Summary
La combinación de microscopía electrónica de transmisión y transducción de señales en el útero es un poderoso enfoque para estudiar los cambios morfológicos en la ultraestructura fina del sistema nervioso durante el desarrollo. Este método combinado permite penetraciones profundas en cambios en los detalles estructurales subyacentes de neuroplasticidad con respecto a su representación topográfica.
Abstract
El presente estudio combina la transducción en el útero con microscopía electrónica de transmisión (TEM) con el objetivo de un análisis preciso morfométricas de parámetros ultraestructurales en estructuras topográficas claramente identificados, afectados por una proteína de interés se introduce en el organismo vía transferencia viral. Este enfoque combinado permite una transición fluida de macroestructurales a identificación ultraestructural por mapas topográficos de la navegación en un atlas de tejido. Alta resolución microscopia electrónica del tejido en el útero-transduced revela la fina ultraestructura el neuropil y sus parámetros de plasticidad, tales como áreas de sección bouton sináptico, el número de vesículas sinápticas y mitocondrias dentro de un Perfil de Bouton, la longitud de los contactos sinápticos, sección áreas axonales, el grosor de las vainas de mielina, el número de laminillas del myelin y áreas de sección de perfiles de las mitocondrias. El análisis de estos parámetros revela conocimientos esenciales en los cambios de plasticidad ultraestructural en las áreas del sistema nervioso que se ven afectados por la transferencia viral de la construcción genética. Este método combinado no sólo se puede utilizar para estudiar el efecto directo de biomoléculas genéticamente o drogas en la plasticidad neuronal pero también abre la posibilidad para estudiar el rescate en el útero de la plasticidad neuronal (por ejemplo, en el contexto de enfermedades neurodegenerativas).
Introduction
Ningún fotón puede penetrar a una muestra de tejido ultrafino en el grado de profundidad de un electrón. Esto atribuye ventajas inestimables a TEM en la captura de imágenes de resolución nanométrica de estructuras finas en comparación con técnicas de microscopía de luz. Por ejemplo, permite la visualización de los organelos intracelulares como mitocondrias, melanosomas y varios tipos de gránulos secretores, microtúbulos, microfilamentos, cilios, microvellosidades y uniones intercelulares (superficie de la célula TEM especializaciones), en particular sinapsis en el sistema nervioso1,2,3,4. El objetivo general del presente estudio metodológico es el reconocimiento ultraestructural de los cambios en la plasticidad neuronal durante el desarrollo sobre interferencia prenatal mediante la combinación de las técnicas de vanguardia de transducción en el útero y TEM. Virally codificadas proteínas de interés han sido transduced en el útero en el sistema nervioso central5,6,7, incluyendo la médula espinal6. Por ejemplo, en el útero transducción en combinación con TEM se ha utilizado para estudiar el efecto de la molécula de adherencia de célula L1 motor aprendizaje plasticidad en ratones deficientes en L1, en particular con respecto a la interacción entre las proteínas del receptor nuclear y L1 en las neuronas cerebelosas7.
El análisis de parámetros de neuroplasticidad requiere información precisa sobre la localización de las zonas más pequeñas dentro del sistema nervioso. Por lo tanto, es adecuada describir detalles ultraestructurales y su orientación topográfica exacta con respecto a otras estructuras. En el presente estudio, se presenta un método preparatorio específico con el objetivo de la investigación detallada de áreas morfológicas distintas basadas en la luz y la microscopia electrónica. Este enfoque combina varias técnicas de manipulación del tejido, a partir de transducción en el útero de ratón cerebro y médula espinal y seguido por la fijación de la perfusión, incrustación de molde y procesamiento del tejido para TEM. Un paso esencial entre la fijación y el procesamiento del tejido para TEM es la documentación de los tejidos, utilizando la técnica de reflexión de la luz de interferencia que permite la documentación precisa microfotográficos y baja magnificación de muestras de tejido8,9,10. Incorporado en el enfoque actual, esta técnica permite a los investigadores examinar detalles topográficos y estructurales de las superficies de tejido nervioso y de perfiles de segmento de muestra antes de su preparación para TEM.
