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Neuroscience

마우스에 Transcranial Photobiomodulation 치료에 대 한 프로토콜

doi: 10.3791/59076 Published: November 18, 2018

Summary

Photobiomodulation 치료 다양 한 신경학 상과 정신 장애의 처리를 위한 혁신적인 비 침 투 적인 양식 적임 이며 건강 한 두뇌 기능을 향상 시킬 수 있다. 이 프로토콜은 다른 실험실 설치류에 있는 사용을 위해 적응 시킬 수 있다 transcranial 빛 배달 여 쥐에서 뇌 photobiomodulation를 수행 하는 단계별 가이드를 포함 합니다.

Abstract

Transcranial photobiomodulation 뇌 생체, 다양 한 신경학 상과 정신 장애, 뇌 기능 및 나이 관련 된 인지에 관한 약화에 메모리 향상을 향상을 위한 잠재적인 혁신적인 비 침 투 적인 치료 방법입니다. 그리고 신경 퇴행 성 질환입니다. 우리 쥐에서 transcranial photobiomodulation 치료 (PBMT)를 위한 실험실 프로토콜을 설명합니다. 세 BALB/c 마우스 (18 개월)는 660 nm 레이저 transcranially, 일단 2 주 동안 매일 처리 됩니다. 레이저 투과율 데이터는 두 피에 빨간 입사광의 약 1% 관통 등 해 마는 대뇌 피 질의 표면에서 1mm 깊이 도달 보여줍니다. 두 가지 방법으로 치료 결과 평가: 반 즈 미로 한 해 마 의존 공간 학습 및 메모리 작업 평가, 테스트 및 측정 hippocampal ATP 수준 생체 인덱스로 사용 되는. 반 즈 작업에서 결과 레이저 치료 세 쥐 나이 일치 하는 컨트롤에 비해 공간 메모리 향상을 보여 줍니다. 생 화 확 적인 분석 뒤 레이저 치료 hippocampal ATP 레벨 증가. 우리는 메모리 성능 향상은 잠재적으로 빨간 레이저 치료에 의해 유도 된 hippocampal 에너지 대사에 개선 인해 공준. 쥐에서 관찰 때문에이 프로토콜 변환 신경 과학, 토끼, 고양이, 개, 또는 원숭이 등에서 자주 사용 하는 다른 종에 적응 될 수 다른 동물 모델에 연장 될 수 있습니다. Transcranial photobiomodulation 나이 관련 된 인지 장애에 유망한 치료 접근 될 수 있는 안전 하 고 비용 효율적인 양식 적임 이다.

Introduction

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PBMT, 또는 저수준 레이저 가벼운 치료 (LLLT), 레이저 또는 발광 다이오드 (Led) 빛 에너지에 의해 생물 학적 조직의 자극에 따라 치료 방법을 참조 하는 일반적인 용어입니다. 거의 모든 PBMT 치료 1100 nm, 1에서 500 까지의 출력 전력 600에서 근처-적외선 (NIR) 빛 파장에서 붉은 색으로 적용 됩니다 mW, 그리고 < 1 >에서 이르기까지 fluence 20 J/c m2 (정 외.1참조).

Transcranial PBMT 외부 광원 (레이저 또는 Led)2를 사용 하 여 머리의 방사선 조사에 의해 실시 하는 비 침 투 적인 빛 전달 방법입니다. 동물 응용 프로그램에 대 한이 방법은 접촉 또는 비접촉 배치의 동물의 머리에 LED 또는 레이저 프로브를 포함합니다. 치료 관심 영역에 따라 가벼운 프로브 (모든 뇌 영역을 다루는)에 대 한 전체 머리 또는 머리, 전 두 엽, 정면, 또는 정수 리 영역 등의 특정 부분에 배치할 수 있습니다. 두 피, 두개골, 그리고 두 라 메이 터를 통해 레드/NIR 빛의 부분 전송 대뇌 피 질의 표면 수준에 도달 하 고 치료 혜택을 생산 하는 충분 한 광자 에너지의 금액을 제공할 수 있습니다. 그 후, 대뇌 피 질의 수준에서 전달 된 빛 fluence 뇌3의 깊은 구조를 도달할 때까지 회색과 흰색 두뇌 문제에 메시지를 전파 것 이다.

