Summary
Se ha desarrollado un método cuantitativo para identificar y predecir la toxicidad de productos químicos, analizando automáticamente los perfiles fenotípicos de Caenorhabditis elegans. Este protocolo describe cómo tratar gusanos con productos químicos en una placa de 384 pozos, capturar videos y cuantificar fenotipos relacionados toxicológicos.
Abstract
Aplicación de ensayos de toxicidad de químicos en los organismos superiores de la orden, tales como ratones o ratas, es lento y costoso, debido a su larga vida útil y problemas de mantenimiento. Por el contrario, el nematodo Caenorhabditis elegans (C. elegans) tiene ventajas que lo hacen una opción ideal para las pruebas de toxicidad: una vida corta, fácil cultivo y reproducción eficiente. Aquí, describimos un protocolo para la automática perfiles fenotípicos de C. elegans en una placa de 384 pozos. Los gusanos nematodos son cultivados en una placa de 384 pozos con líquido medio tratamiento físico-químico, y videos se toman de cada pozo para cuantificar la influencia química de 33 características de gusano. Resultados experimentales demuestran que las características de fenotipo cuantificada pueden clasificar y predecir la toxicidad aguda de compuestos químicos diferentes y establecer una lista de prioridades para más pruebas de la evaluación de la toxicidad química tradicional en un modelo roedor.
Introduction
Junto con el rápido desarrollo de compuestos químicos aplicados a la producción industrial y la vida cotidiana de las personas, es importante estudiar la toxicidad pruebas modelos de los productos químicos. En muchos casos, el modelo animal de roedor se emplea para evaluar la potencial toxicidad de diferentes productos químicos sobre la salud. En general, la determinación de concentraciones letales (es decir, el ensayo 50% dosis letal [DL50] de diferentes productos químicos) se utiliza como parámetro tradicional en un modelo de roedor (rata/ratón) en vivo, que es muy costoso y desperdiciador de tiempo. Además, debido a reducir, afinar, o sustituir (3R) principio fundamental con la ética y el bienestar de los animales, nuevos métodos que permiten la sustitución de los animales superiores son valiosos para la investigación científica1,2,3 . C. elegans es un nematodo de vida libre que se ha aislado del suelo. Ha sido ampliamente utilizado como un organismo de investigación en el laboratorio debido a sus características beneficiosas, tales como una vida útil corta, fácil cultivo y reproducción eficiente. Además, muchos caminos biológicos fundamentales, incluyendo los procesos fisiológicos básicos y las respuestas de estrés en C. elegans, se conservan en el más alto mamíferos4,5,6,7 , 8. en un par de comparaciones entre nosotros y otros hemos hecho, hay una buena concordancia entre la toxicidad de C. elegans y toxicidad en roedores9. Todo esto hace que C. elegans un buen modelo para probar los efectos de toxicidad química en vivo.
Recientemente, algunos estudios cuantifican las características fenotípicas de C. elegans. Las características se pueden utilizar para analizar la toxicidad de productos químicos2,3,10 y la crianza de gusanos11. También se desarrolló un método que combina un líquido gusano cultivo sistema y un sistema de análisis de imagen, en la que los gusanos se cultivan en una placa de 384 pozos bajo diferentes tratamientos químicos12. Esta técnica cuantitativa ha sido desarrollada para analizar automáticamente los 33 parámetros de C. elegans después de 12-24h de tratamiento químico en una placa de 384 pozos con medio líquido. Una platina del microscopio automatizado se utiliza para la adquisición de video experimental. Los videos son procesados por un programa de diseño personalizado, y se cuantifican 33 características relacionadas con el comportamiento de movimiento de los gusanos. El método se utiliza para cuantificar los fenotipos gusano bajo el tratamiento de 10 compuestos. Los resultados muestran que la toxicidad diferente puede alterar los fenotipos de C. elegans. Estos fenotipos cuantificables pueden utilizarse para identificar y predecir la toxicidad aguda de compuestos químicos diferentes. El objetivo general de este método es facilitar la observación y cuantificación fenotípica de experimentos con C. elegans en un cultivo líquido. Este método es útil para el uso de C. elegans en evaluaciones de la toxicidad química y cuantificaciones de fenotipo, que ayudan a predecir la toxicidad aguda de compuestos químicos diferentes y establecer una lista de prioridad para el más tradicional pruebas de evaluación de la toxicidad química en un modelo roedor. Además, este método puede aplicarse a la toxicidad, evaluación y análisis de nuevos productos químicos o el compuesto como la contaminación del agente aditivo de alimentos, farmacéutico compuestos, compuestos exógenos ambientales y así sucesivamente.