Un marco especial para seccionar todo cerebro corresponde a las coordenadas estereotáxicas. Este marco de beneficios morfológica reconstrucción tridimensional (3D) de zonas en tejido nervioso y puede ser utilizado para el análisis morfométrico. Las macrographs de las visualizadas secciones se asignan a coordenadas topográficas, y las secciones en serie numeradas crear mapas en un atlas de tejido.
Después de procesamiento de la resina, se secciona el tejido embebido en secciones ultrafinas (< 70 nm) que contiene las áreas seleccionadas, según los mapas del atlas mencionado tejido. Las secciones ultrafinas son sometidas a TEM para obtención de imágenes de alta resolución de los parámetros (por ejemplo, áreas de sección transversal Perfil de botones sinápticos o axonales fibras) de la plasticidad de sus contenidos y de contactos a estructuras vecinas dentro del complejo neuropilo.
Con el método descrito en este documento, la transición de macroestructuras visualizado a micro - y nanoestructuras permite estudios comparativos detallados de la plasticidad neuronal morfológica después en el útero de transducción el desarrollo nervioso sistema.
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Protocol
Todos los procedimientos sobre temas animales han sido aprobados por los comités institucionales de ética animal de los Estados federales de Hamburgo y Nordrhein-Westfalen, Alemania. Utilizar instrumentos estériles, guantes y abrigos asépticas a lo largo de todo el procedimiento quirúrgico.
1. en la transducción de útero
- Preparar virus adeno-asociado tipo 1 (AAV1) codificación para el destino deseado (4 x 1011 viral partículas/μl de AAV1) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7.4. Añadir 0,1 mg/μl verde Fast Green y mantener la mezcla AAV1-Fast-Green a 37 ° C.
- Preparar una punta capilar fina con la forma deseada (8 mm de largo, con un diámetro externo de 80 μm y un interior diámetro de 50 μm), usando un extractor de micropipeta (configuración: presión = 500, calor = 700, tire = 0, velocidad = 80, tiempo = 200, vea el tabla de materiales < / c1 >). Romper la punta del tubo capilar para que sea 4-5 mm.
- Montar un tubo aspirador (44 cm x 0,7 cm) con la punta del capilar y Aspire 15 μl de la mezcla de AAV1-Fast-Green en el capilar.
- Mantener los animales sujetos a una temperatura corporal fisiológica constante de 37 ° C durante todo el procedimiento.
- Coloque un embarazada ratón C57Bl/6 (día embrionario 14.5) en la cámara de preincubación y anestesiar el ratón con gaseosa 4% isoflurano (con una tasa de flujo volumétrico de aire de 0.6-0.8 L/min).
- Inyectar por vía subcutánea, buprenorfina (0.1 mg/kg de peso corporal).
- Coloque el ratón anestesiado en la placa quirúrgica precalentada (37 ° C).
- Cubrir los ojos con un lubricante.
- Ajuste el ratón con la máscara de la anestesia (isoflurano gaseosa de 1,5% a una tasa de flujo volumétrico de aire de 0.6-0.8 L/min) en la placa quirúrgica y afeitado de la región de la piel abdominal. Limpie la región depilada con 3 X 75% etanol y luego con solución de betadine.
Nota: Controlar continuamente el comportamiento de la respiración del ratón anestesiado. Ajustar la concentración del gas isoflurano según el patrón de inhalación-exhalación del ratón. - Comprobar la ausencia del reflejo plantar apretando las falanges traseras de la pata del ratón.
- Abrir la cavidad abdominal, sujetando la piel con pinza de iris aserrado curvo (10 cm) y cortar la piel a lo largo de la linea mediana con tijeras rectas de carburo de tungsteno (10 cm) y luego, sujetando la pared peritoneal con recta Pinzas Dumont (12 cm, 0,2 mm x 0.12 mm) y tijeras de corte de la pared a lo largo de la linea alba con recta Vanna (8 cm).
- Coloque un pedazo de la película de parafina fenestrados en la abertura abdominal y fijar la película en ambos extremos con pinzas hemostáticas mosquito micro (12,5 cm, curvado).
