Summary
脳虚血再灌流のマウス モデルを確立して、脳卒中の病態を調査します。我々 は遠位右中大脳動脈と右総頚動脈を結紮し、10 または 40 分間虚血後血流を復元します。
Abstract
本研究では中大脳動脈 (MCA) 閉塞マウス モデルを用いて、脳虚血・再灌流を検討します。再現性と信頼性の高いマウス モデル、脳虚血・再灌流の病態を調査し、脳卒中患者の潜在的な治療戦略の決定に役立ちます。ウィリスの c57bl/6 マウスのサークルの解剖学の変化は、虚血性脳傷害後梗塞体積を影響します。研究は、その遠位部の MCA 閉塞 (MCAO) することができますこの問題を克服し、安定した梗塞サイズに示されています。本研究では、右 MCA への血流遮断による脳虚血・再灌流の 2 血管閉塞マウス モデルを確立します。我々 は遠位方向右 MCA と右総頚動脈 (CCA) を縛るし、虚血のある特定の期間後に血流を復元します。この虚血再灌流傷害は、安定したサイズと行動の赤字の梗塞を誘発します。末梢の免疫細胞は、24 h 浸透期間内虚血性脳を潜入します。また、皮質の領域で神経細胞の損失より長い再灌流時間の少ないです。したがって、この 2 血管閉塞モデルは脳虚血後再灌流期間中に免疫応答と神経回復の調査に適しています。
Introduction
脳虚血・再灌流マウス モデルは、虚血性脳損傷1病態生理学を調査するための最も広く使用されている実験的アプローチの一つです。脳虚血・再灌流は、末梢の免疫系を活性化ため、末梢の免疫細胞は虚血性の脳に潜入し、引き起こす神経損傷2。したがって、脳虚血・再灌流を模したマウスの信頼性と再現性のあるモデルは、脳卒中の病態生理を理解する必要です。
C57bl/6 j (B6) マウスでは、遺伝的に操作する簡単にことができますストローク実験で最も一般的に使用されるひずみです。脳虚血再灌流の状態を模した MCAO/再灌流の 2 つの一般的なモデルがあります。最初のシリコン コーティング フィラメントを採用して巡って MCA; 血流を閉塞する近位の MCAO の腔内のフィラメント モデルです。遮蔽のフィラメントはその後血流3を復元する削除されます。閉塞期間が長い場合は、皮質と皮質下のエリアの梗塞を引き起こすに対し、短い閉塞期間は皮質領域の病変の結果します。2 番目のモデルは、管外結紮縫合と動脈瘤のクリップ4の取り外しによって後の血流が回復、MCA の血流を減らすために MCA と CCA を含む遠位 MCAO の結紮モデルです。このモデルで皮質野に、梗塞が生じるし、死亡率が低い。MCAO/再灌流モデルの結紮は頭遠位 MCA のサイトを公開する必要があるので、サイトを簡単に確認することができます、プロシージャ中遠位 MCA の血流が中断されるかどうかを調べることは簡単です。
B6 マウス展示; ウィリス動脈輪の解剖学にばらつき脳虚血・再灌流5,6、7の後梗塞ボリュームに影響を与える可能性があります。現在、遠位 MCA8の結紮によってこの問題を克服することができます。本研究では、MCA 血流を閉塞し、一定期間虚血後再灌流の方法を確立します。脳虚血-再灌流モデルの 2 血管閉塞は、虚血の一定の期間の後で復元の血流と右遠位 MCA と右の CCA の結紮による MCA 領域の一過性虚血を誘発します。この MCAO/再灌流モデルは、脳虚血-再灌流4後安定したサイズ、虚血性の脳と行動の赤字で脳浸潤の免疫細胞の一括の梗塞を誘発します。
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Protocol
制度上のアニマル ・ ケアおよび中央研究院、台北医科大学の使用委員会、実験動物の使用のためこのプロトコルを承認しました。
1. MCAO/再灌流モデル
- 手術までには、水と食事への無料アクセスとマウスを提供します。
- オートクレーブ手術ツールし、手術テーブルと 70% のエタノールを使用して機器を校正します。サージカル マスクと滅菌手袋を着用します。乾燥ビーズ滅菌器を使用して、複数マウス手術は 1 つの実験で行われます場合、手術器具を滅菌します。
- 8-12 週齢マウスの麻酔 (質量: 25-30 g) 0.8% 水クロラール、腹腔内注射を介してを使用しています。麻酔下のマウスがないペダル反射 (テストとしてしっかりつま先ピンチを使用して)、anesthetization の後を確認します。
- 麻酔下ではマウスの目の乾燥を防ぐために獣医軟膏を使用します。
- 非観血的血圧測定システムを使用すると、マウスの血圧を監視します。
- その直腸温と動脈血液ガスを監視するのに生理学的モニタリング システムを使用します。36.5 ± で体温を維持 0.5 の ° c.