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Protocol
El protocolo sigue las pautas de cuidado de los animales del Comité de ética Animal del centro de Beijing para la prevención de enfermedades y el Control en China.
1. química preparación
- Obtener productos químicos (tabla 1 y Tabla de materiales).
- Determinar la dosis más alta y más baja de los productos químicos individuales para una concentración mínima del 100% de mortalidad (LC100, 24 h) y una concentración máxima de 100% nonlethality (LC0, 24 h) a los gusanos. Use al menos seis diluciones de la mayor concentración (tabla 1).
Nota: Realizar un gusano preliminar mortalidad prueba9 para explorar LC100 y LC0 para un nuevo producto químico, para determinar la dosificación. - Diluir cada sustancia con K-medio (Tabla de materiales) a 2 x la concentración requerida. Uso K-medio como control para comparar las alteraciones del fenotipo causadas por los productos químicos.
- Por ejemplo, preparar 7 concentraciones gradiente de cloruro de cadmio (CdCl2) (tabla 1). Para preparar 2 x la solución acuosa concentrada más alta (4,64 mg/mL), disolver 92,8 mg de CdCl2 polvo sólido en 8 mL de medio de K y completar hasta 10 mL después de que el polvo se haya disuelto completamente. Preparar los otros niveles de concentración por dilución en medio K.
- Preparar ocho pozos paralelos para cada concentración en el gradiente químico. Bien, cada una contiene 50 μl de la 2 x solución química. Preparar al menos tres grupos de ocho pozos paralelos de K medianas como controles (tabla 2).
Nota: en breve, un volumen de 500 μl de 2 x solución de trabajo es necesario para una sola dosis de cada sustancia química.
2. gusano preparación
- Obtener gusanos de N2 de tipo salvaje y cepas de Escherichia coli OP50 desde el centro de genética de Caenorhabditis (CGC).
- Obtener gusanos L4 sincronizados.
- Escoge una sola Colonia de OP50 de e. coli de la placa de la raya. Inocular la colonia de 100 mL de LB caldo asépticamente y crecer durante la noche a 37 ° C.
Nota: La solución de e. coli OP50 está ahora lista para la siembra a placas de medio (NGM, Tabla de materiales) de crecimiento nematodos. - Vierta NGM en una placa de Petri de plástico de 90 mm. Semilla cada placa con 300 μL de solución de e. coli OP50 el día después de verter. Incubar gusanos de N2 en las planchas NGM con OP50 a 20 ° C durante 2-3 días, hasta que la mayoría de los gusanos ha llegado a la etapa adulta.
- Cosecha de gusanos grávidos en un tubo de centrifugadores cónicos estériles de 15 mL estéril de H2O. Que los gusanos asentarse durante al menos 2 minutos, aspirar la H2O y añadir 5 mL de solución de lejía (Tabla de materiales).
- Vórtice el tubo durante 5 minutos, girar el tubo durante 30 s (a 1.300 x g) a los huevos de la pelotilla y descarte el sobrenadante.
- Lavar los huevos con 5 mL de H2O y vórtice estéril el tubo por 5 s. Centrifugar el tubo durante 30 s (a 1.300 x g), eliminar el sobrenadante y lavar otra vez.
- Pipetear los huevos en un plato nuevo de NGM con OP50. Incubar a 20 ° C. Controlar el tramado L1 gusanos a la mañana siguiente; los gusanos se llega a la etapa de L4 en aproximadamente 40 h.
- Escoge una sola Colonia de OP50 de e. coli de la placa de la raya. Inocular la colonia de 100 mL de LB caldo asépticamente y crecer durante la noche a 37 ° C.
- Lave los gusanos L4 de las placas de Petri de 90 mm con medio de K en un tubo cónico estéril de 50 mL. Ajustar la concentración de gusanos a ~ 40 animales por 100 μl de medio de K bajo un estereomicroscopio. Añadir 50 μl (~ 20 gusanos) en cada pocillo de la placa de 384 pozos. Estos gusanos sincronizados (etapa L4) están listos para el siguiente tratamiento por sustancias químicas.
