Summary
Сочетание просвечивающей электронной микроскопии и внутриутробно трансдукции представляет собой мощный подход для изучения морфологических изменений в тонкой Ультраструктура нервной системы во время разработки. Этот комбинированный метод позволяет глубокое понимание изменений в структурные детали лежащие в основе нейропластичности отношении их топографические представительства.
Abstract
Настоящее исследование объединяет внутриутробно трансдукция с просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) направленных на точное морфометрических анализ ультраструктурных параметров однозначно определены топографических структур, пострадавших от протеин интереса что вводится в организм через вирусный передачи. Этот комбинированный подход позволяет для плавного перехода от макроструктурных ультраструктурных идентификации следующих топографических навигационных карт в атласе ткани. Высоким разрешением электронной микроскопии в utero преобразованы ткани раскрывает прекрасные Ультраструктура Нейропиль и его пластичности параметров, таких как районы поперечном синаптических бутона, количество синаптических пузырьков и митохондрий в течение Бутон профиль, длину синаптических контактов, поперечном аксональное районов, толщина миелиновой оболочки, количество ламели миелина и поперечном областях митохондрий профилей. Анализ этих параметров показывает основные понимание изменений ультраструктурных пластичности в районах нервной системы, которые страдают от вирусных передачи генетической конструкции. Этот комбинированный метод может использоваться не только для изучения прямое воздействие генетически биомолекул или наркотики на пластичность нейронов, но также открывает возможность для изучения в утробе спасения пластичности нейрональных (например, в контексте нейродегенеративные заболевания).
Introduction
Не фотон может проникать ультратонких ткани образца в глубине класса электрона. Это атрибуты бесценный преимущества ТЕА в захват нанометра резолюции изображений тонких структур по сравнению с методами световой микроскопии. К примеру ТЕА позволяет для визуализации внутриклеточных органелл например митохондрий, меланосомы и различные виды секреторных гранул, микротрубочки, микрофиламенты, реснички, микроворсинки и межклеточные соединения (клеточной поверхности специализации), в частности синапсов в нервной системы,12,3,4. Общая цель настоящего методологические исследования признается ультраструктурные изменения пластичности нейронных во время разработки после пренатальной вмешательства путем объединения последнему слову техники внутриутробно трансдукция и ТЕА. Вирусно закодированные протеинов интереса были преобразованы в утробе матери в центральной нервной системе5,6,7, включая спинного6. Например в утробе трансдукции в сочетании с ТЕА был использован для изучения воздействия молекулы адгезии клеток L1 на Мотор обучения пластичности в L1-недостаточным мышей, в частности в том, что касается взаимосвязи между L1 и ядерных рецепторов белки в7нейронов мозжечка.
Анализ параметров нейропластичности требует точной информации о локализации маленьких областей внутри нервной системы. Таким образом это достаточно для описания ультраструктурных деталей и их точные топографические ориентации в отношении других структур. В настоящем исследовании представлен конкретные подготовительные метод, направленный на подробное расследование различных морфологических областей на основе света и электронной микроскопии. Этот подход сочетает в себе несколько методов манипуляции ткани, начиная с внутриутробно трансдукции мыши головного и спинного мозга и следуют перфузии фиксации, встраивание плесень и обработка ткани для ТЕА. Важным шагом, включенных между внедрением и обработки ткани для ТЕА является документация ткани, используя метод отражения света вмешательства, который позволяет для точного microphotographic и низким увеличение документации ткани образцов8,9,10. Включены в нынешний подход, эта техника позволяет исследователям изучить топографические и структурные детали нервной ткани поверхностей и профилей фрагмент образца до их подготовки к ТЕА.
Особый кадр для разрезания весь мозг соответствует стереотаксического координат. Эта рамка выгоды морфологических трехмерные (3D) реконструкции районов в нервной ткани и может быть использован для анализа морфометрических. Macrographs визуализация Секции назначаются топографических координат, и последовательно пронумерованными разделами построения карт в атласе ткани.
После обработки смолы, встроенных ткани секционного ультратонких разделов (< 70 нм) содержащий отдельных областях, согласно карты выше ткани атласа. Ультратонких секций подвергаются ТЕА для получения изображения с высоким разрешением пластичности параметров (например, сечение профиля области синаптической boutons или аксональное волокон), их содержание и контактов в соседние структуры внутри комплекса Нейропиль.
