Summary
المزيج من مجهر إلكتروني وتوصيل في الرحم ونهج قوية لدراسة التغييرات الشكلية في أولتراستروكتوري جيد للجهاز العصبي أثناء التطوير. يسمح هذا الأسلوب الجمع بين الأفكار العميقة إلى تغييرات في التفاصيل الهيكلية الكامنة وراء أعصاب فيما يتعلق بتمثيلها الطوبوغرافية.
Abstract
هذه الدراسة يجمع بين توصيل في الرحم مجهر إلكتروني (TEM) تهدف إلى إجراء تحليل دقيق مورفوميتريكال المعلمات ultrastructural في هياكل الطوبوغرافية التي تم تحديدها على نحو لا لبس فيه، المتأثرين بروتين للفائدة أن يتم إدخال في الكائن الحي عن طريق نقل الفيروس. يسمح هذا النهج الموحد لانتقال سلس من ماكروستروكتورال لتحديد هوية ultrastructural بالتالي خرائط الملاحة الطوبوغرافية في أطلس أنسجة. يكشف المجهر الإلكتروني عالية الاستبانة للأنسجة في-الرحم-ترانسدوسيد أولتراستروكتوري غرامة نيوروبيل ومعلماتها اللدونة، مثل المناطق كروسسيكتيونيد بوتون متشابك، والعدد من الحويصلات متشابك والميتوكوندريا داخل بوتون الشخصية، طول اتصالات متشابك، ومناطق محواري كروسسيكتيونيد، سمك اﻷغماد المايلين، وعدد lamellae المايلين، ومناطق كروسسيكتيونيد الميتوكوندريا التشكيلات الجانبية. ويكشف تحليل هذه المعلمات الأساسية ثاقبة التغييرات من اللدونة ultrastructural في مجالات النظام العصبي التي تتأثر بنقل بنية الوراثية الفيروسية. هذا الأسلوب مجتمعة لا يمكن أن تستخدم فقط لدراسة التأثير المباشر للمهندسة وراثيا من الجزيئات الحيوية و/أو المخدرات على اللدونة العصبية ولكن أيضا يفتح إمكانية دراسة عملية الإنقاذ في الرحم من اللدونة العصبية (مثلاً، في سياق أمراض الأعصاب).
Introduction
يمكن اختراق لا فوتون عينة أنسجة سامسونج في درجة عمق إلكترون. وهذا سمات مزايا لا تقدر بثمن إلى تيم في التقاط الصور القرار نانومتر من الهياكل الدقيقة عند مقارنة بتقنيات الفحص المجهري الخفيفة. على سبيل المثال، يسمح تيم لتصور العضيات داخل الخلية مثل الميتوكوندريا والأجسام الصباغية، وأنواع مختلفة من حبيبات افرازية، ميكروتوبوليس، ميكروفيلامينتس، أهداب، زغيبات، والوصلات بين الخلايا (سطح الخلية التخصصات)، وبخاصة سينابسيس في الجهاز العصبي1،2،،من34. والهدف العام لهذه الدراسة المنهجية هو ultrastructural الاعتراف بالتغيرات في اللدونة العصبية أثناء التطوير على التدخل قبل الولادة عن طريق الجمع بين الدولة من أحدث تقنيات توصيل في الرحم وال. تم ترانسدوسيد البروتينات المرمزة فيروسي للفائدة في الرحم إلى أن الجهاز العصبي المركزي5،،من67، بما في ذلك الحبل الشوكي6. على سبيل المثال، توصيل في الرحم في تركيبة مع تيم قد استخدمت لدراسة تأثير جزيء التصاق الخلايا L1 على موتور التعلم اللدونة في الفئران تفتقر إلى المستوى 1، لا سيما فيما يتعلق بالتفاعل بين L1 والبروتينات مستقبلات النووية في7من الخلايا العصبية في الدماغ.
ويتطلب تحليل معلمات أعصاب معلومات دقيقة حول التعريب أصغر المناطق داخل الجهاز العصبي. ولذلك، فمن الملائم لوصف تفاصيل ultrastructural وميولهم الطوبوغرافية الدقيقة فيما يتعلق بالهياكل الأخرى. ويرد في هذه الدراسة، أسلوب تحضيرية محددة تهدف إلى تحقيق مفصل لمجالات المورفولوجية متميزة على أساس كل من الضوء والمجهر الإلكتروني. يجمع هذا النهج بين عدة تقنيات للتلاعب الأنسجة، بدءاً في الرحم وتوصيل الماوس المخ والحبل الشوكي، وتليها نضح التثبيت، تضمين العفن، وتجهيز الأنسجة لل. هو خطوة أساسية شملت بين التضمين وتجهيز الأنسجة لل الوثائق المتعلقة الأنسجة، واستخدام تقنية انعكاس الضوء التدخل الذي يسمح للوثائق ميكروفوتوجرافيك وتضخم منخفضة الدقة من الأنسجة العينات8،،من910. إدماج النهج الحالي، يتيح هذا الأسلوب الباحثين لدراسة التفاصيل الطوبوغرافية والهيكلية للسطوح النسيج العصبي والتشكيلات الجانبية لشريحة العينة قبل إعدادها لل.
إطار خاص لتقطيع العقول كله يناظر الإحداثيات ستيريوتاكسيك. فوائد تعمير المناطق في النسيج العصبي (3D) ثلاثي الأبعاد المورفولوجية هذا الإطار ويمكن أن تستخدم لتحليل شكلي. ماكروجرافس المقاطع تصور يتم تعيين الإحداثيات الطبوغرافية، وبناء الأقسام مرقمة تسلسلياً الخرائط في أطلس أنسجة.
