Summary
Presentamos un método para la purificación, detección e identificación de péptidos digliquenados que se originan a partir de proteínas ubiquitinadas a partir de muestras biológicas complejas. El método presentado es reproducible, robusto y supera a los métodos publicados con respecto al nivel de profundidad del análisis ubiquitinome.
Abstract
La modificación posttranslacional de las proteínas por la pequeña proteína ubiquitina está involucrada en muchos eventos celulares. Después de la digestión tripptica de proteínas ubiquitinadas, se pueden utilizar péptidos con un remanente diglycine conjugado con el grupo de aminoácidos de épsilon ('K-o-diglycine' o simplemente 'diGly') para rastrear el sitio de modificación original. La inmunopurificación eficiente de péptidos diGly combinados con la detección sensible por espectrometría de masas ha dado lugar a un enorme aumento en el número de sitios de ubiquitinación identificados hasta la fecha. Hemos realizado varias mejoras en este flujo de trabajo, incluyendo el fraccionamiento de fase inversa de pH alto fuera de línea de péptidos antes del procedimiento de enriquecimiento, y la inclusión de ajustes de fragmentación de péptidos más avanzados en el multipolo de enrutamiento iónico. Además, una limpieza más eficiente de la muestra utilizando un tapón basado en filtros para retener las perlas de anticuerpos da como resultado una mayor especificidad para los péptidos diglily. Estas mejoras resultan en la detección rutinaria de más de 23.000 péptidos diGly de células de cáncer de cuello uterino humano (HeLa) las células se lisia al inhibir el proteasoma en la célula. Mostramos la eficacia de esta estrategia para el análisis en profundidad de los perfiles ubiquitinome de varios tipos celulares diferentes y de muestras in vivo, como el tejido cerebral. Este estudio presenta una adición original a la caja de herramientas para el análisis de ubiquitinación de proteínas para descubrir el ubiquitinomo celular profundo.
Introduction
La conjugación de ubiquitina a las proteínas las marca para la degradación por el proteosoma y es un proceso crucial en la proteostasis. El grupo carboxilo C-terminal de ubiquitina forma un enlace isopéptido con el grupo de lisina-amino de la proteína objetivo1,2. Además, la ubiquitina se puede unir a otros módulos de ubiquitina, lo que resulta en la formación de estructuras homogéneas (es decir, K48 o K11) o ramificadas (es decir, heterogéneas o mixtas) de poliubiquitina1,3. La función más conocida de la ubiquitina es su papel en la degradación proteasomal, mediada por poliubiquitina vinculada a K48. Sin embargo, ha quedado claro que tanto la mono- como la poliubiquitinación también juegan papel en muchos procesos que son independientes de la degradación por el proteosoma. Por ejemplo, las cadenas vinculadas a K63 tienen funciones no demoledor en el tráfico intracelular, la degradación issosomal, la señalización de quinasa y la respuesta de daño al ADN4,5. Los otros seis tipos de enlaces son menos abundantes y sus funciones siguen siendo en gran medida enigmáticas, aunque están surgiendo las primeras indicaciones sobre sus funciones en la célula, en gran parte debido al desarrollo de nuevas herramientas para permitir la detección específica de la vinculación6,7.
La espectrometría de masas se ha convertido en una herramienta indispensable para los análisis de proteome y hoy en día miles de proteínas diferentes de prácticamente cualquier fuente biológica se pueden identificar en un solo experimento. Una capa adicional de complejidad se presenta mediante modificaciones posttranslacionales (PTM) de proteínas (por ejemplo, fosforilación, metilación, acetilación y ubiquitinación) que pueden modular la actividad proteica. La identificación a gran escala de proteínas portadoras de PTM también ha sido posible gracias a los desarrollos en el campo de la espectrometría de masas. La estequiometría relativamente baja de péptidos que llevan PTM en comparación con sus contrapartes no modificadas presenta un desafío técnico y las etapas de enriquecimiento bioquímico son generalmente necesarias antes del análisis de espectrometría de masas. En las últimas dos décadas, se han desarrollado varios métodos de enriquecimiento específicos diferentes para el análisis de los MPT.
