Summary
Мы представляем метод очистки, обнаружения и идентификации диглы пептидов, которые происходят из убиквитинаированных белков из сложных биологических образцов. Представленный метод воспроизводим, надежен и превосходит опубликованные методы по уровню глубины анализа убикитиномы.
Abstract
Постпереводная модификация белков мелким белком убиквитин участвует во многих клеточных событиях. После триптического переваривания убиквитированных белков, пептиды с остатками диглицина, спряченные с группой аминокислот эпсилона ('K---дигизина или просто 'diGly') могут быть использованы для отслеживания первоначального места модификации. Эффективная иммуноочищенность дигли пептидов в сочетании с чувствительным обнаружением масс-спектрометрией привела к значительному увеличению числа выявленных на сегодняшний день участков убиквитинации. Мы внесли ряд улучшений в этот рабочий процесс, в том числе в автономном режиме высокой рН обратной фазы фракции пептидов до процедуры обогащения, а также включение более продвинутых параметров фрагментации пептида в ионную размыва. Кроме того, более эффективная очистка образца с помощью фильтра на основе штепсельной вилки для того, чтобы сохранить бусы антитела приводит к большей специфичности для диGly пептидов. Эти улучшения приводят к регулярному обнаружению более 23000 диглы пептидов из клеток рака шейки матки человека (HeLa) клеточные лисаты на протеасомы ингибирование в клетке. Мы показываем эффективность этой стратегии для углубленного анализа профилей убикитиномы нескольких различных типов клеток и образцов in vivo, таких как ткани мозга. Это исследование представляет собой оригинальное дополнение к инструментарию для анализа убиквитинации белка, чтобы раскрыть глубокий клеточный убикитино.
Introduction
Спряжение убиквитина к белкам знаменует их для деградации протеасомы и является решающим процессом в протеостазе. C-терминал carboxyl группа убиквитина образует изопептид связи с лизином и амино группы целевого белка1,2. Кроме того, убиквитин может быть прикреплен к другим модулям побиквитина, что приводит к образованию однородных (т.е. K48 или K11) или разветвленных (т.е. неоднородных или смешанных) поликубиквитовых структур1,3. Наиболее известной функцией убиквитин является его роль в протеасомальной деградации, при посредничестве K48-связанных полиубиквитин. Тем не менее, стало ясно, что как моно-, так и полиубичицинация также играют роль во многих процессах, которые не зависят от деградации протеасомы. Например, цепи, связанные с K63, играют недеградную роль во внутриклеточной торговле, лисосомальной деградации, сигнализации киназы и ответе повреждения ДНК4,,5. Другие шесть типов связей менее обильные и их роли по-прежнему в значительной степени загадочные, хотя первые указания об их функциях в ячейке появляются, в основном из-за разработки новых инструментов для обеспечения связи конкретных обнаружения6,7.
Масс-спектрометрия стала незаменимым инструментом для анализа протеомов, и в настоящее время тысячи различных белков практически из любого биологического источника могут быть идентифицированы в одном эксперименте. Дополнительный уровень сложности представлен постпереводными модификациями (ПТМ) белков (например, фосфорилированием, метилированием, ацетилированием и убиквитинированием), которые могут модулировать белковую активность. Крупномасштабная идентификация PTM-несущих белков также стала возможной благодаря изменениям в области масс-спектрометрии. Относительно низкая стойчиометрия пептидов, несущих ПТМ по сравнению с их неизмененными аналогами, представляет собой техническую проблему, и шаги биохимического обогащения, как правило, необходимы до анализа масс-спектрометрии. За последние два десятилетия для анализа ПТМ было разработано несколько различных конкретных методов обогащения.
Из-за многогранной роли убиквитина белка в клетке, существует большой спрос на разработку аналитических методов для обнаружения мест убиквитина на белках8. Применение масс-спектрометрических методов привело к взрыву числа выявленных мест убиквитинации в плодовой мухе, мыши, человеческих и дрожжевых белках99,10,,11,,12,,13,14. Важным шагом стала разработка стратегий обогащения на основе иммунопрецидации на уровне пептида с использованием антител, направленных против остатков мотива K-A-GG (также называемого «диглицином» или «дигли»). Эти диглы пептиды производятся при переваривании убиквитинаированных белков с помощью трипсина в качестве протеаза15,16.