С методом, описанным в настоящем документе плавный переход от визуализированных макростроение микро - и наноструктур позволяет сравнительных углубленные исследования морфологическая пластичность нейронов после в утробе матери трансдукции развивающихся нервной системы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры на животных темы были одобрены комитетами институциональных животных этики федеральных штатов Гамбурга и Северный Рейн-Вестфалия, Германия. Используйте стерильные инструменты, защитные перчатки и асептических пальто на протяжении всего хирургическая процедура.
1. в утробе матери трансдукция
- Подготовьте аденоассоциированный вирус типа 1 (AAV1) кодирования для нужного целевого (4 х 1011 вирусных частиц/мкл AAV1) фосфат амортизированное saline (PBS) при рН 7,4. Добавить 0,1 мг/мкл быстро зеленый и сохранить AAV1-быстро-зеленый смесь при 37 ° C.
- Подготовить кончик тонкий капилляров с желаемой формы (8 мм в длину, с внешним диаметром 80 мкм и внутренний диаметр 50 мкм), с помощью съемника микропипеткой (параметры: давление = 500, тепло = 700, тянуть = 0, скорость = 80, время = 200, см таблица материалов < / c1 >). Разбейте кончик капилляра, так что это 4-5 мм.
- Соберите Аспиратор трубки (44 cm х 0,7 см) с капиллярной кончиком и аспирационная 15 мкл AAV1-быстро-зеленый смеси в капилляр.
- Держите животных подданных постоянной физиологической тела при температуре 37 ° C на протяжении всей процедуры.
- Место беременной C57Bl/6 мышь (эмбриональных день 14,5) в preincubation камеру и анестезировать мыши с газообразным изофлюрановая 4% (с коэффициентом объемного потока воздуха 0,6-0,8 Л/мин).
- Подкожно придать бупренорфин (0,1 мг/кг веса тела).
- Место наркотизированных мыши на пластину подогретую хирургические (37 ° C).
- Покрытия глаза с смазки.
- Подходят мышь с маской анестезии (газообразных изофлюрановая 1,5% в размере объемный расход воздуха 0,6-0,8 Л/мин) на хирургические пластины и брить область брюшной кожи. Протрите бритая региона с 3 X 75% этанола и затем Бетадин-раствор.
Примечание: Непрерывно контролировать дыхание поведение наркотизированных мыши. Регулировка концентрации газа изофлюрановая по схеме ингаляции выдох мыши. - Проверьте отсутствие подошвенный рефлекс, сжимая задние лапы фаланг мыши.
- Откройте брюшной полости, сжимая кожи пинцетом (10 см) изогнутых зубчатые Ирис и резки кожи вдоль linea медиана ножницами прямо из карбида вольфрама (10 см), а затем путем захвата брюшной стенки с прямыми Дюмон пинцетом (12 см, 0,2 мм x 0,12 мм) и резки стены вдоль linea alba с прямыми Vanna ножницы (8 см).
- Поместите кусок пленки перфорированную парафина на брюшной открытия и исправить фильм на обоих концах с микро комаров гемостатический пинцет (12,5 см, изогнутая).
- Разоблачить маточные рожки с устройством ложка как во избежание повреждения эмбрионов внутри маточные рожки. Капать несколько капель PBS (37 ° C) на маточные рожки и осмотрите эмбрионов за ущерб или пороков развития внутри матки sac.
- Документ, порядок и положение эмбрионы в рога матки. Поверните эмбрионов тщательно внутри матки sac, пока не будет достигнуто нужное положение для инъекций.
- Придать 1-2 мкл смеси AAV1-быстро-зеленый, визуально изучив инъекции (например, желудочков мозга) и проникновения красителя под стереомикроскопом.
- Документ вводится эмбрионов и место маточные рожки с эмбрионы вводят обратно в брюшной полости.
- Капать несколько капель PBS (37 ° C) в брюшную полость. Закройте полость, ушивания брюшной стены (Использование полиамида 6-0-размера шва) и кожи (Использование полиамида швы размером 3-0), используя Хальстед комаров гемостатический пинцет (12,5 см, изогнутая). Кроме того используйте шаблон простой прерван или из нержавеющей стали шовный материал/скобы для закрытия брюшной полости и кожу.
2. Telemacrophotography отдельных тканей
-
Подготовка буферов
- Подготовка Sörensen в буфер (1 Л) путем растворения 14.95 г Na2HPO4 и 2.18 г х2PO4 в 1 Л дистиллированной воды при помешивании в 200 об/мин. Для перфузии в конце беременности щенков и щенков в послеродовой периоды времени, использовать соответствующий размер игл для инъекций брюшной или внутрижелудочного и убедитесь, что концентрация терминала Натрий Пентобарбитал анестезии не превышает 180 мг / кг веса тела.
