Summary
Vi presenterer en metode for rensing, deteksjon og identifisering av diGly peptider som stammer fra ubiquitinerte proteiner fra komplekse biologiske prøver. Den presenterte metoden er reproduserbar, robust og overgår publiserte metoder med hensyn til dybdenivået i ubiquitinome-analysen.
Abstract
Den posttranslationale modifikasjonen av proteiner av det lille proteinet ubiquitin er involvert i mange cellulære hendelser. Etter tryptisk fordøyelse av ubiquitinerte proteiner, kan peptider med en diglycine rest konjugert til epsilon aminogruppen lysin ('K-ε-diglycine' eller bare 'diGly') brukes til å spore tilbake det opprinnelige modifikasjonsstedet. Effektiv immunrensing av diGly peptider kombinert med sensitiv deteksjon av massespektrometri har resultert i en stor økning i antall ubiquitination nettsteder identifisert oppdatert. Vi har gjort flere forbedringer i denne arbeidsflyten, inkludert offline høy pH omvendt fase fraksjon av peptider før berikelseprosedyren, og inkludering av mer avanserte peptidfragmenteringsinnstillinger i ionruting multipol. Også mer effektiv opprydding av prøven ved hjelp av en filterbasert plugg for å beholde antistoffperlene resulterer i en større spesifisitet for diGly peptider. Disse forbedringene resulterer i rutinemessig påvisning av mer enn 23.000 diGly peptider fra humane livmorhalskreftceller (HeLa) celle lysates på proteasome hemming i cellen. Vi viser effekten av denne strategien for grundig analyse av ubiquitinome profiler av flere forskjellige celletyper og in vivo prøver, for eksempel hjernevev. Denne studien presenterer et originalt tillegg til verktøykassen for proteinubiquitinasjonsanalyse for å avdekke den dype cellulære ubiquitinome.
Introduction
Bøyningen av ubiquitin til proteiner markerer dem for nedbrytning av proteasomen og er en avgjørende prosess i proteostase. C-terminal karboksylgruppen av ubiquitin danner et isopeptidbånd med lysin-ε-amino-gruppen avmålproteinet 1,2. I tillegg kan ubiquitin festes til andre ubiquitinmoduler, noe som resulterer i dannelse av homogene (dvs. K48 eller K11) eller forgrenet (dvs. heterogen eller blandet) polyubiquitinstrukturer1,3. Den mest kjente funksjonen til ubiquitin er dens rolle i proteasomal nedbrytning, mediert av K48-koblet polyubiquitin. Det har imidlertid blitt klart at både mono- så vel som polyubiquitination også spiller roller i mange prosesser som er uavhengige av nedbrytning av proteasom. For eksempel har K63-tilknyttede kjeder nondegradative roller i intracellulær handel, lysosomal nedbrytning, kinasesignalering og DNA-skaderespons4,5. De andre seks koblingstypene er mindre rikelig, og deres roller er fortsatt i stor grad gåtefulle, selv om de første indikasjonene på deres funksjoner i cellen dukker opp, hovedsakelig på grunn av utviklingen av nye verktøy for å muliggjøre koblingsspesifikk deteksjon6,7.
Massespektrometri har blitt et uunnværlig verktøy for proteomeanalyser, og i dag kan tusenvis av forskjellige proteiner fra nesten alle biologiske kilder identifiseres i et enkelt eksperiment. Et ekstra lag av kompleksitet presenteres ved posttranslational modifikasjoner (PTMs) av proteiner (f.eks fosforylering, metylering, acetylering og ubiquitination) som kan modulere proteinaktivitet. Storskala identifisering av PTM-bærende proteiner har også blitt gjort mulig av utviklingen i massespektrometrifeltet. Den relativt lave stoichiometry av peptider bærer PTMs sammenlignet med sine umodifiserte kolleger presenterer en teknisk utfordring og biokjemiskberikelse trinn er generelt nødvendig før massespektrometri analyse. I løpet av de siste to tiårene har flere ulike spesifikke berikelsesmetoder blitt utviklet for analyse av PTMs.