- 予防的抗生物質 (25 mg/kg セファゾリン)8マウス皮下注入します。
- 仰臥位加熱パッドの上にマウスを配置します。
- 電気バリカンを使って、腹側頸部だけでなく、右目と右耳の間の領域でのマウスの毛皮を削って皮膚を公開します。
- 脱毛クリームを使用してマウスの体内から毛皮をクリアし、交互に povidione ヨウ素と 70% エタノール scrbus 手術部位を消毒します。
- アイリスはさみを使用して、首に 1 cm 長い正中切開をカットします。
- アイリス鉗子を使用して、慎重に物理的な損傷を引き起こすことがなく迷走神経から無料の CCA を解剖します。
- 5-0 絹糸を使用すると、CCA を分離します。
- 右目と右耳の中間点で頭皮で 0.3 cm の切開を行います。
- 刀を使用して、頬骨と squamosal 骨を公開する側頭筋をカットします。
- ステレオ解剖顕微鏡の下で、ドリルして右側に遠位 MCA の真上 2 mm 径の穴を作成します。
- 10-0 縫合糸を使用して右側に遠位 MCA のトランクを縛る。
- 非外傷性脳動脈瘤クリップを使用して右側に CCA をオクルードします。
- 虚血の 10 または 40 分後動脈瘤クリップと MCA と CCA に血流を復元する縫合を削除します。
- 頭に皮膚切開を密封するのに縫合クリップを使用します。
- 縫合やステープル9首の皮膚を閉じることによって続いて縫合を用いた頚部皮膚切開をシールします。
- 痛み救済9に対するブプレノルフィン (0.1 mg/kg) を皮下注入します。
- それは完全に麻酔から回復まで 36.5 ± 0.5 ° C 加熱パッドでマウスの体温を維持します。それは完全に回復するまで他の動物の会社に手術を受けた動物は返されません。それは十分な意識を取り戻すまで、無人すぎる動物は放置しないでください。
- 自由に水をアクセスし、チョウは完全に回復した後、オートクレーブのケージにマウスを配置します。
2. 塩化 2,3,5 トリフェニルテトラゾリウム染色
- マウス腹腔内注射を介して 0.8% 抱水クロラールとの麻酔します。
- 営業のはさみを使って、動物の首をはねます。
- 頭の皮膚に切開を行いますにアイリスのはさみを使って頭蓋骨を公開します。
- 前頭骨の前部をカットするはさみを営業に使用します。
- アイリスはさみを使用して、矢状縫合線に沿って頭蓋骨をカットします。
- 骨 rongeur を使用して、前頭部および頭頂骨を押しのけて、脳を公開します。
- アイリス鉗子を使用して、脳を解剖します。
- マウス脳マトリックスとかみそりの刃を使用して 2 mm コロナ スライスを取得します。
- 1 リン酸緩衝生理食塩水 x 2 %2,3,5 - 塩化トリフェニルテトラゾリウム) 37 ° C で 10 分間の脳切片を染色します。
- 2 脳をリンス 10% ホルマリンで x。
- 24 時間室温で 10% ホルマリンで脳を修正します。
3. 梗塞サイズの測定
- きれいなプラスチック スライドのセクションを配置し、吻側から尾側のセクションの向き。
- スキャナーを使用してスライドをスキャンします。メトリック定規を置き、スキャンした画像に表示されていることを確認します。スライドを裏返して裏面をスキャンします。
- ImageJ のソフトウェアを使用して各セクションの梗塞領域を計算します。
- イメージファイルを開き、イメージのスケールを設定します。
- フリーハンド選択範囲を使用して、領域の梗塞部位を選択します。
- 利益 (率 ROI) マネージャーの領域を使用して、関心のある領域を測定します。
- 各セクションの梗塞領域を合計し、結果総梗塞体積を推定する切片厚を掛けます。
4. 統計解析
- グラフパッド プリズム 6 を使用して、学生のtの統計的有意性を決定するためのテストします。
注: バー グラフの誤差範囲 (SEMs) 平均値の標準誤差を表しています。 - 使用 G * 電力 3.1 適切なサンプル サイズを計算し、電力解析10を実行します。
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Representative Results
この MCAO/再灌流手順は、右 MCA 周辺皮質梗塞を生産し、行動の赤字の原因します。虚血性梗塞量 (図 1 a, B) と (図 1d) 神経細胞の損失の程度が異なるが結紮期間の増加を通じて右 MCA 領域の大脳皮質で作成されました。この MCAO/再灌流障害は、MCAO 灌 (図 2) 後 48 h で動物の自発運動を減少しました。末梢免疫細胞 (CD45高細胞) の一括は、虚血性脳 (同側半球) を潜入しても、脳虚血-再灌流後 (図 3)。また、MCAO モデルでこの 2 血管閉塞モデルを比較し、これらの 2 つのモデルの梗塞体積が大幅に異なる (図 4) でなかったことを発見します。死亡率率は低かった (< 5%)脳虚血再灌流の 2 血管閉塞マウス モデル。手術中に出血した場合、我々 はさらなる分析からマウスを除外しました。外科的処置は続いていた正しく、頭または MCA から過度の出血による動物除外率は 15% 未満をだった。右 MCA または単独で CCA の閉塞は、梗塞を発生していません。