빨강 빨강 영역 (600-680 nm)과 초기 NIR 영역 (800-870 nm)에서 스펙트럼 밴드 빛 시 토 크롬 c 산화 효소, 미토 콘 드리 아 호흡 사슬4의 터미널 효소의 흡수 스펙트럼에 해당합니다. 그것을 PBMT 레드/적외선 스펙트럼에서 photodissociation 산화 질소 (NO)의 시 토 크롬 c 산화 효소에서 결과적으로 미토 콘 드리 아 전자 전송에 증가 원인과, 궁극적으로, ATP 생성5증가 가설입니다. 신경 응용 프로그램 관련의 잠재적인 neurostimulatory 혜택 뇌 방법 다양 한 외상 성 뇌 부상 (TBI)6의 설치류 모델을 포함 한 전 임상 연구에서에서 보고 되었습니다 transcranial 방사선을 사용 하 여 PBMT 급성 뇌졸중7, Alzheimer의 질병 (광고)8, 파 킨 슨 병 (PD)9, 우울증10, 그리고 노화11.

뇌 노화에는 부정적인 영향을 미치는 몇 가지 인지 기능, 학습 및 메모리12등 신경 심리적 조건으로 간주 됩니다. 미토 콘 드리 아 ATP 생산 및 신경 생체에 대 한 책임 기본 세포입니다. 미토 콘 드 리아 기능 장애 관련 마13등 공간 탐색 메모리에 연결 된 뇌 영역에 적자 나이 관련 된 것으로 알려져 있다. 레드/NIR 두개골 치료 행위 주로 미토 콘 드리 아 생체의 변조, 빛 때문에 해 마에 전달된 빛 복용량을 충분 한 공간 메모리 결과14의 개선 될 수 있습니다.

현재 프로토콜의 목표는 쥐, 붉은 빛의 낮은 수준을 사용 하의 transcranial PBMT 절차를 보여 줍니다. 필요한 레이저 광선 전송 측정 세 쥐의 머리 조직을 통해 설명 합니다. 또한, 반 즈 미로, 해 마 의존 공간 학습 및 메모리 작업 및 생체 인덱스로 hippocampal ATP 수준으로 사용 됩니다 동물에서 치료 영향의 평가.

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Protocol

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모든 절차의 관리 및 건강의 국가 학회 (NIH;의 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 따라 실시 했다 게시 번호 85-23, 개정 1985) Tabriz 대학 의료 과학의 지역 윤리 위원회에 의해 승인.

주의:이 프로토콜 클래스 3B 레이저의 응용 프로그램을 포함 하 고 적절 한 교육 및 안전 지침을 준수 해야 합니다. 클래스 3B 레이저 심각 하 게 눈을 손상 시킬 수 있습니다 그리고 피부를 열 수 있습니다. 클래스 3B 레이저 화상 위험을 간주 되지 않습니다. 눈 보호 고글을 착용 해야 합니다 항상 레이저 장치를 운영 하는 경우.

1. 레이저 광선 전송 실험

참고: 여기에서 사용 했다 3 18 개월 남성 BALB/c 마우스에서에서 얻은 Tabriz 대학 의료 과학의 동물 시설. 60 mW 레이저 (660 nm) 원형 빔 모양 직경에서 2.5 m m의 광원으로 사용입니다. 레이저 소스 가우스 강도 프로필 원형 편광 된 빛을 생산 및 연속파 모드에서 운영 됩니다. 10 nW 해상도, 평방 1 cm2 포토 다이오드 활성 영역, 400에서 1100 nm의 스펙트럼 응답 범위와 상업 포토 다이오드 전력 측정기는 샘플을 통해 전송 된 광 전력 측정 하는 데 사용 됩니다.