På grunn av de mangefasetterte rollene til proteinubiquitination i cellen, er det stor etterspørsel etter utvikling av analytiske metoder for påvisning av ubiquitination nettsteder på proteiner8. Anvendelsen av massespektrometriske metoder har ført til en eksplosjon av antall identifiserte ubiquitination nettsteder i frukt fly, mus, menneskelig, og gjær proteiner9,,10,11,12,13,14. Et stort skritt ble presentert ved utvikling av immunnedbørsbaserte berikelsesstrategier på peptidnivå ved hjelp av antistoffer rettet mot K-ε-GG restmotiv (også referert til som "diglycine" eller "diGly"). Disse diGly peptidene er produsert ved fordøyelsen av ubiquitinated proteiner ved hjelp av trypsin som protease15,16.
Her presenterer vi en optimalisert arbeidsflyt for å berike for diGly peptider ved hjelp av immunrensing og påfølgende deteksjon av Orbitrap massespektrometri. Ved hjelp av en kombinasjon av flere modifikasjoner av eksisterende arbeidsflyter, spesielt i prøvepreparatet og massespektrometristadiene, kan vi nå rutinemessig identifisere mer enn 23 000 diGly peptider fra en enkelt prøve av HeLa-celler behandlet med en proteasom hemmer og ~10 000 fra ubehandlede HeLa-celler. Vi har brukt denne protokollen til å lysates fra både umerkede og stabile isotop merking med aminosyrer i cellekultur (SILAC) merket HeLa celler samt til endogene prøver som hjernevev.
Denne arbeidsflyten presenterer et verdifullt tillegg til repertoar av verktøy for analyse av ubiquitination nettsteder for å avdekke den dype ubiquitinome. Følgende protokoll beskriver alle trinnene i arbeidsflyten i detalj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder som er beskrevet her, er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (EDC) i Erasmus MC.
1. Prøveforberedelse
- Kultiverte celler
- Velg en cellelinje av interesse (f.eks. HeLa eller osteosarkom [U2OS] celler) og vokse cellene i Dulbeccos Minimal Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% varme inaktivert føtal storfe serum (FBS) og 100 enheter / ml penicillin / streptomycin.
- For kvantitative proteomics eksperimenter, kulturceller i DMEM mangler arginin og lysin. Mediet må suppleres med 10% dialyzed fetal storfe serum (FBS), 100 enheter / ml penicillin / streptomycin, og alanin-glutamin. Lag to typer medier ved å legge til enten konvensjonell lysin og arginin ('Light' Medium) eller lysin-8 (13C6; 15N2) og arginin-10 (13C6; 15N4) ('Heavy' Medium), henholdsvis.
- Kulturgrupper av celler i Light Medium (dvs. umerket) og Heavy Medium (dvs. merket, SILAC) i minst seks doblinger før utvidelse og behandling for å sikre at alle proteiner i heavy medium-kulturen er merket med tung stabil isotop som inneholder aminosyrer.
- Behandle cellene i 8 timer med 10 μM av proteasomhemmeren bortezomib eller et tilsvarende volum av DMSO som en mock behandling. Vask cellene med PBS, dissosier dem ved hjelp av 1% trypsin / EDTA, og pellet cellene.
- Lyse cellepellet fra en 150 cm2 kulturplate per tilstand testet i 2 ml iskald 50 mM Tris-HCl (pH = 8,2) med 0,5% natriumdeoksycholate (DOC). Kok lysatved 95 °C i 5 min og sonikat i 10 min (innstilling "H" for sonicatoroppført i materialtabellen) ved 4 °C. Vi anbefaler ikke bruk av deubiquitinase hemmere som N-etylmaleimid (NEM), fordi dette kan innføre uønskede protein modifikasjoner som kan komplisere peptid identifikasjon.
- In vivo mus hjernevev
- Ved bruk av in vivo vev, lyse vevet i en iskald buffer som inneholder 100 mM Tris-HCl (pH = 8,5), 12 mM natrium DOC og 12 mnatrium N-lauroylsarcosinat17. Sonicate lysate i 10 min (innstilling "H" for sonicator oppført i Materialtabellen) ved 4 °C og kok lysati5 min ved 95 °C.
- Kvantat den totale proteinmengden ved hjelp av et kolorisk absorbans BCA proteinanalysesett. Den totale mengden protein bør være minst flere milligram for en vellykket diGly peptid immunnedbør (IP). For SILAC eksperimenter bland de lette og tunge merkede proteiner i et 1:1-forhold basert på den totale proteinmengden.