بعد راتنج التجهيز، هو مقطوع الأنسجة المضمنة إلى أقسام سامسونج (< 70 نانومتر) التي تحتوي على مناطق مختارة، وفقا لخرائط الأطلس الأنسجة المذكورة أعلاه. المقاطع سامسونج يتعرضون لل للحصول على صور عالية الاستبانة للمعلمات اللدونة (مثلاً، عينة الشخصية المناطق boutons متشابك أو ألياف محواري) من محتوياتها واتصالاتها لهياكل المجاورة داخل المجمع نيوروبيل.
بالطريقة المبينة في هذا التقرير، يسمح الانتقال السلس من ماكروستروكتوريس تصور للمشاريع المتناهية الصغر والنانو دراسات متعمقة مقارنة اللدونة العصبية المورفولوجية بعد في الرحم توصيل النامية العصبي النظام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
كافة الإجراءات على الموضوعات الحيوان أقرتها لجان أخلاقيات الحيوان المؤسسية للدول الاتحادية في هامبورغ ونوردراين-فيستفالن، ألمانيا. استخدام أدوات معقمة وقفازات واقية ومعاطف العقيم طوال الإجراءات الجراحية بأكملها.
1-في توصيل الرحم
- تعد الفيروسات المرتبطة بالغدة من النوع 1 (AAV1) الترميز للهدف المنشود (4 × 1011 الفيروسية الجسيمات/ميليلتر من AAV1) في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) على درجة الحموضة 7.4. إضافة 0.1 ملغم/ميليلتر "الأخضر سريع" والحفاظ على خليط AAV1--السريع--الأخضر عند 37 درجة مئوية.
- إعداد تلميح شعرية رقيقة بالشكل المطلوب (8 ملم في الطول، مع خارج قطر 80 ميكرومتر وداخل قطرها 50 ميكرومتر)، استخدام ساحبة ميكروبيبيتي (إعدادات: الضغط = 500، الحرارة = 700، سحب = 0، السرعة = 80، وقت = 200، انظر "الجدول للمواد" ). كسر غيض شعري حيث يكون من 4-5 ملم.
- تجميع أنبوب المضخة (44 × 0.7 سم) مع طرف الشعرية ونضح 15 ميليلتر من خليط AAV1--السريع--الخضراء إلى الشعرية.
- الحفاظ على الموضوعات الحيوان في درجة حرارة جسم فسيولوجية مستمر من 37 درجة مئوية في جميع أنحاء الإجراء بأكمله.
- ضع ماوس C57Bl/6 حوامل (14.5 يوم الجنينية) في قاعة بريينكوبيشن وتخدير الماوس مع الغازي 4% إيسوفلوراني (بمعدل تدفق الهواء حجمي 0.6-0.8 لتر/دقيقة).
- تحت الجلد، حقن البوبرينورفين (0.1 مغ/كغ وزن الجسم).
- ضع الماوس أنيسثيتيزيد على لوحة العمليات الجراحية بريوارميد (37 درجة مئوية).
- تغطية العينين مع مواد تشحيم.
- تناسب الماوس مع قناع التخدير (الغازية 1.5% إيسوفلوراني بمعدل تدفق الهواء حجمي 0.6-0.8 L/دقيقة) على لوحة العمليات الجراحية والحلاقة منطقة جلد البطن. مسح منطقة حلق مع الإيثانول 3 × 75%، ومن ثم مع الحل تدين.
ملاحظة: مراقبة سلوك الماوس أنيسثيتيزيد التنفس بشكل مستمر. ضبط تركيز الغاز isoflurane وفقا للنمط استنشاق زفير من الماوس. - التحقق من وجود غياب منعكس أخمصي بالضغط على السلاميات مخلب هند من الماوس.
- فتح تجويف البطن التي تجتاح الجلد مع ملقط القزحية مسنن منحنية (10 سم) وقطع الجلد على طول mediana لينيا مع مقص مستقيم كربيد التنغستن (10 سم)، ومن ثم، التي تجتاح الجدار البريتوني مع مستقيم دومون ملاقط (12 سم، 0.2 مم × 0.12 ملم) وقطع الجدار على طول ألبا لينيا مع مستقيم تكونوا المقص (8 سم).
- ضع قطعة من الفيلم البارافين fenestrated المتعلق بفتح البطن وإصلاح الفيلم على طرفي مع ملقط مرقئ الصغرى-البعوض (12.5 سم، منحنى).
- فضح ابواق الرحم مع جهاز مثل ملعقة تلافي وقوع ضرر على الأجنة داخل الرحم قرون. التنقيط بضع قطرات من برنامج تلفزيوني (37 درجة مئوية) على قرون الرحم وفحص الأجنة للأضرار أو التشوهات داخل كيس الرحم.
- توثيق النظام، وموقف من الأجنة في قرون الرحم. دورة الأجنة بعناية داخل كيس الرحم حتى يتم التوصل إلى الموضع الذي تريده للحقن.
- حقن 1-2 ميليلتر من خليط AAV1--السريع--الأخضر بصريا تفتيش موقع الحقن (مثلاً البطينين الدماغ) وتغلغل الصبغة تحت ستيريوميكروسكوبي.
- وثيقة حقن الأجنة وقرون الرحم مع حقن الأجنة مرة أخرى في تجويف البطن.
- التنقيط بضع قطرات من برنامج تلفزيوني (37 درجة مئوية) في تجويف البطن. إغلاق التجويف بخياطة الجدار البريتوني (استخدام بولي أميد 6-0-الحجم خيوط) والجلد (استخدام بولي أميد 3-0-الحجم خيوط)، باستخدام البعوض ملقط ل Halsted مرقئ (12.5 سم، منحنى). بدلاً من ذلك، استخدام نمط توقف بسيطة أو الفولاذ المقاوم للصدأ خياطة/المواد الغذائية الأساسية إلى إغلاق تجويف البطن والجلد.
