Summary
Un metodo quantitativo è stato sviluppato per identificare e prevedere la tossicità acuta dei prodotti chimici analizzando automaticamente l'analisi fenotipica dei Caenorhabditis elegans. Questo protocollo descrive come trattare vermi con prodotti chimici in una piastra 384 pozzetti, catturare video e quantificare tossicologici fenotipi correlati.
Abstract
L'applicazione di test di tossicità delle sostanze chimiche negli organismi superiori di ordine, come topi o ratti, è lungo e costoso, grazie alla loro lunga durata di vita e problemi di manutenzione. Al contrario, il nematode Caenorhabditis elegans (c. elegans) presenta vantaggi per renderlo la scelta ideale per i test di tossicità: una vita relativamente breve, facile coltivazione e riproduzione efficiente. Qui, descriviamo un protocollo per la profilazione fenotipica automatica di c. elegans in una piastra 384 pozzetti. I vermi del nematode sono coltivati in una piastra 384 pozzetti con trattamento medio e chimico liquidi e video è presi di ciascun pozzetto per quantificare l'influenza chimica su 33 caratteristiche di verme. Risultati sperimentali dimostrano che le caratteristiche di fenotipo quantificati possono classificare e prevedere la tossicità acuta di diversi composti chimici e stilare un elenco di priorità per ulteriori prove di valutazione di tossicità chimica tradizionale in un modello del roditore.
Introduction
Con il rapido sviluppo di composti chimici applicato alla produzione industriale e la vita quotidiana delle persone, è importante studiare la tossicità test di modelli per le sostanze chimiche. In molti casi, il modello animale roditore è impiegato per valutare la potenziale tossicità di diverse sostanze chimiche sulla salute. In generale, la determinazione delle concentrazioni letali (cioè, la dosati 50% dose letale [LD50] di diverse sostanze chimiche) è utilizzata come parametro tradizionale in un modello di roditore (ratto/topo) in vivo, che è molto costoso e richiede tempo. Inoltre, a causa della riduzione, affinare, o sostituire il principio di (3R) che è centrale per etica e sul benessere degli animali, nuovi metodi che consentono per la sostituzione degli animali superiori sono preziose per la ricerca scientifica1,2,3 . C. elegans è un nematode dissipato che è stato isolato dal suolo. È stato ampiamente utilizzato come un organismo di ricerca in laboratorio per le sue caratteristiche benefiche, come una vita relativamente breve, facile coltivazione e riproduzione efficiente. Inoltre, molte vie biologiche fondamentali, tra cui processi fisiologici di base e le risposte di sforzo in c. elegans, sono conservate nei più alti mammiferi4,5,6,7 , 8. in un paio di confronti noi ed altri abbiamo fatto, c'è una buona concordanza tra tossicità di c. elegans e tossicità osservati in roditori9. Tutto ciò fa di c. elegans un buon modello per testare gli effetti di tossicità chimica in vivo.
Recentemente, alcuni studi quantificato le caratteristiche fenotipiche di c. elegans. Le caratteristiche possono essere utilizzate per analizzare la tossicità dei prodotti chimici2,3,10 e l'invecchiamento dei vermi11. Abbiamo anche sviluppato un metodo che combina un verme liquido coltura sistema e un sistema di analisi di immagine, in cui i vermi sono coltivati in una piastra 384 pozzetti in diversi trattamenti chimici12. Questa tecnica quantitativa è stata sviluppata per analizzare automaticamente i 33 parametri di c. elegans dopo 12-24h di trattamento chimico in una piastra 384 pozzetti con mezzo liquido. Una fase di microscopio automatizzato viene utilizzata per l'acquisizione dei video sperimentali. I video vengono elaborati da un programma di misura, e sono quantificati 33 caratteristiche relazionati al comportamento commovente ai vermi. Il metodo viene utilizzato per quantificare i fenotipi di vite senza fine nell'ambito del trattamento di 10 composti. I risultati mostrano che le diverse tossicità possono alterare i fenotipi di c. elegans. Questi fenotipi quantificati possono essere utilizzati per identificare e prevedere la tossicità acuta di diversi composti chimici. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di facilitare l'osservazione e la quantificazione fenotipica degli esperimenti con c. elegans in una coltura liquida. Questo metodo è utile per l'applicazione di c. elegans in valutazioni di tossicità chimica e quantificazioni di fenotipo, che aiutano a prevedere la tossicità acuta di diversi composti chimici e stabilire una lista di priorità per ulteriori tradizionale test di valutazione di tossicità chimica in un modello del roditore. Inoltre, questo metodo può essere applicato alla tossicità di screening e test di nuove sostanze chimiche o il composto come l'inquinamento agente additivo alimentare, composti farmaceutici, composti esogeni ambientali e così via.