- Reduser alle proteiner ved hjelp av 5 mM 1,4-dithiothreitol i 30 min ved 50 °C og alkylate dem deretter med 10 mM iodoacetamid i 15 min i mørket. Utfør proteinfordøyelsen med Lys-C (1:200 enzym-til-substratratio) i 4 timer etterfulgt av fordøyelsen over natten med trypsin (1:50 enzym-til-substratratio) ved 30 °C eller ved romtemperatur (RT).
- Tilsett trifluoreddiksyre (TFA) til den fordøyde prøven til en endelig konsentrasjon på 0,5% og sentrifuge prøven på 10.000 x g i 10 min for å utløse og fjerne alt vaskemiddel. Samle supernatanten som inneholder peptidene for påfølgende fraksjonering.
2. Frakoblede peptidfraksjonering
- Bruk høy pH omvendt fase (RP) C18 kromatografi med polymere stasjonære fasemateriale (300 Å, 50 μM; se Materialtabellen) lastet inn i en tom kolonnepatron for å fraksjonere de tryptiske peptidene. Den stasjonære fase sengestørrelsen må justeres til mengden protein fordøye som skal fraksjonert. Klargjør en tom 6 ml kolonnepatron (se materialtabellen) fylt med 0,5 g stasjonært fasemateriale for ~10 mg proteinfordøye. Proteinet fordøye til stasjonærfaseforholdet bør være ca. 1:50 (w/w).
- Last peptidene på den klargjorte kolonnen og vask kolonnen med ca. 10 kolonnevolumer på 0,1 % TFA, etterfulgt av omtrent 10 kolonnevolumer på H2O.
- Elute peptidene i tre brøker med 10 kolonnevolumer på 10 mM ammoniumformatløsning (pH = 10) med henholdsvis 7 %, 13,5 % og 50 % actonitrile (AcN). Lyofiliseralle fraksjoner for å fullføre.
- Bruk ubiquitin restmotiv (K-ε-GG) antistoffer som er konjugert til protein A agaroseperler for immunberikelse av diGly peptider. Fordi den nøyaktige mengden antistoff per batch av perler er proprietær informasjon og ikke avslørt av produsenten, anbefales det å bruke samme definisjon for en batch av perler som produsenten gjør for å unngå forvirring. Vask en batch av disse perlene 2x med PBS og del perleslurryen i seks like fraksjoner. Se figur 1 for en detaljert eksperimentell ordning.
- Oppløs de tre peptidfraksjonene som samles inn i trinn 2,3 i 1,4 ml av en buffer bestående av 50 mM MOPS, 10 mM natriumfosfat og 50 mM NaCl (pH = 7,2), og snurr er avfallet.
- Tilsett supernatants av fraksjonene til diGly antistoff perler og inkuber ei 2 h ved 4 °C på en rotator enhet. Snurr ned perlene og overfør supernatanten til en frisk batch av antistoffperler og inkuber igjen i 2 timer ved 4 °C.
- Oppbevar supernatants for påfølgende global proteome (GP) analyse.
- Overfør perlene fra hver brøkdel til en 200 μL pipettespiss utstyrt med en GF/F-filterplugg for å beholde perlene. Sett pipettespissen med perlene i et 1,5 ml mikrosentrifugerør utstyrt med en sentrifugespissadapter. Vask perlene 3x med 200 μL iskald IAP-buffer og deretter 3x med 200 μL iskald milliQ H2O. Snurr ned kolonnen på 200 x g i 2 min før hvert vasketrinn, men vær forsiktig så du ikke lar kolonnen gå tørr. Peptidene elute ved hjelp av 2 sykluser på 50 μL av 0,15 % TFA.
- Desalt peptidene ved hjelp av en C18-trinnsspiss (i hovedsak en pipettetips på 200 μL med to C18-disker) og tørk dem til fullstendighet ved hjelp av vakuumsentrifugering.
3. Nanoflow LC-MS/MS
- Utfør LC-MS/MS-eksperimenter på et følsomt massespektrometer kombinert med et nanoflow LC-system.
