Summary
Vi præsenterer en metode til rensning, påvisning og identifikation af diGly peptider, der stammer fra ubiquitinated proteiner fra komplekse biologiske prøver. Den præsenterede metode er reproducerbar, robust og overgår offentliggjorte metoder med hensyn til dybden af ubiquitinomanalysen.
Abstract
Den posttranslationelle ændring af proteiner af den lille protein ubiquitin er involveret i mange cellulære begivenheder. Efter tryptisk fordøjelse af ubiquitinerede proteiner kan peptider med en diglycine rest konjugeret til epsilon aminogruppen af lysin ('K-ε-diglycine' eller blot 'diGly') bruges til at spore tilbage det oprindelige modifikationssted. Effektiv immunrensning af diGly peptider kombineret med følsom påvisning ved massespektrometri har resulteret i en enorm stigning i antallet af allestedsnærværende steder identificeret up to date. Vi har foretaget flere forbedringer af denne arbejdsgang, herunder offline høj pH reverse-fase fraktionering af peptider forud for berigelse procedure, og inddragelse af mere avancerede peptid fragmentering indstillinger i ion routing multipole. Også mere effektiv oprydning af prøven ved hjælp af et filter-baseret stik for at bevare antistofperlerne resulterer i en større specificitet for diGly peptider. Disse forbedringer resulterer i rutinemæssig påvisning af mere end 23,000 diGly peptider fra humane livmoderhalskræft celler (HeLa) celle lysater på proteasomhæmning i cellen. Vi viser effekten af denne strategi for dybdegående analyse af ubiquitinomprofiler af flere forskellige celletyper og af in vivo-prøver, såsom hjernevæv. Denne undersøgelse præsenterer en original tilføjelse til værktøjskassen for protein allestedsnærværende analyse for at afdække den dybe cellulære ubiquitinom.
Introduction
Konjugeringen af ubiquitin til proteiner markerer dem for nedbrydning af proteasomet og er en afgørende proces i proteostasis. C-terminal carboxyl gruppen af ubiquitin danner en isopeptid obligation med lysin ε-amino gruppe af målet protein1,2. Desuden kan ubiquitin fastgøres til andre ubiquitinmoduler, hvilket resulterer i dannelse af homogene (dvs.1,3 Den mest kendte funktion ubiquitin er dens rolle i proteasomal nedbrydning, medieret af K48-linked polyubiquitin. Men det er blevet klart, at både mono- såvel som polyubiquitination også spiller roller i mange processer, der er uafhængige af nedbrydning af proteasomet. For eksempel har K63-forbundne kæder ikke-nedbrydende roller i intracellulær handel, lysosomal nedbrydning, kinase signalering, og DNA-skader svar4,5. De øvrige seks koblingstyper er mindre rigelige, og deres roller er stadig i vid udstrækning gådefulde, selv om de første indikationer om deres funktioner i cellen er ved at opstå, hovedsagelig på grund af udviklingen af nye værktøjer til at muliggøre sammenkædningsspecifik detektion6,7.
Massespektrometri er blevet et uundværligt redskab til proteomanalyser, og i dag kan tusindvis af forskellige proteiner fra stort set alle biologiske kilder identificeres i et enkelt eksperiment. Et yderligere lag af kompleksitet præsenteres ved posttranslationelle modifikationer (PTMs) af proteiner (f.eks. fosforylering, methylering, acetylation og allestedsnærværelse), som kan modulere proteinaktivitet. Det er også blevet muligt at identificere PTM-bærende proteiner i stor skala som følge af udviklingen inden for massespektrometriområdet. Den relativt lave stoichiometri af peptider med PTMs sammenlignet med deres umodificerede modstykker udgør en teknisk udfordring, og biokemiske berigelsestrin er generelt nødvendige forud for massespektrometrianalysen. I løbet af de sidste to årtier er der udviklet flere forskellige specifikke tilsætningsmetoder til analyse af ptm'er.