Здесь мы представляем оптимизированный рабочий процесс для обогащения диглы пептидов с помощью иммуноочищенности и последующего обнаружения масс-спектрометрией Orbitrap. Используя комбинацию нескольких модификаций существующих рабочих процессов, особенно на этапах подготовки образцов и масс-спектрометрии, мы можем регулярно идентифицировать более 23 000 пептидов диГлли из одного образца клеток HeLa, обработанных протеасомой ингибитор и 10 000 фунтов от необработанных клеток HeLa. Мы применили этот протокол к лисатам как от немаркированной, так и изотопной маркировки аминокислотами в клеточной культуре (SILAC) с маркировкой клеток HeLa, а также к эндогенным образцам, таким как ткани мозга.
Этот рабочий процесс представляет собой ценное дополнение к репертуару инструментов для анализа убиквитинации сайтов для того, чтобы раскрыть глубокий убикитино. Следующий протокол подробно описывает все этапы рабочего процесса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (EDC) Erasmus MC.
1. Подготовка образца
- Культурные клетки
- Выберите линию интереса клеток (например, HeLa или остеосаркома (U2OS) и вырастите клетки в мини-орлином среднем Dulbecco (DMEM) дополненном 10% тепловой инактивированной сывороткой крупного рогатого скота (FBS) и 100 единиц/мл пенициллина/стрептомицина.
- Для количественных экспериментов протеомики, культурные клетки в DMEM не хватает аргинина и лизин. Среда должна быть дополнена 10% диализированной сывороткой крупного рогатого скота плода (FBS), 100 единиц/мЛ пенициллина/стрептомицина и аланина-глутамина. Сделать два типа носителей, добавив либо обычный лизин и аргинин ('Light' Medium) или лизин-8 (13C6; 15N2) и аргинин-10 (13C6; 15N4) ('Тяжелый' Средний), соответственно.
- Культурные партии клеток в Light Medium (т.е. без маркировки) и Heavy Medium (т.е. помечены, SILAC) в течение по крайней мере шести удвоений до расширения и лечения, чтобы убедиться, что все белки в культуре тяжелой среды помечены тяжелым стабильным изотопов, содержащим Аминокислот.
- Лечить клетки в течение 8 ч с 10 мкм протеасомы ингибитор бортезомиб или эквивалентный объем DMSO в качестве макета лечения. Вымойте клетки с PBS, разъединить их с помощью 1% трипсин / EDTA, и гранулы клеток.
- Лиза клеточной гранулы из одного 150 см2 культуры пластины на состояние испытания в 2 мл ледяной 50 мм Tris-HCl (pH No 8.2) с 0,5% дезоксихолата натрия (DOC). Отварить лизат при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 5 мин и сонести в течение 10 минут (установка "H" для звукового, перечисленных в таблице материалов) при 4 градусах По Цельсию. Мы не рекомендуем использовать ингибиторы деубитиназы, такие как N-этилмалеймид (NEM), потому что это может привести к нежелательным изменениям белка, которые могут усложнить идентификацию пептида.
- In vivo мышь ткани мозга
- При использовании ткани in vivo, лиза ткани в ледяной буфер, содержащий 100 мм Tris-HCl (pH No 8.5), 12 мм натрия DOC, и 12 мМ натрия N-lauroylsarcosine17. Снофите лизат в течение 10 мин (установка "H" для звукового, указанного в таблице материалов) при температуре 4 градусов по Цельсию и вскипятите лизат в течение 5 мин при температуре 95 градусов по Цельсию.
- Количественная оценка общего количества белка с помощью колоритного абсорбции BCA белкового набора анализов. Общее количество белка должно быть не менее нескольких миллиграммов для успешного иммунопреципиции пептида диГли (IP). Для экспериментов SILAC смешивают легкие и тяжелые маркированные белки в соотношении 1:1, основанном на общем количестве белка.
