में Transcranial Photobiomodulation थेरेपी के लिए एक प्रोटोकॉल
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Salehpour, F., De Taboada, L., Cassano, P., Kamari, F., Mahmoudi, J., Ahmadi-Kandjani, S., Rasta, S. H., Sadigh-Eteghad, S. A Protocol for Transcranial Photobiomodulation Therapy in Mice. J. Vis. Exp. (141), e59076, doi:10.3791/59076 (2018).More

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