図 1: 梗塞量と神経細胞の減少、血管閉塞の長さと正の相関します。(A) 代表的な TTC MCAO/再灌流後 24 h マウスの脳スライスの汚れ。MCAO の期間であった 10 または 40 分のデータが 3 つの独立実験の代表。(B) 梗塞量の定量化。誤差範囲を表す SEMs。n = 8;p < 0.05。免疫組織染色による MCAO/再灌流後 24 h で B6 脳、MAP2 (C) 式を求めた。MAP2 負領域は MAP2 染色脳部の代表的なイメージの破線で囲まれます。MAP2 の負の領域の (D) の定量化。MAP2 負領域 (%) = 同側の MAP2 負領域/対側半球 x 100; n = 3; * p < 0.05。
図 2: 脳虚血・再灌流後に自発運動減少します。(A) 自発運動は、MCAO/再灌流後 48 h を分析しました。MCAO の時間は 40 分でした。データは、オープン フィールド試験で 60 分間記録されました。マウスの追跡距離は、CleverSys TopScan 1.0 を使用して分析しました。偽の管理グループは、MCA や CCA の閉塞することがなく手術を受けていたマウスで構成されていた。(B) シャムと MCAO/再灌流のマウスの移動距離の定量化。± SEM; を意味するようにデータが表示されます。n = 7;p < 0.05。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 末梢の免疫細胞は脳虚血・再灌流後虚血性半球に潜入します。(A) MCAO/再灌流後、24 h で同側および対側半球の脳 infiltrating 免疫細胞 (CD45高細胞) が流量フローサイトメトリーで分析しました。脳浸潤免疫細胞の分離は、前研究4に記載されています。MCAO の期間は、MCAO/再灌流後 40 分 (B) 24 h で同側および対側半球の脳浸潤免疫細胞の定量化をでした。± SEM; を意味するようにデータが表示されます。n = 4;p < 0.05。
図 4: 梗塞ボリュームは MCAO MCAO 再灌流性および傷害の間で異なるありません。(A) 代表的な TTC、MCAO 後 24 h マウスの脳スライスの汚れ。MCAO の実験群では、右 MCA 完全に切り捨てられた船師を使用して右の CCA は、40 分の一過性結紮に対し。MCAO 灌 (MCAO/担当者) の実験群では、プロトコルのセクション 1 で説明しました。MCAO の期間は 40 分 (B) 梗塞量の定量化。± SEM; を意味するようにデータが表示されます。n = 7。
表 1: 梗塞体積とさまざまな実験から変動の比較。梗塞ボリュームを 3 つの独立した実験から MCAO/再灌流後 24 時間で求めた。MCAO の期間は 40 分 SD = 標準偏差;n = 実験ごとに使用されるマウスの数。
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Discussion
MCAO 灌マウス モデル採用して人間の一過性虚血を模倣する動物モデルであります。この動物モデルは、脳卒中の病態を検討するトランスジェニック、ノックアウト マウス系統に適用できます。プロトコルのいくつかの手順は、特に重要です。(簡単に MCA から出血を引き起こす不適切な行動で、頭蓋骨に穴を作成するときは、1) ドリルを慎重に使用する必要があります。(2) の MCA が破損していない必要がありますと結紮プロシージャの前後に出血回避する必要があります。MCA の損傷7脳虚血再灌流のレベルに影響を与えます。MCAO 後 MCA 再灌流状態を確認する必要があります。咬合と MCA に血流の回復は、レーザーのドップラーを使用して分析できます。(3) CCA は、CCA 分離中に出血する必要があります。(これは梗塞サイズと死亡率の確率を高めることができるので、4) 迷走神経を CCA 分離中に破損していない必要があります。(5) マウスの体温は、36.5 ± で維持されるべき 0.5 の ° c.温熱療法には、梗塞サイズと死亡率11の確率が増加します。低体温は、脳虚血12後梗塞ボリュームを軽減します。
この MCAO/再灌流モデルの意義は、再現性の高い皮質梗塞と行動の赤字4を作成することができます。湾内などの異なる MCAO モデルと比較して虚血性 (H/私) ストローク モデル以前のとおり研究8, この 2 血管閉塞モデル (変動係数からであった梗塞量の比較的小さい変動を誘発します。0.11 0.17) (表 1)。腔内のフィラメント モデルなどの代替ストローク モデル手術13後咬合と再灌流状態の不確かな状態のため予測不可能な梗塞量可能性があります。3 容器 MCAO モデル (右 MCA の結紮と右と左の CCAs)14と比較して、提案モデルは (右 MCA と右 CCA) 脳虚血を達成するために 2 つだけ血管の結紮を含まれます。その結果、短い手術時間が 3 容器 MCAO モデルよりも必要です。この MCAO/再灌流モデルの主な制限は、MCA 結紮を実行する頭を必要とすることです。1 つの研究は、その開頭術により脳15で転写が変更示されます。したがって、偽の制御は、MCAO/再灌流の遺伝子発現に及ぼす影響を決定するため必要です。