På grund af de mangefacetterede roller protein allestedsnærværende i cellen, der er en stor efterspørgsel efter udvikling af analytiske metoder til påvisning af allestedsnærværende steder på proteiner8. Anvendelsen af massespektrometriske metoder har ført til en eksplosion af antallet af identificerede allestedsnærværende steder i frugtflue, mus, menneske og gær proteiner9,10,11,12,13,14. Et vigtigt skridt blev præsenteret ved udviklingen af immunudfældningsbaserede berigelsesstrategier på peptidniveau ved hjælp af antistoffer rettet mod K-ε-GG-restmotivet (også kaldet »diglycine« eller »diGly«). Disse diGly peptider er produceret ved fordøjelsen af ubiquitinated proteiner ved hjælp af trypsin som protease15,16.
Her præsenterer vi en optimeret arbejdsgang for at berige diGly peptider ved hjælp af immunrensning og efterfølgende detektion af Orbitrap massespektrometri. Ved hjælp af en kombination af flere ændringer af eksisterende arbejdsgange, især i prøveforberedelsen og massespektrometristadierne, kan vi nu rutinemæssigt identificere mere end 23.000 diGly peptider fra en enkelt prøve af HeLa-celler behandlet med et proteasom og ~10.000 fra ubehandlede HeLa-celler. Vi har anvendt denne protokol på lysater fra både umærkede og stabile isotopmærkning med aminosyrer i cellekultur (SILAC) mærket HeLa-celler samt endogene prøver såsom hjernevæv.
Denne arbejdsgang præsenterer en værdifuld tilføjelse til repertoiret af værktøjer til analyse af allestedsnærværende steder for at afdække den dybe ubiquitinom. Følgende protokol beskriver alle trin i arbejdsprocessen i detaljer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (EDC) under Erasmus MC.
1. Forberedelse af prøver
- Dyrkede celler
- Vælg en cellelinje af interesse (f.eks HeLa eller osteosarkom [U2OS] celler) og vokse cellerne i Dulbecco's Minimal Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% varme inaktiveret føtal kvæg serum (FBS) og 100 enheder / ml penicillin / streptomycin.
- Til kvantitative proteomiske eksperimenter mangler dyrkningsceller i DMEM arginin og lysin. Mediet skal suppleres med 10% dialyseret fosterserum (FBS), 100 enheder/ml penicillin/streptomycin og alanin-glutamin. Lav to typer medier ved at tilføje enten konventionel lysin og arginin ('Light' Medium) eller lysin-8 (13C6; 15N2) og arginin-10 (13C6; 15N4) (»Heavy«- Medium).
- Dyrkningsbatches af celler i Light Medium (dvs. ikke-mærket) og Heavy Medium (dvs. mærket, SILAC) i mindst seks fordoblinger før udvidelse og behandling for at sikre, at alle proteiner i Heavy Medium-kulturen er mærket med kraftig stabil isotop indeholdende Aminosyrer.
- Cellerne behandles i 8 timer med 10 μM proteasomhæmmer bortezomib eller et tilsvarende volumen Af DMSO som en mock-behandling. Cellerne vaskes med PBS, de adskilles ved hjælp af 1% trypsin/EDTA, og cellerne pelleters.
- Cellepellet slyses fra en 150 cm2 dyrkningsplade pr. tilstand testet i 2 ml iskold 50 mM Tris-HCl (pH = 8,2) med 0,5% natriumdeoxycholate (DOC). Lysatet koges ved 95 °C i 5 min. og sonikeres i 10 min (indstilling "H" for sonikeren, der er anført i materialetabellen) ved 4 °C. Vi anbefaler ikke brug af deubiquitinasehæmmere såsom N-ethylmaleimid (NEM), da dette kan medføre uønskede proteinændringer, der kan komplicere peptididentifikationen.
- In vivo mus hjernevæv
- Ved brug af in vivo-væv lyses vævet i en iskold buffer indeholdende 100 mM Tris-HCl (pH = 8,5), 12 mM natrium DOC og 12 mM natrium N-lauroylsarcosinat17. Lysatet sonikeres i 10 min (indstilling "H" for den soniker, der er anført i materialetabellen)ved 4 °C og kog lysatet i 5 min ved 95 °C.
- Quantietat den samlede proteinmængde ved hjælp af en kolorimetrisk absorbans BCA protein assay kit. Den samlede mængde protein bør være mindst flere milligram for en vellykket diGly peptid immunudfældning (IP). Til SILAC-eksperimenter blandes de lette og tunge mærkede proteiner i et 1:1-forhold baseret på den samlede proteinmængde.