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Protocol
Il protocollo segue le indicazioni di cura degli animali del Comitato di etica animale del centro di Pechino per la prevenzione e il controllo in Cina.
1. preparazione chimica
- Ottenere prodotti chimici (tabella 1 e Tabella materiali).
- Determinare il dosaggio più alto e più basso dei singoli prodotti chimici per una concentrazione minima di 100% letalità (LC100, 24 h) e una concentrazione massima del 100% nonlethality (LC0, 24 h) alle viti senza fine. Utilizzare almeno sei diluizioni della più alta concentrazione (tabella 1).
Nota: Condurre un verme preliminare letalità prova9 per esplorare LC100 e LC0 per un nuovo prodotto chimico, per determinare il dosaggio. - Diluire ciascuna sostanza chimica con K-medie (Tabella materiali) a 2 volte la concentrazione necessaria. Utilizzare K-medie come controllo per confrontare le alterazioni del fenotipo causate dai prodotti chimici.
- Ad esempio, preparare gradiente 7 concentrazioni di cloruro di cadmio (CdCl2) (tabella 1). Per preparare 2 x soluzione acquosa concentrata più alta (4,64 mg/mL), sciogliere 92,8 mg di CdCl2 polvere solida in 8 mL di K-medie e riempire fino a 10 mL dopo la polvere si è sciolta completamente. Preparare gli altri livelli di concentrazione mediante diluizione con K-medie.
- Preparare otto pozzi paralleli per ogni concentrazione del gradiente chimico. Ciascun pozzetto contiene 50 µ l di soluzione chimica di 2x. Preparare almeno tre gruppi di otto pozzi paralleli di K-medie come controlli (tabella 2).
Nota: In breve, un volume di 500 µ l di soluzione di lavoro: 2x è necessario per una dose singola di ogni prodotto chimico.
2. preparazione verme
- Ottenere il selvaggio-tipo N2 worm e ceppi di Escherichia coli OP50 da Caenorhabditis Genetics Center (CGC).
- Ottenere sincronizzato L4 vermi.
- Scegliere una singola colonia di Escherichia coli OP50 dalla piastra di striscia. Asetticamente inoculare la Colonia in 100 mL di brodo LB e crescere in una notte a 37 ° C.
Nota: La soluzione di e. coli OP50 è ora pronta per la semina a piatti di mezzo (NGM, Tabella materiali) di sviluppo del nematode. - Versare NGM in una plastica piastra di Petri di 90 mm. Semi di ogni piatto con 300 µ l di soluzione di Escherichia coli OP50 il giorno dopo la colata. Incubare N2 vermi sulle piastre NGM con OP50 a 20 ° C per circa 2-3 giorni fino a quando la maggior parte dei vermi hanno raggiunto lo stadio adulto.
- Worm gravid raccolto in una provetta sterile conica per centrifuga 15 mL con sterile H2O. Lasciate che i vermi stabilirsi per almeno 2 min, aspirare l' H2O e aggiungere 5 mL di tampone di candeggina (Tabella materiali).
- Vortex la provetta per 5 minuti, girare il tubo per 30 s (a 1.300 x g) per le uova di pellet e scartare il surnatante.
- Lavare le uova con 5 mL di H2O sterile e vortexare la provetta per 5 s. Centrifugare la provetta per 30 s (a 1.300 x g), rimuovere il surnatante e lavare nuovamente.
- Le uova su un piatto nuovo NGM con OP50 una pipetta. Li Incubare a 20 ° C. Monitorare i vermi L1 tratteggiati la mattina successiva; i vermi raggiungerà la fase L4 in circa 40 h.
- Scegliere una singola colonia di Escherichia coli OP50 dalla piastra di striscia. Asetticamente inoculare la Colonia in 100 mL di brodo LB e crescere in una notte a 37 ° C.
- Lavare i vermi L4 fuori le piastre di Petri di 90 mm con K-medie in una provetta conica sterile 50 mL. Regolare la concentrazione di vermi a ~ 40 animali per 100 µ l di K-medie sotto un microscopio stereoscopico. Aggiungere 50 µ l (~ 20 vermi) in ciascun pozzetto della piastra 384 pozzetti. Questi vermi sincronizzati (fase L4) sono pronti per il seguente trattamento di sostanze chimiche.