3. química tratamiento y captura de vídeo
Nota: En una placa de 384 pozos, gusanos (50 μL en cada pocillo) tratan a seis a siete dosis de una sustancia química individual (tabla 1). Preparar ocho pozos paralelos, cada uno con 50 μl de la 2 x solución química para cada dosis (ocho pozos están llenos de la misma química y la misma concentración, tabla 2). Todos los vídeos son recogidos utilizando una cámara digital conectada a un microscopio invertido (Tabla de materiales). El experimento de tratamiento químico dura 24 h. No agregue alimentos bacteriana a cada pocillo durante el experimento de tratamiento químico de 24 h.
- Antes de añadir los productos químicos, coloque la placa de 384 pocillos con los gusanos sincronizados en la etapa automática y grabar vídeos de cada pozo con el procedimiento de adquisición programada (7 cuadros por segundo para 2 s; tarda ~ 25 min para escanear cada placa).
- Añada 50 μl de la 2 x acción química preparada según la sección 1 para cada pozo (tabla 2). Ajustar el tiempo como el punto de 0 h.
- Incubar la placa de 384 pozos a 20 ° C y agitar a 80 rpm en un agitador incubador.
- Retire la placa de la incubadora y transferirlo a una etapa automática. Tomar videos de cada pocillo de la placa entera, a las 12 h y a las 24 h, para comprobar los fenotipos de los gusanos para cada tratamiento químico específico en medio de K. Aproximadamente 25 minutos son necesarios para la pantalla de una placa.
4. procesamiento de vídeo del experimento
Nota: Un programa de video experimental y procesamiento de imágenes fue escrito y empaquetado. Se puede descargar libremente (véase Tabla de materiales). El video experimental se almacena en forma de una secuencia de marcos de imagen, y la secuencia de fotogramas de cada vídeo se almacena en un directorio específico. El programa puede reconocer gusanos y cuantificar fenotipos automáticamente.
- En la interfaz gráfica de usuario (GUI, figura 1), agregue los parámetros, tales como el directorio de secuencia de marco, el directorio de salida, el parámetro de tamaño de gusano y el parámetro de umbral de movimiento. Haga clic en el botón analizar para procesar las imágenes experimentales.
- Haga clic en el botón seleccionar para elegir el directorio de imágenes de origen.
- Añada el directorio de resultado medio en la interfaz.
Nota: Los resultados mediados incluyen las imágenes segmentadas. Estos resultados mediados son útiles para la observación visual de las imágenes procesadas. - Añada el directorio de resultado final en la interfaz.
- Añadir el parámetro de tamaño medio gusano en el cuadro de texto Tamaño de gusano en la interfaz.
Nota: El parámetro de tamaño utilizado en los experimentos es 2.000. - Agregar el umbral de proporción movido en la interfaz.
Nota: La proporción utilizada en los experimentos es 0,93. - Haga clic en el botón analizar para comenzar el proceso de imagen. Haga clic en el botón de Reset para borrar los parámetros añadidos.
Nota: Hay 33 características definidas y cuantificadas para gusanos. Todos los fenotipos definidos están ordenados por categorías (enumeradas en la tabla 3). Estas características se pueden cuantificar de imágenes experimentales. Una comparación cuantitativa entre diferentes productos químicos, que tienen diferentes efectos secundarios, puede hacerse mediante la comparación de estas características.
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Representative Results
Hemos probado los fenotipos de gusanos expuestos a diferentes concentraciones de más de 10 productos químicos12. En la prueba, se cuantificaron 33 características distintas para cada producto químico compuesto en tres puntos del tiempo (0 h, 12 h y 24 h). Anteriormente, una comparación entre un manual y un análisis automático de un ensayo de vida útil se realizó11,12. En este ensayo, se encontró que los productos químicos y concentraciones pueden influir en los fenotipos de gusano. Un resumen de este método se muestra en la figura 2.
Los resultados (figura 3 y figura 4c, d) demostraron que los gusanos murieron rápidamente como la concentración de productos química aumentó. En concentraciones más altas, los gusanos se convirtieron en más rectos y menos curvadas que en concentraciones más bajas o en los grupos de control (figura 3 y figura 4b). Al principio (a 0 h), no hubo ninguna diferencia significativa entre el control (K-medio) y tratamientos químicos para todos los fenotipos. Después de 12 h de tratamiento con una dosificación química dada, los fenotipos de gusanos mostraron diferentes grados de diferencias entre grupos de diferente concentración y control. Por ejemplo, la longitud del eje mayor aumentado tiempo aumentado. También hay una tendencia gradiente de menor a mayores concentraciones de químicas. La tendencia de la gradiente de concentraciones químicas también fue significativa en la longitud del eje menor (figura 4a, b).