- Готовят раствор Mugnaini в фиксации (5 Л) путем нагрева 500 мл дистиллированной воды до 75 ° C и добавление 50 г порошка параформальдегида под перемешивания на 200 об/мин, добавив 200 мкл 5 N NaOH, добавив 1500 мл Sörensen буфера, 1750 мл дистиллированной воды и 500 мл 25%-го раствора. Заполните до 5000 мл дистиллированной водой. Используйте этот последний буфер для перфузии.
Примечание: Приготовляют раствор фиксации Mugnaini под капотом, носить защитные очки и избегать дыма. Добавьте Метиленовый синий (0,05 г/Л) для лучшей визуализации перфузии.
-
Изоляция перфузии и ткани мыши
- Transcardially perfuse беременных мышей, которые несут transduced эмбрионов (в случае исследования эмбриона) или род transduced пабов на желаемый возраст (например, послеродовой день 24) в соответствии со стандартными процедурами6,7, 11,12,13,14,,1516,17, используя внутрибрюшинного терминала Натрий Пентобарбитал анестезия (200 мг/кг веса тела).
- Придать transcardially мышей с раствором гепарина (500 U) с помощью 26 G, 1 игла и, до фиксации, влить мышей transcardially с 10 мл PBS вымывать крови из организма, и perfuse их transcardially с 30 мл 40 ° C подогретую Mugnaini Фиксация решение.
Примечание: Для взрослых мышей выполните альтернативные Ретроградная перфузии через брюшной аорты14. - Изолировать перфузии тканей интерес (например, весь головного или спинного мозга) и постфиксная ткани в по крайней мере 10 мл раствора Mugnaini в фиксации для другой 24 ч при 4 ° C.
- Вымойте ткань в 10 мл PBS для 3 ч при комнатной температуре.
-
Встраивание в агарозы, плюс документации и секционирование
- Настройка изолированных ткани (например, весь мозг) в специальной рамке с воспроизводимые секущей угол8,9,10. Кроме того используйте vibratome с регулируемым резки толщиной.
- Разместите нервной ткани в кадре, отрегулировать ткани для telemacrography и документировать координаты.
- Подготовка 3% легкоплавких агарозы встраивание среднего: добавить 3 g агарозы в 100 мл Sörensen буфера и тепло смесь на водяной бане до 90 ° C.
- Залейте 3% агарозном (30 ° C) в кадр, содержащий ткань. Обложка кадр с теплой металлические блок и подождать до тех пор, пока это закалка. При закалке, используйте telemacrographic устройства для изображения встроенных ткани и его координаты в пределах фрейма.
- Передача агарозы врезанных тканей в рамку с резки пробелы, соответствующие координаты первого кадра.
- Нарезать разделы требуемой толщины (например, 1,5 мм) встроенных ткани с устройством тонкой и вибрационные лезвие бритвы (см. Таблицу материалы).
Примечание: Чтобы улучшить скольжение лезвия бритвы, капать несколько капель глицерина на встроенных ткани. - Образ каждого раздела ткани в PBS и собирать изображения в папку.
3. Подготовка изолированной ткани просвечивающей электронной микроскопии
Примечание: Выполните все дальнейшие инкубации в стеклянных блюдах крышками плотно замыкаем на тряску платформе под капотом.
- Вымойте разделов ткани для 2 x 30 мин в PBS. Инкубируйте разделы в 2% раствор водный осмия тетраоксид (4OsO) за 2 ч при комнатной температуре.
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Осмия тетраоксид является токсичным и может быть вредным, когда он приходит в контакт с кожей. - Мыть osmicated секции для 2 x 30 мин в PBS.
- Инкубировать разделы в 30%, 50% и 70% этанола при комнатной температуре за 10-15 мин (необязательно: инкубировать в 70% этанол на 4 ° C на ночь).
- Изображение osmicated образцов в 70% этанол под LED RGB света8,9,10 (2 x 15 Вт) применяется к выборке из левой и правой стороны под углом 45 °. Используйте черный блюда и тупой черный фон, чтобы минимизировать рассеяния и отражение света во время освещения.
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Не позволяют секции высохнуть во время визуализации. - Создайте Атлас изображений раздел с координатами, собирая изображения в серии в папке.
- Проинкубируйте образцы в 100% этанола (2 x 30 минут) и 100% пропилена оксида (2 x 30 минут) при комнатной температуре.