3. chimica trattamento e acquisizione video
Nota: In un piatto di 384 pozzetti, vermi (50 µ l in ogni pozzetto) sono trattati a sei a sette dosi di una sostanza chimica individuale (tabella 1). Preparare otto pozzi paralleli, ciascuno contenente 50 µ l di 2x soluzione chimica per ogni dosaggio (otto pozzi sono riempiti con lo stesso prodotto chimico e la stessa concentrazione, tabella 2). Tutti i video sono raccolti utilizzando una fotocamera digitale collegata al microscopio invertito (Tabella materiali). L'esperimento di chimica trattamento dura per 24 h. Non aggiungere cibo batterico in ciascun pozzetto durante l'esperimento di trattamento chimico di 24 h.
- Prima di aggiungere i prodotti chimici, porre la piastra 384 pozzetti con i vermi sincronizzati sulla scena automatico e prendere i video di ciascun pozzetto con la procedura di acquisizione programmata (7 fotogrammi al secondo per 2 s; prende ~ 25 min per eseguire la scansione ogni piatto).
- Aggiungere 50 µ l di 2x chimica brodo preparato conformemente al punto 1 per ciascun pozzetto (tabella 2). Impostare il tempo come il punto h 0.
- Incubare la piastra 384 pozzetti a 20 ° C e agitare a 80 rpm in un agitatore incubatore.
- Rimuovere la piastra dall'incubatrice e trasferirlo in una fase automatica. Prendere i video di ciascun pozzetto della piastra intera, alle ore 12 e a 24 h, per controllare i fenotipi dei vermi per ogni specifico trattamento chimico in K-medie. Circa 25 min sono necessari per schermo piatto.
4. elaborazione video esperimento
Nota: Un programma per elaborazione di immagini e video sperimentali è stato scritto e confezionato. Può essere liberamente scaricato (Vedi Tabella materiali). Il video sperimentale è memorizzato sotto forma di una sequenza di frame di immagine, e la sequenza di fotogrammi di ogni video è memorizzata in una directory specifica. Il programma è in grado di riconoscere il worm e quantificare fenotipi automaticamente.
- Nell'interfaccia utente grafica (GUI, Figura 1), aggiungere i parametri, ad esempio la directory di sequenza di frame, la directory di output, il parametro di dimensione del verme e il parametro di soglia di movimento. Fare clic sul pulsante Analyze per elaborare le immagini sperimentali.
- Fare clic sul pulsante Seleziona per scegliere la directory di immagini di origine.
- Aggiungere la directory di risultato intermedio nell'interfaccia.
Nota: I risultati centrali includono le immagini segmentate. Questi risultati centrali sono utili per l'osservazione visiva delle immagini elaborate. - Aggiungere la directory di risultato finale nell'interfaccia.
- Aggiungere il parametro di dimensione medio verme nella casella Dimensione del verme nell'interfaccia.
Nota: Il parametro di dimensione utilizzato negli esperimenti è 2.000. - Aggiungere la soglia del rapporto spostato nell'interfaccia.
Nota: Il rapporto utilizzato negli esperimenti è 0,93. - Fare clic sul pulsante analizza per avviare l'elaborazione di immagini. Fare clic sul pulsante Reset per cancellare i parametri aggiunti.
Nota: Ci sono 33 caratteristiche definito e quantificato per i vermi. Tutti i fenotipi definiti sono ordinati per categorie (riportate nella tabella 3). Queste caratteristiche possono essere quantificate dalle immagini sperimentali. Un confronto quantitativo tra diverse sostanze chimiche, che hanno diversa tossicità, può essere fatto confrontando queste caratteristiche.
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Representative Results
Abbiamo testato i fenotipi di vermi esposti a diverse concentrazioni di più di 10 prodotti chimici12. Nel test, 33 caratteristiche distinte sono state quantificate per ogni composto a tre intervalli di tempo (h 0, 12h e 24h) chimico. In precedenza, un confronto tra un manuale e un'analisi automatica di un test di durata della vita è stato fatto11,12. In questa analisi, abbiamo trovato che prodotti chimici e le concentrazioni possono influenzare i fenotipi di verme. Una panoramica di questo metodo è illustrata nella Figura 2.
I risultati (Figura 3 e Figura 4c, d) hanno mostrato che i vermi morirono rapidamente come la concentrazione chimica aumentata. A concentrazioni più elevate, i vermi sono diventato più dritti e meno curvo rispetto alle concentrazioni più basse o nei gruppi di controllo (Figura 3 e Figura 4b). All'inizio (a 0 h), non c'era differenza significativa fra il controllo (medio-K) e trattamenti chimici per tutti i fenotipi. Dopo 12 h di trattamento con un determinato dosaggio chimico, i fenotipi di vermi ha mostrato diversi gradi di differenze tra gruppi di diversa concentrazione e controllo. Ad esempio, la lunghezza dell'asse maggiore aumentato come tempo aumentato. C'è anche una tendenza gradiente da inferiore alle più alte concentrazioni chimiche. La tendenza gradiente delle concentrazioni chimiche differenti è stato anche significativa nella lunghezza asse minore (Figura 4a, b).
