Summary
Vi presenterar en metod för rening, detektion och identifiering av diGly peptider som härrör från ubiquitinated proteiner från komplexa biologiska prover. Den presenterade metoden är reproducerbar, robust och överträffar publicerade metoder med avseende på nivån på djupet av ubiquitinome analysen.
Abstract
Den posttranslationala modifieringen av proteiner av det lilla proteinet ubiquitin är involverad i många cellulära händelser. Efter tryptisk matsmältning av allestädes närvarande proteiner, peptider med en diglycine kvarleva konjugerade till epsilon aminosagruppen av lysin ("K-ε-diglycine" eller helt enkelt "diGly") kan användas för att spåra tillbaka den ursprungliga modifieringsstället. Effektiv immunopurification av diGly peptider i kombination med känsliga detektion av masspektrometri har resulterat i en enorm ökning av antalet ubiquitination webbplatser identifieras aktuell. Vi har gjort flera förbättringar av detta arbetsflöde, inklusive offline hög pH omvänd fas fraktionering av peptider före anrikning förfarandet, och införandet av mer avancerade peptid fragmentering inställningar i jon routing multipole. Dessutom, effektivare sanering av provet med hjälp av en filterbaserad kontakt för att behålla antikroppar pärlor resulterar i en större specificitet för diGly peptider. Dessa förbättringar resulterar i rutinmässig upptäckt av mer än 23.000 diGly peptider från mänskliga livmoderhalscancer celler (HeLa) cell lysates vid proteasome hämning i cellen. Vi visar effekten av denna strategi för djupgående analys av ubiquitinome profiler av flera olika celltyper och in vivo prover, såsom hjärnvävnad. Denna studie presenterar ett original tillägg till verktygslådan för protein ubiquitination analys för att avslöja den djupa cellulära ubiquitinome.
Introduction
Konjugeringen av ubiquitin till proteiner markerar dem för nedbrytning av proteasom och är en avgörande process i proteostas. C-terminalkarboxylgruppen av ubiquitin bildar en isopeptidbindning med lysin ε-aminogruppen i målproteinet1,2. Dessutom kan allestädes närvarande fästas vid andra allestädes närvarande moduler, vilket resulterar i bildandet av homogena (dvs. K48 eller K11) eller grenade (dvs. heterogena eller blandade) polyubiquitinstrukturer1,3. Den mest kända funktionen av ubiquitin är dess roll i proteasomal nedbrytning, medierad av K48-länkade polyubiquitin. Det har dock blivit tydligt att både mono- och polyubiquitination också spelar roller i många processer som är oberoende av nedbrytning av proteasomen. Till exempel har K63-länkade kedjor icke-degradativa roller i intracellulär handel, lysosomal nedbrytning, kinassignalering och DNA-skadehantering4,5. De övriga sex kopplingstyperna är mindre rikliga och deras roller är fortfarande i stort sett gåtfulla, även om de första indikationerna om deras funktioner i cellen håller på att växa fram, till stor del på grund av utvecklingen av nya verktyg för att möjliggöra länkningsspecifik upptäckt6,7.
Masspektrometri har blivit ett oumbärligt verktyg för proteomanalyser och numera kan tusentals olika proteiner från praktiskt taget alla biologiska källor identifieras i ett enda experiment. Ett ytterligare komplext lager presenteras genom posttranslationala modifieringar (PTMs) av proteiner (t.ex. fosforylering, metylering, acetyleration och ubiquitination) som kan modulera proteinaktivitet. Storskalig identifiering av PTM-bärande proteiner har också möjliggjorts genom utvecklingen inom masspektrometriområdet. Den relativt låga stökiometrin hos peptider med PTMs jämfört med deras oförändrade motsvarigheter utgör en teknisk utmaning och biokemiska anrikningssteg är i allmänhet nödvändiga före masspektrometrianalysen. Under de senaste två decennierna har flera olika specifika anrikningsmetoder utvecklats för analys av PTMs.