  1. 샘플 준비
    1. 신선한 샘플을 얻기 위해 케 타 민 (100mg/kg) 및 xylazine (10 mg/kg)의 혼합물으로 마우스를 anesthetize 깊이.
    2. 어깨 바로 위에 있는 지점에서 시작 하는 일반가 위 마우스의 머리를 해 부.
    3. 턱의 복 부 측 앞면이 위쪽을 향하도록 머리를 회전 합니다. 슬라이드 각도 해 부가 위 구강을 통해 원활 하 게 악의 접합의 저항을 발견 될 때까지. 모든 큰 근육 연결 mandible 뼈 두개골 하 고 그들을 삭제.
    4. 각된 해 부가 위를 사용 하 여 팔 뼈를 제거 합니다.
    5. 곡선된 겸 자 사용 하 여 두개골을 둘러싼 모든 육체를 삭제 합니다.
    6. 해 부는 두개골의 낮은 부분 그리고, 신중 하 게 걸릴 나머지 두개골 뼈에서 두뇌 곡선된 주걱으로.
    7. 그래서 조직 슬 라이 싱에 적합 것 그대로 뇌 조직의 2 %agarose 젤에 수정.
      참고: 순서 그대로 두개골을 얻을 플러스 샘플 두 피, 뇌 조직의 제거 되어야 한다 어떤 손상도 없이 동물의 머리의 복 부 측에서 머리의 등 쪽 부분에.
  2. 절차를 부 러 뜨 리는 두뇌
    1. Vibratome 마운트 블록의 표면에 드롭 superglue (~0.05 mL)의 확산.
    2. 신중 하 게 vibratome는 두뇌의 복 부 표면 올려 놓습니다, 블록을 장착을 agarose 블록을 연결 하 고 그것의 위치를 조정.
    3. 약간 agarose 블록의 위쪽 표면에 vibratome 블레이드 일치 하 고 기본 수준으로 커터 값을 기록 합니다.
    4. 얼음 처럼 차가운 정상적인 염 분 솔루션 vibratome 탱크를 채우십시오.
    5. 만족 스러운 슬라이스를 (예를 들어, 슬라이스 두께 [1mm], 속도 장치 단위에 5 [5], 그리고 진동 주파수 [장치 단위에 5 5]) vibratome 매개 변수를 조정 합니다.
    6. 잘라 두뇌 transversely 조각 1000 µ m 두께.
      참고: 슬라이스는 대뇌 피 질의 표면에 의해 구분 된 뇌 조직의 부분 고 비행기 1000 µ m (지 마) 대뇌 피 질의 표면에 열 등 한.
    7. 광학 유리 표면에 한 방울의 물 (~0.05 mL)을 추가 하 고 그것의 위에 뇌 조각을 넣어. 다음, 물에 두뇌 슬라이스 한 방울을 추가 하 고 신중 하 게 그것의 위에 두 번째 광학 유리를 배치.
      참고: 한 방울의 물 추가 되어야 합니다 샘플 유리 경계에 건조 하는 조직과 거친 표면에서 산란 하는 빛을 방지 하기 위하여.
  3. 머리 조직을 통해 빛 전송의 측정
    1. 레이저 장치를 반영 하는 거울, 그리고 파워 미터 단위를 포함 하 여 광학 장비를 설정 합니다.
      주의: 레이저를 켜기 전에 눈 보호 고글에 넣어.
    2. 전원 측정기에 샘플의 부재, 레이저 장치 고는 다이오드의 활성 영역에 수직 빔 지도 대 한 적절 한 거리에 위치 하는 거울에 레이저 빔을 초점.
      참고: 광선 전송 측정 수행 되어야 합니다 (23-25 ° C), 실 온에서 암실에서 머리 조직 추출 된 후 30 분 이내.
    3. 슬라이스된 뇌 조직에서 측정을 수행 합니다.
      1. 파워 미터의 표면에 2 개의 빈 광학 유리를 배치 합니다.
      2. 전송 된 가벼운 힘을 읽고 (내가0) 파워 미터의에서 화면을 표시 하 고 값을 기록.
      3. 부드럽게 두 광학 유리에 의해 포함 하 고 뇌 샘플 파워 미터의 표면에, 직물의 각각 지역에 빔을 집중, 전송된 전력, 읽기 놓고 값을 기록 합니다.
    4. 두개골 플러스는 두 피에서 측정을 수행 합니다.
      1. 파워 미터의 표면에 빈 광학 유리를 배치 합니다.
      2. 전송 된 가벼운 힘을 읽고 (내가0) 파워 미터의에서 화면을 표시 하 고 값을 기록.
      3. 가볍게 신선한 두개골을 가진 광학 유리 플러스 파워 미터의 표면에 조직 두 피, 광선 bregma 영역에 일치, 전송된 전력, 읽기 놓고 값을 기록 합니다.
      4. 신호 대 잡음 비율을 최대화 하기 위해 가벼운 전송 측정 최소 3 반복 모든 샘플에 대 한 x.
        참고: bregma 영역에 배치 되는 약 3 m m rostral 귀 앞쪽 기지를 통해 그린 선. 두개골 플러스 두 피 조직의 두께 표준 캘리퍼스에 의해 측정 됩니다.

2. Photobiomodulation 치료 (PBMT)

참고: 45 컷 BALB/c 마우스 15 생쥐의 세 그룹에 할당 된 사용 되었다. 그룹 세 제어 마우스 (18 개월) 받은 가짜-PBMT, 및 PBMT를 받은 세 PBMT 마우스 (18 개월) 가짜-PBMT를 받은 영 제어 마우스 (2 개월) 구성 되어 있었다. 가짜-PBMT 치료 치료는 PBMT와 동일 그룹 하지만 비활성 레이저로 구성 되어 있습니다. 마우스는 Tabriz 대학 의료 과학의 동물 시설에서 가져온 고 12 h 빛과 어두운 photoperiod 12 h 24-25 ° C 및 55% 상대 습도에 신경 과학 연구 센터 (NSRC)의 단위를 들고 동물에 보관 되어 있었다. 음식과 물 광고 libitum제공 했다. 모든 마우스는 치료 전에 적어도 1 주 동안 acclimatized 했다.