Debido a los roles multifacéticos de la ubiquitinación de proteínas en la célula, existe una gran demanda para el desarrollo de métodos analíticos para la detección de sitios de ubiquitinación en proteínas8. La aplicación de métodos espectrométricos de masas ha dado lugar a una explosión del número de sitios de ubiquitinación identificados en la mosca de la fruta, ratón, humano y proteínas de levadura9,10,11,12,13,14. Un paso importante fue presentado por el desarrollo de estrategias de enriquecimiento basadas en inmunoprecipitación a nivel de péptidos utilizando anticuerpos dirigidos contra el motivo remanente de K-o-GG (también conocido como 'diglycine' o 'diGly'). Estos péptidos digly se producen tras la digestión de proteínas ubiquitinadas utilizando la trippsina como la proteasa15,,16.
Aquí, presentamos un flujo de trabajo optimizado para enriquecer los péptidos diglily utilizando inmunopurificación y posterior detección por espectrometría de masas Orbitrap. Usando una combinación de varias modificaciones de los flujos de trabajo existentes, especialmente en las etapas de preparación de muestras y espectrometría de masas, ahora podemos identificar rutinariamente más de 23.000 péptidos diGly de una sola muestra de células HeLa tratadas con un proteosoma inhibidor y 10.000 euros de células HeLa no tratadas. Hemos aplicado este protocolo a los lisados tanto del etiquetado de isótopos no etiquetados como estables con aminoácidos en el cultivo celular (SILAC) etiquetados células HeLa, así como a muestras endógenas como el tejido cerebral.
Este flujo de trabajo presenta una valiosa adición al repertorio de herramientas para el análisis de sitios de ubiquitinación con el fin de descubrir el ubiquitinome profundo. El protocolo siguiente describe todos los pasos del flujo de trabajo en detalle.
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Protocol
Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (EDC) de Erasmus MC.
1. Preparación de la muestra
- Células cultivadas
- Seleccione una línea de interés celular (por ejemplo, células HeLa u osteosarcoma [U2OS]) y haga crecer las células en el medio mínimo de águila (DMEM) de Dulbecco complementado con 10% de calor en suero bovino fetal activado (FBS) y 100 unidades/ml de penicilina/estreptomicina.
- Para experimentos proteómicos cuantitativos, células de cultivo en DMEM carecen de arginina y lisina. El medio debe complementarse con suero bovino fetal (FBS) 10% dializado, 100 unidades/ml de penicilina/estreptomicina y alanina glutamina. Hacer dos tipos de medios añadiendo lisina convencional y arginina ('Light' Medium) o lisina-8 (13C6; 15N2) y arginina-10 (13C6; 15N4) («Medio pesado»), respectivamente.
- Lotes de cultivo de células en Medio Ligero (es decir, sin etiquetar) y Medio Pesado (es decir, etiquetado, SILAC) durante al menos seis duplicaciones antes de la expansión y el tratamiento para asegurarse de que todas las proteínas en el cultivo De Heavy Medium estén etiquetadas con isótopos pesados y estables que contengan isótopos pesados y estables que Aminoácidos.
- Tratar las células durante 8 h con 10 m del inhibidor del proteosoma bortezomib o un volumen equivalente de DMSO como tratamiento simulado. Lavar las células con PBS, disociarlas usando 1% de trippsina/EDTA, y peletizar las células.
- Lijar el pellet celular de una placa de cultivo de 150 cm2 por condición probada en 2 ml de hielo-frío 50 mM Tris-HCl (pH a 8,2) con 0,5% de desoxicolato de sodio (DOC). Hervir el lisado a 95 oC durante 5 min y sonicar durante 10 min (ajuste "H" para el sonicador listado en la Tabla de Materiales)a 4oC. No recomendamos el uso de inhibidores de la deubiquitinasa como N-etilmaleimida (NEM), ya que esto puede introducir modificaciones proteicas no deseadas que pueden complicar la identificación de péptidos.
- Tejido cerebral de ratón in vivo
- Cuando se utilice tejido in vivo, lisar el tejido en un tampón helado que contenga 100 mM Tris-HCl (pH a 8,5), DOC de sodio de 12 mM y N-lauroylsarcosinato de sodio17mM. Sonicar el lisado durante 10 min (ajuste "H" para el sonicador listado en la Tabla de Materiales)a 4 oC y hervir el lisado durante 5 min a 95 oC.