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Не позволяйте разделы высохнуть при смене решений. - Смешайте 260 мл смолы с 240 мл dodecenylsuccinic ангидрида в стеклянный сосуд помешивая осторожно с стеклянный бар. Периодически проверяйте наличие неоднородности, пузыри и мазки. Очень аккуратно перемешайте вручную, по крайней мере 45 мин.
- Подготовка смолы/пропилена оксида в соотношении 1:2 и 1:1 и добавить 3% ускоритель (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol).
- Инкубируйте ткани в 1:2, внедрение решения от шаг 3,8 за 2 ч, а затем в растворе 1:1 внедрения от шаг 3,8 втечение 2 ч при комнатной температуре на вращающееся колесо.
- Место ткани в плоской полипропиленовые блюда, крышка ткани с свежей смолы, содержащие 3% ускоритель и вылечить встроенных ткани на 65-85 ° C для 12-24 ч.
- Охладить встроенных ткани до комнатной температуры и удалить образцы смолы встроенный из полипропилена блюда.
4. Выбор параметров ультраструктурных нейропластичности для количественного анализа
-
Отображение области интереса
- Выберите область интересов (например, гиппокамп или мозжечка) и локализовать область в разделе Атлас, выбрав изображение из атласа (шаг 3.5), содержащий эту область.
- Эскиз границы области интересов раздел образ и найти/наложить эти границы региона на образец смолы.
- Скретч Марк границы области интересов (например, гиппокамп или мозжечка) смолы образца, с помощью тонкой иглы датчика (26 G, 1 в).
- Тепла смолы образца до 85 ° C в духовке смягчить смолы для обрезки или, альтернативно, использовать устройство обрезки, тонкие лезвия или наждачной бумагой.
- Акцизный области интересов от смолы образца с лезвием бритвы (см. Таблицу материалы). Смонтируйте образца на проведении баров из акрилового стекла требуется калибра, например, с (диаметром 8 мм) и длиной 1 см с клеем. Трим подключенные образца для полу - и ультратонких секционирование.
- Подготовить полутонкая (0,75 мкм) и ультратонких (70 нм) секции обрезанные области с использованием ultramicrotome: установить его на 1,5 мм/сек для 0,75 микрон толщины и при 70 нм толщиной 0,7 мм/с.
- Собирать полутонкая разделы на стекло перевозчиков и выведение секции с 1% толуидиновый синий в PBS (за 4 мин).
- Вымойте разделы несколько раз в деионизированной воде. Изучить окрашенных участков под световой микроскоп, используя 4 x (NA 0.1 ∞ /-), 10 x (NA 0.22 ∞/0.17), 40 x (NA 0,65 ∞/0.17) и 100 x (NA 1,25 ∞/0.17) целей.
- Соберите ультратонких разделы на никель сетках. Учетом сетки ТЕА на 180 кв и на 3, 200 x, 6, 000 x, и/или 8000 x увеличение.
-
Анализ ТЕА
- Выберите ультраструктурных параметры интерес для количественного анализа ТЕА (например, boutons с везикулы и митохондрии или циклопоид и безмиелиновые аксонов) и ТЕА изображения этих параметров под 3, 500 x, 6000 x и/или 8000 x увеличение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для надежной и быстрой анестезии мышей были рассмотрены многочисленные параметры безопасности, и оптимизированный Рабочей группы анестезия оказалась адекватных (рис. 1A). Прибор предназначен для управления смесь жидких изофлюрановая и окружающего воздуха с точностью, требуемой для успешной операции на мелких животных, таких как мыши и крысы. Воздух и изофлюрановая смешиваются в испаритель согласно желаемые параметры и доставлены в коробку или через маску для животных (рис. 1А). Мародер собирает и инактивирует любые излишки изофлюрановая газа, которые могут быть произведены, обеспечивая тем самым безопасной рабочей среды. Газ является собираются и передаются через активный уголь в патрон (рис. 1А).
Оптимизированный набор инструментов (рис. 1Б) позволяет ученым быстро выполнять операции на беременных мышей. Фильм просто парафина с гидрофобные свойства предотвращает слизистую оболочку брюшной сушки после резекции (рис. 1Б). Маточные рожки, укрывательство эмбрионы подвергаются на фильм парафина и эмбрионы нумеруются как показано на рисунке 1C. Как только локализовать, эмбрионы корректируются в правильное положение для инъекции вируса через тонкий капилляров (рис. 1D). Инъекции контролируется визуально наблюдения диффузии форма проникающего красителя, содержащихся в смесь вводят вирус (рис. 1D). После инъекции в утробе матери маточные рожки помещаются обратно в брюшной полости позволяет развитие зародышей вводят до стадии (например, до рождения и достигнув послеродовой день 24), который необходим для эксперимента (см., например, Лутц et al.5 ,6 и7Краус и др.). Для исследования на синаптической пластичности рекомендуется поздней стадии развития или взрослых.