  1. 레이저 치료 절차
    참고: 660 nm 파장에서 연속파 모드 다이오드 GaAlAs 레이저 transcranial PBMT 치료를 위해 사용 되었다. 레이저 장치는 200 ± 2 mW의 출력 전력과 0.03 c m2의 점 크기와 6.66 W/c m2의 irradiance에서 운영 했다. 각 세션 별로 99.9 J/c m2 의 평균 fluence 15 두 피 표면에 전달 된 방사선의 s. 방사선은 관리 1 x 2 연속적인 주 동안 매일.
    1. 치료 방, 치료 전에 약 20 분 자신의 집 새에 쥐를가지고.
    2. 전기 보호 벽 콘센트에 연결 합니다.
    3. 전기 보호기에 레이저 장치 플러그를 삽입 합니다.
    4. 어떤 표면에 긁힘 방지 하기 위해 투명 한 나일론 필름으로 레이저 프로브 팁을 커버.
    5. 신중 하 게 레이저 소자의 채널에 프로브를 연결 합니다.
    6. 레이저 장치를 켜고 따뜻하게 잠시 기다립니다.
    7. 방사선 시간 및 운영 모드를 포함 하 여 레이저/치료 매개 변수를 조정 합니다.
    8. 모든 샘플의 부재에서 레이저의 평균 전력 레이저 장치에 파워 미터의 활성 영역에 프로브 팁에 연락 하 여 확인 합니다. 값을 기록 합니다.
    9. 교정 과정 (2.1.8 단계)를 반복 하 여 최소 5 배, 읽기 파워 미터에서 사고 능력 화면을 표시 하 고 값을 기록 합니다.
    10. 부드럽게 손의 손바닥에 동물의 목의 등 쪽 피부에 의해 마우스를 보유 하 고 그것의 머리를 고정.
      참고: 현재 프로토콜에 레이저 프로브 ~ 3 m m 귀에의 내부 자료 사이 그려진 선 rostral bregma 영역에 배치 됩니다.
    11. 가볍게 중간, 약 3 m m 선 귀 앞쪽 자료 통해 rostral에 두 피에 직접 프로브 팁을 놓습니다.
      참고 사항: 개최에서 프로브는 복 부의 비행기로 약 45 ° 각도.
    12. 동물의 눈에 직접 방사선을 방지 하기 위해 먼저 머리에 프로브 팁을 문의 하 고, 레이저 장치를 켭니다.
    13. 켜고 레이저 방사선 완료 될 때까지 안정적으로 프로브를 개최.
    14. 치료의 끝 후에 머리에서 레이저 프로브를 철회 하 고 부드럽게 그것의 감 금 소를 마우스를 반환 합니다.
    15. 레이저 장치를 끄고 장치에서 프로브를 분리.
    16. 적합 한 광학 청소기 레이저 프로브를 청소.
    17. 동물 시설에 쥐를 전송 합니다.