In questo test, motilità del verme è stata calcolata in due modi, basati sulla zona il worm si trasferì nel e il rapporto di motilità (Figura 4c, d). Risultati di motilità di entrambi i modi ha mostrato i simili modelli. Non c'erano differenze significative della motilità verme tra concentrazioni differenti e gruppi di controllo all'inizio (al punto di tempo 0 h). Col passare del tempo, i vermi nei gruppi di controllo hanno mostrati una stabile diminuiscono della motilità. A 12 h, il worm che hanno subito trattamenti chimici alle concentrazioni differenti hanno mostrato differenze significative nella motilità rispetto ai gruppi di controllo. Inoltre, i vermi sotto trattamenti a più alte concentrazione ha mostrato debole motilità rispetto ai vermi sotto trattamenti a concentrazione inferiore. Questo indica che vermi sotto trattamenti a più alte concentrazione è diventato meno motili e morironopiù rapido (Figura 4c, d). Questi risultati indicano che il metodo progettato è utile per le valutazioni di tossicità chimica, e i fenotipi quantificati di c. elegans sono indicatori utili per l'identificazione di tossicità chimica.
Figura 1 : L'interfaccia del software. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : La pipeline di analisi ad alta produttività per la previsione della tossicità chimica mediante profilatura fenotipica automatizzato di Caenorhabditis elegans. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Immagini sperimentali di vermi sotto 4,64 mg/mL CdCl2 (pannello superiore), 0,464 mg/mL CdCl2 (pannello centrale) e K-medie (pannello inferiore), in diversi momenti. Le immagini mostrano i cambiamenti di stato di vermi sotto trattamento chimico o in un gruppo di controllo in un pozzetto rappresentativo della piastra 384 pozzetti tutto il tempo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Le caratteristiche quantificate di vermi sotto diverse concentrazioni di CdCl2. (a) la lunghezza dell'asse maggiore quantificati. (b) la lunghezza dell'asse minore quantificati. zona (c) la motilità quantificata da spostato. dimensione di zona/vite senza fine (d) la motilità quantificata da spostato. Il bar grafici mostrano la quantificazione media per ogni funzionalità di vermi singoli. Le barre di errore indicano ± deviazione standard (SD). L'unità di concentrazione = mg/mL. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: concentrazione di esposizione di 10 prodotti chimici per la piastra a 384 pozzetti C. elegans test di tossicità acuta.
Tabella 2: Schema del layout piastra 384 pozzetti.
Tabella 3: Definito fenotipi di vermi.
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Discussion
I vantaggi di c. elegans hanno portato al suo utilizzo crescente in tossicologia9, sia per studi meccanicistici e approcci di screening ad alta resa. Un ruolo maggiore per c. elegans nell'integrare altri sistemi di modello nella ricerca tossicologica è stato notevole negli ultimi anni, soprattutto per la valutazione della tossicità rapida di nuove sostanze chimiche. Questo articolo fornisce una nuova analisi di screening ad alta resa, quantitativa del worm fenotipi in una piastra 384 pozzetti per l'identificazione automatica e la valutazione della tossicità chimica. Questo test è ideale per test di tossicità acuta di sostanze chimiche all'interno di 24 h, e potrebbe essere applicato a tossicità subacuta test anche quando più tempo punti di dati vengono raccolti e fonte di cibo (OP50) viene fornito per i vermi.
Il mezzo utilizzato per diluire le sostanze chimiche possa variare; Abbiamo scelto il K-medie nel dosaggio facendo riferimento a Sofieet al. 13. worm sono stati coltivati in K-medie nei gruppi di trattamento chimico sia il controllo. Una soluzione di acqua dolce artificiale o una soluzione di suolo con forza ionica bassa potrebbe essere alternative al K-medie.
Prodotti chimici con diversa tossicità possono alterare i fenotipi di c. elegans in diversi modelli. Prodotti chimici utilizzati in questo test sono stati scelti dal terzo al sesto categorie del sistema mondiale armonizzato di classificazione e di etichettatura delle sostanze chimiche (GHS). C. elegans sono stati esposti a sostanze chimiche a sei o più livelli di dosaggio, che copriva l'intervallo di dosaggio di mortalità 0% - 100%. Per quelle sostanze chimiche con bassa solubilità in acqua, DMSO è consigliato per promuovere la dissoluzione chimica in acqua. Come un'alta concentrazione di DMSO può influenzare lo sviluppo della vite senza fine e durata della vita14, non più di 0,2% DMSO dovrebbe essere usato per i test di acquatica.