2-تيليماكروفوتوجرافي أنسجة المعزولة
-
إعداد المخازن المؤقتة
- إعداد Sörensen المخزن المؤقت (1 لتر) بحل ز 14.95 غ2هبو4 و 2.18 ز خ2ص4 في 1 لتر ماء المقطر تحت التحريك 200 لفة في الدقيقة. التروية في وقت متأخر الجراء الحمل و/أو الجراء في مرحلة ما بعد الولادة الفترات الزمنية، استخدم حجم مناسب للابر لحقن البطن أو إجراء وتأكد من أن تركيز التخدير بينتوباربيتال الصوديوم المحطة الطرفية لا تتجاوز 180 مغ/ كغم من وزن الجسم.
- إعداد سنقبل تثبيت الحل (5 لتر) بتدفئة 500 مل ماء المقطر إلى 75 درجة مئوية وإضافة 50 جرام مسحوق بارافورمالدهيد تحت التحريك 200 لفة في الدقيقة، مشيراً إلى 200 ميليلتر من 5 هيدروكسيد الصوديوم N، إضافة مل 1,500 من المخزن المؤقت في Sörensen، 1,750 مل من الماء المقطر ، و 500 مل جلوتارالديهيدي 25%. ملء يصل إلى 5,000 مل بالماء المقطر. استخدم هذا المخزن النهائي التروية.
ملاحظة: إعداد تثبيت الحل سنقبل تحت غطاء محرك السيارة، وارتداء النظارات الواقية، وتجنب الأبخرة. إضافة الميثيلين الأزرق (0.05 غرام/لتر) لوضع تصور أفضل التروية.
-
عزل التروية والأنسجة الماوس
- ترانسكارديالي نتخلل الفئران الحوامل التي تحمل الأجنة ترانسدوسيد (في حالة دراسات الأجنة) أو الحانات ترانسدوسيد المولود في السن المطلوب (مثلاً بعد الولادة يوم 24) وفقا للإجراءات الموحدة6،7، 11،12،13،14،15،،من1617، استخدام بينتوباربيتال الصوديوم داخل المحطة الطرفية التخدير (200 مغ/كغ وزن الجسم).
- حقن ترانسكارديالي الفئران مع الهيبارين الحل (500 يو) استخدام غ 26، 1 في الإبرة، وقبل التثبيت، لبث الفئران ترانسكارديالي مع 10 مل من برنامج تلفزيوني إخراج الدم من الجسم، ونتخلل لهم ترانسكارديالي مع 30 مل من 40 درجة مئوية بريوارميد سنقبل تثبيت الحل.
ملاحظة: للفئران الكبار، القيام نضح بديلة إلى الوراء عبر الشريان الاورطي البطني14. - عزل الأنسجة بيرفوسيد للفائدة (مثلاً، الجامعة الدماغ أو النخاع الشوكي) و postfix الأنسجة في مالا يقل عن 10 مل سنقبل بتثبيت الحل لآخر 24 ساعة في 4 درجات مئوية.
- غسل الأنسجة في 10 مل من برنامج تلفزيوني عن 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
-
التضمين في [اغروس]، بالإضافة إلى الوثائق وتمزيقها
- ضبط الأنسجة المعزولة (مثلاً، الجامعة الدماغ) في إطار خاص باستنساخه بتقطيع زاوية8،،من910. بدلاً من ذلك، استخدم فيبرتوم مع سمك قطع قابل لتعديل.
- ضع النسيج العصبي في الإطار وضبط الأنسجة تيليماكروجرافي، وتوثيق الإحداثيات.
- إعداد 3% المتوسطة التضمين [اغروس] انصهار منخفضة: إضافة 3 ز من [اغروس] في 100 مل من المخزن المؤقت في Sörensen وتسخين الخليط في حمام مائي إلى 90 درجة مئوية.
- في الإطار الذي يحتوي على الأنسجة، صب [اغروس] 3% (30 درجة مئوية). تغطية الإطار مع كتلة معدنية دافئة وانتظر حتى يتم تقوية. أثناء تصلب، استخدام أجهزة تيليماكروجرافيك لصورة الأنسجة المضمنة وإحداثياته ضمن الإطار.
- نقل الأنسجة جزءا لا يتجزأ من [اغروس] في إطار خفض الثغرات المقابلة لإحداثيات الإطار الأول.
- قطع الأنسجة المضمنة إلى أقسام من السمك المطلوب (مثلاً 1.5 مم) مع جهاز بشفرة حلاقة رقيقة وتهتز (انظر الجدول للمواد).
ملاحظة: تحسين التزلق لشفرة حلاقة، التنقيط بضع قطرات من الجلسرين على الأنسجة المضمنة. - صورة كل قسم الأنسجة في برنامج تلفزيوني وجمع الصور في مجلد.
3-إعداد الأنسجة المعزولة مجهر إلكتروني
ملاحظة: تنفيذ خطوات إضافية للحضانة في الأطباق الزجاجية مع أغطية كلوسابل مشددة على منصة تهتز تحت غطاء محرك السيارة.
- أغسل أقسام الأنسجة ل 2 × 30 دقيقة في برنامج تلفزيوني. احتضان الفروع في 2% مائي أوزميوم أكسيد solution (أوسو4) لح 2 في درجة حرارة الغرفة.
تنبيه: أكسيد الاوزميوم السامة وقد تكون ضارة عندما يتعلق الأمر على اتصال بالجلد. - أغسل المقاطع أوسميكاتيد 2 × 30 دقيقة في برنامج تلفزيوني.
- احتضان المقاطع في الإيثانول 30%، 50% و 70% في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة (اختياري: احتضان بين عشية وضحاها في الإيثانول 70% في 4 درجات مئوية).
- صورة العينات أوسميكاتيد في الإيثانول 70% تحت RGB الصمام الخفيفة8،9،10 (2 × 15 ث) المطبقة على العينة من الجانب الأيسر والأيمن بزاوية مقدارها 45 درجة. استخدم أطباق أسود وخلفية سوداء مملة للتقليل من تشتت وانعكاس الضوء أثناء الإضاءة.
