Summary
Для расследования патофизиологии инсульта создана модель мыши церебральной ишемии-реперфузии. Мы дистально перевязать право средней мозговой артерии и правой общей сонной артерии и восстановления кровотока после 10 или 40 мин ишемии.
Abstract
В этом исследовании модель мыши окклюзии средней мозговой артерии (MCA) используется для изучения церебральной ишемии реперфузии. Воспроизводимость и надежную мышь модель полезна для изучения патофизиологии церебральной ишемии реперфузии и определения потенциальных терапевтических стратегий для больных с инсультом. Вариации в анатомии круг Уиллис C57BL/6 мышей влияет на объем их инфаркте после травмы головного мозга индуцированной ишемии. Исследования показали, что дистального прикуса MCA (СМАо) может преодолеть эту проблему и привести к стабильной инфаркте размер. В этом исследовании мы создать модель мыши двух сосудистой окклюзии церебральной ишемии-реперфузии через прерывание потока крови к правой MCA. Мы дистально перевязать правый MCA и правой общей сонной артерии (ОСО) и восстановление кровообращения после определенного периода ишемии. Эта травма ишемии реперфузии индуцирует инфаркте стабильный размер и поведенческих дефицита. Периферические иммунных клеток проникнуть ишемии мозга в течение периода 24 h инфильтрации. Кроме того нейронов потери в области коры меньше на более длительный срок реперфузии. Таким образом эта модель двух судно окклюзии подходит для исследования иммунного ответа и нейрональных восстановления во время периода реперфузии после церебральной ишемии.
Introduction
Церебральной ишемии реперфузии мыши модель является одним из наиболее широко используемых экспериментальных подходов для изучения патофизиологии индуцированной ишемии мозга травмы1. Потому что церебральной ишемии реперфузии активирует периферийных иммунной системы, периферической иммунные клетки проникнуть в ишемии мозга и вызвать повреждения нейронов2. Таким образом надежных и воспроизводимых мыши модель, которая имитирует церебральной ишемии реперфузии требуется понимать патофизиологию инсульта.
Мышей C57Bl/6J (B6) являются наиболее часто используемые штамм в ход экспериментов, потому что они легко могут быть генетически манипулировать. Имеются две общие модели СМАо/реперфузии, которые имитируют состояние церебральной ишемии реперфузии. Во-первых, модель накаливания внутрипросветная проксимальной СМАо, где накаливания с покрытием кремния используется для intravascularly загородить кровотока в МКА; для восстановления крови поток3впоследствии удаляется наложения накаливания. Продолжительность короткого окклюзии приводит поражением подкорковых региона, тогда как продолжительность окклюзии причины инфарктов в корковых и подкорковых областях. Вторая модель является моделью лигирование дистальной СМАо, которая включает внесосудистой лигирование MCA и ОСО, чтобы уменьшить приток крови через MCA, после чего поток крови восстанавливается путем удаления швов и аневризмы клип4. В этой модели инфаркте вызывается в корковых областях, и отмечается низкий коэффициент смертности. Потому что перевязка СМАо/реперфузия модели требует Краниэктомия подвергать сайт дистальной MCA, сайт может быть легко подтверждено, и изучения ли поток крови в дистальной MCA нарушается во время процедуры является простым.
B6 мышей демонстрируют значительные вариации в анатомии их круг Уиллис; Это может повлиять на объем инфаркте, после церебральной ишемии реперфузии5,6,7. В настоящее время этой проблемы могут быть преодолены путем перевязки дистальной MCA8. В этом исследовании мы создать метод для поглощения MCA приток крови и позволяет реперфузии после определенного периода ишемии. Два судна окклюзии церебральной ишемии реперфузии модели индуцирует переходных ишемии MCA территории путем перевязки право дистальной MCA и правой ОСО, с потоком крови, восстановлен после определенного периода ишемии. Эта модель СМАо/реперфузия индуцирует инфаркте стабильный размер, основная часть проникают в мозг иммунные клетки в ишемии мозга и поведенческих дефицита после церебральной ишемии реперфузии4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Институционального ухода за животными и использования комитетов Синика и Тайбэйского медицинского университета одобрил этот протокол для использования экспериментальных животных.
1. СМАо/реперфузия модель
- Предоставить свободный доступ к вода и Чоу мышей до операции.