3. 행동 작업

  1. 오픈 필드 테스트
    1. 평가 운동으로 오픈 필드 테스트 기간 동안 여행 하는 총 거리에 의해 각 마우스의 활동15설명한.
  2. 반 즈 미로 작업
    1. 장치
      참고: 공간 학습 및 메모리 작업 반 즈 미로16에서 수행 됩니다. 만든 검은 나무 (95 cm 직경에서) 20의 등거리, 원형 플랫폼 이루어져이 neurobehavioral 작업에 사용 되는 장치 플랫폼, 경계에서 3 cm에 있는 5 cm 직경 원형 구멍. 장치 등반에서 동물을 방지 하기 위해 바닥에서 상승 된 50 cm 이다. 움직이는 검은 플라스틱 탈출 상자 (20 cm x 15 cm x 5 cm) 탈출 구멍 아래에 배치 됩니다. 검은 미로 흰 쥐, 테스트를 위해 사용 되 고 추적 시스템 소프트웨어 사용 하는 경우 블랙 매트 미로에서 배치 되어야 합니다.
      1. 밝은 간접 점화를 가진 조용한 방 중앙에 미로 장치를 놓습니다.
      2. 작업 방 문의 외부에 "입력 하지 않으면" 기호를 배치 합니다.
      3. 경계 벽에 시각-공간 신호를 연결 합니다.
      4. 미로 플랫폼 위에 디지털 비디오 카메라를 배치 합니다.
      5. 원치 않는 후 각 큐를 제거 하려면 70% 에탄올과 미로 플랫폼의 표면 청소.
      6. 후 각 큐 역할을 탈출 상자 안쪽에 동물의 홈 장에서 침구의 작은 금액을 추가 합니다.
    2. 적응 세션
      1. 가져올 각 마우스 마우스 길 들 여가를 위해서에서 실험을 시작 하기 전에 작업 공간 약 30 분.
      2. 그것의 감 금에서 마우스를 제거 하 고 부드럽게 1 분 탈출 상자에 동물을 배치.
    3. 교육 세션
      참고: 교육 세션 4 연속적인 일에 각 마우스에 대 한 반복 됩니다.
      1. 부드럽게 탈출 상자에서 마우스를 제거 합니다.
      2. 장소; 경기장의 센터에 마우스 다음, 시작 챔버를 위에 마우스를 놓습니다.
      3. 10 후 시작 챔버를 제거 s, 마우스 3 분 동안 경기장을 탐구 하 고.
      4. 조용히 고 컴퓨터 영역에 넣어 소음 취소 헤드폰으로 이동 합니다.
      5. 플랫폼 수준에서 약 80 dB의 큰 백색 잡음의 구성 된 부정적인 청각 자극을 실행 하 고 마우스를 찍고 시작 합니다.
      6. 백색 잡음을 끄고 마우스 탈출 상자로 들어갈 때 찍고 중지. 1 분에 대 한 상자에 그대로 남아 동물 허용.
      7. 이스케이프 상자에서 마우스를 제거 하 고 다시 그것의 감 금 소에 배치.
      8. 3.4.2 3.4.7 통해 단계를 반복 반복된 실험 사이 3 분 간격으로 하루 4 배.
        참고: 모든 실험, 사이 경기장 표면에서 소변 이나 대변을 제거 하 고 70% 에탄올과 미로 청소.
    4. 프로브 시험 세션
      1. 마지막 훈련 재판, 24 시간 후, 다음 미로 플랫폼에서 탈출 상자를 제거 하 고 3.4.2 3.4.5 통해 단계를 반복 합니다.
      2. 3 분 후 백색 잡음을 해제 하 고 찍고 중지 합니다. 마우스 미로 경기장에서 제거 하 고 다시 그것의 감 금에 그것을 배치.
      3. 모든 동물을 테스트 후 미로 플랫폼 및 시작 챔버 청소. 방에 불을 끄고 문을에서 "입력 하지 않으면" 기호를 제거.
      4. 추가 분석을 위해 외부의 하드 드라이브를 테스트 세션에서 비디오 녹화를 저장 합니다.
      5. 비디오 추적 소프트웨어 프로그램 및 추출 프로브 시험 세션 시 대상 사분면에 소요 되는 훈련 세션의 4 일 동안 대상 구멍을 찾을 수 대기 시간 및 시간을 포함 하 여 녹화 된 동영상에서 매개 변수를 설정 합니다.

4. 생 화 학적 평가

  1. 해 마에서 ATP 수준
    1. 깊이와 케 타 민 (체중의 그램 당 100 밀리 그램) 및 xylazine (체중의 그램 당 10 밀리 그램)의 혼합물의 복 주사 각 마우스 anesthetize.
    2. 동물을 목을 벨 하 고 빠르게 두개골에서 뇌 조직의 제거.
    3. 해 마 개 dissect 그리고 조직 균질 화기와 차가운 샘플 버퍼 (키트에 의해 제공) 조직 균질.
    4. 즉시 원심 2000 x g 4 ° c.에 3 분에 homogenate
    5. 깨끗 한 튜브는 상쾌한 전송.
    6. spectrophotometric를 사용 하 여 hippocampal ATP 수준을 평가 방법은 앞에서 설명한11.

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Representative Results

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통계 분석

양방향 ANOVA;에 의해 반 즈 훈련 세션에서 가져온 데이터의 통계 분석 분석 다른 행동 테스트와 분석 그룹 사이의 hippocampal ATP 레벨의 일방통행 ANOVA, Tukey의 포스트 hoc 테스트 다음에 의해 실행 되었다. 모든 데이터는 의미 ± 표준 편차 (SD)으로 표시 되는 레이저 전송 데이터 제외 ± 표준 오차 (SEM), 의미의 수단으로 표현 됩니다. 중요성 수준의 p < 0.05에서 설정 했다.