På grund av de mångfacetterade rollerna av proteinubiquitination i cellen, det finns en stor efterfrågan på utveckling av analytiska metoder för detektion av allestädes närvarande platser på proteiner8. Tillämpningen av masspektrometriska metoder har lett till en explosion av antalet identifierade ubiquitination platser i fruktfluga, mus, människa och jäst proteiner9,,10,11,12,13,14. Ett viktigt steg presenterades genom utvecklingen av immunoprecipitation baserade anrikningsstrategier på peptidnivå med hjälp av antikroppar riktade mot K-ε-GG kvarleva motiv (även kallad "diglycin" eller "diGly"). Dessa diGly peptider produceras vid matsmältningen av ubiquitinerade proteiner med trypsin som proteas15,16.
Här presenterar vi ett optimerat arbetsflöde för att berika för diGly peptider med hjälp av immunopurification och efterföljande detektion av Orbitrap masspektrometri. Med hjälp av en kombination av flera ändringar av befintliga arbetsflöden, särskilt i provberedningen och masspektrometristadiet, kan vi nu rutinmässigt identifiera mer än 23 000 diGly peptider från ett enda prov av HeLa-celler som behandlats med en proteasom och ~10 000 från obehandlade HeLa-celler. Vi har tillämpat detta protokoll på lysates från både omärkta och stabila isotopmärkning med aminosyror i cellodling (SILAC) märkta HeLa-celler samt på endogena prover som hjärnvävnad.
Detta arbetsflöde presenterar ett värdefullt tillägg till repertoaren av verktyg för analys av allestädes närvarande platser för att avslöja den djupa ubiquitinome. I följande protokoll beskrivs alla steg i arbetsflödet i detalj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av EDC:s kommitté för institutionsvård och användning (EDC).
1. Provberedning
- Odlade celler
- Välj en cellinje av intresse (t.ex. HeLa eller osteosarkom [U2OS] celler) och odla cellerna i Dulbecco's Minimal Eagle Medium (DMEM) kompletteras med 10% värme inaktiverat fetala nötkreatur serum (FBS) och 100 enheter/ml penicillin /streptomycin.
- För kvantitativa proteomik experiment, kulturceller i DMEM saknar arginin och lysin. Mediet måste kompletteras med 10% dialyserat fetalt bovin serum (FBS), 100 enheter/ml penicillin/streptomycin och alanin-glutamin. Gör två typer av medier genom att lägga till antingen konventionellt lysin och arginin ("Light" Medium) eller lysin-8 (13C6; 15N2) och arginin-10 (13C6; 15N4) ("Heavy" Medium).
- Odlingssatser av celler i Light Medium (dvs. omärkta) och Heavy Medium (dvs. märkt, SILAC) för minst sex fördubblingar före expansion och behandling för att säkerställa att alla proteiner i Heavy Medium-kulturen är märkta med tung stabil isotop som innehåller Aminosyror.
- Behandla cellerna i 8 timmar med 10 μM av proteasomhämmaren bortezomib eller en motsvarande volym DMSO som en mock behandling. Tvätta cellerna med PBS, separera dem med 1% trypsin/EDTA och pellet cellerna.
- Lyse cellpelleten från en 150 cm2 odlingsplatta per tillstånd som testats i 2 ml läkkalla 50 mM Tris-HCl (pH = 8,2) med 0,5% natriumdeoxycholat (DOC). Koka lysate vid 95 °C i 5 min och sonikerat i 10 min (inställning av "H" för ljudgöraren som anges i materialtabellen) vid 4 °C. Vi rekommenderar inte användning av deubiquitinase hämmare såsom N-etylmaleimide (NEM), eftersom detta kan införa oönskade proteinmodifieringar som kan komplicera peptid identifiering.
- In vivo mus hjärnvävnad
- Vid användning av in vivo-vävnad, lyse vävnaden i en iskall buffert som innehåller 100 mM Tris-HCl (pH = 8,5), 12 mM natrium DOC, och 12 mM natrium N-lauroylsarcosinate17. Sonicate lysate i 10 min (inställning "H" för sonicator som anges i tabellen över material) vid 4 °C och koka lysate i 5 min vid 95 °C.
- Kvantifiera den totala proteinmängden med hjälp av en kolorimetrisk absorbans BCA proteinanalys kit. Den totala mängden protein bör vara minst flera milligram för en framgångsrik diGly peptid immunprecipitation (IP). För SILAC-experiment blandas de lätta och tunga märkta proteinerna i ett 1:1-förhållande baserat på den totala proteinmängden.