- Exponga los cuernos uterinos con a cuchara-como el dispositivo para evitar daños a los embriones dentro de los cuernos uterinos. Gotear algunas gotas de PBS (37 ° C) en los cuernos uterinos e inspeccione los embriones por daños o malformaciones en el saco uterino.
- Documento el orden y la posición de los embriones en los cuernos uterinos. Girar los embriones con cuidado dentro del saco uterino hasta la posición deseada para la inyección.
- Inyectar 1-2 μl de la mezcla de AAV1-Fast-Green por inspeccionar visualmente el sitio de inyección (por ejemplo, ventrículos cerebrales) y la penetración de tinte bajo un estereomicroscopio.
- Documentar los embriones inyectados y coloque los cuernos uterinos con los embriones inyectados en la cavidad abdominal.
- Gotear algunas gotas de PBS (37 ° C) en la cavidad abdominal. Cerrar la cavidad suturando la pared peritoneal (uso poliamida 6-0-tamaño de las suturas) y la piel (uso poliamida 3-0-tamaño de las suturas), uso de pinzas hemostáticas de mosquito de Halsted (12,5 cm, curvado). Como alternativa, utilizar un patrón interrumpido simple o grapas/sutura de acero inoxidable para cerrar la cavidad abdominal y la piel.
2. Telemacrophotography de tejidos aislados
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Preparación de tampones
- Preparar el tampón de Sörensen (1 L) por disolución 14,95 g de Na2HPO4 y 2,18 g de KH2PO4 en 1 L de agua destilada con agitación a 200 rpm. Para perfusión de cachorros gestación o cachorros en el post-natal periodos de tiempo, use un tamaño apropiado de agujas para inyección intragástrica o abdominal y asegúrese de que la concentración de la anestesia de pentobarbital de sodio terminal no supera los 180 mg / kg de peso corporal.
- Preparar solución de fijación de Mugnaini (5 L) al calentar 500 mL de agua destilada a 75 ° C y añadir 50 g de polvo paraformaldehido con agitación a 200 rpm, añadir 200 μL de 5 N NaOH, añadir 1.500 mL de tampón de Sörensen, 1.750 mL de agua destilada y 500 mL de glutaraldehído al 25%. Llene hasta 5.000 mL con agua destilada. Utilice este búfer final para perfusión.
Nota: Preparar la solución de fijación de Mugnaini bajo el capó, usar gafas de protección y evitar humos. Añadir azul de metileno (0.05 g/L) para una mejor visualización de la perfusión.
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Aislamiento de perfusión y de tejido de ratón
- Transcardially perfusión los ratones embarazados que llevan los embriones transduced (en el caso de estudios de embriones) o los pubs transduced nacidos a la edad deseada (por ejemplo, día postnatal 24) según procedimientos estándar6,7, 11,12,13,14,15,16,17, utilizando pentobarbital sódico intraperitoneal de terminal anestesia (200 mg/kg de peso corporal).
- Inyectar a lo ratones transcardially con solución de heparina (500 U) utilizando un 26 G, 1 aguja y, antes de la fijación, infundir los ratones transcardially con 10 mL de PBS para eliminar la sangre del cuerpo y ellos perfusión transcardially con 30 mL de 40 º C precalentado Mugnaini solución de fijación.
Nota: Para los ratones adultos, realizar una alternativa perfusión retrógrada a través de la aorta abdominal14. - Aislar el tejido perfundido de interés (por ejemplo, todo el cerebro o la médula espinal) y postfix el tejido en menos de 10 mL de solución de fijación de Mugnaini por otro 24 h a 4 ° C.
- Lavar el tejido en 10 mL de PBS durante 3 horas a temperatura ambiente.
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Incrustación en agarosa, además de documentación y seccionamiento
- Ajustar el tejido aislado (por ejemplo, todo el cerebro) en un marco especial con un reproducible seccionamiento ángulo8,9,10. Como alternativa, utilice un vibratome con un espesor de corte ajustable.
- Coloque el tejido nervioso en el marco, ajustar el tejido para telemacrography y documentar las coordenadas.