- Der reduceres alle proteiner med 5 mM 1,4-dithiothreitol i 30 min ved 50 °C og derefter tilalt med 10 mM iodoacetamid i 15 minutter i mørke. Udfør proteinfordøjelse med Lys-C (1:200 enzym-til-substratforhold) i 4 timer efterfulgt af nattens fordøjelse med trypsin (1:50 enzym-til-substratforhold) ved 30 °C eller ved stuetemperatur (RT).
- Trifluoreddikesyre (TFA) tilsættes til den fordøjede prøve til en endelig koncentration på 0,5% og prøven centrifugeres ved 10.000 x g i 10 min for at udfælde og fjerne alt vaskemiddel. Supernatanten, der indeholder peptiderne, indsamles til efterfølgende fraktionering.
2. Offline peptid fraktionering
- Brug høj pH-omvendt fase (RP) C18-kromatografi med polymert stationært fasemateriale (300 Å, 50 μM; se Materialetabel)indlæst i en tom søjlepatron for at fraktionere tryptiske peptider. Den stationære fase seng størrelse skal justeres til mængden af protein fordøje at blive fraktioneret. Der fremstilles en tom 6 ml søjlepatron (se Materialetabel)fyldt med 0,5 g stationært fasemateriale til ~10 mg proteinfordøje. Proteinfordøjet til det stationære faseforhold skal være ca. 1:50 (w/w).
- Læg peptiderne på den forberedte kolonne og vask kolonnen med ca. 10 kolonnevolumener på 0,1% TFA efterfulgt af ca. 10 kolonnemængder h2O.
- Elupeptiderne i tre fraktioner med 10 kolonnevolumener på 10 mM ammoniumformatopløsning (pH = 10) med henholdsvis 7%, 13,5% og 50% acetonitril (AcN). Lyophilize alle fraktioner til fuldstændighed.
- Brug ubiquitin rest motiv (K-ε-GG) antistoffer konjugeret til protein En agarose perler til immunberigelse af diGly peptider. Da den nøjagtige mængde antistof pr. parti perler er fortrolige oplysninger og ikke videregives af producenten, anbefales det at bruge den samme definition for et parti perler, som producenten gør for at undgå forvirring. Vask et parti af disse perler 2x med PBS og split perle gylle i seks lige store fraktioner. Se figur 1 for en detaljeret forsøgsordning.
- De tre peptidfraktioner, der er indsamlet i trin 2.3 i 1,4 ml af en buffer bestående af 50 mMM MOPS, 10 mM natriumfosfat og 50 mM NaCl (pH = 7.2), og der spindes ned i snavset.
- Supernatanterne af fraktionerne til de diGly antistofperler og inkuberes i 2 timer ved 4 °C på en rotatorenhed. Spin ned perlerne og overføre supernatant til en frisk parti af antistof perler og inkubere igen i 2 timer ved 4 °C.
- Gem supernatanterne til efterfølgende global proteomanalyse (GP).
- Overfør perlerne fra hver fraktion til en 200 μL pipettespids udstyret med et GF/F filterstik for at bevare perlerne. Sæt pipettespidsen med perlerne i et 1,5 ml mikrocentrifugerør udstyret med en centrifugespidsadapter. Perlerne vaskes 3x med 200 μL iskold IAP-buffer og derefter 3x med 200 μL iskold milliQ H2O. Spin ned i kolonnen ved 200 x g i 2 min før hvert vasketrin, men pas på ikke at lade kolonnen løbe tør. Elu peptider ved hjælp af 2 cyklusser af 50 μL af 0,15% TFA.
- Afsalt peptiderne ved hjælp af en C18-trinsspids (hovedsagelig en 200 μL pipettespids med to C18-diske) og tør dem for fuldstændighed ved hjælp af vakuumcentrifugering.
3. Nanoflow LC-MS/MS
- Udfør LC-MS/MS-eksperimenter på et følsomt massespektrometer koblet til et nanoflow LC-system.
- Brug en intern pakket 50 cm omvendt fasesøjle med en inderdiameter på 75 μm pakket med CSH130-harpiks (3,5 μm, 130 Å) og udrev peptiderne med en gradient på 2−28% (AcN, 0,1% FA) over 120 min ved 300 nL/min. Alternativt kan du bruge kommercielt tilgængelige kolonner LC med lignende egenskaber. Hold kolonnen ved 50 °C ved hjælp afen kolonneovn, f.eks.