После transcardial перфузии животных на стадии желаемого нервной ткани (например, головного и спинного мозга на рис. 2) помещен и ориентированы в прозрачной пластиковой рамке с координатами и встроенных в агарозном (Рисунок 2 A, B). После резки, каждый раздел — образы (рис. 2C, E, G) и затем osmicated. После osmication и инкубации в 70-80% этанола разделы отражаются снова с помощью интерференции света telemacrography8,9,10. В разделах ткани должны быть помещены в тупой черный окружающих к минимуму рассеянного излучения во время требует высокой интенсивности освещения. Волокно участки и различных областях ткани отражают радужных цветов, которые контрастируют на фоне темных тканей, и специально цветной узор на поверхности ткани возникает (Рисунок 2D, F, H). Все радужные изображения накладываются с nonosmicated изображениями и, вместе с прогнозируемой координаты этапа внедрения, они создают навигационные карты рельефа ткани. Далее ткань далее обезвоженной и встроенных в смолы. Основываясь на навигационных картах, области интересов отбираются и дальнейшей обработки для ТЕА-как примеры, гиппокамп (stratum lucidum), мозжечок (гранул слоя клеток) и спинного мозга (спинной водянки) приведены в Рисунок 3A1-C4 .
В гиппокампе и мозжечке Мшистое волокна синапсы известны выставлять ультраструктурные особенности по сравнению с другими синапсы, включая большие Пресинаптический boutons (A1-B5рис. 3). Они могут локализоваться легко с помощью Радужная навигационных карт, установленных в ходе предыдущих шагов обработки. В их профилей поперечных сечений boutons содержат огромное количество пузырьков и митохондрий и очень часто заключить несколько дендритных шипиков (рис. 3A4, A5, B4, B5). ТЕА образы этих профилей позволяют количественную оценку районов поперечном синаптических бутона, числа синаптических пузырьков и митохондрии внутри бутона профиль, длину синаптических контактов и количество контактов сайтов.
В спинной мозг спинной водянки содержит много аксональное волокон, которые Миелинизированные, oligodendroglia. На поперечных секций спинной водянки можно найти между оба заднего рога спинного мозга на поперечные секции (рис. 3C1, C2). На изображениях ТЕА поперечном Миелинизированные аксоны появляются круглые и миелиновой оболочки, окружающие аксоны организованы в ламели (рис. 3C3, C4). Количественная оценка поперечном аксональное областей, включая толщину миелиновой оболочки и количество ламели миелина, а также количественная оценка поперечном митохондрий, профиль районов может осуществляться.
Подготовлен атлас и микрографические изображений ТЕА ультраструктурных параметров полезны не только для сравнения морфологических нейропластичности после различных условий лечения, но и когда сравнение между параметрами в пределах той же области не требуется (например, сравнение между другой тип синапсов в гиппокампе18 и эквивалентных структур различных видов [Рисунок 4]).
Рисунок 1 : Подготовка к внутриутробно трансдукции. (A) изофлюрановая анестезии установки: 1) индукции камеры для первоначального анестезии; 2) насос; 3) блок анестезии; 4) маршрутизации переключатель клапана; 5) анестезии поставки труб; 6) блок приспособления; 7) респиратор; 8) с подогревом операционный стол; 9) бинокль стереоскоп с источником света; 10) блок управления. Оборудование для хирургии (B): 1) Электробритва; 2) глаз смазки; 3) фиксации ленты; 4) гигиенические прокладки; 5) Ирис щипцы (10 см, изогнутая, зубчатые); 6 и 7) Ирис ножницы (11 см, прямой, твердосплавные); 8) Дюмон пинцет (#3, 12 см, прямой, 0,2 мм x 0,12 мм); 9) Vanna ножницы (8 см, прямые); 10 и 11) микро комаров гемостатический пинцет (12,5 см, изогнутая); 12) фильм парафин; 13) микро ложка; 14) ватные тампоны; 15 и 16) Хальстед комаров гемостатический пинцет (12,5 см, прямые); 17 и 18) швы (размер 6-0 и 3-0); 19) шприц; 20) Аспиратор трубки для пипетки калибровки микрокапиллярной. (C) схема систематического нумерации эмбрионов в рога матки на эмбриональных день (E) 14.5: L = left; R = правый. (D) стратегии впрыска: в первой и второй мозг желудочки (яve и IIve, соответственно), четвертый