- Cantidad de la cantidad total de proteína utilizando un kit de ensayo de proteína BCA de absorbación colorimétrica. La cantidad total de proteína debe ser de al menos varios miligramos para una inmunoprecipitación de péptido diGly exitosa (IP). Para los experimentos SILAC mezclan las proteínas etiquetadas ligeras y pesadas en una proporción de 1:1 basada en la cantidad total de proteínas.
- Reducir todas las proteínas usando 5 mM 1,4-ditiothreitol durante 30 min a 50 oC y posteriormente alquilarlas con 10 mM de iodoacetamida durante 15 minutos en la oscuridad. Realizar la digestión proteica con Lys-C (relación enzima-sustrato 1:200) durante 4 h seguida de digestión durante la noche con trippsina (relación enzima-sustrato 1:50) a 30 oC o a temperatura ambiente (RT).
- Añadir ácido trifluoroacético (TFA) a la muestra digerida a una concentración final del 0,5% y centrifugar la muestra a 10.000 x g durante 10 min para precipitar y eliminar todo el detergente. Recoger el sobrenadante que contiene los péptidos para el fraccionamiento posterior.
2. Fraccionamiento de péptidos sin conexión
- Utilice la cromatografía C18 de fase inversa de pH alto (RP) con material de fase estacionaria polimérica (300 o, 50 m; ver tabla de materiales)cargado en un cartucho de columna vacío para fraccionar los péptidos trippticos. El tamaño del lecho de fase estacionaria debe ajustarse a la cantidad de proteína digerida que se va a fraccionar. Preparar un cartucho de columna vacío de 6 ml (ver Tabla de materiales)lleno de 0,5 g de material de fase estacionaria para 10 mg de digerido proteico. La relación de digerida proteica a fase estacionaria debe ser aproximadamente 1:50 (p/p).
- Cargue los péptidos en la columna preparada y lave la columna con aproximadamente 10 volúmenes de columna de 0,1% TFA, seguido de aproximadamente 10 volúmenes de columna de H2O.
- Eluir los péptidos en tres fracciones con 10 volúmenes de columna de solución de formación de amonio de 10 mM (pH a 10) con 7%, 13,5% y 50% de acetonitrilo (AcN), respectivamente. Liofilizar todas las fracciones a la integridad.
- Utilice anticuerpos de motivos remanentes de ubiquitina (K-o-GG) conjugados con cuentas de agarosa de proteína A para el inmunoenriquecimiento de péptidos digly. Debido a que la cantidad exacta de anticuerpos por lote de perlas es información de propiedad y no divulgada por el fabricante, se recomienda utilizar la misma definición para un lote de cuentas que el fabricante para evitar confusiones. Lave un lote de estas cuentas 2x con PBS y divida la suspensión de perlas en seis fracciones iguales. Consulte la Figura 1 para obtener un esquema experimental detallado.
- Disolver las tres fracciones de péptidorecogidas recogidas en el paso 2.3 en 1,4 ml de un tampón compuesto de 50 mM de MOPS, 10 mM de fosfato sódico y 50 mM de NaCl (pH a 7,2), y espinar los escombros.
- Añadir los sobrenadores de las fracciones a las cuentas de anticuerpos diGly e incubar durante 2 h a 4 oC en una unidad de rotator. Espinta las cuentas y transfiere el sobrenadante a un nuevo lote de cuentas de anticuerpos e incuba de nuevo durante 2 h a 4oC.
- Almacene los sobrenadores para el posterior análisis global del proteome (GP).
- Transfiera las perlas de cada fracción a una punta de pipeta de 200 ml equipada con un tapón de filtro GF/F para retener las perlas. Coloque la punta de la pipeta con las perlas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml equipado con un adaptador de punta centrífuga. Lavar las perlas 3x con 200 sl de tampón IAP helado y posteriormente 3x con 200 éL de miliQ Frío-frío H2O. Gire hacia abajo la columna a 200 x g durante 2 minutos antes de cada paso de lavado, pero tenga cuidado de no dejar que la columna se seque. Eluir los péptidos usando 2 ciclos de 50 l de 0.15% TFA.
- Deslízalos con una punta de etapa C18 (esencialmente una punta de pipeta de 200 ml con dos discos C18) y séquelos hasta completarlos mediante centrifugación al vacío.