- Udfør massespektrometrianalysen.
- Massespektrometeret skal betjenes i dataafhængig anskaffelsestilstand (DDA). MS1-massespektre skal indsamles ved høj opløsning (f.eks. 120.000) med en automatiseret forstærkningskontrol (AGC) målindstilling på 4E5 og en maksimal injektionstid på 50 ms i tilfælde af et Orbitrap-massespektrometer.
- Udfør massespektrometrianalysen i tilstanden "Højeste intensitet først" først. På denne måde vælges den mest intense ion først til fragmentering, derefter den næsthøjeste og så videre ved hjælp af tophastighedsmetoden med en samlet cyklustid på 3 s. Udfør derefter en anden runde af DDA MS-analysen i tilstanden "Laveste intensitet først", så den mindst intense ion vælges først, derefter den næstlaveste osv. Denne strategi sikrer optimal påvisning af meget lave abundancy peptider.
- Filtrer forløberen ioner i henhold til deres afgift stater (2-7 afgifter) og monoisotop peak opgave. Ekskluder tidligere afhørte prækursorer dynamisk for 60 s. Isoler peptidprækursorer med et quadrupole massefilter indstillet til en bredde på 1,6 Th.
- Saml MS2-spektre i ionfælden ved en AGC på 7E3 med en maksimal injektionstid på 50 ms og HCD kollisionsenergi på 30%.
4. Dataanalyse
- Analysér massespektrometri rå filer ved hjælp af en passende søgemaskine såsom frit tilgængelige MaxQuant software suite baseret på Andromeda søgemaskine18,19. I MaxQuant skal du vælge standardindstillingerne med nogle få tilpasninger, der er angivet nedenfor. Indstil enzymetspecificitet til trypsin, med det maksimale antal ubesvarede spaltninger hævet til tre. Indstil lysin med en diGly rest (+114.04 Da), oxidation af methionin og N-terminal acetylation som variable modifikationer, og sæt carbamidomethylation af cystein som en fast modifikation.
- Udfør databasesøgninger mod en FASTA-fil, der indeholder proteinsekvenserhttps://www.uniprot.org/downloads,der er hentet fra f.eks. Indstil den falske registreringshastighed (FDR) til 1 % og angiv minimumscoren for modificerede (diGly) peptider til 40 (standardværdi). Ekskluder peptider identificeret med en C-terminal diGly modified lysin rest fra yderligere analyse.
- For den kvantitative analyse af SILAC-eksperimentfiler skal du indstille multipliciteten til "2" og gentage trin 4.2.
- Udfør alle downstream-analyser (f.eks. statistik, genontologianalyser) med Perseus modul20 i MaxQuant-softwarepakken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ubiquitinated proteiner efterlader en 114.04 Da diglycine rest på målet lysinrester, når proteinerne er fordøjet med trypsin. Masseforskellen forårsaget af dette motiv blev brugt til utvetydigt at genkende stedet for allestedsnærværelse i et massespektrometrieksperiment. Den strategi, vi beskriver her, er en state-of-the-art metode til berigelse og efterfølgende identifikation af diGly peptider ved nanoflow LC-MS/ MS (Figur 1A). I denne undersøgelse blev både dyrkede celler og in vivo materiale brugt som den biologiske kilde til proteiner, men denne protokol er forenelig med enhver kilde til proteiner. Efter trinene i protokollen bør det være ligetil at identificere 10.000-25.000 diGly peptider fra 2-20 mg proteininput. For at øge omfanget af protein allestedsnærværende i celler, en proteasom hæmmer såsom bortezomib eller MG132 kan tilføjes et par timer før høst cellerne. Hvis der ikke blev anvendt proteasomhæmmer, havde antallet af identificerede diGly peptider en tendens til at være betydeligt lavere (30-40%).