- Автоклав, хирургические инструменты и дезинфицировать хирургии таблицы и оборудования с использованием 70% этиловом спирте. Одежда хирургическая маска и стерильные перчатки. Используйте сухой шарик стерилизатор для resterilize хирургические инструменты, если несколько операций мыши будет проводиться в одном эксперименте.
- Анестезировать 8 - до 12-недельных мыши (массовые: 25-30 г) с помощью хлораль гидрата 0,8%, через внутрибрюшинной инъекции. Убедитесь, что наркотизированных мышь не имеет педали рефлекс (как испытания с использованием щепотку фирмы мыс) после анестезии.
- Используйте мазь ветеринар для предотвращения сухости глаз для мыши, в то время как он находится под наркозом.
- Используйте систему неинвазивного артериального давления для контроля артериального давления мыши.
- Используйте физиологические системы мониторинга для контроля за его ректальной температуры и газы артериальной крови. Поддержания температуры тела на 36,5 ± 0.5 ° C.
- Подкожно вводить мышь с профилактического Антибиотик (25 мг/кг Цефазолин)8.
- Поместите указатель мыши в лежачем положении на грелку.
- Используйте Электрические ножницы подвергать кожу после бритья меха мыши на области брюшной шеи, а также в регионе между правым глазом и правого уха.
- Используйте крем эпиляции чтобы очистить мех от мыши тело и дезинфекция хирургические сайт, чередуя scrbus с povidione йода и 70% этиловом спирте.
- Используйте Ирис ножницы, чтобы вырезать 1 см длиной срединной линии разреза на шее.
- Используйте корнцанг Ирис тщательно анализировать ОСО от блуждающих нервов без причинения телесных повреждений.
- Используйте шелковыми швами 5-0, чтобы изолировать ОАС.
- Сделайте надрез 0,3 см в волосистой части головы на середину между правым глазом и правого уха.
- Используйте microscissors для резки височной мышцы подвергать squamosal и скуловой кости.
- Под микроскопом стерео рассечения используйте microdrill для создания 2 мм в диаметре отверстия непосредственно над дистальной MCA справа.
- Перевязать стволе справа дистальной MCA с использованием шва 10-0.
- Загородить справа ОАС, используя клип нетравматических аневризмы.
- После 10 или 40 мин ишемии удалите клипов аневризм и шовный материал для восстановления кровотока в MCA и ОАС.
- Используйте зажим шовный материал для герметизации разрез кожи на голове.
- Печать разрезов шейки матки кожи, с использованием единого шва после закрытия кожи шеи с швом или основных9.
- Подкожно вводить бупренорфин (0,1 мг/кг) для боли помощи9.
- Поддерживать температуру тела мыши на 36,5 ± 0,5 ° C на грелке, до тех пор, пока он полностью оправился от анестезии. Не вернуть животное, которое претерпел хирургии в компании других животных до тех пор, пока он полностью выздоровел. Не оставляйте животное без присмотра, до тех пор, пока он приходит в сознание достаточно.
- Поместите курсор мыши в газобетона клетку, так что он может свободно доступ к воде и Чоу после того, как он полностью выздоровел.
2. окрашивание с 2,3,5-triphenyltetrazolium хлорид
- Анестезировать мыши с хлораль гидрата 0,8% через внутрибрюшинной инъекции.
- Использование операционной ножницы, чтобы обезглавить животного.
- Разоблачить черепа с помощью ножниц Ирис сделать разрез в коже головы.
- Использование операционной ножницы, чтобы вырезать передней лобной кости.
- Используйте Ирис ножницы, чтобы вырезать череп вдоль Сагиттальный шов.
- Использование костей rongeur отодвинуть в сторону лобной и теменной кости и подвергнуть мозг.
- Используйте корнцанг Ирис вскрыть мозга.
- Для получения 2 мм корональные срезы можно используйте матрицу мозга мыши и лезвия.
- Пятно срезы мозга для 10 минут при 37 ° C с 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium хлорид (TTC) в 1 x фосфат амортизированное saline.
- Промыть мозг 2 x с формалина 10%.
- Исправьте мозга в формалина 10% при комнатной температуре в течение 24 ч.
3. измерение размер infarct
- Расположить разделы на слайде чистые пластиковые и ориентировать разделы с ростральной хвостовой.
- Сканирование слайдов с использованием сканера. Место метрические линейки и убедитесь, что она видна в отсканированного изображения. Переверните слайд и сканировать обратную сторону.