3. Nanoflujo LC-MS/MS
- Realice experimentos LC-MS/MS en un espectrómetro de masasensible acoplado a un sistema LC de nanoflujo.
- Utilice una columna de fase invertida de 50 cm empaquetada internamente con un diámetro interior de 75 m embalado con resina CSH130 (3,5 m, 130 o) y eluda los péptidos con un gradiente de 2 a 28% (AcN, 0,1% FA) sobre 120 min a 300 nL/min. Mantenga la columna a 50 oC utilizando un horno de columna, por ejemplo (consulte Tabla de materiales).
- Realice el análisis de espectrometría de masas.
- El espectrómetro de masas debe funcionar en modo de adquisición dependiente de datos (DDA). Los espectros de masa MS1 deben recogerse a alta resolución (por ejemplo, 120.000), con un ajuste de objetivo de control de ganancia automatizado (AGC) de 4E5 y un tiempo máximo de inyección de 50 ms en caso de un espectrómetro de masas Orbitrap.
- Realice primero el análisis de espectrometría de masas en el modo "Mayor intensidad primero". De esta manera, el ion más intenso se selecciona primero para la fragmentación, luego el segundo más alto, y así sucesivamente, utilizando el método de velocidad máxima con un tiempo de ciclo total de 3 s. Posteriormente, realice una segunda ronda de análisis de EM DDA en el modo "La intensidad más baja primero", de modo que primero se seleccione el ion menos intenso, luego el segundo más bajo, y así sucesivamente. Esta estrategia garantiza una detección óptima de péptidos de abundancia muy bajos.
- Filtrar los iones precursores según sus estados de carga (2-7 cargas) y asignación de pico monoisotópico. Excluya dinámicamente los precursores interrogados anteriormente para 60 s. Aísle los precursores de péptidos con un filtro de masa cuadrúpolo ajustado a una anchura de 1,6 Th.
- Recoger espectros MS2 en la trampa iónnica en un AGC de 7E3 con un tiempo máximo de inyección de 50 ms y una energía de colisión HCD del 30%.
4. Análisis de datos
- Analice los archivos sin procesar de espectrometría de masas utilizando un motor de búsqueda adecuado, como la suite de software MaxQuant de libre disponibilidad basada en el motor de búsqueda de Andrómeda18,19. En MaxQuant, seleccione la configuración predeterminada con algunas adaptaciones que se indican a continuación. Establezca la especificidad de la enzima en trippsina, con el número máximo de escotes no cumplidos elevado a tres. Establecer lisina con un remanente diGly (+114.04 Da), oxidación de metionina y Acetilación N-terminal como modificaciones variables, y establecer la carbamidometilación de la cisteína como una modificación fija.
- Realice búsquedas de base de datos en un archivo FASTA que contenga secuencias de proteínas descargadas desde, por ejemplo, el repositorio Uniprot (https://www.uniprot.org/downloads) combinado con un señuelo y una base de datos de contaminantes comunes estándar que MaxQuant proporciona automáticamente. Establezca la tasa de detección falsa (FDR) en 1% y establezca la puntuación mínima para los péptidos modificados (diGly) en 40 (valor predeterminado). Excluya los péptidos identificados con un residuo de lisina modificado diGly c-lyde de análisis posterior.
- Para el análisis cuantitativo de los archivos de experimento SILAC, establezca la multiplicidad en "2" y repita el paso 4.2.
- Realice todos los análisis posteriores (por ejemplo, estadísticas, análisis de ontología genética) con el módulo Perseus20 de la suite de software MaxQuant.
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Representative Results
Las proteínas ubiquitinadas dejan un remanente de 114.04 Da diglycine en el residuo de lisina diana cuando las proteínas se digieren con trippsina. La diferencia de masa causada por este motivo se utilizó para reconocer inequívocamente el sitio de la ubiquitinación en un experimento de espectrometría de masas. La estrategia que describimos aquí es un método de vanguardia para el enriquecimiento y la posterior identificación de péptidos digly por nanoflujo LC-MS/MS(Figura 1A). En este estudio, tanto las células cultivadas como el material in vivo se utilizaron como fuente biológica de proteínas, pero este protocolo es compatible con cualquier fuente de proteínas. Siguiendo los pasos en el protocolo debe ser sencillo identificar 10,000-25,000 péptidos diGly de 2-20 mg de entrada de proteína. Para aumentar la extensión de la ubiquitinación de proteínas en las células, se puede agregar un inhibidor del proteasoma como bortezomib o MG132 unas horas antes de cosechar las células. Si no se utilizó ningún inhibidor del proteasoma, el número de péptidos digly identificados tendía a ser significativamente menor (30-40%).