Vi har foretaget flere forbedringer af de eksisterende protokoller. For det første udføres en grov fraktionering i tre fraktioner baseret på omvendt fasekromatografi og efterfølgende eluering ved høj pH-udledning for at reducere kompleksiteten af peptidblandingen. Disse fraktioner udviser en meget lav overlapning i peptididentifikationer, og der bør identificeres et sammenligneligt antal diGly peptider pr. fraktion (figur 2). Dette resulterer i et stort antal unikke diGly peptider identificeret i hver af disse fraktioner. Vigtigere er det, en af de fraktioner (typisk den anden) bør indeholde ubiquitin egen K48 modificeret tryptic diGly peptid LIFAGK (GG) QLEDGR (m / z 730,39). Dette er langt det mest udbredte peptid i den immunpræcipiterede fraktion og er kendetegnet ved den intense og brede top i LC-kromatogrammet (Figur 1B). Dette er et toneangivende kromatografisk højdepunkt, og hvis det ikke er med i kromatogrammet, var det højst sandsynligt ikke lykkedes at nå frem til up'en.
En anden forbedring er tilpasningen af DDA-analyseproceduren er ionføringsmultipole i massespektrometeret. Ved konventionel N top N-dataafhængig erhvervelse (DDA) udvælges N-spidser fra MS1-spektret til fragmentering. Denne fragmenteringsordning starter med den højeste intensitetstop først, efterfulgt af toppen af næsthøjeste intensitet osv. I en alternativ fragmenteringsordning vælges den mindst intense top først efterfulgt af den næstmindst intense top osv. Rationalet bag denne rækkefølge af udvælgelse er, at der er tilstrækkelig tid til at fragmentere meget lavt rigelige peptider samt. Faktisk fandt vi, at antallet af peptid identifikationer stiger, når den "højeste første" og "laveste første" DDA kører blev kombineret i forhold til en dublet LC-MS analyse med standard DDA indstillinger (dvs. højeste først). For mere omfattende ubiquitinomprofilering anbefales det derfor at kombinere LC-MS-kørslerne med "højeste først" og "laveste først" fragmenteringsregimer i dataanalyseproceduren. Denne "laveste første" strategi kan producere mere end yderligere 4.000 unikke diGly peptider, som ikke blev opdaget, når kun den konventionelle DDA regime blev brugt (Figur 2).
Endelig yderligere IP's af flowthrough efter den første IP kan producere en anden ~ 2,500 unikke diGly peptider (Figur 2).
Artikler i litteraturen om ubiquitination profilering typisk rapport omkring 10.000 identificerede diGly peptider12,21. Her, af alle diGly peptider identificeret over tre biologiske replikat skærme, > 9,000 var til stede i alle tre, mens > 17,000 var til stede i mindst to ud af tre replikater (Figur 3). Typisk, efter den protokol, der er beskrevet her, bør man identificere > 21,000 unikke diGly peptider fra en 15-20 mg protein prøve ved hjælp af en standard parti af CST antistof perler. Med hensyn til renhed og selektivitet bør forholdet mellem identificerede diGly peptider og uændrede peptider altid være >0.5. Antallet af diGly peptid identifikationer var stærkt afhængig af mængden af protein input materiale. En IP udført med kun 1 mg inputmateriale produceret omkring 2.500 diGly peptid identifikationer, mens der med 10 mg protein input materiale > 15,000 diGly peptid identifikationer blev produceret. Tabel 1 viser det forventede antal identificerede diGly peptider for hver tilstand. Det skal bemærkes, at disse tal kun er skøn og afhænger af den anvendte type massespektrometer. Figur 4 viser overlapningen mellem diGly peptid identifikationer med lav, medium, og store mængder af input materiale.