تنبيه: لا تسمح للقسم لتجف أثناء التصوير. - إنشاء أطلس الصور القسم مع الإحداثيات عن طريق جمع الصور في سلسلة في مجلد.
- احتضان العينات في الإيثانول 100% (2 x ل 30 دقيقة)، وأكسيد البروبيلين 100% (2x) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
تنبيه: عدم السماح بالفروع لتجف أثناء تغيير الحلول. - مل 260 مزيج من راتنج مع 240 مل دوديسينيلسوكسينيك الخل في وعاء زجاج أثناء التحريك بلطف مع شريط زجاج. فحص دوري إينهوموجينيتي، وفقاعات، ومسحات. جداً بلطف، يحرك باليد لمدة 45 دقيقة على الأقل.
- تحضير أكسيد الراتنج/البروبيلين بنسبة 1:2 و 1:1، وإضافة المسرع 3% (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol).
- احتضان الأنسجة في 1:2 تضمين الحل من الخطوة 3.8 ح 2، ومن ثم في الحل تضمين 1:1 من الخطوة 3.8 ح 2 في درجة حرارة الغرفة على عجلة دوارة.
- وضع الأنسجة في أطباق مسطحة البوليبروبيلين وتغطي الأنسجة مع الراتنج الطازجة التي تحتوي على مسرع 3%، وعلاج الأنسجة المضمنة في 65-85 درجة مئوية ح 12-24.
- تهدئة الأنسجة المضمنة إلى درجة حرارة الغرفة وإزالة العينات جزءا لا يتجزأ من الراتنج من الأطباق البوليبروبيلين.
4-اختيار المعلمات أعصاب Ultrastructural للتحليل الكمي
-
تعيين مجال الاهتمام
- اختر أحد المجالات ذات الأهمية (على سبيل المثال، الحصين أو المخيخ) وتعريب المنطقة في الأطلس القسم باختيار الصورة من الأطلس (الخطوة 3، 5) الذي يحتوي على هذا المجال.
- رسم حدود مجال الاهتمام على صورة المقطع والبحث/ركب هذه حدود المنطقة على العينة الراتنج.
- علامة الصفر حدود مجال الاهتمام (على سبيل المثال، الحصين أو المخيخ) في العينة الراتنج، باستخدام مقياس إبرة غرامة (26 ز، 1 بوصة).
- حرارة العينة الراتنج إلى 85 درجة مئوية في فرن تليين الراتنج للتشذيب، أو بدلاً من ذلك، استخدم جهاز تشذيب أو شفرة رقيقة أو الصنفرة.
- المكوس مجال الاهتمام من العينة الراتنج مع شفرة حلاقة (انظر الجدول للمواد). تحميل العينة على عقد قضبان من زجاج اﻷكريليك من العيار المطلوب على سبيل المثال، مع (قطرها 8 ملم) وطولها 1 سم مع الغراء. تقليم العينة المركبة لشبه وتمزيقها سامسونج.
- إعداد سيميثين (0.75 ميكرون) وسامسونج (70 نانومتر) أقسام المنطقة المشذبة باستخدام أولتراميكروتومي: مجموعة 1.5 ملم/s ل 0.75 ميكرون سمك وإلى 0.7 mm/s لسمك nm 70.
- تجميع المقاطع سيميثين على شركات الزجاج ووصمة عار المقاطع مع تولويدين 1% باللون الأزرق في برنامج تلفزيوني (4 دقيقة).
- تغسل الأجزاء عدة مرات في المياه. دراسة المقاطع الملون تحت المجهر الخفيفة استخدام 4 x (نا 0.1 ∞/-)، 10 x (نا 0.22 ∞/0.17)، 40 × (نا من 0.65 ∞/0.17)، و 100 × أهداف (نا من 1.25 ∞/0.17).
- تجميع المقاطع سامسونج على شبكات النيكل. إخضاع الشبكات لل 180 كيلو فولت والساعة 3، 200 س، 6، 000 x، و/أو 8,000 x التكبير.
-
تحليل TEM
- اختيار المعلمات ultrastructural من أهمية بالنسبة للتحليل الكمي لل (مثلاً، بتونس مع حويصلات والميتوكوندريا أو محاور عصبية ميليناتيد ونونميليناتيد) والتقاط صور تيم هذه المعلمات تحت 3، 500 x و 6,000 x 8,000 x التكبير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
للتخدير سريعة وموثوقة للفئران، واعتبرت العديد من معلمات الأمان، ومساحة أمثل لوحدة التخدير أثبتت أن تكون كافية (الشكل 1أ). تم تصميم الوحدة للتحكم في الخليط من إيسوفلوراني السائل والهواء المحيط بدقة المطلوبة لعملية جراحية ناجحة في الحيوانات الصغيرة، مثل الفئران والجرذان. الهواء و isoflurane مختلطة في المبخر وفقا للإعدادات المطلوبة وتسليمها إلى مربع أو من خلال قناع للحيوان (الشكل 1أ). يجمع الكاسح ويحللها أي غاز isoflurane الفائضة التي يمكن إنتاجها، وبالتالي توفير بيئة عمل آمنة. يتم جمع الغاز وتمريرها من خلال الفحم النشط في خرطوشة (الشكل 1أ).