желудочек (veIV) и спинного мозга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Документация изолированных ткани, telemacrography. (A и B) Встраивание головного и спинного мозга в агарозы, используя кюветы с системой координат (сетки). После резки, разделы подвергаются telemacrography и вмешательства отражения света изображений. (C-F) Поперечные и сагиттальной участки мозга. Масштаб баров = 5 мм; Co = коры; ST = стриатума; Di = таламус; Me = среднего мозга; Привет = гиппокампа; пед = pedunculi мозга; CE = мозжечка; Mo = продолговатого мозга. (G и H) поперечном разрезе шейного сегмента спинного мозга. Шкалы бар = 1 мм; ahR = прямо передний Рог; ahL = левый передний Рог; DF = спинной водянки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Топографические и ультраструктурная идентификации параметров пластичности. (А1) Перевернутый интерференции света macrograph гиппокампа. Выделяется региона моховые волокна boutons в пределах lucidum stratum (sl). PCL = слоя пирамидальных клеток; GCL = гранул слоя клеток. Шкалы бар = 500 мкм. (А2) света microphotograph (100 x цель) полутонкая секции (0,75 мкм) показаны stratum lucidum. Звездочки показывают регионы boutons Мшистое волокна, которые окружают многих дендритных острова (черные стрелки). Толуидиновый синий/OsO4 пятнать. Шкалы бар = 50 мкм. (A3) передачи электронная микрофотография на малое увеличение, показываю моховые волокна boutons (звездочки) окружающих дендритов (D). Прямоугольник включает в себя один моховые волокна бутона. Шкалы бар = 2 мкм. (A4) передачи электронная микрофотография профиля поперечного сечения одного моховые волокна бутона (MFB). Колючки (синий) и бутона сечение (фиолетовый), выделены. m = митохондрий; s = колючки. Шкалы бар = 200 Нм. (A5) Синаптических пузырьков внутри MFB. Шкалы бар = 100 Нм. (B1) Перевернутый интерференции света macrograph мозжечка. Указывается регион слоя клеток гранул (gcl), содержащий моховые волокна boutons. MCL = молекулярный слой; h = хилус. Шкалы бар = 500 мкм. (B2) света microphotograph (100 x цель) полутонкая секции (0,75 мкм) показаны область слоя клеток гранул, который граничит с клеток Пуркинье (PC). Звездочки показывают регионах моховые волокна boutons, которые находятся в окружении многих нейронов мозжечка гранул (CGN). Толуидиновый синий/OsO4 пятнать. Шкалы бар = 50 µm. (B3) передачи электронная микрофотография при низком увеличении, показаны области МПБ. Прямоугольник включает одну кнопку MFB. Шкалы бар = 2 мкм. (B4) передачи электронная микрофотография профиля поперечного сечения гриб как MFB в слое гранул клеток мозжечка. Бутон сечение (фиолетовый) и свободной везикул шипами (синий), выделены. Шкалы бар = 1 мкм. (B5) митохондрии (фиолетовый) и синаптических пузырьков внутри MFB. Шкалы бар = 150 Нм. (C1) Перевернутый свет macrograph вмешательства спинного мозга. Выделена область дорсальной водянки (df), который содержит сильно Миелинизированные аксоны. ahR и АХЛ = правой и левой передней рога, соответственно; ВПЧ и phL = справа и слева заднего рога, соответственно. Шкалы бар = 500 мкм. (C2) света microphotograph (100 x цель) полутонкая секции (0,75 мкм) показаны спинной водянки, который обогащен сильно Миелинизированные аксоны (АКС), которые четко отличимы от безмиелиновые волокон (звездочки). CT = соединительной ткани. Толуидиновый синий/OsO4 пятнать. Шкалы бар = 50 µm. (C3) передачи электронная микрофотография профилей поперечных сечений циклопоид и безмиелиновые аксонов (топор, фиолетовый). Моя = миелиновой оболочки. Шкалы бар = 200 Нм. (C4) Rectangle показывает увеличенное высоким, сильно Миелинизированные аксоны с ламелями миелина и безмиелиновые волокна. Микротрубочки (mt) и митохондрии (m) в пределах аксональное волокна являются видимыми. Шкалы бар = 50 Нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Примеры параметров ультраструктурных пластичности в различных моделях животных. (A) boutons Мшистое волокна мозжечка акулы. Шкалы бар = 400 Нм. (B) моховое волокна бутона в гиппокампе резус макака. Шкалы бар = 200 Нм. (C) нервно-Джанкшн кошки. Шкалы бар = 300 