- Minska alla proteiner med 5 mM 1,4-dithiothreitol i 30 min vid 50 °C och därefter alkylera dem med 10 mM iodoacetamid i 15 min i mörker. Utför proteinrötning med Lys-C (1:200 enzym-till-substrat förhållande) för 4 h följt av natten matsmältning med trypsin (1:50 enzym-till-substrat förhållande) vid 30 °C eller vid rumstemperatur (RT).
- Tillsätt trifluoracetisk syra (TFA) till det smälta provet till en slutlig koncentration på 0,5 % och centrifugera provet med 10 000 x g i 10 minuter för att fälla ut och avlägsna allt tvättmedel. Samla upp supernatanten som innehåller peptiderna för efterföljande fraktionering.
2. Fraktionering av peptider offline
- Använd hög pH-reverse-phase (RP) C18-kromatografi med polymert stationärt fasmaterial (300 Å, 50 μM; se Tabell över material) lastad i en tom kolonnpatron för att fraktionera trypptiska peptiderna. Den stationära fasbäddsstorleken måste justeras till den mängd proteinsmältning som ska fraktioneras. Förbered en tom 6 ml-kolonnpatron (se Tabell över material) fylld med 0,5 g stationärt fasmaterial för ~10 mg proteinsmältning. Proteinsmältningsgraden till stationär fas bör vara cirka 1:50 (w/w).
- Lasta peptiderna på den förberedda kolonnen och tvätta kolonnen med cirka 10 kolonnvolymer på 0,1 % TFA, följt av cirka 10 kolonnvolymer av H2O.
- Elute peptiderna i tre fraktioner med 10 kolumnvolymer av 10 mM ammonium formate lösning (pH = 10) med 7%, 13,5% och 50% acetonitril (AcN), respektive. Lyophilize alla fraktioner till fullständighet.
- Använd ubiquitin kvarlevermotiv (K-ε-GG) antikroppar konjugerade till protein A agarose pärlor för immunoenrichment av diGly peptider. Eftersom den exakta mängden antikroppar per parti pärlor är patentskyddad information och inte lämnas ut av tillverkaren, rekommenderas att använda samma definition för ett parti pärlor som tillverkaren gör för att undvika förvirring. Tvätta ett parti av dessa pärlor 2x med PBS och dela pärla slurry i sex lika stora fraktioner. Se figur 1 för ett detaljerat försöksschema.
- Lös upp de tre peptidfraktionerna som samlats in i steg 2,3 i 1,4 ml av en buffert bestående av 50 mM MOPS, 10 mM natriumfosfat och 50 mM NaCl (pH = 7,2) och snurra ner skräpet.
- Tillsätt fraktionernas supernatants till diGly-antikroppspärlorna och inkubera i 2 timmar vid 4 °C på en rotatorenhet. Snurra ner pärlorna och överför supernatanten till ett nytt parti antikroppspärlor och inkubera igen i 2 h vid 4 °C.
- Lagra supernatants för efterföljande global proteom (GP) analys.
- Överför pärlorna från varje fraktion till en 200 μL pipettspets utrustad med en GF/F-filterplugg för att behålla pärlorna. Sätt pipettspetsen med pärlorna i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör utrustat med en centrifugspetsadapter. Tvätta pärlorna 3x med 200 μL iskallt IAP-buffert och därefter 3x med 200 μl iskalla milliQ H2O. Vrid ner kolonnen vid 200 x g i 2 min före varje tvättsteg, men var noga med att inte låta kolonnen torka. Elute peptiderna med 2 cykler av 50 μL av 0,15% TFA.
- Avsalta peptiderna med en C18-scenspets (i huvudsak en 200 μL pipettspets med två C18-skivor) och torka dem till fullständighet med hjälp av vakuumcentrifugering.
3. Nanoflow LC-MS/MS
- Utför LC-MS/MS-experiment på en känslig masspektrometer kopplad till ett nanoflödes-LC-system.