- Bruk en internpakket 50 cm omvendt fasekolonne med en 75 μm indre diameter fullpakket med CSH130 harpiks (3,5 μm, 130 Å) og elute peptidene med en gradient på 2-28% (AcN, 0,1% FA) over 120 min på 300 nL / min. Alternativt bruker du kommersielt tilgjengelige LC kolonner med lignende egenskaper. Hold kolonnen ved 50 °C ved hjelp av en kolonneovn, for eksempel (se Materialtabellen).
- Utfør massespektrometrianalysen.
- Massespektrometeret må brukes i dataavhengig innhentingsmodus (DDA). MS1 massespektra bør samles ved høy oppløsning (f.eks. 120 000), med en automatisert gevinstkontroll (AGC) målinnstilling på 4E5 og en maksimal injeksjonstid på 50 ms i tilfelle et Orbitrap-massespektrometer.
- Utfør massespektrometrianalysen i "Høyeste intensitet først"-modus først. På denne måten velges den mest intense ionen først for fragmentering, deretter den nest høyeste, og så videre, ved hjelp av topphastighetsmetoden med en total syklustid på 3 s. Deretter utfører du en andre runde med DDA MS-analyse i "Laveste intensitet først"-modus, slik at den minst intense ionen velges først, deretter den nest laveste og så videre. Denne strategien sikrer optimal påvisning av svært lave abundancy peptider.
- Filtrer forløperionene i henhold til deres ladetilstander (2-7 kostnader) og monoisotopisk toppoppgave. Ekskluder tidligere forhørsforløpere dynamisk for 60 s. Isolere peptid forløpere med en quadrupole massefilter satt til en bredde på 1,6 Th.
- Samle MS2 spectra i ionfellen ved en AGC på 7E3 med en maksimal injeksjonstid på 50 ms og HCD kollisjonsenergi på 30%.
4. Dataanalyse
- Analyser massespektrometri raw-filer ved hjelp av en passende søkemotor, for eksempel den fritt tilgjengelige MaxQuant programvarepakken basert på Andromeda søkemotor18,19. I MaxQuant velger du standardinnstillingene med noen tilpasninger som er angitt nedenfor. Sett enzymet spesifisitet til trypsin, med maksimalt antall tapte cleavages hevet til tre. Sett lysin med en diGly rest (+114.04 Da), oksidasjon av metionin og N-terminal acetylering som variable modifikasjoner, og sett karbamidometylering av cystein som en fast modifikasjon.
- Utfør databasesøk mot en FASTA-fil som inneholder proteinsekvenser lastet ned fra for eksempel Uniprot-repositoriet (https://www.uniprot.org/downloads) kombinert med en lokkedue og en standard felles kontaminantdatabase som automatisk leveres av MaxQuant. Sett den falske oppdagelsesfrekvensen (FDR) til 1 % og sett minimumspoengsummen for endrede (diGly) peptider til 40 (standardverdi). Ekskluder peptider identifisert med en C-terminal diGly modifisert lysinrester fra videre analyse.
- For kvantitativ analyse av SILAC-eksperimentfiler, sett mangfoldet til "2" og gjenta trinn 4.2.
- Utfør alle nedstrømsanalyser (f.eks. statistikk, genontologianalyser) med Perseus-modulen20 i MaxQuant-programvarepakken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ubiquitinated proteiner etterlater en 114.04 Da diglycine rest på målet lysin rester når proteinene fordøyes med trypsin. Masseforskjellen forårsaket av dette motivet ble brukt til å entydig gjenkjenne ubiquitinasjonens sted i et massespektrometrieksperiment. Strategien som vi beskriver her er en toppmoderne metode for berikelse og påfølgende identifisering av diGly peptider ved nanoflow LC-MS/ MS (Figur 1A). I denne studien ble både kultiverte celler og in vivo-materiale brukt som den biologiske kilden til proteiner, men denne protokollen er kompatibel med enhver kilde til proteiner. Etter trinnene i protokollen bør det være enkelt å identifisere 10.000-25.000 diGly peptider fra 2-20 mg proteininput. For å øke omfanget av proteinubiquitination i celler, kan en proteasom hemmer som bortezomib eller MG132 legges til noen timer før høsting av cellene. Hvis ingen proteasomhemmer ble brukt, hadde antall identifiserte diGly peptider en tendens til å være signifikant lavere (30-40%).