레이저 광선 전송

레이저 빛 (660 nm) 두개골 플러스 두 피 조직을 통해 전송 (샘플 두께 0.85 ± 0.09 m m)의 세 쥐 때 15.67% ± 0.87% 레이저 빔을 bregma (그림 1)에 집중 했다. 두 피 표면에 초기 fluence 99.9 J/c m2 (6.66 [W/c m2] 15 [s] x) 이후이 광선 전송에 따라, 그것은 수 수 추정 16 J/c m2 의 대략적인 fluence 대뇌 피 질의 표면에 도달 했습니다.

세 뇌 조직의 1 mm 조각을 통해 레이저 투과율은 10.10% ± 0.95% (그림 1). 이러한 값에서 빛 fluence 약 1.6 J/c m2 1 m m 깊이에서 대뇌 피 질의 표면에서 대뇌 피 질 조직 수준에서 16 J/c m2 에서 감소 추정 될 수 있다.

오픈 필드 테스트

모든 실험 그룹 (그림 2) 중 오픈 필드 테스트에서 운동 활동에 통계적으로 유의 한 차이가 있었다.

반 즈 미로 작업

반 즈 미로 작업 하는 동안 실험 그룹와 훈련의 4 일 동안 탈출 대기 시간 분석, 양방향 ANOVA 밝혀 상당한 효과 (p < 0.001) 및 그룹 (p < 0.001), 하지만 하지 날 (p x 그룹 0.47 =). 데이터의 intergroup 분석 세 제어 동물의 대기 시간 3 (p < 0.01)에 영 제어 그룹의 훈련 세션의 4 (p < 0.001) 일 보다 훨씬 더는 나타났다. 그러나, PBMT 처리 세 쥐의 대기 시간 세-컨트롤 마우스 (p < 0.01)와 비교 (p < 0.05), 넷째 날에 상당히 짧은 했다 (그림 3). 프로브 시험 세션에서 세 통제 쥐 영 통제 쥐 (p < 0.01)와 비교 대상 사분면에 상당히 짧은 시간을 보냈다. 그러나, 세 통제 쥐 (p < 0.05) 비교 대상 사분면에 보냈다 쥐 상당히 긴 시간을 세 PBMT 치료 (그림 4).

Hippocampal ATP 수준

세 통제 쥐 영 통제 쥐 (p < 0.05)에 비해 hippocampal ATP 수준에서 크게 감소를 했다. 그러나, 세 PBMT 쥐의 해 마의 평균 ATP 내용을 세 통제 쥐 (p < 0.05) 보다 상당히 큰 했다 (그림 5).

Figure 1
그림 1 : 두개골 플러스 두 피와 뇌 조직을 통해 빛 전송 데이터 레이저. 데이터 평균 ± sd. SD로 표현 된다 = 표준 편차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 오픈 필드 테스트에서 운동 활동 데이터 데이터는 평균 ± SEM. PBMT으로 표현 = photobiomodulation 치료; SEM의 평균 표준 오차 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 쥐 그룹에 대 한 대기 시간 교육 세션의 4 일 동안 탈출. 값은 평균 ± SEM. 대표 * *p < 0.01와 * * *p < 0.001, 영 통제 쥐와 비교. # p < 0.05, 세 통제 쥐와 비교. PBMT = photobiomodulation 치료; SEM의 평균 표준 오차 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : 프로브 세션의 서로 다른 그룹에 대상 사분면에 소요 하는 시간. 값은 평균 ± SEM. 대표 * *p < 0.01, 영 통제 쥐와 비교. # p < 0.05, 세 통제 쥐와 비교. PBMT = photobiomodulation 치료; SEM의 평균 표준 오차 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 : 해 마 조직에서 ATP 내용을. 값은 평균 ± SEM. 나타냅니다 *p < 0.05, 영 통제 쥐와 비교. # p < 0.05, 세 통제 쥐와 비교. PBMT = photobiomodulation 치료; SEM의 평균 표준 오차 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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우리 쥐에서 transcranial PBMT 절차 수행을 위한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 특히 설치류에 초점을 맞춘 photobiomodulation 연구를 수행 하는 신경 과학 연구소를 타겟으로하는. 그러나,이 프로토콜 토끼, 고양이, 개, 또는 원숭이 등 신경 과학 분야에서 자주 사용 되는 다른 실험 동물에 적응 될 수 있다.

현재, 증가 관심 transcranial PBMT 레드/적외선 레이저와 Led를 조사 하 고 있다. 설치류에서 전체 처리 절차를 성공적으로 수행 하기 위해 고려해 야 할 몇 가지 필수적인 단계 있다.

첫째, 그것은 중요 한, 살아있는 동물에서 어떤 치료를 시도 하기 전에 가벼운 침투는 정확 하 게 측정 동물 머리 조직을 통해 최적의 광자 복용량 (J/c m2)를 제공.