- Använd en egen förpackad 50 cm omvänd faskolonn med en innerdiameter på 75 μm packad med CSH130-harts (3,5 μm, 130 Å) och eluerar peptiderna med en lutning på 2−28% (AcN, 0,1% FA) över 120 min vid 300 nL/min. Alternativt använd kommersiellt tillgängliga LC-kolonner med liknande egenskaper. Håll kolonnen vid 50 °C med hjälp av en kolonnugn, till exempel (se Tabell över material).
- Utför masspektrometrianalysen.
- Masspektrometern måste användas i databeroende förvärvsläge .DDA. MS1-massspektra ska samlas in med hög upplösning (t.ex. 120 000), med en automatisk förstärkningskontroll (AGC) målinställning på 4E5 och en maximal injektionstid på 50 ms vid en Orbitrap-masspektrometer.
- Utför masspektrometrianalysen i "Högsta intensitet först" först. På så sätt väljs den mest intensiva jonen först för fragmentering, sedan den näst högsta, och så vidare, med hjälp av topphastighetsmetoden med en total cykeltid på 3 s. Därefter utför du en andra omgång av DDA MS-analysen i läget "Lägsta intensitet först", så att den minst intensiva jonen väljs först, sedan den näst lägsta och så vidare. Denna strategi säkerställer optimal detektion av mycket låga abundancy peptider.
- Filtrera prekursorjonerna enligt deras laddningstillstånd (2-7 laddningar) och monoisotopic maximaltilldelning. Uteslut tidigare förhörda prekursorer dynamiskt för 60 s. Isolera peptidprekursorer med en quadrupole massfilter inställd på en bredd av 1,6 th.
- Samla MS2 spektra i jonfällan vid en AGC på 7E3 med en maximal injektionstid på 50 ms och HCD kollisionsenergi på 30%.
4. Dataanalys
- Analysera masspektrometri raw-filer med hjälp av en lämplig sökmotor som fritt tillgängliga MaxQuant programsvit baserad på Andromeda sökmotor18,19. I MaxQuant väljer du standardinställningarna med några anpassningar som anges nedan. Ställ in enzymet specificitet till trypsin, med det maximala antalet missade klyvningar upp till tre. Ställ lysin med en diGly kvarleva (+114.04 Da), oxidation av metionin och N-terminal acetylation som variabla modifieringar, och ställ karbamidamidometylering av cystein som en fast modifiering.
- Utför databassökningar mot en FASTA-fil som innehåller proteinsekvenser som hämtats från till exempel Uniprot-arkivet (https://www.uniprot.org/downloads) i kombination med ett lockbete och en vanlig standarddatabas som automatiskt tillhandahålls av MaxQuant. Ange den falska identifieringshastigheten (FDR) till 1 % och ange minimipoängen för modifierade (diGly) peptider till 40 (standardvärde). Uteslut peptider som identifierats med en C-terminal diGly modifierad lysin rester från ytterligare analys.
- För kvantitativ analys av SILAC experimentfiler, ange multiplicity till "2" och upprepa steg 4.2.
- Utför alla nedströmsanalyser (t.ex. statistik, gen ontologianalyser) med Perseus modul20 i MaxQuants programsvit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ubiquitinerade proteiner lämnar en 114,04 Da diglycine kvarleva på mållysinresteras när proteinerna rötas med trypsin. Den massskillnad som orsakas av detta motiv användes för att entydigt känna igen platsen för ubiquitination i en masspektrometri experiment. Den strategi som vi beskriver här är en state-of-the-art metod för anrikning och efterföljande identifiering av diGly peptider av nanoflöde LC-MS/MS (figur 1A). I denna studie användes både odlade celler och in vivo-material som den biologiska källan till proteiner, men detta protokoll är kompatibelt med alla proteinkällor. Efter stegen i protokollet bör det vara enkelt att identifiera 10.000-25.000 diGly peptider från 2-20 mg proteintillförsel. För att öka omfattningen av protein ubiquitination i celler, en proteasomhämmare såsom bortezomib eller MG132 kan läggas till några timmar innan skörd cellerna. Om ingen proteasomhämmare användes tenderade antalet identifierade diGly-peptider att vara signifikant lägre (30-40 %).