Vi gjorde flere forbedringer i eksisterende protokoller. For det første utføres en rå fraksjon i tre fraksjoner basert på reversert fasekromatografi og påfølgende elution ved høy pH for å redusere kompleksiteten i peptidblandingen. Disse fraksjonene viser en svært lav overlapping i peptididentifikasjoner, og sammenlignbare antall diGly peptider bør identifiseres per brøkdel (figur 2). Dette resulterer i et høyt antall unike diGly peptider identifisert i hver av disse fraksjonene. Viktigere, en av fraksjonene (vanligvis den andre) bør inneholde ubiquitin sin egen K48 modifisert tryptic diGly peptid LIFAGK (GG)QLEDGR (m /z 730.39). Dette er uten tvil det mest tallrike peptidet i den immunsupprimerte fraksjonen og er preget av den intense og brede toppen i LC-kromatogram (figur 1B). Dette er en referansekroromatografisk topp, og hvis den er fraværende fra kromatogram, var IP mest sannsynlig mislykket.
En annen forbedring er tilpasningen av DDA-analyseprosedyren er ionruting multipol i massespektrometeret. I konvensjonell topp N dataavhengig innhenting (DDA) velges N-topper fra MS1-spekteret for fragmentering. Denne fragmenteringsordningen starter med den høyeste intensitetstoppen først, etterfulgt av toppen av nest høyeste intensitet, og så videre. I en alternativ fragmenteringsordning velges den minst intense toppen først, etterfulgt av den nest minst intense toppen, etc. Begrunnelsen bak denne rekkefølgen av valget er at det er tilstrekkelig tid til å fragmentere svært lave rikelig peptider også. Faktisk fant vi at antall peptididentifikasjoner øker når de "høyeste første" og "laveste første" DDA-kjøringene ble kombinert sammenlignet med en duplisert LC-MS-analyse med standard DDA-innstillinger (dvs. høyest først). For mer omfattende ubiquitinome profilering anbefales det derfor å kombinere LC-MS-kjøringene med "høyeste første" og "laveste første" fragmenteringsregimer i dataanalyseprosedyren. Denne "laveste første" strategien kan produsere mer enn ytterligere 4000 unike diGly peptider, som ikke ble oppdaget når bare det konvensjonelle DDA-regimet ble brukt (Figur 2).
Til slutt kan flere IP-er av gjennomstrømningen etter den første IP produsere en annen ~ 2500 unike diGly peptider (Figur 2).
Artikler i litteraturen om ubiquitination profilering rapporterer vanligvis rundt 10.000 identifiserte diGly peptider12,21. Her, av alle diGly peptider identifisert over tre biologiske replikering skjermer, > 9000 var til stede i alle tre, mens > 17.000 var til stede i minst to av tre replikas (Figur 3). Vanligvis, etter protokollen beskrevet her bør man identifisere > 21.000 unike diGly peptider fra en 15-20 mg protein prøve ved hjelp av en standard batch av CST antistoff perler. Når det gjelder renhet og selektivitet, bør forholdet mellom identifiserte diGly peptider og umodifiserte peptider alltid være > 0,5. Antall diGly peptid identifikasjoner var svært avhengig av mengden protein inngangsmateriale. En IP utført med bare 1 mg inndatamateriale produsert omtrent 2500 diGly peptid identifikasjoner, mens med 10 mg protein inngangsmateriale > 15,000 diGly peptid identifikasjoner ble produsert. Tabell 1 viser forventet antall identifiserte diGly peptider for hver tilstand. Det bør bemerkes at disse tallene er bare estimeringer og avhenger av hvilken type massespektrometer som brukes. Figur 4 viser overlappingen mellom diGly peptididentifikasjoner med lavt, middels og store mengder inngangsmateriale.