Hemos realizado varias mejoras en los protocolos existentes. En primer lugar, se realiza un fraccionamiento bruta en tres fracciones basado en cromatografía de fase inversa y posterior elución a un pH alto para reducir la complejidad de la mezcla de péptidos. Estas fracciones muestran una superposición muy baja en las identificaciones de péptidos, y se deben identificar números comparables de péptidos digly por fracción(Figura 2). Esto resulta en un alto número de péptidos diGly únicos identificados en cada una de esas fracciones. Es importante destacar que una de las fracciones (normalmente la segunda) debe contener el propio péptido tríptico modificado K48 de ubiquitina LIFAGK(GG)QLEDGR (m/z 730.39). Este es, con mucho, el péptido más abundante en la fracción inmunopreciada y se caracteriza por el pico intenso y amplio en el cromatograma LC(Figura 1B). Este es un pico cromatográfico de referencia y si está ausente del cromatograma, lo más probable es que la P.I. no haya tenido éxito.
Otra mejora es la adaptación del procedimiento de análisis DDA es el multipolo de enrutamiento iónico en el espectrómetro de masas. En la adquisición dependiente de datos N superior convencional (DDA), los picos N del espectro MS1 se seleccionan para la fragmentación. Este esquema de fragmentación comienza con el pico de mayor intensidad primero, seguido por el pico de segunda intensidad más alta, y así sucesivamente. En un esquema de fragmentación alternativo, el pico menos intenso se selecciona primero, seguido por el segundo pico menos intenso, etc. La razón detrás de este orden de selección es que hay tiempo suficiente para fragmentar péptidos muy bajos y abundantes también. De hecho, encontramos que el número de identificaciones de péptidos aumenta cuando las "más altas primero" y "la primera primera" se combinaron en comparación con un análisis duplicado de LC-MS con la configuración estándar del DDA (es decir, la más alta primero). Para una elaboración de perfiles ubiquitinome más completa, se recomienda combinar las ejecuciones de LC-MS con los regímenes de fragmentación "más altos primero" y "más bajos primero" en el procedimiento de análisis de datos. Esta estrategia "más baja primero" puede producir más de 4.000 péptidos diGly únicos adicionales, que no se detectaron cuando sólo se utilizó el régimen de DDA convencional(Figura 2).
Por último, las IP adicionales del flujo después de la primera IP pueden producir otros 2.500 péptidos diGly únicos(Figura 2).
Artículos en la literatura sobre la elaboración de perfiles de ubiquitinación típicamente informan alrededor de 10.000 péptidos diGly identificados12,21. Aquí, de todos los péptidos digly identificados en tres pantallas de réplica biológica, >9.000 estaban presentes en las tres, mientras que >17.000 estaban presentes en al menos dos de cada tres réplicas(Figura 3). Típicamente, siguiendo el protocolo descrito aquí uno debe identificar >21,000 péptidos diGly únicos de una muestra de proteína de 15-20 mg usando un lote estándar de perlas de anticuerpos CST. En términos de pureza y selectividad, la relación entre los péptidos digly identificados y los péptidos no modificados siempre debe ser >0.5. El número de identificaciones de péptidos digly dependía en gran medida de la cantidad de material de entrada de proteínas. Una IP realizada con sólo 1 mg de material de entrada produjo aproximadamente 2.500 identificaciones de péptidos digly, mientras que con 10 mg de material de entrada de proteínas >15.000 identificaciones de péptidos digly. En la Tabla 1 se enumera el número esperado de péptidos diGly identificados para cada condición. Cabe señalar que estos números son sólo estimaciones y dependen del tipo de espectrómetro de masautilizado. La Figura 4 muestra la superposición entre las identificaciones de péptidos diGly con cantidades bajas, medias y altas de material de entrada.