For at illustrere merværdien af de forbedringer for analyse af allestedsnærværende steder, der er beskrevet ovenfor, udførte vi også en kvantitativ ubiquitinomic analyse af SILAC-mærkede HeLa-celler, der blev behandlet med proteasominhibiten bortorezomib sammenlignet med ubehandlede kontrolceller i en dobbelt etiketswapanalyse. Mere end halvdelen (>55%) af alle identificerede peptider i eluatet ved IP var diGly peptider. Over 19.000 unikke diGly peptider blev identificeret, hvilket kun er lidt mindre end i en ikke-SILAC mærket prøve. Årsagen til dette kan være den højere kompleksitet af MS1 spektre i en SILAC-analyse på grund af tilstedeværelsen af peptid peak par. I SILAC-analysen blev der observeret relativt store forskelle mellem antallet af diGly peptider, der udelukkende blev identificeret i terminstilstanden (dvs. bortezomib behandlede celler i den tunge kanal, kontrolceller i lyskanalen) og dem, der udelukkende er identificeret i omvendt tilstand (dvs. bortezomib behandlede celler i lyskanalen, kontrolceller i den tunge kanal), i dette tilfælde 1.752 versus 6.356 (supplerende tabel 1). Ved drift af MaxQuant-softwaren i "multiplicitet = 2" (dvs. to-kanals SILAC) tilstand, 7.555 diGly peptider blev identificeret med nul intensitet i den tunge kanal (stort set alle kommer i det omvendte eksperiment) og en ikke-nul intensitet værdi i lyskanalen. I modsætning hertil blev ingen enkelt diGly peptider identificeret med en ikke-nul intensitet værdi i den tunge kanal ledsaget af en nul intensitet værdi i lyskanalen. Når en MaxQuant analyse på det samme datasæt blev udført i "multiplicicity = 1" mode med diGly moiety og den mærkede aminosyre kombineret i en enkelt variabel ændring, mange tunge diGly peptid varianter blev identificeret, selv når ingen lys modstykke til dette peptid kunne påvises. Den mest sandsynlige forklaring på dette er den manglende evne til softwaren til at klare identifikationen af diGly peptider, der udelukkende er til stede i den tunge kanal. Dette fænomen vil sandsynligvis forekomme i udstrakt grad, fordi hæmning af proteasomet vil udløse dannelsen af nye allestedsnærværende steder. Afkrydsning af "requantify" valgmulighed afkrydsningsfeltet i MaxQuant, som blev udviklet til at håndtere disse spørgsmål, og bør korrigerer for dette, synes at være utilstrækkelig til at undgå dette problem helt. Det er klart, langt størstedelen af diGly peptider bliver upregulated eller dannet de novo ved proteasom hæmning, fordi over to tredjedele af peptid puljen har H:L nøgletal på mindst 1,5 (Figur 5B).
Endelig har vi anvendt denne ubiquitination site analysemetode til en in vivo vævsprøve. For at vurdere effektiviteten udvindes ca. 32 mg protein fra frisk musehjerne (~10% af vådvævets vægt er protein). Hjernen materiale blev ikke behandlet med proteasomhæmmere eller andre reagens, der kunne øge den samlede protein ubiquitination. Fra denne prøve blev der identificeret 10.871 unikke diGly peptider (supplerende tabel 2). Alle diGly peptider identificeret i dette væv stammer fra endogene steder af allestedsnærværende i en steady-state situation. Ingen behandling for at øge den globale allestedsnærværelse (f.eks proteasomhæmning) blev indført. Vi har derfor en hypotese om, at disse allestedsnærværende steder i det mindste delvis skyldes (poly) allestedsnærværende involveret i ikke-proteasom medieret cellulære signalering begivenheder, som er i overensstemmelse med ideer foreslået i litteraturen5,16,22.
Afslutningsvis giver den metode, der er beskrevet her, mulighed for en dybtgående undersøgelse af allestedsnærværende på en reproducerbar måde. For en oversigt over typiske resultater opnået med denne procedure se Van Der Wal et al.23.