Vi har gjort flera förbättringar av befintliga protokoll. Först utförs en rå fraktionering i tre fraktioner baserat på omvänd fas kromatografi och efterföljande eluering vid högt pH för att minska komplexiteten i peptidblandningen. Dessa fraktioner visar en mycket låg överlappning i peptididentifieringar, och jämförbara antal diGly peptider bör identifieras per fraktion (figur 2). Detta resulterar i ett stort antal unika diGly peptider identifieras i var och en av dessa fraktioner. Viktigt, en av fraktionerna (vanligtvis den andra) bör innehålla ubiquitin egen K48 modifierade tryptic diGly peptid LIFAGK (GG) QLEDGR (m/z 730,39). Detta är den överlägset vanligaste peptiden i den immunfällda fraktionen och kännetecknas av den intensiva och breda toppen i LC-kromatogrammet (figur 1B). Detta är ett riktmärke kromatografisk topp och om det är frånvarande från kromatogram ip var sannolikt misslyckades.
En annan förbättring är anpassningen av analysförfarandet för utvecklingsagendan från Doha är jonroutningsmulten i masspektrometern. Vid konventionellt topp N-databeroende förvärv (DDA) väljs N-toppar från MS1-spektrumet ut för fragmentering. Detta fragmenteringsschema börjar med den högsta intensitetstoppen först, följt av toppen av näst högsta intensitet och så vidare. I ett alternativt fragmenteringssystem väljs den minst intensiva toppen först, följt av den näst minst intensiva toppen, etc. Den logiska grunden bakom denna ordning urval är att det finns tillräckligt med tid att fragmentera mycket låga rikliga peptider också. I själva verket fann vi att antalet peptid identifieringar ökar när den "högsta första" och "lägsta första" DDA körningar kombinerades jämfört med en duplicerad LC-MS analys med standard DDA inställningar (dvs högsta först). För mer omfattande ubiquitinome profilering, rekommenderas det därför att kombinera LC-MS körs med "högsta först" och "lägsta första" fragmentering regimer i dataanalysförfarandet. Denna "lägsta första" strategi kan producera mer än ytterligare 4000 unika diGly peptider, som inte upptäcktes när endast den konventionella DDA regimen användes (figur 2).
Slutligen kan ytterligare IP-talet av flödet genom efter den första IP producera ytterligare ~ 2.500 unika diGly peptider (figur 2).
Artiklar i litteraturen om ubiquitination profilering rapporterar vanligtvis cirka 10.000 identifierade diGly peptider12,21. Här, av alla diGly peptider identifieras över tre biologiska replikat skärmar, >9.000 var närvarande i alla tre, medan >17.000 var närvarande i minst två av tre replikat (figur 3). Vanligtvis, efter det protokoll som beskrivs här bör man identifiera >21,000 unika diGly peptider från en 15-20 mg proteinprov med hjälp av en standard sats av CST antikroppar pärlor. När det gäller renhet och selektivitet bör förhållandet mellan identifierade diGly peptider och oförändrade peptider alltid vara >0,5. Antalet diGly peptid identifieringar var mycket beroende av mängden proteiningång material. En IP som utförs med endast 1 mg ingående material produceras ungefär 2,500 diGly peptid identifieringar, medan med 10 mg proteiningångmaterial >15,000 diGly peptid identifieringar producerades. I tabell 1 anges det förväntade antalet identifierade diGly-peptider för varje tillstånd. Det bör noteras att dessa siffror endast är uppskattningar och beror på vilken typ av masspektrometer som används. Figur 4 visar överlappningen mellan diGly peptid identifieringar med låga, medelstora och höga mängder inmatningsmaterial.