Con el fin de ilustrar el valor añadido de las mejoras para el análisis del sitio de ubiquitinación descrita anteriormente, también realizamos un análisis ubiquitinómico cuantitativo de células HeLa etiquetadas siLAC que fueron tratadas con el inhibidor del proteasoma bortezomib en comparación con las células de control no tratadas en un ensayo de intercambio de etiquetas duplicado. Más de la mitad (>55%) de todos los péptidos identificados en el eluido sobre la P.I. eran péptidos dilicosos. Se identificaron más de 19.000 péptidos diGly únicos, que es sólo un poco menor que en una muestra no etiquetada con SILAC. La razón de esto puede ser la mayor complejidad de los espectros MS1 en un ensayo SILAC debido a la presencia de pares de picos de péptidos. En el análisis SILAC se observaron diferencias relativamente grandes entre el número de péptidos diGly que se identificaron exclusivamente en la condición de avance (es decir, células tratadas con bortezomib en el canal pesado, células de control en el canal ligero) y aquellas identificadas exclusivamente en la condición inversa (es decir, células tratadas con bortezomib en el canal ligero, células de control en el canal pesado), en este caso 1.752 frente a 6.356(Tabla suplementaria 1). Cuando se opera el software MaxQuant en el modo "multiplicidad 2" (es decir, SILAC de dos canales), se identificaron 7.555 péptidos diGly con intensidad cero en el canal pesado (prácticamente todo lo que viene en el experimento inverso) y un valor de intensidad distinto de cero en el canal de luz. Por el contrario, no se identificaron péptidos diGly con un valor de intensidad distinto de cero en el canal pesado acompañado de un valor de intensidad cero en el canal ligero. Cuando se realizó un análisis MaxQuant sobre el mismo conjunto de datos en el modo "multiplicidad 1" con la mitad terrible y el aminoácido etiquetado combinado en una sola modificación variable, se identificaron muchas variantes de péptidos digly pesados, incluso cuando no se pudo detectar ninguna contraparte ligera de ese péptido. La explicación más probable para esto es la incapacidad del software para hacer frente a la identificación de péptidos digly que están exclusivamente presentes en el canal pesado. Es probable que este fenómeno ocurra extensamente, porque la inhibición del proteosoma desencadenará la formación de nuevos sitios de ubiquitinación. Marcar la casilla de verificación de la opción "recuantificar" en MaxQuant, que se desarrolló para tratar estos problemas y debe corregir esto, parece ser insuficiente para evitar este problema por completo. Obviamente, la gran mayoría de los péptidos diGly están siendo regulados o formados de novo tras la inhibición del proteasoma, porque más de dos tercios de la agrupación de péptidos tienen relaciones H:L de al menos 1,5(Figura 5B).
Finalmente, aplicamos este método de análisis del sitio de ubiquitinación a una muestra de tejido in vivo. Para evaluar la eficacia, extrajimos aproximadamente 32 mg de proteína del cerebro fresco del ratón (el 10% del peso del tejido húmedo es proteína). El material cerebral no fue tratado con inhibidores del proteasoma o cualquier otro reactivo que pudiera aumentar la ubiquitinación general de proteínas. A partir de esta muestra, se identificaron 10.871 péptidos diGly únicos(Tabla Suplementaria 2). Todos los péptidos digly identificados en este tejido se originaron a partir de sitios endógenos de ubiquitinación en una situación de estado estacionario. No se impuso ningún tratamiento para aumentar la ubiquitinación global (por ejemplo, inhibición del proteasoma). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que estos sitios de ubiquitinación surgen al menos parcialmente de (poli)ubiquitinación implicada en eventos de señalización celular mediados no proteosoma, lo que está de acuerdo con las ideas propuestas en la literatura5,16,22.
En conclusión, el método descrito aquí permite la exploración en profundidad del ubiquitinome de una manera reproducible. Para una visión general de los resultados típicos obtenidos con este procedimiento, véase Van Der Wal et al.23.