Нм. (D) синаптической boutons в Substantia Парс reticularis, о phalanger. Звездочки показывают постсинаптических плотность (PSD; врезные: черные стрелки). Rectangle показывает увеличенное PSD. Шкалы бар = 400 Нм. (E) A nonmyelinating Шванновские клетки (SC) вокруг много аксональное волокон в спинной ганглий мыши. В непосредственной близости сильно Миелинизированные волокна являются видимыми. Шкалы бар = 300 Нм. Для всех панелей: ax = аксона; D = дендритов; m = митохондрий; MFB = бутона моховые волокна; MF = моховые волокна; Моя = миелиновой оболочки; s = позвоночника; SA = аппарата позвоночника; SV = синаптических пузырьков. Контактная сайты (постсинаптических плотность) обозначаются звездочками. Фиолетовый и синий выделяются области сечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Решающий шаг в утробе трансдукции является процедура инъекции. Точное инъекции в желудочки мозга или в другую область интересов требует опыта и практических навыков. Чем тоньше кончик микрокапиллярной, может произойти меньше повреждение тканей; Однако это за счет увеличения давления впрыска. В отличие от внутриутробно электропорации19,20,21,22показатель выживаемости эмбрионов вводят после внутриутробно трансдукции очень высока. Все эмбрионы рога матки могут быть введены, даже если эмбрионы находятся в корни маточные рожки и нужно быть подрегулировано внутри матки sac. Этапы развития инъекций и анализа может быть адаптирована к научный вопрос.
Когда вводится в желудочках мозга, частицы AAV1 распространяются через спинномозговой жидкости через всю желудочковой системы. Разработке структуры с поверхностей, которые находятся в тесном контакте с ликера, такие как гиппокамп и мозжечке, преобразованы в прикладной вирусных частиц5,6,7. Анализ изменений ультраструктурных параметры, такие как размер бутона, поперечном бутона областей, числа синаптических пузырьков, количество митохондрий и цифры и длина синаптических контактов в этих структурах, является элегантный считывания Ультраструктурные пластичности. Внутриутробно трансдукции метод может применяться для изучения различных мозга областях, а также спинного6. Кроме того другие органы и ткани аналогично могут быть выбраны как трансдукции целей. Наконец модель часто используемых мыши могут быть заменены другими видами при необходимости.
Фотографии фрагментов тканей позволяет очень точно рассечение смолы встроенный образцов для просвечивающей электронной микроскопии. Так как пространственной ориентации образца определяется, резки обширные и времени был опущен. Кроме того решающее значение соседних регионов может храниться в их оригинальной отношения друг к другу. Важным преимуществом фотографической документации шаг является возможность контролировать качество фиксации ткани и признать патологических изменений. Таким образом качество фиксации и встраивание материала имеет первостепенное значение. Nonsuitable образцы, которые содержат артефакты могут быть переданы перед дальнейшей обработкой.
Микрофотография серии фотосъемка тканей срезы обеспечивают полезные морфологических Атлас. Нейроанатомический сравнительных исследований, которые могут также включать редких видов, Атлас представляет собой ценный Архив. Выбор толщины кусочков ткани зависит рассматривается вопрос научной и ограничен размер образца ткани. Для мелких животных должны быть скорректированы толщиной до 1 мм. Очень толстые секции (> 5 мм) не рекомендуется, из-за ограниченной Проникновение потенциал осмия тетраоксид8,9,10.
Telemacrophotography документация необходима для морфометрических исследований. Он предлагает фиксированный корреляции поверхности ткани на боковой и верхней плоскости рамы и определяет положение данной структуры в пространственной системы координат. Сочетание описанных метода электрофизиологии18 или с моделью травмы спинного мозга, где пластичности играет важную роль в регенерации6, возможен. Нейроанатомический сравнительных исследований, которые могут также включать редких видов, Радужное ткани атласа и микрографические изображений ТЕА ультраструктурных параметров являются ценными активами.