För att illustrera mervärdet av de förbättringar för ubiquitination webbplats analys som beskrivs ovan, utförde vi också en kvantitativ ubiquitinomic analys av SILAC märkta HeLa celler som behandlades med proteasomhämmare bortezomib jämfört med obehandlade kontroll celler i en dubbel etikett swap analys. Mer än hälften (>55 %) av alla identifierade peptider i eluatet på IP var diGly peptider. Över 19 000 unika diGly peptider identifierades, vilket bara är något mindre än i ett icke-SILAC-märkt prov. Anledningen till detta kan vara den högre komplexiteten av MS1 spektra i en SILAC-analys på grund av förekomsten av peptid topppar. I SILAC-analysen observerades relativt stora skillnader mellan det antal diGly peptider som uteslutande identifierades i terminstillståndet (dvs. bortezomib behandlade celler i den tunga kanalen, kontrollceller i ljuskanalen) och de som uteslutande identifierats i omvänd skick (dvs. bortezomib behandlade celler i ljuskanalen, kontrollceller i den tunga kanalen), i detta fall 1.752 jämfört med 6.356(Kompletterande tabell 1). När du använder MaxQuant-programvaran i "multiplicity = 2" (dvs. tvåkanaliga SILAC)-läge identifierades 7 555 diGly-peptider med noll intensitet i den tunga kanalen (nästan alla som kommer i det omvända experimentet) och ett intensitetsvärde som inte är noll i ljuskanalen. Däremot identifierades inga enskilda diGly peptider med ett intensitetsvärde som inte var noll i den tunga kanalen tillsammans med ett nollintensitetsvärde i ljuskanalen. När en MaxQuant-analys på samma datamängd utfördes i "multiplicity = 1"-läget med diGly moiety och den märkta aminosyran kombineras till en enda variabel modifiering, identifierades många tunga diGly peptidvarianter, även när ingen lätt motsvarighet till peptiden kunde detekteras. Den mest sannolika förklaringen till detta är oförmågan hos programvaran för att klara av identifiering av diGly peptider som är uteslutande närvarande i den tunga kanalen. Detta fenomen kommer sannolikt att inträffa i stor utsträckning, eftersom hämning av proteasom kommer att utlösa bildandet av nya allestädes närvarande platser. Markera "requantify" alternativet kryssrutan i MaxQuant, som har utvecklats för att hantera dessa frågor och bör korrigerar för detta, verkar vara otillräcklig för att undvika denna fråga helt. Uppenbarligen är den stora majoriteten av diGly peptider uppregleras eller bildas de novo på proteasom hämning, eftersom över två tredjedelar av peptid poolen har H: L nyckeltal på minst 1,5 (Figur 5B).
Slutligen tillämpade vi denna ubiquitination webbplats analysmetod till en in vivo vävnad prov. För att bedöma effektiviteten extraherade vi cirka 32 mg protein från färsk mushjärna (~10% av den våta vävnadsvikten är protein). Hjärnmaterialet behandlades inte med proteasomhämmare eller någon annan reagens som kunde öka övergripande protein ubiquitination. Av detta prov identifierades 10 871 unika diGlypeptider(tilläggstabell 2). Alla diGly peptider identifieras i denna vävnad härstammar från endogena platser av allestädes närvarande i en steady-state situation. Ingen behandling för att öka den globala allestädes närvarande (t.ex. proteasomhämning) infördes. Vi tställ därför hypotesen att dessa allestädes närvarande platser åtminstone delvis uppstår från (poly) allestädes närvarande i icke-proteasom medierad cellulära signalering händelser, som är i samförstånd med idéer som föreslås i litteraturen5,16,22.
Sammanfattningsvis gör den metod som beskrivs här för djupgående utforskning av ubiquitinome på ett reproducerbart sätt. För en översikt över typiska resultat som erhållits med detta förfarande se Van Der Wal et al.23.