長い再灌流時間を採用する場合、皮質の領域で神経細胞の損失が小さいです。研究では、再灌流4,16の 2 日間と比較して再灌流の 7 日後、MAP2 負領域が小さいことを示しています。しかし、この回復効果ほとんどありません、脳内 MCAO17,18の腔内モノフィラメント モデルによる虚血。また、MCAO の腔内モノフィラメント モデルは、少なくとも 7 日間梗塞サイズを維持できます。
B6 マウス前大脳動脈 MCA19と広範な担保があります。我々 は完全に虚血性の脳の MCA を切り捨てとき、あった梗塞ボリュームない 24 h で骨格 MCA とマウスと大幅に異なる後 MCAO (図 4)。したがって、前大脳動脈側枝からの血流は遠位の MCA が完全に遮蔽されたとき MCA 領域の虚血効果補う可能性がありますをお勧めします。
本研究では 2 容器 MCAO/再灌流モデルは虚血再灌流傷害を作成され、虚血性の脳に侵入し末梢の免疫細胞の原因します。このモデルは、脳と免疫系の相互作用を調査する使用できます。さらに、それは潜在的な神経保護剤や脳虚血・再灌流後の免疫応答を調節する薬をテストするために使用できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、省の科学と技術、台湾 (最も 106-2320-B-038-024, ほとんど 105-2221-E-038-007-MY3 と最も 104-2320-B-424-001) と台北医科大学附属病院 (107TMUH-SP-01) によって支えられました。この原稿は、ウォレス学術編集することによって編集されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bone rongeur | Diener | Friedman | |
| Buprenorphine | Sigma | B-044 | |
| Cefazolin | Sigma | 1097603 | |
| Chloral hydrate | Sigma | C8383 | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-745 | |
| Electric clippers | Petpro | ||
| 10% formalin | Sigma | F5304 | |
| Germinator dry bead sterilizer | Braintree Scientific | ||
| Iris Forceps | Karl Klappenecker | 10 cm | |
| Iris Scissors | Diener | 9 cm | |
| Iris Scissors STR | Karl Klappenecker | 11 cm | |
| Microdrill | Stoelting | FOREEDOM K.1070 | |
| Micro-scissors-Vannas | HEISS | H-4240 | blade 7mm, 8 cm |
| Mouse brain matrix | World Precision Instruments | ||
| Non-invasive blood pressure system | Muromachi | MK-2000ST | |
| Operating Scissors STR | Karl Klappenecker | 14 cm | |
| Physiological Monitoring System | Harvard Apparatus | ||
| Razor blades | Ever-Ready | ||
| Stoelting Rodent Warmers | Stoelting | 53810 | Heating pad |
| Suture clip | Stoelting | ||
| Tweezers | IDEALTEK | No.3 | |
| Vetbond | 3M | 15672 | Surgical glue |
| 10-0 suture | UNIK | NT0410 | |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma | T8877 |
References
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