둘째, 여러 매개 변수 최적화, 가벼운 침투를 극대화 하 고 긍정적인 결과의 가능성을 증가에 필요에 따라 어떤 두뇌 지구는 병 리에 의해 영향을 치료에 대 한 대상. 조사 시간, 치료 간격, 응용된 방사 및 fluence 포함 됩니다. 예를 들어 세 동물 모델에서이 지역 나이 관련 된 병 리2에 연결 하기 때문에 뇌 해 마와 전 두 엽 피 질에 충분 한 방사선 복용량을 제공할 결정적 이다. 대상 조직에 최적의 fluence 속도 PBMT에 또 다른 중요 한 요소 이다. 대부분 연구자 광선 전송에 영향을 미칠 하지만 자주 방치 뇌 대상 조직에 복 형 응답 존재 fluence (J/c m2) 뿐만 아니라 fluence 배달의 속도 고려 하는 요소를 설명 합니다. 즉, 1 분 이상 배달 1 J/c m2 의 fluence 1 J/c m2 이상 1 s17,18전달지 않습니다.

또한 transcranial PBMT 연구를 실행 하기 전에 고려해 야 하는 몇 가지 추가적인 요인이 있다. 설치류에 Transcranial PBMT은 일반적으로 레이저를 사용 하 여 적용 하거나 Led 프로브 프로브 팁 크기 동물의 뇌 크기를 조정 합니다. 설치류, 보통-파워 레이저 응용 프로그램에 대 한 (≤ 500의 출력으로 mW) 짧은 시간에 빛 에너지의 큰 금액을 제공 하 고 동물 치료 시간과 치료 관련 스트레스를 줄일 수 있습니다. 클래스 3B 레이저 PBMT 복용량 범위 (≤20 J/c m2)에 중요 한 photothermal 효과가지고 있지 않습니다, 얼음 또는 젤, 같은 투명 한 광 물질과 두 피 표면 냉각 것이 좋습니다 transcranial 응용 프로그램 중.

일부 실험 transcranial PBMT 연구, 광섬유 레이저 또는 LED 프로브, 머리에 특정 작은 영역의 방사선에 대 한 그것의 이점 때문에 대신 사용 됩니다. 대 한 예를 들어, 초점 뇌경색, TBI, 및 PD 모델, 손상 된 영역의 정확한 방사선 조사에서 보증 된다. 그러나, 광섬유 일반적으로 작은 빔 지역이 있다, 그래서이 한 세션에 전달 하는 에너지의 총량에 영향을 미칠 것입니다 하 고 연구자 감소 지역에 대 한 보상 이상의 자리에 절차를 반복 해야 합니다. 가장 실험적인 transcranial PBMT 연구에서 머리의 방사선 조사는 경고, unanesthetized 동물에 실시 됩니다. 동물 안정성을 보장 하기 위해 수동 머리 지주 및 보호 장치를 사용 하 여 것이 좋습니다. 수동으로 유지에서 때문에 사실 그 동물 갑자기 이동할 수 있습니다 방사선 영역에서 그것의 머리를 이동 가능 하 게, 비친된 빛의 일부 낭비 될지도 모 르다 방법. 또한, 두 방법 동물에 여분의 스트레스를 일으킬 수 및 잠재적인 혼동 요인이 될 수 있습니다. 경우에 따라 조사 절차는 마 취 동물에 수행 됩니다. 그것은 너무 많은 마 취 신경 과학 연구에 실험 결과 저하 수 있습니다 주목 해야한다. 따라서, 짧은 조사 간격 실험의이 유형에 서 신중 하 게 고려 되어야 한다.

현재 연구에서 우리가 먼저 두개골을 통해 빛의 전송 측정 플러스 남성 BALB/c의 두 피 세 대뇌 피 질의 표면에 도달 하는 660 nm 레이저 에너지의 양을 결정 하는 마우스. 결과 표시 16% 깎된 두 피 표면에 초기 빛의 두뇌를 통해 전달 되었다. 남성 BALB/c 마우스에서 다른 실험실에서 전송 데이터 670 nm 레이저 빛의 1.2%만 그대로 두개골19침투 수 있었습니다 나타났습니다. 그것은 또한 670 nm LED 빛의 약 90% 마우스 두개골20내부 감쇠는 보고 되었습니다.