For å illustrere merverdien av forbedringene for ubiquitination site analyse beskrevet ovenfor, utførte vi også en kvantitativ ubiquitinomic analyse av SILAC merket HeLa celler som ble behandlet med proteasom hemmer bortezomib sammenlignet med ubehandlede kontrollceller i en duplikat etikett swap analyse. Mer enn halvparten (>55 %) av alle identifiserte peptider i eluat ved IP var diGly peptider. Over 19 000 unike diGly peptider ble identifisert, som bare er litt mindre enn i en ikke-SILAC merket prøve. Årsaken til dette kan være den høyere kompleksiteten av MS1 spectra i en SILAC analyse på grunn av tilstedeværelsen av peptid peak par. I SILAC-analysen ble det observert relativt store forskjeller mellom antall diGly peptider som utelukkende ble identifisert i fremre tilstand (dvs. bortezomib behandlede celler i den tunge kanalen, kontrollceller i lyskanalen) og de som utelukkende identifiseres i omvendt tilstand (dvs. bortezomib behandlede celler i lyskanalen, kontrollceller i den tunge kanalen), i dette tilfellet 1752 versus 6356 (Supplerende tabell 1). Når du bruker MaxQuant-programvaren i "multiplisitet = 2" (dvs. tokanals SILAC)-modus, ble 7555 diGly peptider identifisert med null intensitet i den tunge kanalen (nesten alle som kommer i omvendt eksperiment) og en ikke-null intensitetsverdi i lyskanalen. I motsetning ble ingen enkelt diGly peptider identifisert med en ikke-null intensitetverdi i den tunge kanalen ledsaget av en null intensitetsverdi i lyskanalen. Når en MaxQuant-analyse på samme datasett ble utført i "multiplisitet = 1"-modus med diGly moiety og merket aminosyre kombinert i en enkelt variabel modifikasjon, ble mange tunge diGly peptidvarianter identifisert, selv når ingen lett motstykke av det peptidet kunne oppdages. Den mest sannsynlige forklaringen på dette er manglende evne til programvaren for å takle identifisering av diGly peptider som utelukkende er til stede i den tunge kanalen. Dette fenomenet vil sannsynligvis forekomme mye, fordi hemmingen av proteasomen vil utløse dannelsen av nye ubiquitination nettsteder. Hvis du merker av for "requantify" i MaxQuant, som ble utviklet for å håndtere disse problemene og bør korrigeres for dette, synes å være utilstrekkelig for å unngå dette problemet helt. Selvfølgelig blir det langt flertallet av diGly peptider oppregulert eller dannet de novo ved proteasome hemming, fordi over to tredjedeler av peptidbassenget har H: L-forhold på minst 1,5 (Figur 5B).
Til slutt brukte vi denne ubiquitination site analysemetoden på en in vivo vevsprøve. For å vurdere effektiviteten, vi ekstrahert ca 32 mg protein fra frisk mus hjernen (~ 10% av våtvev vekt er protein). Hjernematerialet ble ikke behandlet med proteasomhemmere eller andre reagens som kunne øke den generelle proteinubiquitinasjonen. Fra dette eksemplet ble det identifisert 10 871 unike diGly peptider (Tilleggstabell 2). Alle diGly peptider identifisert i dette vevet stammer fra endogene steder av ubiquitination i en steady-state situasjon. Ingen behandling for å øke global ubiquitination (f.eks. proteasome hemming) ble pålagt. Vi hypoteser derfor at disse ubiquitination nettsteder minst delvis oppstår fra (poly)ubiquitination involvert i ikke-proteasom medierte cellulære signalhendelser, som er i samsvar med ideer foreslått i litteraturen5,16,22.
Til slutt åpner metoden som er beskrevet her for grundig utforskning av ubiquitinome på en reproduserbar måte. For en oversikt over typiske resultater oppnådd med denne prosedyren, se Van Der Wal et al.23.