مجموعة أمثل من الصكوك (الشكل 1ب) يسمح للعلماء بإجراء جراحة بسرعة على الفئران الحوامل. يمنع فيلم بارافين بسيطة مع خصائص عمود المصباح في الغشاء المخاطي البطن من التجفيف بعد بتر (الشكل 1ب). قرنية الرحم إيواء الأجنة معرضون على الفيلم البارافين والأجنة يتم ترقيم بالطريقة المبينة في الشكل 1ج. وبمجرد مترجمة، يتم ضبط الأجنة في الموضع الصحيح للحقن بالفيروس عن طريق الشعرية رقيقة (الشكل 1د). ويسيطر الحقن بصريا مراقبة شكل نشر صبغ اختراق الوارد في خليط حقن الفيروس (الشكل 1د). بعد الحقن في الرحم، وتوضع قرون الرحم مرة أخرى في تجويف البطن للسماح بتنمية الأجنة حقن حتى المرحلة (مثلاً، حتى الولادة، والتوصل إلى ما بعد الولادة يوم 24) أن هناك حاجة للتجربة (انظر، على سبيل المثال، لوتز وآخرون5 ،6 و7من كراوس وآخرون). لإجراء دراسات عن اللدونة متشابك، ينصح أواخر مراحل إنمائية أو الكبار.
توضع بعد نضح ترانسكارديال الحيوانات في المرحلة المرجوة، النسيج العصبي (على سبيل المثال، المخ والحبل الشوكي في الشكل 2) والموجهة في إطار بلاستيكية شفافة مع الإحداثيات وجزءاً لا يتجزأ من [اغروس] (الشكل 2 أ، ب.) بعد قطع، كل قسم يتم تصويرها (الشكل 2ج، ه، ز) وثم أوسميكاتيد. بعد أوسميكيشن والحضانة في الإيثانول 70% أو 80%، يتم تصويرها المقاطع مرة أخرى باستخدام التدخل الخفيفة تيليماكروجرافي8،،من910. يجب وضع المقاطع الأنسجة في السوداء القاتمة المحيطة للتقليل من الإشعاع متفرقة خلال الإضاءة عالية الكثافة المطلوبة. الألياف مساحات ومناطق مختلفة من الأنسجة وتعكس الألوان قزحي الألوان التي على النقيض من الخلفية المظلمة الأنسجة، ويظهر نمط التحديد ملونة من على سطح النسيج (الشكل 2د، و، ح). يتم فرضه كل الصور قزحي الألوان مع الصور نونوسميكاتيد، وجنبا إلى جنب مع الإحداثيات المسقطة من الخطوة التضمين، أنها تولد الملاحة خرائط طبوغرافية الأنسجة. بعد ذلك، كذلك الأنسجة المجففة وجزءاً لا يتجزأ في الراتنج. استناداً إلى خرائط الملاحة، مجالات الاهتمام المختارة وكذلك المجهزة لل-كأمثلة، ترد في الحصين (لوسيدوم الطبقة) والمخيخ (طبقة الخلايا الحبيبية) والحبل الشوكي (فونيكولوس الظهرية) في الشكل 3A1-C4 .
وفي قرن آمون والمخيخ، معروفة نهايات الألياف المطحلب يحمل خصائص فريدة من نوعها ultrastructural بالمقارنة مع الاشتباكات العصبية الأخرى، بما في ذلك boutons بريسينابتيك الكبيرة (الشكل 3A1-B5). يمكن أن تكون مترجمة بسهولة مع مساعدة خرائط الملاحة قزحي الألوان المنشأة أثناء خطوات المعالجة السابقة. في ملفاتهم المقطع العرضي، تحتوي على عدد كبير من الحويصلات والميتوكوندريا بتونس وأرفق في كثير من الأحيان عدة أشواك الجذعية (الشكل 3A4، A5، B4، B5). صور تيم من هذه التشكيلات الجانبية السماح بإجراء تقييم كمي للمناطق كروسسيكتيونيد بوتون متشابك، وأرقام من حويصلات متشابك والميتوكوندريا داخل ملف تعريف بوتون، طول متشابك الاتصالات، وإعداد مواقع الاتصال.
في الحبل الشوكي، فونيكولوس الظهرية تحتوي على ألياف محواري كثيرة وميليناتيد من أوليجوديندروجليا. في المقاطع مستعرضة، ويمكن الاطلاع على فونيكولوس الظهرية بين كلا الأبواق الخلفي من الحبل الشوكي في مقاطع مستعرضة (C1, C2منالشكل 3). تيم الصور، تظهر محاور عصبية ميليناتيد كروسسيكتيونيد جولة والأغماد المايلين المحيطة محاور عصبية تنظم في lamellae (الشكل 3C3، C4). إجراء تقييم كمي لمناطق محواري كروسسيكتيونيد، بما في ذلك سمك اﻷغماد المايلين وعدد lamellae المايلين، فضلا عن إجراء تقييم كمي الميتوكوندريا كروسسيكتيونيد التي يمكن الاضطلاع بها المناطق الشخصية.
الأطلس مستعدة والصور تيم صغير من المعلمات ultrastructural ليست فقط مفيدة لمقارنة أعصاب المورفولوجية عند ظروف مختلفة من العلاج، ولكن أيضا عند المقارنة بين المعلمات داخل نفس المنطقة مطلوب (على سبيل المثال، مقارنة بين نوع مختلف من الاشتباكات العصبية في قرن آمون18 وبين هياكل مماثلة من أنواع مختلفة [الشكل 4]).