En este ensayo, motilidad del gusano se calculó de dos maneras, basadas en la zona del gusano se movió en y la relación de movilidad (figura 4c, d). Resultados de la movilidad de ambas maneras mostraron patrones similares. No hubo diferencias significativas de la motilidad de gusano entre grupos de control al principio (en el momento 0 h) y diferentes concentraciones. Paso del tiempo, los gusanos en los grupos de control mostró una estable disminución de la motilidad. A las 12 h, los gusanos que experimentaron tratamientos químicos a diferentes concentraciones mostraron diferencias significativas en la motilidad en comparación con grupos control. Además, los gusanos bajo tratamientos de concentración mayor demostraron movilidad débil en comparación con los gusanos bajo tratamientos de concentración menor. Esto indica que gusanos bajo tratamientos de concentración más alta se convirtió en menos móviles y muerto más rápido (figura 4c, d). Estos resultados sugieren que el método diseñado es útil para la evaluación de la toxicidad química, y los fenotipos cuantificables de C. elegans son marcadores útiles para la identificación de la toxicidad química.
Figura 1 : La interfaz del programa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : La tubería de un análisis de alto rendimiento para la predicción de toxicidad química por perfiles fenotípicos automatizado de elegans de Caenorhabditis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Imágenes experimentales de gusanos 4,64 mg/mL CdCl2 (panel superior), 0,464 mg/mL CdCl2 (panel central) y K-medianas (panel inferior), en momentos diferentes. Las imágenes muestran los cambios de estado de gusanos bajo tratamiento químico o en un grupo control de un bien representativo de la placa de 384 pozos a través del tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Las características cuantificables de gusanos bajo diferentes concentraciones de CdCl2. (a) la longitud del eje mayor cuantificados. (b) la longitud del eje menor cuantificada. zona (c) la motilidad cuantificada por la movida. tamaño del área y gusanos (d) la motilidad cuantificada por la movida. La barra de diagramas muestran la cuantificación promedio para cada función en gusanos solo. Las barras de error representan ± desviación estándar (SD). La unidad de concentración = mg/mL. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: concentración de exposición de 10 productos químicos para la placa de 384 pozos C. elegans Test toxicidad aguda.
Tabla 2: Un esquema de la disposición de la placa de 384 pozos.
Tabla 3: Definir fenotipos de gusanos.
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Discussion
Las ventajas de la C. elegans han conducido a su creciente uso en toxicología9, para el estudio de mecanismos y métodos de cribado de alto rendimiento. Un papel creciente para C. elegans en complementar otros sistemas modelo en la investigación toxicológica ha sido notable en los últimos años, especialmente para la evaluación rápida de la toxicidad de nuevos productos químicos. Este artículo proporciona un nuevo ensayo de cribado de alto rendimiento, cuantitativa del gusano fenotipos en una placa de 384 pozos para la identificación automática y la evaluación de toxicidad química. Este ensayo es ideal para las pruebas de toxicidad aguda de los productos químicos dentro de las 24 h, y podría aplicarse a toxicidad subaguda pruebas así más puntos de tiempo de los datos se recogen y fuente de alimento (OP50) se suministra para los gusanos.
El medio utilizado para diluir los productos químicos puede variar; elegimos K-medio en el ensayo haciendo referencia a Sofieet al. 13. gusanos fueron cultivados en medio de K en los grupos de tratamiento el control y la química. Una solución de agua dulce artificial o en suelo con baja fuerza iónica puede ser alternativas al medio de K.
Productos químicos con toxicidad diferente pueden alterar los fenotipos de C. elegans en diversos patrones. Productos químicos utilizados en esta prueba fueron seleccionados de las categorías tercera a sexta del sistema mundialmente armonizado de clasificación y etiquetado de productos químicos (GHS). C. elegans fueron expuestos a productos químicos de seis o más niveles de dosificación, que cubre el rango de dosificación de mortalidad de 0% - 100%. Para las sustancias químicas con solubilidad de agua baja, DMSO se recomienda promover la disolución química en el agua. Como una alta concentración de DMSO puede afectar el desarrollo del gusano y vida útil14, no más que 0.2% DMSO debe utilizarse para las pruebas acuáticas.