Figur 1: Eksperimentel oversigt. AA) Oversigt over forsøgsmetoden. Prøverne blev forberedt, trypsiniseret og fraktioneret i tre fraktioner ved hjælp af reverse-fasekromatografi med høj pH-eluering. Et parti af kommercielle α-diGly peptid antistof perler blev opdelt i seks lige store fraktioner og de tre peptid fraktioner blev derefter indlæst på tre af perle fraktioner. De diGly peptider blev immunrenset, elueret, og indsamlet, og flowthrough blev efterfølgende overført til de tre resterende friske perler fraktioner. De indsamlede diGly peptider blev analyseret ved massespektrometri på et Lumos Orbitrap massespektrometer i henhold til en todelt ordning, der kombinerer en cyklus, hvor de mest intense toppe først blev udvalgt til peptidfragmentering og den næste cyklus, hvor de mindst intense toppe blev valgt først. Det komplette sæt nLC-MS/MS-kørsler blev derefter analyseret ved hjælp af MaxQuant. (B) En af brøkenenskal indeholde ubiquitins egen K48-modificerede tryptiske peptid LIFAGK(GG)QLEDGR (m/z 730,39). Dette er langt den mest rigelige peptid i immunpræcipiteret fraktion og var kendetegnet ved den intense og brede top i LC kromatogramme mellem 50-55 min på en 120 min gradient. Hvis dette benchmark-højdepunkt ikke findes i kromatogrammet, var det højst sandsynligt ikke lykkedes at nå frem til et resultat af dette benchmark. Dette tal er blevet ændret fra Van Der Wal et al.23. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Antallet af diGly peptider opdaget for hver af de tre forbedringstrin. (A) Effekt af grov fraktionering før immunudfældning. Overlapningen mellem diGly peptid populationer identificeret i de tre separate fraktioner er vist. (B) Effekt af første og andet inkubationstrin. (C) Resultater af det justerede peptidfragmenteringsregime. Dette tal er blevet ændret fra Van Der Wal et al.23. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: DiGly peptider opdaget i tre biologiske replikater af bortezomib behandlede celler viser mængden af overlapning mellem kørslerne. Dette tal er blevet ændret fra Van Der Wal et al.23. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Overlapning af identificerede diGly peptider fra analyser med lav (4 mg), medium (10 mg) og høje (40 mg) samlede proteininput mængder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Påvisning af diGly peptider i SILAC-mærkede celler. (A) Antallet af peptider, der påvises i de forreste og omvendte forhold i De HeLa-mærkede HeLa-celler med navnet HeLa til multiplicitetsindstillinger 1 og 2. (B) Scatterplot af diGly peptid SILAC nøgletal i Bortezomib (Btz) behandlet HeLa celler. Kun peptider, der blev identificeret og kvantificeret i både fremad- og bakforsøg, vises. Dette tal er blevet ændret fra Van Der Wal et al.23. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Betingelse | Mængden af inputmateriale (mg) | Forventet antal identificerede diGly peptider |
| Ubehandlede HeLa-celler | 10 | 7,500 |
| Proteasomhæmmer behandlede HeLa-celler | 1 | 2,500 |
| 2 | 5,000 | |
| 10 | 15,000 | |
| 20 | 20,000 | |
| 40 | >25.000 | |
| Væv (musehjerne) | 30 | >10.000 |
Tabel 1: Forventet antal diGly peptid identifikationer for forskellige betingelser. Disse tal er kun estimater og afhænger af de anvendte eksperimentelle indstillinger.
Supplerende tabel 1. Klik her for at se denne tabel (Højreklik for at downloade).
Supplerende tabel 2. Klik her for at se denne tabel (Højreklik for at downloade).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den protokol, der er beskrevet her, blev anvendt på prøver fra forskellige biologiske kilder, såsom dyrkede celler og in vivo-væv. I alle tilfælde identificerede vi tusindvis af diGly peptider, forudsat at den samlede proteintilførselsmængde var mindst 1 mg. Tilsætningen ved hjælp af specifikke antistoffer er yderst effektiv, da der kun blev identificeret 100-150 meget lave diGly peptider fra hele cellelysater, hvis der ikke blev anvendt nogen berigelsesprocedurer for ubiquitinerede proteiner eller diGly peptider. Det er klart, at følsomt massespektrometri er en forudsætning for at opnå et stort antal diGly-identifikationer. Selv om vi med succes har brugt flere forskellige masse spektrometre, fandt vi Orbitrap Tribrid Lumos at være den mest følsomme, der gav de højeste udbytter.
Offline RP-kromatografien med høj pH-eluering skal testes, før IP'erne udføres. Overlapningen mellem fraktionerne med hensyn til peptididentifikation bør være så lav som muligt for et optimalt eksperiment. Efter IP skal en af brøken indeholde ubiquitins egen K48-modificerede tryptiske peptid LIFAGK(GG)QLEDGR (m/z 730,39). Dette er langt det mest udbredte peptid i den immunpræcipiterede fraktion og er karakteriseret ved den intense og brede top i LC-kromatogrammet mellem 50-55 min på en 120 min gradient (Figur 1B). Hvis dette benchmark-højdepunkt ikke findes i kromatogrammet, lykkedes det højst sandsynligt ikke at nå frem til et resultat af up'et.