- Уменьшите все белки, используя 5 мМ 1,4-дитиотрейтол в течение 30 мин при 50 градусах По Цельсия, а затем алкилировать их с 10 мм йодоацетамид в течение 15 минут в темноте. Выполняйте переваривание белка с помощью Lys-C (коэффициент 1:200 фермента к субстрату) в течение 4 ч с последующим ночным перевариванием с трипсином (коэффициент фермента к субстрату) при температуре 30 градусов по Цельсию или при комнатной температуре (RT).
- Добавьте трифтороацетическую кислоту (TFA) в переваренный образец до конечной концентрации 0,5% и центрифуги юрисцом в 10 000 х г в течение 10 мин, чтобы выскочить и удалить все моющие средства. Соберите супернатант, содержащий пептиды для последующего фракционирования.
2. офлайн пептидная фракционация
- Используйте высокофазную реверсную фазу рН (RP) C18 C18 с полимерическим стационарным фазовым материалом (300, 50 мкм; см. Таблица материалов),загруженного в пустой картридж столбцов для фракции триптических пептидов. Неподвижный размер кровати фазы должен быть скорректирован на количество белкового дайджеста, которое должно быть фракционировано. Подготовьте пустой картридж столбца 6 мл (см. Таблица материалов),наполненный 0,5 г стационарного фазового материала для дайджеста белка на 10 мг белка. Белковый дайджест к стационарной фазе соотношения должен быть примерно 1:50 (w/w).
- Загрузите пептиды на подготовленную колонку и промойте колонну примерно 10 объемами столбцов 0,1% TFA, а затем примерно 10 объемами столбцов H2O.
- Выделите пептиды на три фракции с 10 объемами столбцов аммония 10 мм дляспаривания раствора (pH и 10) с 7%, 13,5% и 50% ацетонитрилом (AcN), соответственно. Лиофилизируют все фракции до полноты.
- Используйте убиквитин остатки мотива (K--Я-GG) антитела сопряжены с белком агарозных бусин для иммунообогащения ди-Gly пептидов. Поскольку точное количество антител на партию бисера является конфиденциальной информацией и не разглашается производителем, рекомендуется использовать то же определение для партии бисера, что и производитель, чтобы избежать путаницы. Вымойте одну партию этих бусин 2x с PBS и разделить шарик овсянности на шесть равных фракций. Подробную экспериментальную схему можно найти на рисунке 1.
- Растворите три пептидные фракции, собранные в шаге 2,3 в 1,4 мл буфера, состоящего из 50 мМ MOPS, 10 мМ фосфата натрия и 50 мм NaCl (pH 7.2), и вращаться вниз мусора.
- Добавьте супернацианты фракций в бисер антитела diGly и инкубировать в течение 2 ч при 4 кв с на блоке ротатора. Спин вниз бисера и передать супернатант на свежий пакет антител бусы и инкубировать снова на 2 ч при 4 градусах Цельсия.
- Храните супернацианты для последующего глобального анализа протеома (GP).
- Перенесите шарики с каждой фракции в наконечник пипетки в 200 л, оснащенный вилкой фильтра GF/F для удержания бисера. Положите наконечник пипетки с бисером в микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл, оснащенную концептером наконечника центрифуги. Вымойте бусы 3x с 200 qL ледяного буфера IAP, а затем 3x с 200 л ледяной милли H2O. Спин вниз по столбце на 200 х г в течение 2 минут перед каждым шагом мытья, но будьте осторожны, чтобы не дать столбику иссякнут. Выявите пептиды, используя 2 цикла по 50 л 0,15% TFA.
- Остоятить пептиды с помощью C18 этап еосечки (по сути 200 л пипетки отзыв с двумя дисками C18) и высушить их до полноты с помощью вакуумной центрифугации.
3. Nanoflow LC-MS/MS
- Выполните эксперименты LC-MS/MS на чувствительном масс-спектромете в сочетании с системой нанопотока LC.
- Используйте в доме упакованы 50 см обратной фазы колонки с 75 мкм внутреннего диаметра упакованы с смолой CSH130 (3,5 мкм, 130 ю) и elute пептидов с градиентом 2-28% (AcN, 0,1% FA) более 120 мин на 300 нл / мин. Держите столбец при температуре 50 градусов по Цельсию, используя, например, колонку (см. Таблицу Материалов).