Figur 1: Eksperimentell oversikt. (A) Oversikt over den eksperimentelle tilnærmingen. Prøvene ble utarbeidet, trypsinisert og fraksjonert i tre brøker ved hjelp av omvendt fase kromatografi med høy pH-elution. En batch av kommersielle α-diGly peptid antistoff perler ble delt inn i seks like fraksjoner og de tre peptid fraksjoner ble deretter lastet på tre av perle fraksjoner. DiGly peptider ble immunpurifisert, eluted, og samlet, og gjennomstrømningen ble senere overført til de tre gjenværende friske perler fraksjoner. De innsamlede diGly peptidene ble analysert av massespektrometri på et Lumos Orbitrap massespektrometer i henhold til en to-lags ordning som kombinerer en syklus der de mest intense toppene først ble valgt for peptidfragmentering og neste syklus der de minst intense toppene ble valgt først. Det komplette settet med nLC-MS/MS-kjøringer ble deretter analysert ved hjelp av MaxQuant. (B) En av fraksjonene skal inneholde ubiquitins egen K48 modifisert tryptisk diGly peptid LIFAGK(GG)QLEDGR (m/z 730.39). Dette er uten tvil det mest tallrike peptidet i den immunsupprimerte fraksjonen og var preget av den intense og brede toppen i LC-kromatogrammellom 50-55 min på en 120 min gradient. Hvis denne referansetoppen er fraværende fra kromatogram, var IP mest sannsynlig mislykket. Dette tallet er endret fra Van Der Wal et al.23. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Antall diGly peptider oppdaget for hver av de tre forbedringstrinnene. (A) Effekt av rå fraksjon før immunnedbør. Overlappingen mellom diGly peptidpopulasjoner identifisert i de tre separate fraksjonene er vist. (B) Effekt av første og andre inkubasjonstrinn. (C) Resultater av det justerte peptidfragmenteringsregimet. Dette tallet er endret fra Van Der Wal et al.23. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: DiGly peptider oppdaget i tre biologiske replikater av bortezomib behandlede celler som viser mengden overlapping mellom løpene. Dette tallet er endret fra Van Der Wal et al.23. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Overlapping av identifiserte diGly peptider fra analyser med lav (4 mg), middels (10 mg) og høye (40 mg) totale proteininngangsmengder. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Påvisning av diGly peptider i SILAC merkede celler. (A) Antall peptider oppdaget i forover og omvendt forhold for SILAC merket HeLa celler for multiplisitet innstillinger 1 og 2. (B) Scatterplot av diGly peptid SILAC-forhold i Bortezomib (Btz) behandlet HeLa celler. Bare peptider som ble identifisert og kvantifisert i både fremover og omvendt eksperimenter vises. Dette tallet er endret fra Van Der Wal et al.23. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Tilstand | Mengde inndatamateriale (mg) | Forventet antall identifiserte diGly peptider |
| Ubehandlede HeLa-celler | 10 | 7,500 |
| Proteasomhemmer behandlet HeLa celler | 1 | 2,500 |
| 2 | 5,000 | |
| 10 | 15,000 | |
| 20 | 20,000 | |
| 40 | >25 000 | |
| Vev (mus hjerne) | 30 | >10 000 |
Tabell 1: Forventet antall diGly peptididentifikasjoner for ulike forhold. Disse tallene er bare estimeringer og avhenger av eksperimentelle innstillinger som brukes.
Tilleggstabell 1. Vennligst klikk her for å se denne tabellen (Høyreklikk for å laste ned).
Tilleggstabell 2. Vennligst klikk her for å se denne tabellen (Høyreklikk for å laste ned).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen som er beskrevet her ble brukt på prøver fra ulike biologiske kilder, for eksempel kultiverte celler og in vivo vev. I alle tilfeller identifiserte vi tusenvis av diGly peptider, forutsatt at den totale proteininngangsmengden var minst 1 mg. Berikelsen ved hjelp av spesifikke antistoffer er svært effektiv, gitt at bare på det meste 100-150 svært lave rikelig diGly peptider ble identifisert fra hele celle lysates hvis ingen berikelse prosedyrer for ubiquitinated proteiner eller diGly peptider ble brukt. Åpenbart er sensitiv massespektrometri en forutsetning for å oppnå høye antall diGly identifikasjoner. Selv om vi med hell har brukt flere forskjellige massespektrometre, fant vi Orbitrap Tribrid Lumos å være den mest følsomme som ga de høyeste utbyttene.
Offline RP-kromatografien med høy pH-elution bør testes før IP-ene utføres. Overlappingen mellom fraksjonene når det gjelder peptididentifikasjoner, bør være så lav som mulig for et optimalt eksperiment. Etter IP bør en av fraksjonene inneholde ubiquitins egen K48 modifiserttryptisk diGly peptid LIFAGK(GG)QLEDGR (m/z 730.39). Dette er uten tvil det mest tallrike peptidet i den immunsnedsatte fraksjonen og er preget av den intense og brede toppen i LC-kromatogram mellom 50-55 min på en 120 min gradient (figur 1B). Hvis denne referansetoppen er fraværende fra kromatogram, var IP mest sannsynlig mislykket.