- Вычислите площадь миокарда каждого раздела с помощью ImageJ программного обеспечения.
- Открыть файл изображения и настроить масштаб изображения.
- Используйте руки выбора для выбора области при инфаркте.
- Регионы интереса (ROI) менеджер используйте для измерения области интересов.
- Сумма области миокарда для каждого раздела и умножьте результат на толщина среза для оценки объема всего миокарда.
4. Статистический анализ
- Использование GraphPad Призма 6 для определения статистической значимости с студента t-теста.
Примечание: Погрешностей на гистограммы представляют собой стандартные ошибки среднего (SEMs). - Использование G * мощность 3.1 для расчета размера соответствующей выборки и выполнять анализ питания10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эта процедура СМАо/реперфузия производства корковых инфаркте вблизи правом MCA и причиной дефицита поведения. Различные степени индуцированной ишемии при инфаркте громкости (рис. 1AB) и нейрональных потери (рис. 1 cD) были созданы в коре правой области MCA путем увеличения продолжительности перевязки. Этот СМАо/реперфузионных повреждений сократилось двигательной активности животных в 48 ч после СМАо/реперфузии (рис. 2). Основная часть периферийных иммунных клеток (CD45высоким клетки) также проникли ишемии мозга (ипсилатеральные полусфера) после церебральной ишемии реперфузии (рис. 3). Кроме того мы по сравнению этой модели двух сосудистой окклюзии с моделью СМАо и обнаружил, что при инфаркте томов этих двух моделей не были существенно разные (рис. 4). Коэффициент смертности был низким (< 5%) в двух сосудистой окклюзии мыши модель церебральной ишемии реперфузии. Мы исключили мышей из дальнейшего анализа, если чрезмерное кровотечение произошло во время операции. Когда были правильно после хирургических процедур, животных исключения из-за чрезмерного кровотечения из Краниэктомия или MCA составлял менее 15%. Непроходимость права MCA или ОСО только не вызывает миокарда.
Рисунок 1: объем инфаркте и нейрональных потери положительно коррелирует с длиной судна окклюзии. (A) представитель ТТК пятна срезы мозга от мышей, 24 ч после СМАо/реперфузии. Продолжительность СМАо было 10 или 40 мин данные являются репрезентативными для трех независимых экспериментов. (B) количественная оценка объема при инфаркте. Планки погрешностей представляют ГСМОС; n = 8; p < 0,05. (C) MAP2 выражение в B6 мозги на 24 ч после СМАо/реперфузии была определена с использованием иммуногистохимия. MAP2-отрицательных областей заключены в пунктирной линии в изображении представитель MAP2 окрашивания секции мозга. (D) количественная оценка MAP2 отрицательную область. MAP2-отрицательных площади (%) = ипсилатеральные MAP2-отрицательных район / контралатеральной полушарии x 100; n = 3; * p < 0,05.
Рисунок 2: двигательной активности снизился после церебральной ишемии реперфузии. (A) двигательную активность была проанализирована 48 ч после СМАо/реперфузии. Продолжительность СМАо был 40 мин. Данные были записаны для 60 мин в assay открытое поле. Мышей отслеживания расстояния были проанализированы с помощью CleverSys TopScan 1.0. Шам контрольная группа состояла из мышей, которые прошли операцию без окклюзии MCA или ОСО. (B) количественную оценку расстояния переехал Шам и реперфузии СМАо мышей. Данные представлены как означает ± SEM; n = 7; p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: периферийных иммунных клеток проникнуть в ишемичных полушария после церебральной ишемии реперфузии. (A) иммунные клетки мозга infiltrating (CD45высоким клетки) в ипсилатерального и контралатеральной полушарии, в 24 ч после СМАо/реперфузии, были проанализированы поток цитометрии. Изоляции проникают в мозг иммунных клеток был описан в предыдущем исследовании4. Продолжительность СМАо был 40 мин (B) количественная оценка проникают в мозг иммунные клетки в ипсилатерального и контралатеральной полушарии, 24 ч после СМАо/реперфузии. Данные представлены как означает ± SEM; n = 4; p < 0,05.