- Выполните анализ масс-спектрометрии.
- Масс-спектрометр должен работать в режиме приобретения данных (DDA). Масс-спектры MS1 должны быть собраны с высоким разрешением (например, 120 000), с автоматизированным параметром управления усилением (AGC) целевого уровня 4E5 и максимальным временем впрыска 50 мс в случае масс-спектрометра Orbitrap.
- Сначала выполните анализ масс-спектрометрии в режиме "Высокая интенсивность первой". Таким образом, наиболее интенсивный ион выбирается сначала для фрагментации, затем второй самый высокий, и так далее, используя метод максимальной скорости с общим временем цикла 3 с. Затем выполните второй раунд анализа DDA MS в режиме "Самая низкая интенсивность первого", так что наименее интенсивный ион выбран сначала, затем второй самый низкий, и так далее. Эта стратегия обеспечивает оптимальное обнаружение очень низкой аубарантности пептидов.
- Фильтр ионов предшественников в соответствии с их состояниями заряда (2-7 зарядов) и моноизотопным пиковым назначением. Исключите ранее допрошенные прекурсоры динамически на 60 с. Изолят пептидные прекурсоры с четырехполюсным массовым фильтром, установленным на ширину 1,6 тыс.
- Соберите спектры MS2 в ионной ловушке на AGC 7E3 с максимальным временем впрыска 50 мс и энергией столкновения HCD 30%.
4. Анализ данных
- Проанализируйте масс-спектрометрии сырые файлы с помощью соответствующей поисковой системы, такие как свободно доступный пакет программного обеспечения Max'ant на основе поисковой системы Andromeda18,19. В Max'ant выберите параметры по умолчанию с несколькими адаптациями, указанными ниже. Установите специфичность фермента, чтобы трипсин, с максимальным количеством пропущенных расщеплений увеличено до трех. Установите лизин с остатками дигли (No114.04 Da), окисление метионина и N-терминальной ацетилирования в качестве переменных модификаций, и установить карбамидометилирование цистеина в качестве фиксированной модификации.
- Выполните поиск базы данных в отношении файла FASTA, содержащего белковые последовательности, загруженные, например, из репозитория Uniprot(https://www.uniprot.org/downloads)в сочетании с приманкой и стандартной общей базой данных загрязнений, которая автоматически предоставляется Maxquant. Установите частоту ложного обнаружения (FDR) до 1% и установите минимальный балл для модифицированных (diGly) пептидов до 40 (значение по умолчанию). Исключить пептиды, идентифицированные с C-терминалом diGly модифицированный остаток лизина из дальнейшего анализа.
- Для количественного анализа файлов эксперимента SILAC установите разносторонность на "2" и повторите шаг 4.2.
- Выполняйте все анализы вниз по течению (например, статистика, анализ генонологии) с модулем Perseus20 программного пакета Max'uant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Убиквитинатированные белки оставляют остатки 114.04 Da diglycine на остатке лизина цели когда протеины усваиваются с трипсином. Массовая разница, вызванная этим мотивом, была использована для однозначного распознавания места убиквитина в эксперименте масс-спектрометрии. Стратегия, которую мы описываем здесь, является самым современным методом обогащения и последующей идентификации дигли пептидов с помощью нанопотока LC-MS/MS(рисунок 1A). В этом исследовании, как культивированные клетки и in vivo материал были использованы в качестве биологического источника белков, но этот протокол совместим с любым источником белков. Следуя шагам в протоколе должно быть просто определить 10000-25000 диглы пептиды из 2-20 мг белка ввода. Для увеличения степени убликвитирования белка в клетках, ингибитор протеасомы, такие как бортезомиб или MG132 могут быть добавлены за несколько часов до сбора клеток. Если не был использован ингибитор протеасомы, количество выявленных диглы пептидов, как правило, значительно ниже (30-40%).