Det er viktig å analysere de immunsnedsettede diGly tryptiske peptidene umiddelbart etter IP-prosedyren, slik at tiden mellom IP og analyse bør holdes til et minimum. I løpet av den tiden bør peptider fortrinnsvis lagres i et hetteglass i stedet for plastrør. Å la peptider stå i plastrør for lenge, enten ved RT eller ved -20 °C, kan føre til utfelling av peptider og/eller fast i plastrørveggen. Dette vil til slutt påvirke følsomheten til analysen.
Selv om det har vært rapporter i litteraturen om den potensielle feiltolkningen av iodoacetamidaddukter som ubiquitination nettsteder på grunn av deres identiske 114.04 Da masseskift24, har vi ikke funnet noen indikasjon på dette med våre preparater av immunprecipitated tryptic peptider. For det første er bivirkningene av å bruke iodoacetamid (IAM) minimale i våre hender ved hjelp av alkyleringsreduksjonsprotokollen beskrevet ovenfor. For det andre er antistoffet spesifikt for peptider med en diglycine rest. Peptider med to iodoacetamide moieties covalently lagt til lysinrester bør ikke berikes i denne protokollen. For det tredje er flertallet av peptidene i den immunsuppiterte fraksjonen oppregulert ved proteasom hemming, som eksemplifisert på SILAC-eksperimentet beskrevet ovenfor (figur 5). Fordi populasjonen av ubiquitinerte proteiner påvirkes som følge av denne behandlingen, er det svært sannsynlig at disse berørte peptidene faktisk er diGly peptider som følge av ubiquitinerte proteiner.
Til slutt kan denne protokollen brukes i kombinasjon med en nylig publisert multipleksert kvantitativ strategi ved hjelp av TMT19. Selvfølgelig, selv om de publiserte diGly peptid tallene er noe lavere enn de som er oppnådd ved hjelp av dagens protokoll, evnen til å relativt kvantifisere opptil 16 prøver samtidig er en stor fordel. Ved å kombinere disse metodene vil forskerne kunne utføre store kvantitative ubiquitinome-studier i stor dybde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet er en del av prosjektet "Proteiner på jobben", et program fra Nederland Proteomics Centre finansiert av Nederlands organisasjon for vitenskapelig forskning (NWO) som en del av National Roadmap Large-Scale Research Facilities (prosjektnummer 184.032.201 ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-Aldrich | D8255 | |
| 3M Empore C18 Octadecyl disks | Supelco | 66883-U | product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore) |
| Ammonium formate | Sigma-Aldrich | 70221 | |
| Bortezomib | UBPbio | ||
| CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å | Waters | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| DMEM | ThermoFisher | ||
| EASY-nanoLC 1200 | ThermoFisher | ||
| FBS | Gibco | ||
| GF/F filter plug | Whatman | 1825-021 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Lysine, Arginine | Sigma-Aldrich | ||
| Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4) | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lysyl Endopeptidase(LysC) | Wako Pure Chemicals | 129-02541 | |
| NanoLC oven | MPI design, MS Wil GmbH | ||
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L-5125 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher / Pierce | 23225 | |
| PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles | Agilent Technologies | PL1412-2K01 | |
| PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit | Cell Signaling Technologies | 5562 | |
| Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge | Waters | WAT036790 | Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Trypsin, TPCK Treated | ThermoFisher | 20233 |
References
- Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143, 682-685 (2010).
- Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway. Cell. 79 (1), 13-21 (1995).
- Ohtake, F., Tsuchiya, H. JB special review - Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture. Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).
- Bergink, S., Jentsch, S. Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair. Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).
- Komander, D., Rape, M. The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).
- Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling. Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).
- Swatek, K. N., et al. Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping. Nature. 572, 533-537 (2019).
- Peng, J., et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).
- Wagner, S. A., et al. Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).
- Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).
- Elia, A. E. H., et al. Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response. Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).
- Wagner, S. A., et al. A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles. Molecular & Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284 (2011).
- Udeshi, N. D., et al. Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition. Molecular & Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).
- Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown. Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).
- Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling. Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
- Wakabayashi, M., et al. Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides. Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).
- Rose, C. M., et al. Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes. Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).
- Kaiser, S. E., et al. Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools. Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).
- Van Der Wal, L., et al. Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry. Journal of Proteomics. (July), (2017).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