Рисунок 4: объем инфаркте не отличается от травм СМАо - и СМАо/реперфузи наведенного. (A) представитель ТТК пятна срезы мозга от мышей, 24 ч после СМАо. В экспериментальной группе СМАо правый MCA постоянно усечена с использованием судна cauterizer, тогда как право ОАС был временно лигируют 40 мин. В опытной группе СМАо/реперфузии (СМАо/Rep) Эта процедура была, как описано в разделе 1 этого протокола. Продолжительность СМАо был 40 мин (B) количественная оценка объема при инфаркте. Данные представлены как означает ± SEM; n = 7.
Таблица 1: Сравнение объема при инфаркте и изменчивость от различных экспериментов. Объем при инфаркте был определен на 24 ч после СМАо/реперфузии из трех независимых экспериментов. Продолжительность СМАо был 40 мин SD = стандартное отклонение; n = количество мышей, используемые в эксперимент.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
СМАо/реперфузия мыши модель является моделью животных обычно используются для имитации переходных ишемии в организме человека. Это животное модель может применяться нокаут и трансгенных мышей штаммов для изучения патофизиологии инсульта. Особенно важны несколько шагов в протоколе. (1 microdrill тщательно должен использоваться при создании отверстие в черепе, с легко вызывая кровотечение из MCA ненадлежащих действий. (2 MCA не должны быть повреждены, и кровотечения следует избегать до и после процедуры перевязки. Повреждение MCA влияет на уровень реперфузии в ишемии мозга7. После СМАо необходимо проверить состояние реперфузии MCA. Окклюзии и восстановление кровотока в MCA могут быть проанализированы с помощью лазера Doppler. (3 ОАС должен не кровоточат при изоляции ОСО. (4) блуждающего нерва не должны быть повреждены во время изоляции ОАС, потому что это может увеличить размер infarct и вероятностей смертности. (5) температура тела мыши должен поддерживаться на 36,5 ± 0.5 ° C. Гипертермия повышает размер infarct и вероятностей смертности11. Гипотермия снижает объем инфаркте после церебральной ишемии12.
Значимость этой модели СМАо/реперфузия является, что она может создать весьма воспроизводимый корковых infarcts и поведенческие недостатки4. По сравнению с различными моделями СМАо, например гипоксическая ишемическая (H / I) модель инсульта, как описано в предыдущем изучения8, эта модель двух судно окклюзии индуцирует сравнительно небольшая изменчивость в инфаркте тома (коэффициент вариации варьировались от 0.11-0,17) (Таблица 1). Альтернативные инсульта модели, например модель накаливания внутрипросветная, может привести к непредсказуемым инфаркте объем из-за неопределенного статуса окклюзии и реперфузии состояния после хирургии13. По сравнению с трех судно СМАо модель (перевязка права MCA и правый и левый ОСО)14, предлагаемая модель включает в себя перевязкой только два судна (правый MCA и правой ОСО) для достижения церебральной ишемии. Следовательно короче время операции требуется, чем в модели СМАо три судна. Основным ограничением этой модели СМАо/реперфузия является, что она требует Краниэктомия для выполнения перевязки MCA. Одно исследование показало, что краниотомии вызывает transcriptional изменений в мозг15. Таким образом элемент управления Шам требуется определить последствия СМАо/реперфузия на экспрессию генов.
Нейрональных потери в области коры меньше при реперфузии продолжительности. Исследования показали, что площадь MAP2-отрицательных меньше после 7 дней реперфузии, по сравнению с 2 дней реперфузии4,16. Однако этот эффект восстановления маловероятно в мозге с ишемией, индуцированных модель леска внутрипросветная СМАо17,18. Кроме того модель леска внутрипросветная СМАо может выдержать размер infarct для по крайней мере 7 дней.
B6 мышей имеют обширные обеспечение между передней мозговой артерии и MCA19. Когда мы постоянно усеченный MCA в ишемии мозга, мы обнаружили, что объем инфаркте не был значительно отличается от мышей с reperfused MCA 24 ч после СМАо (рис. 4). Поэтому мы предлагаем, что поток крови из залогов передней мозговой артерии может компенсировать последствия ишемии MCA территории при дистальной MCA окончательно закрыта.