Мы внесли ряд улучшений в существующие протоколы. Во-первых, для снижения сложности пептидной смеси происходит грубое дробление на три фракции на основе хроматографии обратной фазы и последующего элюции при высоком рН. Эти фракции показывают очень низкое перекрытие в пептидных идентификационных системах, и сопоставимое количество диглы пептидов должно быть определено на фракцию(рисунок 2). Это приводит к большому количеству уникальных диглы пептидов, выявленных в каждой из этих фракций. Важно отметить, что одна из фракций (обычно вторая) должна содержать собственный субиквитин K48 модифицированный триптик diGly пептид LIFAGK (GG) ЗЛЕДГР (м/z 730.39). Это на сегодняшний день наиболее распространенный пептид в иммунопрорисцифицированной фракции и характеризуется интенсивным и широким пиком в хроматограмме LC(рисунок 1B). Это эталонный хроматографический пик, и если он отсутствует в хроматограмме, ТО ИС, скорее всего, оказался неудачным.
Другим усовершенствованием является адаптация процедуры анализа DDA является ионный многополюс в масс-спектрометре. В обычных верхних N данных-зависимых приобретения (DDA), N пики из спектра MS1 выбраны для фрагментации. Эта схема фрагментации начинается с пика самой высокой интенсивности во-первых, а затем пик второй высокой интенсивности, и так далее. В альтернативной схеме фрагментации, наименее интенсивный пик выбран первым, а затем второй наименее интенсивный пик, и т.д. Обоснование этого порядка отбора заключается в том, что у него также есть достаточно времени для фрагментации очень низких обильных пептидов. В самом деле, мы обнаружили, что количество пептидных идентификаций увеличивается, когда "самый высокий первый" и "самый низкий первый" DDA работает были объединены по сравнению с дубликатОМ АНАЛИЗ LC-MS со стандартными настройками DDA (т.е., самый высокий первый). Поэтому для более полного профилирования убикитинома рекомендуется сочетать пробежки LC-MS с режимами фрагментации "наивысшего первого" и "самого низкого первого" в процедуре анализа данных. Эта "самая низкая первая" стратегия может производить более 4000 уникальных пептидов diGly, которые не были обнаружены, когда использовался только обычный режим DDA(рисунок 2).
Наконец, дополнительные IP-адреса прохода после первого IP может произвести еще 2500 уникальных пептидов diGly(рисунок 2).
Статьи в литературе по профилированию вездесущности обычно сообщают о около 10 000 выявленных дигли пептидов12,21. Здесь, всех диглы пептиды определены в течение трех биологических экранов репликации, 9000 присутствовали во всех трех, в то время как 17000 были присутствовать, по крайней мере два из трех реплик (Рисунок 3). Как правило, после протокола, описанного здесь, следует определить, что из одного образца белка 15-20 мг используется одна стандартная партия бусинок антител CST. С точки зрения чистоты и избирательности соотношение между выявленными дигли пептиды и неизмененные пептиды всегда должны быть Количество диглы пептидных идентификаций сильно зависела от количества входиного материала белка. IP выполняется только с 1 мг входного материала производится примерно 2500 диглы пептидных идентификаций, в то время как с 10 мг белка входного материала , 15000 диГли пептидных идентификаций были произведены. В таблице 1 перечислено ожидаемое количество выявленных диглы пептидов для каждого состояния. Следует отметить, что эти цифры являются лишь оценками и зависят от типа используемого масс-спектрометра. На рисунке 4 показано перекрытие между диглинсными пептидными идентификациями с низким, средним и большим количеством входного материала.