الشكل 1 : إعداد لتوصيل في الرحم. الإعداد التخدير إيسوفلوراني (A): 1) الدائرة التعريفي للتخدير الأولية؛ 2) مضخة؛ 3) وحدة التخدير؛ 4) التوجيه تبديل صمام؛ 5) التخدير توريد الأنابيب؛ 6) وحدة الكاسح؛ 7) قناع التنفس؛ 8) الجدول ساخنة الجراحية؛ 9) ستيريوسكوبي مجهر مع مصدر الضوء؛ 10) وحدة مراقبة. معدات الجراحة (ب): 1) ماكينة الحلاقة الكهربائية؛ 2) مواد التشحيم العين؛ 3) تثبيت أشرطة؛ 4) منصات المرافق الصحية؛ 5) الملقط آيريس (10 سم، منحنى، مسنن)؛ 6 و 7) قزحية مقص (كربيد التنغستن مستقيم، 11 سم)؛ 8) دومون ملاقط (#3، 12 سم، على التوالي، 0.2 مم × 0.12 مم)؛ 9) المقص تكونوا (8 سم، على التوالي)؛ 10 و 11) البعوض الصغير مرقئ الملقط (12.5 سم، منحنى)؛ 12) فيلم البارافين؛ 13) ملعقة الصغرى؛ 14) مسحات القطن؛ البعوض ملقط 15 و 16) Halsted مرقئ (12.5 سم، على التوالي)؛ خياطة الجروح 17 و 18) (حجم 6-0 و 3-0)؛ 19) حقنه؛ 20) تجميعات أنبوب الشافطة ميكروكابيلاري معايرة الماصات. (ج) نظام لترقيم المنهجي من الأجنة داخل الرحم قرون في يوم الجنينية (ﻫ) 14.5: L = يسار؛ R = الحق. (د) استراتيجيات للحقن: في البطينين الدماغ الأولى والثانية (أناve والثانيهاء، على التوالي)، البطين الرابع (رابعاهاء)، والحبل الشوكي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : وثائق أنسجة المعزولة من تيليماكروجرافي- (أ و ب) التضمين في المخ وحبل الشوكي في [اغروس]، باستخدام الترعة مع نظام إحداثيات (الشبكات). بعد القطع، والأقسام تخضع للتفكير تيليماكروجرافي والتدخل ضوء التصوير. (ج-F) مقاطع مستعرضة والسهمي في الدماغ. تغيير حجم أشرطة = 5 مم؛ co = قشرة؛ ش = المخطط؛ دي = الجملة؛ لي = ميسينسيفالون؛ مرحبا = الحصين؛ ped = البلعوم بيدونكولي؛ ce = المخيخ؛ مو = سيسائيه لب. (زاي و حاء) قسم مستعرضة الجزء العنقي من الحبل الشوكي. مقياس بار = 1 مم؛ فهرس = القرن الأمامي حق؛ أهل = القرن الأمامي الأيسر؛ مدافع = فونيكولوس الظهرية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : تحديد معلمات اللدونة الطوبوغرافية و ultrastructural- (A1) تدخل مقلوب ماكروجراف الخفيفة الحصين. وتبرز منطقة boutons المطحلب الألياف داخل الطبقة لوسيدوم (sl). pcl = طبقة الخلايا الهرمية؛ جكل = طبقة الخلايا الحبيبية. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (A2) الخفيفة ميكروفوتوجراف (الهدف x 100) قسم سيميثين (0.75 ميكرون) عرض لوسيدوم الطبقة. تشير العلامات النجمية إلى مناطق boutons المطحلب الألياف التي تحيط بالعديد من الجزر الجذعية (رؤوس سوداء). تولويدين تلطيخ الأزرق/أوسو4 . شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (A3) انتقال إلكترون صورة مجهرية في تكبير منخفض، تظهر الألياف المطحلب boutons (علامات نجمية) المحيطة تغصن (د). يتضمن المستطيل بوتون ألياف المطحلب واحد. شريط المقياس = 2 ميكرومتر. (A4) انتقال إلكترون صورة مجهرية لمقطع عرضي بوتون واحد الألياف المطحلب (مفب). يتم تمييز العمود الفقري (الأزرق) ومنطقة بوتون المقطع العرضي (البنفسجي). m = ميتوكندريا؛ s = الأشواك. شريط المقياس = 200 نانومتر. (A5) متشابك حويصلات داخل مفب. شريط المقياس = 100 نانومتر. (B1) تدخل مقلوب ماكروجراف الخفيفة من المخيخ. تتم الإشارة إلى منطقة طبقة الخلايا الحبيبية (جكل) الذي يحتوي على بتونس الألياف المطحلب. mcl = الطبقة الجزيئية؛ ح = نقير. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (B2) الخفيفة ميكروفوتوجراف (الهدف x 100) قسم سيميثين (0.75 ميكرون) عرض منطقة طبقة الخلايا الحبيبية التي تجاور خلايا بركنج (PC). تشير العلامات النجمية إلى مناطق بوتونس المطحلب الألياف التي تحيط بها العديد من الخلايا العصبية الحبيبية للدماغ (CGN). تولويدين تلطيخ الأزرق/أوسو4 . شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (B3) انتقال إلكترون صورة مجهرية في تكبير منخفض، عرض مجال مفبس. ويتضمن المستطيل مفب واحد. شريط المقياس = 2 ميكرومتر. (B4) انتقال إلكترون صورة مجهرية لمقطع عرضي مفب الشبيهة بالفطر داخل طبقة الخلايا الحبيبية من المخيخ. منطقة بوتون المقطع العرضي (البنفسجي)، وهي أبرز الأشواك خالية من حويصلة (أزرق). مقياس بار = 1 ميكرومتر. (B5) الميتوكوندريا (البنفسجي) وحويصلات متشابك داخل مفب. شريط المقياس = 150 نانومتر. (C1) مقلوب ماكروجراف الخفيفة تدخل الحبل الشوكي. وتبرز منطقة فونيكولوس الظهرية (مدافع) التي تحتوي على محاور عصبية ميليناتيد بشكل كبير. فهرس وأهل = اليمين واليسار القرن الأمامي، على التوالي؛ المناصرون والفلبين = اليمين واليسار القرن الخلفي، على التوالي. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (C2) الخفيفة ميكروفوتوجراف (الهدف x 100) قسم سيميثين (0.75 ميكرون) عرض فونيكولوس الظهرية التي أثري مع محاور عصبية ميليناتيد بشكل كبير (ax) التي يمكن تمييزها الواضح من ألياف نونميليناتيد (النجمة). ct = النسيج الضام. تولويدين تلطيخ الأزرق/أوسو4 . شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (C3) انتقال إلكترون صورة مجهرية من التشكيلات الجانبية للمقطع العرضي لمحاور عصبية ميليناتيد ونونميليناتيد (ax، البنفسجي). بي = اﻷغماد المايلين. شريط المقياس = 200 نانومتر. (C4) يظهر المستطيل محاور عصبية تضخيم عالية، ميليناتيد بشكل كبير مع lamellae المايلين وألياف نونميليناتيد. ميكروتوبوليس (mt) والميتوكوندريا (m) داخل ألياف محواري مرئية. شريط المقياس = 50 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : أمثلة لمعلمات اللدونة ultrastructural في نماذج حيوانية مختلفة- (أ) الألياف المطحلب boutons في المخيخ من سمك القرش. شريط المقياس = 400 نانومتر. (ب) ألياف المطحلب بوتون في قرن آمون من المكاك الريسوسي. شريط المقياس = 200 نانومتر. (ج) الوصلات العصبية العضلية القط. شريط المقياس = 300 نانومتر. (د) boutons متشابك في أسود الدماغ قد بارس من فالانجير. تشير العلامات النجمية إلى كثافة بوستسينابتيك (مديرية الأمن العام؛ وفي الإطار الداخلي: أسود رؤوس الأسهم). يظهر المستطيل تضخيم مديرية الأمن العام. شريط المقياس = 400 نانومتر. (ﻫ) نونميليناتينج خلية شوان (SC) المحيطة بالعديد من ألياف محواري في العقدة الشوكي بالماوس. في الجوار، مرئية ألياف ميليناتيد بشكل كبير. شريط المقياس = 300 نانومتر. لكل اللوحات: ax = إكسون؛ د = تغصن؛ m = ميتوكندريا؛ مفب = بوتون الألياف المطحلب؛ MF = المطحلب الألياف؛ بي = اﻷغماد المايلين؛ s = العمود الفقري؛ sa = جهاز العمود الفقري؛ sv = حويصلات متشابك. يتم الإشارة إلى مواقع الاتصال (الكثافة بوستسينابتيك) مع العلامات النجمية. ويبرز المجالات المقطع العرضي البنفسجي والأزرق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خطوة حاسمة لتوصيل في الرحم هو إجراء الحقن. يتطلب حقن دقيقة في البطينين الدماغ أو في مجال آخر ذي أهمية الخبرة والتدريب العملي على المهارات. أرق تلميح ميكروكابيلاري، قد يحدث الضرر الأنسجة أقل؛ ومع ذلك، وهذا على حساب زيادة ضغط الحقن. على النقيض من انهانسر في الرحم19،20،،من2122، معدل البقاء على قيد الحياة من حقن الأجنة بعد توصيل في الرحم مرتفع جداً. يمكن حقن أجنة جميع القرن الأفريقي الرحم، حتى إذا الأجنة الموجودة في جذور قرون الرحم وتحتاج إلى تعديل داخل كيس الرحم. مراحل النمو للحقن والتحليل يمكن تكييفها لمسألة علمية.
عند حقنها في البطينين الدماغ، يتم توزيع الجسيمات AAV1 عن طريق السائل النخاعي من خلال النظام بأكمله البطين. تطوير هياكل مع الأسطح الموجودة في اتصال وثيق مع الخمور، مثل في قرن آمون والمخيخ، هي ترانسدوسيد من6،،من5الجسيمات الفيروسية التطبيقية7. تحليل التغيرات في معلمات ultrastructural، مثل حجم بوتون والمناطق بوتون كروسسيكتيونيد، أعدادا من حويصلات متشابك، وأرقام الميتوكوندريا، وأرقام وطول اتصالات متشابك في هذه الهياكل، وهو قراءة أنيقة ultrastructural اللدونة. يمكن تطبيق طريقة توصيل في الرحم لدراسة مناطق الدماغ المختلفة، فضلا عن الحبل الشوكي6. وعلاوة على ذلك، يمكن كذلك اختيار سائر الأعضاء والأنسجة كأهداف توصيل. وأخيراً، يمكن الاستعاضة عن النموذجية المستخدمة بشكل متكرر الماوس الأنواع الأخرى كما هو مطلوب.
التصوير الفوتوغرافي لشرائح الأنسجة يسمح تشريح دقيقة جداً من العينات جزءا لا يتجزأ من الراتنج مجهر إلكتروني. حيث يتم تعريف التوجه المكاني للعينة، أسقطت قطع واسعة النطاق وتستغرق وقتاً طويلاً. وعلاوة على ذلك، يمكن الاحتفاظ بالمناطق المجاورة حاسمة في علاقتها الأصلية لبعضها البعض. ميزة هامة من الوثائق الفوتوغرافية الخطوة هو إمكانية مراقبة جودة تثبيت الأنسجة والاعتراف بالتغيرات الباثولوجية. وهكذا، نوعية التثبيت وتضمين المواد أهمية محورية. يمكن أن تكون الاستعانة بمصادر خارجية نونسويتابل العينات التي تحتوي على التحف قبل إجراء مزيد من المعالجة.
توفر سلسلة صورة مجهرية من الشرائح المصورة الأنسجة أطلسا مورفولوجية مفيدة. الدراسات نيورواناتوميكال النسبية، التي قد تشمل أيضا من الأنواع النادرة، الأطلس أرشيف قيماً. اختيار سمك شرائح الأنسجة يعتمد على تناول مسألة علمية وهي محدودة بحجم العينة الأنسجة. للحيوانات الصغيرة، ينبغي أن تعدل بسمك يصل إلى 1 مم. أبواب سميكة جداً (> 5 ملم) لا ينصح، نظراً لقدرة اختراق محدودة من أكسيد الاوزميوم8،،من910.