Figura 1: Visión general experimental. (A) Visión general del enfoque experimental. Se prepararon, se triprinizaron y fraccionaron en tres fracciones utilizando cromatografía de fase inversa con alta elución de pH. Un lote de cuentas comerciales de anticuerpos de péptidos de é-diGly se dividió en seis fracciones iguales y las tres fracciones de péptidos se cargaron en tres de las fracciones de perlas. Los péptidos diGly fueron inmunopurificados, eluydos y recogidos, y el flujo a través fue transferido posteriormente a las tres fracciones de cuentas frescas restantes. Los péptidos diGly recogidos fueron analizados por espectrometría de masas en un espectrómetro de masas Lumos Orbitrap de acuerdo con un esquema de dos niveles que combina un ciclo en el que los picos más intensos fueron seleccionados por primera vez para la fragmentación de péptidos y el siguiente ciclo en el que los picos menos intensos fueron seleccionados primero. El conjunto completo de ejecuciones nLC-MS/MS se analizó utilizando MaxQuant. (B) Una de las fracciones debe contener el propio péptido tríptico modificado K48 LIFAGK(GG)QLEDGR (m/z 730.39). Este es, con mucho, el péptido más abundante en la fracción inmunopreciada y se caracterizó por el pico intenso y amplio en el cromatograma LC entre 50-55 min en un gradiente de 120 min. Si este pico de referencia está ausente del cromatograma, lo más probable es que la P.I. no haya tenido éxito. Esta cifra ha sido modificada de Van Der Wal et al.23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Números de péptidos diGly detectados para cada uno de los tres pasos de mejora. (A) Efecto del fraccionamiento bruto antes de la inmunoprecipitación. Se muestra la superposición entre las poblaciones de péptidos digly identificadas en las tres fracciones separadas. (B) Efecto de la primera y segunda etapa de incubación. (C) Resultados del régimen de fragmentación de péptidos ajustado. Esta cifra ha sido modificada de Van Der Wal et al.23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Péptidos diglilos detectados en tres réplicas biológicas de células tratadas con bortezomib que muestran la cantidad de superposición entre las corridas. Esta cifra ha sido modificada de Van Der Wal et al.23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Superposición de péptidos digly identificados a partir de análisis con cantidades de entrada de proteínas totales bajas (4 mg), medias (10 mg) y altas (40 mg). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Detección de péptidos digly en células etiquetadas SILAC. (A) Números de péptidos detectados en las condiciones de avance e retroceso de las células HeLa etiquetadas siLAC para los ajustes de multiplicidad 1 y 2. (B) Gráfico de dispersión de las relaciones SILAC de péptido digliga en células HeLa tratadas con Bortezomib (Btz). Solo se muestran los péptidos que se identificaron y cuantificaron tanto en experimentos hacia adelante como en reversa. Esta cifra ha sido modificada de Van Der Wal et al.23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Condición | Cantidad de material de entrada (mg) | Número esperado de péptidos diGly identificados |
| Células HeLa no tratadas | 10 | 7,500 |
| Inhibidor de proteasoma células HeLa tratadas | 1 | 2,500 |
| 2 | 5,000 | |
| 10 | 15,000 | |
| 20 | 20,000 | |
| 40 | >25.000 | |
| Tejido (cerebro del ratón) | 30 | >10.000 |
Tabla 1: Números esperados de identificaciones de péptidos diGly para diferentes condiciones. Estos números son sólo estimaciones y dependen de la configuración experimental utilizada.
Cuadro Suplementario 1. Haga clic aquí para ver esta tabla (haga clic con el botón derecho para descargar).
Cuadro Suplementario 2. Haga clic aquí para ver esta tabla (haga clic con el botón derecho para descargar).
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Discussion
El protocolo descrito aquí se aplicó a muestras de diversas fuentes biológicas, como células cultivadas y tejido in vivo. En todos los casos identificamos miles de péptidos digly, siempre que la cantidad total de entrada de proteína sin al menos 1 mg. El enriquecimiento con anticuerpos específicos es altamente eficiente, dado que sólo a lo sumo se identificaron 100-150 péptidos digly muy bajos y abundantes a partir de lisatos de células enteras si no se aplicaron procedimientos de enriquecimiento para proteínas ubiquitinadas o péptidos digly. Obviamente, la espectrometría de masas sensible es un requisito previo para obtener un gran número de identificaciones diGly. Aunque hemos utilizado con éxito varios espectrómetros de masas diferentes, encontramos que el Orbitrap Tribrid Lumos es el más sensible que dio los mayores rendimientos.