Figur 1: Experimentell översikt. (A)Översikt över försöksmetoden. Prover var beredda, trypsinized och fraktionerade i tre fraktioner med omvänd fas kromatografi med hög pH eluering. Ett parti av kommersiella α-diGly peptid antikroppar pärlor delades upp i sex lika stora fraktioner och de tre peptid fraktionerna lastades sedan på tre av pärla fraktioner. DiGly peptider var immunopurified, eluerade och samlas in, och flowthrough överfördes därefter till de tre återstående färska pärlor fraktioner. De insamlade diGly peptiderna analyserades av masspektrometri på en Lumos Orbitrap masspektrometer enligt ett tvåstegsschema som kombinerar en cykel där de mest intensiva topparna först valdes ut för peptidfragmentering och nästa cykel där de minst intensiva topparna valdes först. Den fullständiga uppsättningen nLC-MS/MS-körningar analyserades sedan med MaxQuant. ( B)En av fraktionerna bör innehålla ubiquitin s egna K48 modifierad tryptic diGly peptid LIFAGK(GG)QLEDGR (m/ z 730,39). Detta är den överlägset vanligaste peptiden i immunoprecipitated fraktionen och kännetecknades av den intensiva och breda toppen i LC-kromatogrammet mellan 50-55 min på en 120 min gradient. Om denna riktmärke topp saknas från kromatogram ip var sannolikt misslyckades. Denna siffra har ändrats från Van Der Wal et al.23. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Antal diGly peptider som detekteras för vart och ett av de tre förbättringsstegen. (A) Effekten av råfraktionation före immunprecipitation. Överlappningen mellan diGly peptid populationer identifieras i de tre separata fraktionerna visas. (B)Effekten av den första och andra inkubation steg. (C)Resultat av den justerade peptidfragmenteringsregimen. Denna siffra har ändrats från Van Der Wal et al.23. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: DiGly peptider som detekteras i tre biologiska replikat av bortezomibbehandlade celler som visar mängden överlappning mellan körningarna. Denna siffra har ändrats från Van Der Wal et al.23. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Överlappning av identifierade diGly peptider från analyser med låga (4 mg), medium (10 mg) och höga (40 mg) totala proteintillförselmängder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Detektion av diGly peptider i SILAC-märkta celler. (A) Antal peptider som detekteras i de framåt- och omvända förhållandena hos SILAC-märkta HeLa-celler för multiplicitetsinställningarna 1 och 2. (B)Scatterplot av diGly peptid SILAC nyckeltal i Bortezomib (Btz) behandlade HeLa celler. Endast peptider som identifierades och kvantifierades i både framåt och bakåt försök visas. Denna siffra har ändrats från Van Der Wal et al.23. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Villkor | Mängden ingående material (mg) | Förväntat antal identifierade diGly-peptider |
| Obehandlade HeLa-celler | 10 | 7,500 |
| Proteasomhämmare behandlade HeLa-celler | 1 | 2,500 |
| 2 | 5,000 | |
| 10 | 15,000 | |
| 20 | 20,000 | |
| 40 | >25 000 | |
| Vävnad (mushjärna) | 30 | >10 000 |
Tabell 1: Förväntat antal diGly peptididentifieringar för olika förhållanden. Dessa siffror är bara uppskattningar och beror på de experimentella inställningar som används.
Tilläggstabell 1. Klicka här för att se den här tabellen (Högerklicka för att ladda ner).
Tilläggstabell 2. Klicka här för att se den här tabellen (Högerklicka för att ladda ner).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här tillämpades på prover från olika biologiska källor, såsom odlade celler och in vivo vävnad. I alla fall identifierade vi tusentals diGly peptider, förutsatt att den totala proteintillförselen var minst 1 mg. Anrikningen med hjälp av specifika antikroppar är mycket effektiv, med tanke på att endast högst 100-150 mycket låga rikliga diGly peptider identifierades från hela cell lysates om inga anrikning förfaranden för ubiquitinated proteiner eller diGly peptider tillämpades. Uppenbarligen är känslig masspektrometri en förutsättning för att få ett stort antal diGly identifieringar. Även om vi framgångsrikt har använt flera olika masspektrometrar, fann vi Orbitrap Tribrid Lumos vara den mest känsliga som gav den högsta avkastningen.
Offline RP-kromatografin med hög pH-eluering bör testas innan IP-erna utförs. Överlappningen mellan fraktionerna när det gäller peptididentifieringar bör vara så låg som möjligt för ett optimalt experiment. Efter IP-adressen ska en av fraktionerna innehålla ubiquitins egna K48-modifierade tryptiska diGly peptid LIFAGK(GG)QLEDGR (m/z 730,39). Detta är den överlägset vanligaste peptiden i den immunfällda fraktionen och kännetecknas av den intensiva och breda toppen i LC-kromatogrammet mellan 50-55 min på en 120 min gradient (figur 1B). Om denna riktmärke topp saknas från kromatogrammet, var IP troligen misslyckades.