Для того, чтобы проиллюстрировать добавленную стоимость улучшений для анализа сайта вездесущности, описанного выше, мы также провели количественный убикино-анализ sILAC помеченных клеток HeLa, которые лечились с протеасомы ингибитор bortezomib по сравнению с необработанными контрольными клетками в дубликат еде своп анализа. Более половины (55%). всех выявленных пептидов в eluate на IP были диглы пептиды. Было выявлено более 19 000 уникальных диглы-пептидов, что лишь немного меньше, чем в не-SILAC маркированном образце. Причиной этого может быть более высокая сложность спектра MS1 в анализе SILAC из-за присутствия пептидных пиковых пар. В анализе SILAC были отмечены относительно большие различия между числами дигли пептидов, которые были исключительно определены в переднем состоянии (т.е. бортезомиб обработанных клеток в тяжелом канале, контрольных ячеек в световом канале) и тех, которые исключительно определены в обратном состоянии (т.е. бортезомиб обработанных клеток в легком канале, контрольных ячеев в тяжелом канале), в данном случае 1,752 против 6,6( При работе с программным обеспечением Max'uant в режиме "множественность No 2" (т.е. двухканальный SILAC) 7555 диглы пептиды были идентифицированы с нулевой интенсивностью в тяжелом канале (практически все приходят в обратном эксперименте) и ненулевое значение интенсивности в легком канале. В отличие от этого, ни один диглы пептиды не было идентифицировано с ненулевой интенсивностью значения в тяжелом канале сопровождается нулевая интенсивность значение в световом канале. Когда анализ Max'uant на том же наборе данных был выполнен в режиме "многообразие No 1" с diGly moiety и помеченной аминокислотой, объединенной в одну переменную модификацию, было выявлено много тяжелых вариантов пептида diGly, даже если не было обнаружено никакого легкого аналога этого пептида. Наиболее вероятным объяснением этого является неспособность программного обеспечения, чтобы справиться с идентификацией дигли пептидов, которые присутствуют исключительно в тяжелом канале. Это явление, вероятно, произойдет широко, потому что ингибирование протеасомы вызовет формирование новых мест вездесущности. Ticking "requantify" вариант флажок в Maxquant, который был разработан для решения этих вопросов и должны исправить для этого, как представляется, недостаточно, чтобы избежать этого вопроса полностью. Очевидно, что большинство диглы пептиды в настоящее время upregulated или формируется де-ново на протеасомы ингибирование, потому что более двух третей пептидного бассейна имеют H:L отношения по крайней мере 1,5 (Рисунок 5B).
Наконец, мы применили этот метод анализа убиквитинации сайта к образцу ткани in vivo. Чтобы оценить эффективность, мы извлекли около 32 мг белка из мозга свежей мыши (10% от веса влажной ткани белка). Мозг материал не лечился с протеасомы ингибиторов или любой другой реагент, который может повысить общую убиквитинацию белка. Из этого образца было выявлено 10 871 уникальный диглы пептиды(Дополнительная таблица 2). Все диглы пептиды, выявленные в этой ткани, произошли от эндогенных участков вездесущности в стабильной ситуации. Никакое лечение для повышения глобальной вездесущности (например, ингибирование протеасомы) не было введено. Поэтому мы предполагаем, что эти убиквитинации сайтов по крайней мере частично возникают из (поли) убиквитинация, участвующих в не-протеасомы опосредоченных клеточных сигнальных событий, который находится в согласии с идеями, предложенными в литературе5,16,22.
В заключение, описанный здесь метод позволяет углубленное исследование убикитино мы воспроизводимого способа. Для обзора типичных результатов, полученных с этой процедурой см. Ван Дер Вал и др.23.