В этом исследовании два судна СМАо/реперфузия модель создал ишемии реперфузии травмы и вызвало периферийных иммунные клетки проникнуть в ишемии мозга. Эта модель может использоваться для изучения взаимосвязи между мозга и иммунной системы. Кроме того она может использоваться для проверки потенциальных neuroprotectants или наркотиков, которые модулируют иммунную реакцию после церебральной ишемии реперфузии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Министерством науки и технологии, Тайвань (наиболее 106-2320-B-038-024, наиболее 105-2221-E-038-007-MY3 и наиболее 104-2320-B-424-001) и Тайбэй медицинский университет больницы (107TMUH-SP-01). Этот манускрипт был отредактирован Уоллес академических редактирования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bone rongeur | Diener | Friedman | |
| Buprenorphine | Sigma | B-044 | |
| Cefazolin | Sigma | 1097603 | |
| Chloral hydrate | Sigma | C8383 | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-745 | |
| Electric clippers | Petpro | ||
| 10% formalin | Sigma | F5304 | |
| Germinator dry bead sterilizer | Braintree Scientific | ||
| Iris Forceps | Karl Klappenecker | 10 cm | |
| Iris Scissors | Diener | 9 cm | |
| Iris Scissors STR | Karl Klappenecker | 11 cm | |
| Microdrill | Stoelting | FOREEDOM K.1070 | |
| Micro-scissors-Vannas | HEISS | H-4240 | blade 7mm, 8 cm |
| Mouse brain matrix | World Precision Instruments | ||
| Non-invasive blood pressure system | Muromachi | MK-2000ST | |
| Operating Scissors STR | Karl Klappenecker | 14 cm | |
| Physiological Monitoring System | Harvard Apparatus | ||
| Razor blades | Ever-Ready | ||
| Stoelting Rodent Warmers | Stoelting | 53810 | Heating pad |
| Suture clip | Stoelting | ||
| Tweezers | IDEALTEK | No.3 | |
| Vetbond | 3M | 15672 | Surgical glue |
| 10-0 suture | UNIK | NT0410 | |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma | T8877 |
References
- Woodruff, T. M., et al. Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke. Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11 (2011).
- Chamorro, A., et al. The immunology of acute stroke. Nature Reviews. Neurology. 8 (7), 401-410 (2012).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - Middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. (47), e2423 (2011).
- Lee, G. A., et al. Interleukin 15 blockade protects the brain from cerebral ischemia-reperfusion injury. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 562-570 (2018).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13 (4), 683-692 (1993).
- Kitagawa, K., et al. Cerebral ischemia after bilateral carotid artery occlusion and intraluminal suture occlusion in mice: evaluation of the patency of the posterior communicating artery. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 18 (5), 570-579 (1998).
- Wellons, J. C. 3rd, et al. A comparison of strain-related susceptibility in two murine recovery models of global cerebral ischemia. Brain Research. 868 (1), 14-21 (2000).
- Doyle, K. P., Fathali, N., Siddiqui, M. R., Buckwalter, M. S. Distal hypoxic stroke: a new mouse model of stroke with high throughput, low variability and a quantifiable functional deficit. Journal of Neuroscience Methods. 207 (1), 31-40 (2012).
- Doyle, K. P., Buckwalter, M. S. A mouse model of permanent focal ischemia: Distal middle cerebral artery occlusion. Methods in Molecular Biology. , 103-110 (2014).
- Wayman, C., et al. Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability. Journal Of Visualized Experiments. (108), e53106 (2016).
- Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthermia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neuroscience Letters. 349 (2), 130-132 (2003).
- Florian, B., et al. Long-term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia. Neuroscience Letters. 438 (2), 180-185 (2008).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (3), 396-409 (2005).
- Lin, T. N., Te, J., Huang, H. C., Chi, S. I., Hsu, C. Y. Prolongation and enhancement of postischemic c-fos expression after fasting. Stroke. 28 (2), 412-418 (1997).
- Glazier, S. S., O'Rourke, D. M., Graham, D. I., Welsh, F. A. Induction of ischemic tolerance following brief focal ischemia in rat brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 14 (4), 545-553 (1994).
- Tachibana, M., et al. Early Reperfusion After Brain Ischemia Has Beneficial Effects Beyond Rescuing Neurons. Stroke. 48 (8), 2222-2230 (2017).
- Gan, Y., et al. Ischemic neurons recruit natural killer cells that accelerate brain infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (7), 2704-2709 (2014).
- Li, M., et al. Astrocyte-derived interleukin-15 exacerbates ischemic brain injury via propagation of cellular immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), E396-E405 (2017).
- Wang, S., Zhang, H., Dai, X., Sealock, R., Faber, J. E. Genetic architecture underlying variation in extent and remodeling of the collateral circulation. Circulation Research. 107 (4), (2010).