Le caratteristiche automaticamente quantificate mostrano la differenza significativa tra le diverse tossicità, che dimostra che questi fenotipi quantificati di vermi sono molto utili nell'identificare la tossicità delle sostanze chimiche. Ha indicato che analisi fenotipica ha rivelato conservate funzioni di classificare e di prevedere la tossicità dei prodotti chimici differenti utilizzando del nematode c. elegans come organismo modello in vivo.
La US National Toxicology Program (NTP) stabilirono la comunità di Tox21 attraverso un protocollo d'intesa con l'US Environmental Protection Agency (EPA) e il centro di genomica chimico National Institutes of Health (NIH), ora il centro nazionale per Avanzando traslazionale Sciences (NCATS). Tox21 utilizza high throughput screening in vitro e in vivo alternativo modello animale test per identificare i meccanismi di tossicità, la priorità di prodotti chimici per test di tossicità in vivo ulteriori e per sviluppare modelli predittivi delle risposte tossicologiche umane. Come parte di tale sforzo, c. elegans è stato utilizzato per lo screening ToxCast fase dell'EPA ho e librerie di fase II, che contengono sostanze chimiche 292 e 676, rispettivamente, per le sostanze chimiche che conducono alla diminuita crescita e lo sviluppo larvale15. La piattaforma COPAS (complesso oggetto parametrico Analyzer e Sorter) inoltre è stata usata per lo screening tossicologico verme studia2. Tuttavia, la piattaforma COPAS quantifica solo alcune caratteristiche, come larghezza di verme, verme lunghezza e l'intensità di fluorescenza. Questo metodo è un miglioramento ai metodi corrente utilizzando worm per preselezione rapidamente la tossicità di nuove sostanze chimiche.
Ci sono diversi passaggi critici all'interno del protocollo: la cultura della vite senza fine in una piastra 384 pozzetti, il trattamento chimico, la cattura dell'immagine sperimentale e la quantificazione di fenotipo. Rispetto ai metodi di valutazione tradizionali tossicità, questo protocollo può quantificare alcuni fenotipi di vermi che sono difficili da calcolare manualmente e utili per riflettere le tossicità di ogni sostanza chimica, come la motilità verme verme larghezza, dimensione del verme e grigio intensità. Chiaramente, questo test ad alta produttività per la previsione della tossicità chimica sarà un approccio modello prezioso tossicità e potrebbe essere utilizzato per il prescreening di sostanze chimiche prima di roditore esperimenti sugli animali.
In sintesi, questa tecnica apre un modo sulla valutazione della tossicità rapida nelle zone multiple. I ricercatori potrebbero applicare il metodo per l'analisi di emergenza di tossicità in tossicosi di origine alimentare, la valutazione della sicurezza dei composti farmaceutici, nonché la proiezione di tossicità acuta e rilevazione di nuove sostanze chimiche e ambientali composti esogeni.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano CGC per gentilmente inviare il c. elegans. Questo lavoro è stato supportato da nazionali chiave di ricerca e sviluppo programma della Cina (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705); Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina Grant (#31401025, #81273108, #81641184), capitale salute ricerca e sviluppo di un progetto speciale a Pechino (#2011-1013-03), il fondo di apertura del laboratorio di tossicologia ambientale (# chiave Beijing 2015HJDL03) e la Fondazione di scienze naturali della provincia di Shandong, Cina (ZR2017BF041).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 59300 | |
| 384-well plates | Throme | 142761 | |
| Agar | Bacto | 214010 | |
| Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | PHL80892 | |
| Bleach buffer | 0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water | ||
| Cadmium chloride | Sigma-Aldrich | 202908 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 21074 | |
| CCD camera | Zeiss | AxioCam HRm | Zeiss microscopy GmbH |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma-Aldrich | 451657 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 24105 | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| K-Medium | 3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water | ||
| LB Broth | 10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| NGM Plate | 3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer | ||
| Peptone | Bacto | 211677 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 60130 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 795496 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| PPB buffer | 35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water | ||
| shaker | ZHICHENG | ZWY-200D | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | s7920 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71690 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 239305 | |
| The link of program | https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate | ||
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | |
| Zeiss automatic microscope | Zeiss | AXIO Observer.Z1 | Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera |
References
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