Рисунок 1: Экспериментальный обзор. (A) Обзор экспериментального подхода. Образцы были подготовлены, trypsinized, и фракции в три фракции с использованием обратной фазы хроматографии с высоким рН elution. Одна партия коммерческих бусинок пептидных антител s-diGly была разделена на шесть равных фракций, а три пептидные фракции были затем загружены на три фракции бисера. Диглы пептиды были иммуноочищены, eluted, и собраны, и протекать впоследствии был передан на три оставшихся свежих шариковых фракций. Собранные диглы пептиды были проанализированы масс-спектрометрией на масс-спектрометре Lumos Orbitrap по двухуровневой схеме, сочетающей один цикл, в котором наиболее интенсивные пики были впервые выбраны для фрагментации пептида и следующего цикла, в котором были выбраны наименее интенсивные пики. Полный набор трасс nLC-MS/MS затем был проанализирован с помощью Maxquant. (B) Одна из фракций должна содержать собственный убиквитин K48 модифицированный триптик diGly пептид LIFAGK (GG) ЗЛДГР (м /z 730.39). Это на сегодняшний день наиболее распространенным пептид в иммунопромцицитированной фракции и характеризуется интенсивным и широким пиком в хроматограмме LC между 50-55 мин на градиент 120 мин. Если этот пиковый пик отсутствует в хроматограмме, ТО ИС, скорее всего, оказался неудачным. Эта цифра была изменена с Ван Дер Вал и др.23. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Количество диглы пептидов, обнаруженных для каждого из трех этапов улучшения. (A) Эффект сырой фракционирования до иммунопрециционирования. Показано перекрытие между диглинсными пептидными популяциями, выявленными в трех отдельных фракциях. (B) Эффект первого и второго инкубационных шагов. (C) Результаты скорректированного режима фрагментации пептида. Эта цифра была изменена с Ван Дер Вал и др.23. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Дигли пептиды обнаружены в трех биологических репликациях бортезомибобработанных клеток, показывающих количество перекрытий между трассами. Эта цифра была изменена с Ван Дер Вал и др.23. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Перекрытие выявленных диглы пептидов из анализов с низким (4 мг), средним (10 мг) и высоким (40 мг) общим количеством белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Обнаружение диглы пептидов в клетках с маркировкой SILAC. (A) Количество пептидов, обнаруженных в передних и обратных условиях SILAC помечены HeLa клеток для параметров множественности 1 и 2. (B) Scatterplot diGly пептида SILAC соотношения в Bortezomib (Btz) обработанные клетки HeLa. Показаны только пептиды, которые были выявлены и количественно определены как в передних, так и в обратном экспериментах. Эта цифра была изменена с Ван Дер Вал и др.23. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Состояние | Количество вхостасильного материала (мг) | Ожидаемое количество выявленных диглы-пептидов |
| Необработанные клетки HeLa | 10 | 7,500 |
| Ингибитор протеасомы лечил клетки HeLa | 1 | 2,500 |
| 2 | 5,000 | |
| 10 | 15,000 | |
| 20 | 20,000 | |
| 40 | 25 000 фунтов | |
| Ткань (мышечный мозг) | 30 | 10 000 фунтов |
Таблица 1: Ожидаемое количество диглы пептидных идентификаций для различных условий. Эти цифры являются лишь оценками и зависят от используемых экспериментальных настроек.
Дополнительная таблица 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть эту таблицу (Право нажмите, чтобы скачать).
Дополнительная таблица 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть эту таблицу (Право нажмите, чтобы скачать).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный здесь протокол был применен к образцам из различных биологических источников, таких как культивированные клетки и ткани in vivo. Во всех случаях мы выявили тысячи диглы пептидов, при условии, что общее количество ввода белка было не менее 1 мг. Обогащение с использованием конкретных антител является весьма эффективным, учитывая, что только в лучшем случае 100-150 очень низкий обильный дигли пептиды были определены из целых клеточных лисатов, если не процедуры обогащения для убиквитинаированных белков или дигли пептиды были применены. Очевидно, что чувствительная масс-спектрометрия является необходимым условием для получения большого количества диглы идентификационных данных. Хотя мы успешно использовали несколько различных масс-спектрометров, мы обнаружили, что Orbitrap Tribrid Lumos является наиболее чувствительным, который дал самые высокие урожаи.
Оффера хроматография RP с высоким рН elution должна быть проверена до проведения ИС. Перекрытие между фракциями с точки зрения пептидной идентификации должно быть как можно более низким для оптимального эксперимента. После IP, одна из фракций должна содержать собственный убиквитин K48 модифицированный триптик diGly пептид LIFAGK (GG) ЗЛДГР (м/z 730.39). Это на сегодняшний день наиболее распространенным пептид в иммунопромцитированной фракции и характеризуется интенсивным и широким пиком в хроматограмме LC между 50-55 мин на градиент 120 мин (Рисунок 1B). Если этот пиковый пик отсутствует в хроматограмме, IP, скорее всего, оказался неудачным.