Det är viktigt att analysera immunoprecipitated diGly tryptiska peptider omedelbart efter IP-förfarandet, så tiden mellan IP och analys bör hållas till ett minimum. Under den tiden bör peptider helst förvaras i en glasflaska istället för plaströr. Om peptider lämnas i plaströr för länge, antingen vid RT eller vid -20 °C, kan det leda till att peptider och/eller plaströrsväggen blir utfällbara. Detta kommer i slutändan att påverka analysens känslighet.
Även om det har förekommit rapporter i litteraturen om den potentiella feltolkning av iodoacetamide adducts som ubiquitination platser på grund av deras identiska 114.04 Da massa skift24, har vi inte hittat någon indikation på detta med våra preparat av immunoprecipitated tryptiska peptider. För det första är biverkningarna av att använda iodoacetamide (IAM) minimala i våra händer med hjälp av alkylering-minskning protokollet som beskrivs ovan. För det andra är antikroppen specifik för peptider med en diglycine kvarleva. Peptider med två jodoabla moieties kovalent tillsätts lysin rester bör inte berikas i detta protokoll. För det tredje är majoriteten av peptiderna i den immunfällda fraktionen uppreglerade vid proteasomhämning, vilket exemplifieras på SILAC-experimentet som beskrivs ovan (figur 5). Eftersom populationen av ubiquitinated proteiner påverkas som ett resultat av denna behandling, är det mycket troligt att dessa drabbade peptider är verkligen diGly peptider till följd av allestädes närvarande proteiner.
Slutligen skulle detta protokoll kunna användas i kombination med en nyligen publicerad multiplex kvantitativ strategi med TMT19. Självklart, även om de publicerade diGly peptid siffrorna är något lägre än de som erhållits med hjälp av det nuvarande protokollet, förmågan att relativt kvantifiera upp till 16 prover samtidigt är en stor fördel. Genom att kombinera dessa metoder kan forskare utföra storskaliga kvantitativa ubiquitinomestudier på djupet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete är en del av projektet "Proteins at Work", ett program för Nederländerna Proteomics Centre finansierat av The Netherlands Organization for Scientific Research (NWO) som en del av National Roadmap Large-Scale Research Facilities (projektnummer 184.032.201 ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-Aldrich | D8255 | |
| 3M Empore C18 Octadecyl disks | Supelco | 66883-U | product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore) |
| Ammonium formate | Sigma-Aldrich | 70221 | |
| Bortezomib | UBPbio | ||
| CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å | Waters | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| DMEM | ThermoFisher | ||
| EASY-nanoLC 1200 | ThermoFisher | ||
| FBS | Gibco | ||
| GF/F filter plug | Whatman | 1825-021 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Lysine, Arginine | Sigma-Aldrich | ||
| Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4) | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lysyl Endopeptidase(LysC) | Wako Pure Chemicals | 129-02541 | |
| NanoLC oven | MPI design, MS Wil GmbH | ||
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L-5125 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher / Pierce | 23225 | |
| PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles | Agilent Technologies | PL1412-2K01 | |
| PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit | Cell Signaling Technologies | 5562 | |
| Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge | Waters | WAT036790 | Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Trypsin, TPCK Treated | ThermoFisher | 20233 |
References
- Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143, 682-685 (2010).
- Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway. Cell. 79 (1), 13-21 (1995).
- Ohtake, F., Tsuchiya, H. JB special review - Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture. Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).
- Bergink, S., Jentsch, S. Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair. Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).
- Komander, D., Rape, M. The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).
- Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling. Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).
- Swatek, K. N., et al. Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping. Nature. 572, 533-537 (2019).
- Peng, J., et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).
- Wagner, S. A., et al. Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).
- Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).
- Elia, A. E. H., et al. Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response. Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).
- Wagner, S. A., et al. A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles. Molecular & Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284 (2011).
- Udeshi, N. D., et al. Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition. Molecular & Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).
- Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown. Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).
- Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling. Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
- Wakabayashi, M., et al. Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides. Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).
- Rose, C. M., et al. Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes. Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).
- Kaiser, S. E., et al. Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools. Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).
- Van Der Wal, L., et al. Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry. Journal of Proteomics. (July), (2017).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