Las características automáticamente cuantificadas muestran diferencias significativas entre diferentes toxicidades, que demuestra que estos fenotipos cuantificables de gusanos son muy útiles en la identificación de la toxicidad de productos químicos. Indicó que los perfiles fenotípicos revelaban conservadas funciones clasificar y predecir la toxicidad de los diferentes productos químicos utilizando nematodos C. elegans como organismo modelo en vivo.
El programa estadounidense de Toxicología Nacional (NTP) estableció la comunidad Tox21 a través de un memorando de entendimiento con la Agencia de protección ambiental de Estados Unidos (EPA) y el centro de genómica de institutos nacionales de salud (NIH) químico, ahora el Centro Nacional de Avance de las Ciencias traslacionales (NCATS). Tox21 utiliza detección in vitro de alto rendimiento y modelo animal alternativa in vivo pruebas para identificar los mecanismos de toxicidad, para dar prioridad a productos químicos para ensayos de toxicidad in vivo adicional y para desarrollar modelos predictivos de las respuestas toxicológicas humanas. Como parte de ese esfuerzo, C. elegans fue utilizado para ToxCast fase la EPA I y fase II bibliotecas, que contienen productos químicos 292 y 676, respectivamente, para los productos químicos a disminución de desarrollo y crecimiento larvario15. La plataforma COPAS (complejo objeto analizador paramétrico y compaginador) también se ha utilizado para la evaluación toxicológica de gusano estudios2. Sin embargo, la plataforma COPAS sólo cuantifica algunas características, tales como ancho de gusano, gusano largo y la intensidad de fluorescencia. Este método es una mejora a los métodos actuales con gusanos rápidamente evalúe la toxicidad de nuevos productos químicos.
Hay varios pasos críticos dentro del Protocolo: la cultura de gusano en una placa de 384 pozos, el tratamiento químico, la captura de imagen experimental y la cuantificación de fenotipo. En comparación con métodos de evaluación de toxicidad tradicionales, este protocolo puede cuantificar algunos fenotipos de gusanos que son difíciles de calcular manualmente y útiles para reflejar la toxicidad de cada sustancia, tales como la motilidad de gusano, gusano ancho, tamaño del gusano y gris intensidad. Claramente, este ensayo de alto rendimiento para la predicción de toxicidad química será un enfoque de modelo de toxicidad importante y podría ser utilizado para la preselección de productos químicos antes de los experimentos con animales roedores.
En Resumen, esta técnica abre un camino en evaluación de la toxicidad rápida en múltiples áreas. Los investigadores podrían aplicar el método a la emergencia análisis de toxicidad en toxicosis transmitidas por los alimentos, la evaluación de seguridad de compuestos farmacéuticos, así como la evaluación de toxicidad aguda y detección de nuevos productos químicos y compuestos exógenos ambientales.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen la CGC amablemente envío de C. elegans. Este trabajo fue apoyado por nacional clave de investigación y programa de desarrollo de China (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705) Fundación Nacional de Ciencias naturales de China Grant (#31401025, #81273108, #81641184), el Capital salud investigación y desarrollo de proyectos especiales en Pekín (#2011-1013-03), el fondo de la abertura del Beijing clave laboratorio de Toxicología Ambiental (# 2015HJDL03) y la Fundación de Ciencias naturales de la provincia de Shandong, China (ZR2017BF041).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 59300 | |
| 384-well plates | Throme | 142761 | |
| Agar | Bacto | 214010 | |
| Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | PHL80892 | |
| Bleach buffer | 0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water | ||
| Cadmium chloride | Sigma-Aldrich | 202908 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 21074 | |
| CCD camera | Zeiss | AxioCam HRm | Zeiss microscopy GmbH |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma-Aldrich | 451657 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 24105 | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| K-Medium | 3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water | ||
| LB Broth | 10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| NGM Plate | 3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer | ||
| Peptone | Bacto | 211677 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 60130 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 795496 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| PPB buffer | 35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water | ||
| shaker | ZHICHENG | ZWY-200D | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | s7920 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71690 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 239305 | |
| The link of program | https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate | ||
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | |
| Zeiss automatic microscope | Zeiss | AXIO Observer.Z1 | Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera |
References
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