Важно проанализировать иммунопромцитированные триптические пептиды диГлы сразу после процедуры ИС, поэтому время между ИС и анализом должно быть сведено к минимуму. В течение этого времени пептиды предпочтительно хранить в стеклянном флаконе вместо пластиковых труб. Оставляя пептиды в пластиковых трубках слишком долго, либо на РТ или при -20 градусов по Цельсию, может привести к осадкам пептидов и / или прилипания к пластиковой стенке трубки. Это в конечном счете повлияет на чувствительность анализа.
Хотя были сообщения в литературе о потенциальной неправильной интерпретации индуктов йодоацетамида в качестве убиквитинационных участков из-за их идентичных 114.04 Da массовых сдвигов24, мы не нашли никаких признаков этого с нашими препаратами иммунопромизтированных триптических пептидов. Во-первых, побочные эффекты использования йодоацетамид (IAM) являются минимальными в наших руках с помощью алкилирования-сокращения протокола, описанного выше. Во-вторых, антитела специфичны для пептидов с остатками диглицина. Пептиды с двумя йодоацетамидами муэтеции ковалентно добавлены к остаткам лизина не должны обогащаться в этом протоколе. В-третьих, большинство пептидов в иммунопромцитированной фракции регулируются при ингибировании протеасомы, о чем свидетельствует описанный выше эксперимент SILAC(рисунок 5). Потому что популяция убиквитинаированных белков влияет в результате этого лечения, весьма вероятно, что эти пораженные пептиды действительно диглы пептиды в результате убиквитина белков.
Наконец, этот протокол может быть использован в сочетании с недавно опубликованной мультиплексной количественной стратегией с использованием TMT19. Очевидно, что, хотя опубликованные дигли пептидные числа несколько ниже, чем те, которые получены с помощью настоящего протокола, способность относительно количественно до 16 образцов одновременно является огромным преимуществом. Сочетание этих методов позволит исследователям проводить крупномасштабные количественные исследования убикитиномы в большой глубине.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о конфликте интересов.
Acknowledgments
Эта работа является частью проекта "Белки на работе", программы Нидерландского центра протеомики, финансируемого Нидерландской организацией научных исследований (НВО) в рамках Национальной дорожной карты крупномасштабных научно-исследовательских учреждений (проект No 184.032.201 ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-Aldrich | D8255 | |
| 3M Empore C18 Octadecyl disks | Supelco | 66883-U | product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore) |
| Ammonium formate | Sigma-Aldrich | 70221 | |
| Bortezomib | UBPbio | ||
| CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å | Waters | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| DMEM | ThermoFisher | ||
| EASY-nanoLC 1200 | ThermoFisher | ||
| FBS | Gibco | ||
| GF/F filter plug | Whatman | 1825-021 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Lysine, Arginine | Sigma-Aldrich | ||
| Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4) | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lysyl Endopeptidase(LysC) | Wako Pure Chemicals | 129-02541 | |
| NanoLC oven | MPI design, MS Wil GmbH | ||
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L-5125 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher / Pierce | 23225 | |
| PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles | Agilent Technologies | PL1412-2K01 | |
| PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit | Cell Signaling Technologies | 5562 | |
| Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge | Waters | WAT036790 | Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Trypsin, TPCK Treated | ThermoFisher | 20233 |
References
- Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143, 682-685 (2010).
- Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway. Cell. 79 (1), 13-21 (1995).
- Ohtake, F., Tsuchiya, H. JB special review - Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture. Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).
- Bergink, S., Jentsch, S. Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair. Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).
- Komander, D., Rape, M. The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).
- Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling. Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).
- Swatek, K. N., et al. Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping. Nature. 572, 533-537 (2019).
- Peng, J., et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).
- Wagner, S. A., et al. Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).
- Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).
- Elia, A. E. H., et al. Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response. Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).
- Wagner, S. A., et al. A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles. Molecular & Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284 (2011).
- Udeshi, N. D., et al. Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition. Molecular & Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).
- Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown. Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).
- Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling. Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
- Wakabayashi, M., et al. Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides. Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).
- Rose, C. M., et al. Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes. Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).
- Kaiser, S. E., et al. Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools. Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).
- Van Der Wal, L., et al. Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry. Journal of Proteomics. (July), (2017).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