La cromatografía RP fuera de línea con alta elución de pH debe probarse antes de que se lleven a cabo las IP. La superposición entre las fracciones en términos de identificaciones de péptidos debe ser lo más baja posible para un experimento óptimo. Después de la IP, una de las fracciones debe contener el propio péptido ríptico modificado K48 de ubiquitina LIFAGK(GG)QLEDGR (m/z 730.39). Este es, con mucho, el péptido más abundante en la fracción inmunopreciada y se caracteriza por el pico intenso y amplio en el cromatograma LC entre 50-55 min en un gradiente de 120 min(Figura 1B). Si este pico de referencia está ausente del cromatograma, lo más probable es que la P.I. no haya tenido éxito.
Es importante analizar los péptidos inmunoprecipitados diGly tryptic inmediatamente después del procedimiento de P.I., por lo que el tiempo entre la IP y el análisis debe mantenerse al mínimo. Durante ese tiempo, los péptidos deben almacenarse preferentemente en un vial de vidrio en lugar de tubos de plástico. Dejar los péptidos en tubos de plástico durante demasiado tiempo, ya sea a RT o a -20 oC, puede resultar en la precipitación de péptidos y / o adherirse a la pared del tubo de plástico. Esto afectará en última instancia a la sensibilidad del análisis.
Aunque ha habido informes en la literatura sobre la posible mala interpretación de los aductos de yodoacetamida como sitios de ubiquitinación debido a sus idénticos 114.04 Da masa turnos24, no hemos encontrado ninguna indicación de esto con nuestras preparaciones de péptidos trippticos inmunoprecipitados. En primer lugar, los efectos secundarios del uso de yodoacetamida (IAM) son mínimos en nuestras manos utilizando el protocolo de reducción de alquilación descrito anteriormente. En segundo lugar, el anticuerpo es específico para péptidos con un remanente de digglicina. Los péptidos con dos mitades de yodoacetamida añadidas covalentemente a los residuos de lisina no deben enriquecerse en este protocolo. En tercer lugar, la mayoría de los péptidos de la fracción inmunopreciada se regulan al inhibición del proteasoma, como se ejemplifica en el experimento SILAC descrito anteriormente(Figura 5). Debido a que la población de proteínas ubiquitinadas se ve afectada como resultado de este tratamiento, es muy probable que estos péptidos afectados sean de hecho péptidos diglinadas resultantes de proteínas ubiquitinadas.
Por último, este protocolo podría utilizarse en combinación con una estrategia cuantitativa multiplexada publicada recientemente utilizando TMT19. Obviamente, aunque los números de péptidos diGly publicados son algo más bajos que los obtenidos utilizando el protocolo actual, la capacidad de cuantificar relativamente hasta 16 muestras simultáneamente es una gran ventaja. La combinación de estos métodos permitirá a los investigadores realizar estudios cuantitativos ubiquitinome a gran escala en gran profundidad.
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Disclosures
Los autores no declaran conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo forma parte del proyecto "Proteínas en el Trabajo", un programa del Centro de Proteómica de los Países Bajos financiado por la Organización Neerlandesa de Investigación Científica (NWO) como parte de la Hoja de Ruta Nacional de Las Instalaciones de Investigación a Gran Escala (número de proyecto 184.032.201 ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-Aldrich | D8255 | |
| 3M Empore C18 Octadecyl disks | Supelco | 66883-U | product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore) |
| Ammonium formate | Sigma-Aldrich | 70221 | |
| Bortezomib | UBPbio | ||
| CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å | Waters | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| DMEM | ThermoFisher | ||
| EASY-nanoLC 1200 | ThermoFisher | ||
| FBS | Gibco | ||
| GF/F filter plug | Whatman | 1825-021 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Lysine, Arginine | Sigma-Aldrich | ||
| Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4) | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lysyl Endopeptidase(LysC) | Wako Pure Chemicals | 129-02541 | |
| NanoLC oven | MPI design, MS Wil GmbH | ||
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L-5125 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher / Pierce | 23225 | |
| PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles | Agilent Technologies | PL1412-2K01 | |
| PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit | Cell Signaling Technologies | 5562 | |
| Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge | Waters | WAT036790 | Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Trypsin, TPCK Treated | ThermoFisher | 20233 |
References
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