الوثائق تيليماكروفوتوجرافي ضروري للدراسات مورفوميتريكال. يوفر ارتباط ثابت لسطح النسيج إلى الجانب والطائرة أعلى الإطار ويحدد موقف هيكل معين في نظام الإحداثيات مكانية. مزيج من الأسلوب وصف الكهربية18 أو مع نموذج إصابات النخاع الشوكي، حيث اللدونة دوراً أساسيا في تجديد6، من الممكن. الدراسات نيورواناتوميكال النسبية، التي قد تشمل أيضا من الأنواع النادرة، أطلس الأنسجة قزحي الألوان والصور تيم صغير من المعلمات ultrastructural هي قيمة الأصول.
على الرغم من قوتها، تيم نقائص عديدة نظراً لحجم سمك العينة (70 نانومتر)، منطقة كروسسيكتيونيد (< 6 مم2)، والطابع المعقد لإعداد نموذج. ومع ذلك، عندما عينة مستعدة بدقة، صور تيم أولتراستروكتوري للعينة عالية الجودة بالمقارنة مع الصور التي تنتجها أي تقنيات الضوء تقنيين. تقنية توصيل في الرحم ويحد من حجم المحقون والمنطقة الطبوغرافية للحقن. بلا منازع، التقنية إمكانات قوية متعدية طبية في العلاج المبكر التنموية وفي إنقاذ الخلقية لاثيل. وعلاوة على ذلك، هذا الجمع بين توصيل في الرحم مع تيم قد لا فقط يعتبر كنهج لمعالجة الأمراض الخلقية مستقبلا، ولكن أيضا لتشخيص عالية الجودة على أساس أولتراستروكتوري النمائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون الزملاء مرفق الحيوان في "كلية الطب"، جامعة روهر بوخوم، تقديم الرعاية لهم الدعم والحيوان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol | Serva | 36975 | |
| 26 G x 1'' needle | Henke-Sass, Wolf GmbH | ||
| 410 Anaesthesia Unit for air pump | Biomedical Instruments (Univentor) | 8323102 | |
| Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) | UKE (Viral Core Facility) | - | For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54. |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | low gelling agarose |
| Air Pump | Biomedical Instruments (Univentor) | Eheim 100 | |
| Araldite | CIBA-GEIGY | 23857.9 | resin for embedding of tissue |
| aspirator tune assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium | Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| buprenorphine | Temgesic | ampules | painkiller |
| capillaries | Science-Products | GB100TF-10 | with fillament |
| Dodecenylsuccinic anhydride | Fluka | 44160 | |
| Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) | FST | 11203-23 | |
| electric shaver | Phillips | - | |
| Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) | Ethicon | - | polyamide |
| eye lubricant | Bepanthene | - | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | for visualization of injected liquids |
| Gas Routing Switch 4/2 connectors | Biomedical Instruments (Univentor) | 8433020 | |
| halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) | FST | 13011-12 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 25 000 I.E./5 mL | |
| Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155 mm x 115 mm x 130 mm. Wall thickness: 6 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| iris forceps (10 cm, curved, serrated) | FST | 14007-14 | |
| iris scissors (11 cm, straight, tungsten carbide) | FST | 14501-14 | |
| Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257mm x110 mm x 18 mm. Heating area: 190 mm x 90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations |
Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| isoflurane (Attane) | JD medical | inhalation anesthesia | |
| LED RGB lights | Cameo | CLQS15RGBW | LEDs 2 x 15 W |
| Light microscope Basic DM E | Leica | - | 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives |
| micropipette puller | Science-Products | P-97 | |
| Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, curved) | FST | 13010-12 | |
| Nickel grids, 200 mesh | Ted Pella | 1GC200 | |
| Osmium (VIII)-oxid | Degussa | 73219 | |
| Propylene oxide | Fluka | 82320 | |
| razor blades | Schick | 87-10489 | |
| Sodium pentobarbital (Narcoren) | Merial GmbH | - | |
| TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback | Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| Technovit 4004 two components glue | Kulzer | ||
| Telemacrodevice | Canon | - | Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand. |
| Thermopuller P-97 | Sutter Instruments | - | |
| thin vibrating razor blade device | Krup | - | with Szabo thin blades |
| toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Transmission electron microscope C20 | Phillips | - | up to 200 kV |
| Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6 mm Inner diameter: 4 mm Wa ll thickness: 1 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| Ultracut E | Reichert-Jung | - | ultramicrotome |
| Univentor Scavenger | Biomedical Instruments (Univentor) | 8338001 | |
| Vannas scissors (8 cm, straight) | FST | 15009-08 |
References
- Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers. Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).
- Hamlyn, L. H. The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit. Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).
- Peters, A., Palay, S., Webster, H. The Fine Structure of the Nervous System. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1991).
- Rollenhagen, A., et al. Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses. Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).
- Lutz, D., et al. Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival. Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).
- Lutz, D., et al. Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury. Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).
- Kraus, K., et al. A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination. Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).
- Andres, K. H., von Düring, M. Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung. Mikroskopie. 30, 139 (1974).
- Andres, K. H., von Düring, M. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. Hayat, M. A. , Van Norstrand Reinhild. 246-261 (1997).
- Andres, K. H., von Düring, M. General Methods for Characterization of Brain Regions. Techniques in Neuroanatomical Research. Heym, C., Forssmann, W. -G. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. 100-108 (1981).
- Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).
- Webster, H. F., Collins, G. H. Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).
- Andres, K. H. Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern. Mikroskopie. 21, 169 (1967).
- Forssmann, W. G., et al. Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation. Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).
- Descarries, L., Schröder, J. M. Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit. Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).
- Langford, L. A., Coggeshall, R. E. The use of potassium ferricyanide in neural fixation. Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).
- Liu, J., et al. Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex. Molecular Brain. 7, 84 (2014).
- Lee, S. H., et al. Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway. Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. , Suppl 1 120-125 (2009).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
- Nishiyama, J., et al. Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation. European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).
- Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo. Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).