대뇌 피 질의 조직 수준에 빨간 레이저의 효과적인 neurostimulatory 복용량11우리의 실험실 수행 하는 이전 연구에서 확인 됐다. 우리 선수가 그 8 J/c m2 레이저의 매일 대뇌 피 질의 fluence 660 nm 모델11노화 마우스에 procognitive 효과. 현재 연구의 치료 섹션에서 약 제공 하 대뇌 피 질의 표면에 16 J/c m2 우리가 하는 데 필요한 15에 레이저를 두고 s는 쥐에 의해 허용 되었다. 현재 작업에서 우리는 또한 해 마 표면에 가벼운 힘 측정. 실험의 결과에 따라 10%의 대략적인 가치 측정 했다 세 뇌, 해당 약 1.6의 빛 fluence 하의 1mm 슬라이스를 통해 투과율을 레이저로 도달 하는 대뇌 피 질의 표면에서 깊이 1 m m J/c m2 . BALB/c 마우스 뇌를 사용 하 여 다른 연구에서 데이터는 대뇌 조직21의 각 밀리미터에 걸쳐 670 nm LED 빛 휘도의 65% 감소를 계시 했다. 그것은 또한 670 nm LED 빛의 약 2.5 %5 mm, substantia nigra compacta (SNc) 지역22에 두개골 표면에서 거리의 뇌 조직에 깊이 도달 하면 표시 되었습니다.

해 마 공간 메모리23의 통합에서 기본적인 역할을 한다. 사실, hippocampal 생체 능력 학습 공간 탐색 메모리와 연결 됩니다. 여기에 제시 된 연구 결과 약 1.6 J/c m2 마 수준에서의 가벼운 복용량 세 쥐에서 공간 메모리 결과의 개선을 생산 하는 충분 한 수 것이 좋습니다. 660의 특정 파장에 빨간색 레이저에 의해 유도 될 나타나는 hippocampal 에너지 대사의 개선 때문 인지 행동 작업 (반 즈 미로)에서 메모리 성능 향상 될 수 있다고 추정 수 nm.

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Disclosures

시공의 급여는 하버드 정신과 부서 (듀 폰-워렌 교제와 리빙스턴 수상), 두뇌 및 행동 연구 재단 (NARSAD 영 조사 상)에 의해 지원 되었다 그리고 Photothera 주식 회사에 의해 부여 무제한. 마약 기부 TEVA에서 왔다. 여행 보상 Pharmacia Upjohn에서 왔다. 시공은 Janssen 연구와 개발에서 상담 수수료를 받고 있다. 시공 정신과에서 근처-적외선 빛의 사용에 관련 된 여러 특허를 제기 했다. PhotoMedex, i n c.는 임상 연구에 대 한 4 개의 장치를 제공합니다. 시공은 transcranial photobiomodulation 주요 우울증 장애의 치료에 대 한 연구를 실시 하 고 건강 한 과목에 대 한 연구를 수행 하는 Litecure Inc.에서 무제한 자금을 받고 있다. 시공 cofounded 근처-적외선 빛;에 따라 치료의 새로운 양상의 개발에 주력 하는 회사 (Niraxx 빛 치료제) 그는 같은 회사에 대 한 컨설턴트 이기도합니다. 시공은 transcranial photobiomodulation 일반화 된 불안 장애에 대 한 연구를 수행 하는 뇌 과학에서 자금을 받았다. 다른 작가를 공개 충돌의 관심 있다.

Acknowledgments

이 작품 S.S. e Tabriz 대학 의료 과학 (no. 61019 부여)에서 교부 금에 의해 지원 되었다 그리고 LiteCure LLC, 뉴어크, 드, 미국 L.D.T.에서에서 게시 부여 저자는 면역학 부 및 그들의 친절에 Tabriz 대학 의료 과학의 교육 개발 센터 (EDC) 감사 하 고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Alfasan #1608234-01
Xylazine Alfasan #1608238-01
Agarose Sigma #A4679
Superglue Quickstar
Vibratome Campden Instruments #MA752-707
Optical glass Sail Brand #7102
Power meter Thor labs #PM100D
Photodiode detector Thor labs #S121C
Caliper Pittsburgh
GaAlAs laser Thor Photomedicine
Etho Vision Noldus
Centrifuge Froilabo #SW14R
Earmuffs Blue Eagle
Digital camera Visionlite #VCS2-E742H
Sterio amplifier Sony
Ethanol Hamonteb #665.128321
Barnes maze Costom-made
ATP assay kit Sigma #MAK190
Elisa reader Awareness #Stat Fax 2100

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References

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마우스에 Transcranial Photobiomodulation 치료에 대 한 프로토콜
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Salehpour, F., De Taboada, L., Cassano, P., Kamari, F., Mahmoudi, J., Ahmadi-Kandjani, S., Rasta, S. H., Sadigh-Eteghad, S. A Protocol for Transcranial Photobiomodulation Therapy in Mice. J. Vis. Exp. (141), e59076, doi:10.3791/59076 (2018).More

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