Несмотря на свои сильные стороны, ТЕА имеет несколько ограничений размера толщина образца (70 нм), области поперечном (< 6 мм2) и сложность подготовки пробы. Однако когда образец точно готова, ТЕА изображения образца Ультраструктура являются высшего качества по сравнению с изображения, любой свет микроскопические методы. Внутриутробно трансдукции техника ограничивается вводят объем и топографические региона инъекции. Бесспорно техника имеет сильный трансляционного медицинских потенциал в начале развития лечения и в спасении патологического врожденными. Кроме того настоящий сочетание внутриутробно трансдукция с ТЕА не только может рассматриваться как подход для будущего лечения врожденных заболеваний, но и для диагностики высокого качества на основе Ультраструктура психомоторного развития.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарят коллег животных фонда на медицинском факультете, Рурского университета Бохума, за их поддержку и животных ухода.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol | Serva | 36975 | |
| 26 G x 1'' needle | Henke-Sass, Wolf GmbH | ||
| 410 Anaesthesia Unit for air pump | Biomedical Instruments (Univentor) | 8323102 | |
| Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) | UKE (Viral Core Facility) | - | For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54. |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | low gelling agarose |
| Air Pump | Biomedical Instruments (Univentor) | Eheim 100 | |
| Araldite | CIBA-GEIGY | 23857.9 | resin for embedding of tissue |
| aspirator tune assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium | Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| buprenorphine | Temgesic | ampules | painkiller |
| capillaries | Science-Products | GB100TF-10 | with fillament |
| Dodecenylsuccinic anhydride | Fluka | 44160 | |
| Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) | FST | 11203-23 | |
| electric shaver | Phillips | - | |
| Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) | Ethicon | - | polyamide |
| eye lubricant | Bepanthene | - | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | for visualization of injected liquids |
| Gas Routing Switch 4/2 connectors | Biomedical Instruments (Univentor) | 8433020 | |
| halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) | FST | 13011-12 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 25 000 I.E./5 mL | |
| Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155 mm x 115 mm x 130 mm. Wall thickness: 6 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| iris forceps (10 cm, curved, serrated) | FST | 14007-14 | |
| iris scissors (11 cm, straight, tungsten carbide) | FST | 14501-14 | |
| Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257mm x110 mm x 18 mm. Heating area: 190 mm x 90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations |
Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| isoflurane (Attane) | JD medical | inhalation anesthesia | |
| LED RGB lights | Cameo | CLQS15RGBW | LEDs 2 x 15 W |
| Light microscope Basic DM E | Leica | - | 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives |
| micropipette puller | Science-Products | P-97 | |
| Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, curved) | FST | 13010-12 | |
| Nickel grids, 200 mesh | Ted Pella | 1GC200 | |
| Osmium (VIII)-oxid | Degussa | 73219 | |
| Propylene oxide | Fluka | 82320 | |
| razor blades | Schick | 87-10489 | |
| Sodium pentobarbital (Narcoren) | Merial GmbH | - | |
| TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback | Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| Technovit 4004 two components glue | Kulzer | ||
| Telemacrodevice | Canon | - | Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand. |
| Thermopuller P-97 | Sutter Instruments | - | |
| thin vibrating razor blade device | Krup | - | with Szabo thin blades |
| toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Transmission electron microscope C20 | Phillips | - | up to 200 kV |
| Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6 mm Inner diameter: 4 mm Wa ll thickness: 1 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| Ultracut E | Reichert-Jung | - | ultramicrotome |
| Univentor Scavenger | Biomedical Instruments (Univentor) | 8338001 | |
| Vannas scissors (8 cm, straight) | FST | 15009-08 |
References
- Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers. Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).
- Hamlyn, L. H. The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit. Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).
- Peters, A., Palay, S., Webster, H. The Fine Structure of the Nervous System. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1991).
- Rollenhagen, A., et al. Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses. Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).
- Lutz, D., et al. Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival. Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).
- Lutz, D., et al. Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury. Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).
- Kraus, K., et al. A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination. Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).
- Andres, K. H., von Düring, M. Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung. Mikroskopie. 30, 139 (1974).
- Andres, K. H., von Düring, M. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. Hayat, M. A. , Van Norstrand Reinhild. 246-261 (1997).
- Andres, K. H., von Düring, M. General Methods for Characterization of Brain Regions. Techniques in Neuroanatomical Research. Heym, C., Forssmann, W. -G. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. 100-108 (1981).
- Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).
- Webster, H. F., Collins, G. H. Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).
- Andres, K. H. Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern. Mikroskopie. 21, 169 (1967).
- Forssmann, W. G., et al. Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation. Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).
- Descarries, L., Schröder, J. M. Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit. Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).
- Langford, L. A., Coggeshall, R. E. The use of potassium ferricyanide in neural fixation. Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).
- Liu, J., et al. Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex. Molecular Brain. 7, 84 (2014).
- Lee, S. H., et al. Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway. Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. , Suppl 1 120-125 (2009).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
- Nishiyama, J., et al. Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation. European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).
- Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo. Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).