Det er vigtigt at analysere de immunpræcipiterede diGly tryptiske peptider umiddelbart efter IP-proceduren, så tiden mellem IP og analysen bør holdes på et minimum. I løbet af denne tid, peptider bør helst opbevares i et glashætteglas i stedet for plastrør. Hvis peptider efterlades i plastrør for længe, enten ved RT eller ved -20 °C, kan det resultere i udfældning af peptider og/eller stikning til plastrørvæggen. Dette vil i sidste ende påvirke analysens følsomhed.
Selv om der har været rapporter i litteraturen om den potentielle fejlfortolkning af iodoacetamid adducts som allestedsnærværende steder på grund af deres identiske 114.04 Da masse skift24,Vi har ikke fundet nogen indikation af dette med vores præparater af immunpræcipiterede tryptiske peptider. For det første er bivirkningerne ved at bruge iodoacetamid (IAM) minimale i vores hænder ved hjælp af alkyleringsreduktionsprotokollen, der er beskrevet ovenfor. For det andet er antistoffet specifikt for peptider med en diglycine rest. Peptider med to iodoacetamid moieties kovalent tilsat lysinrester bør ikke beriges i denne protokol. For det tredje er størstedelen af peptiderne i den immunpræcipiterede fraktion opreguleret ved proteasomhæmning, som eksemplificeret ved SILAC-eksperimentet, der er beskrevet ovenfor (figur 5). Fordi populationen af allestedsnærværende proteiner påvirkes som følge af denne behandling, er det meget sandsynligt, at disse berørte peptider faktisk er diGly peptider som følge af ubiquitinated proteiner.
Endelig kan denne protokol anvendes i kombination med en nyligt offentliggjort multiplexeret kvantitativ strategi ved hjælp af TMT19. Det er klart, selv om de offentliggjorte diGly peptid numre er noget lavere end dem, der opnås ved hjælp af denne protokol, evnen til relativt kvantificere op til 16 prøver samtidig tieret er en enorm fordel. Ved at kombinere disse metoder vil gøre det muligt for forskere at udføre store kvantitative ubiquitinom undersøgelser i stor dybde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde er en del af projektet "Proteiner på arbejdspladsen", et program under det nederlandske Proteomics Center finansieret af Den Nederlandske Organisation for Videnskabelig Forskning (NWO) som en del af den nationale køreplan Store forskningsfaciliteter (projekt nummer 184.032.201 ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-Aldrich | D8255 | |
| 3M Empore C18 Octadecyl disks | Supelco | 66883-U | product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore) |
| Ammonium formate | Sigma-Aldrich | 70221 | |
| Bortezomib | UBPbio | ||
| CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å | Waters | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| DMEM | ThermoFisher | ||
| EASY-nanoLC 1200 | ThermoFisher | ||
| FBS | Gibco | ||
| GF/F filter plug | Whatman | 1825-021 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Lysine, Arginine | Sigma-Aldrich | ||
| Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4) | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lysyl Endopeptidase(LysC) | Wako Pure Chemicals | 129-02541 | |
| NanoLC oven | MPI design, MS Wil GmbH | ||
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L-5125 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher / Pierce | 23225 | |
| PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles | Agilent Technologies | PL1412-2K01 | |
| PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit | Cell Signaling Technologies | 5562 | |
| Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge | Waters | WAT036790 | Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Trypsin, TPCK Treated | ThermoFisher | 20233 |
References
- Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143, 682-685 (2010).
- Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway. Cell. 79 (1), 13-21 (1995).
- Ohtake, F., Tsuchiya, H. JB special review - Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture. Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).
- Bergink, S., Jentsch, S. Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair. Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).
- Komander, D., Rape, M. The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).
- Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling. Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).
- Swatek, K. N., et al. Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping. Nature. 572, 533-537 (2019).
- Peng, J., et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).
- Wagner, S. A., et al. Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).
- Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).
- Elia, A. E. H., et al. Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response. Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).
- Wagner, S. A., et al. A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles. Molecular & Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284 (2011).
- Udeshi, N. D., et al. Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition. Molecular & Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).
- Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown. Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).
- Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling. Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
- Wakabayashi, M., et al. Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides. Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).
- Rose, C. M., et al. Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes. Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).
- Kaiser, S. E., et al. Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools. Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).
- Van Der Wal, L., et al. Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry. Journal of Proteomics. (July), (2017).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