- Preparar el medio de inclusión de agarosa bajo punto de fusión de 3%: agregar 3 g de agarosa en 100 mL de tampón de Sörensen y calentar la mezcla en un baño de agua a 90 ° C.
- Verter la agarosa al 3% (30 ° C) en el marco que contiene el tejido. Cubrir el marco con un bloque de metal caliente y esperar hasta que se endurece. Durante el endurecimiento, utilice dispositivos de telemacrographic para el tejido embebido y sus coordenadas en el marco de la imagen.
- Transferir el tejido embebido en agarosa en un marco con boquetes de corte correspondientes a las coordenadas del primer fotograma.
- Cortar el tejido embebido en secciones de espesor deseado (por ejemplo, 1.5 mm) con un dispositivo con una navaja delgada y vibrante (véase Tabla de materiales).
Nota: Para mejorar el deslizamiento de la hoja de afeitar, vierta unas gotas de glicerina sobre el tejido embebido. - Imagen de cada sección de tejido en PBS y recoger las imágenes en una carpeta.
3. preparación del tejido aislado para microscopía electrónica de transmisión
Nota: Realizar todos los otros pasos de incubación en platos de vidrio con tapas herméticamente con cierre en una plataforma de agitación bajo el capó.
- Lávese las secciones de tejido de 2 x 30 min en PBS. Incubar las secciones en solución acuosa el tetróxido de osmio al 2% (OsO4) por 2 h a temperatura ambiente.
PRECAUCIÓN: El tetróxido de osmio es tóxico y puede ser dañino cuando entra en contacto con la piel. - Lávese las secciones osmicated de 2 x 30 min en PBS.
- Incubar las secciones en etanol al 30%, 50% y 70% a temperatura ambiente durante 10-15 min (opcional: incubar en etanol al 70% a 4 ° C durante la noche).
- Imagen de las muestras osmicated en etanol al 70% en RGB LED luz8,9,10 (2 x 15 W) aplicadas a la muestra de la izquierda y derecha en un ángulo de 45 °. Platos de uso negro y un fondo negro opaco para reducir al mínimo la dispersión y la reflexión de la luz durante la iluminación.
PRECAUCIÓN: No permita que la sección se sequen durante proyección de imagen. - Crear un atlas de la sección con coordenadas por la recogida de imágenes en serie en una carpeta.
- Incubar a las muestras en etanol al 100% (2 x 30 min) y óxido de propileno 100% (2 x 30 minutos) a temperatura ambiente.
PRECAUCIÓN: No permita que las secciones se sequen mientras se cambian las soluciones. - Mezclar 260 mL de resina con 240 mL de anhídrido dodecenylsuccinic en un recipiente de vidrio, agitando suavemente con una barra de vidrio. Revise periódicamente la inhomogeneidad, burbujas y manchas. Muy suavemente, agitar a mano durante al menos 45 minutos.
- Preparar óxido de propileno/resina en una proporción de 1:2 y 1:1 y añadir acelerador de 3% (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol).
- Incubar el tejido en el 1:2 incrustación solución de paso 3.8 por 2 h y luego en la solución de empotrar de 1:1 del paso 3.8 por 2 h a temperatura ambiente en un disco giratorio.
- Coloque el tejido en platos planos de polipropileno, cubrir el tejido con resina fresca que contiene 3% acelerador y curar el tejido embebido en 65-85 ° C durante 12-24 h.
- Enfriar el tejido embebido a temperatura ambiente y extraer a los especímenes incrustados de resina de los platos de polipropileno.
4. selección de parámetros de neuroplasticidad ultraestructurales para análisis cuantitativo
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Mapeo del área de interés
- Elija un área de interés (por ejemplo, el hipocampo o el cerebelo) y localizar el área en el atlas de sección seleccionando la imagen del atlas (paso 3.5) que contiene esta zona.
- Esboce las fronteras del área de interés en la imagen de la sección y encontrar/superponer estas fronteras de la región en la muestra de resina.
- Scratch-marca las fronteras de la zona de interés (por ejemplo, el hipocampo o el cerebelo) en la muestra de resina, con un calibre de aguja fina (26 G, 1 in).
- Calentar la muestra de resina a 85 ° C en un horno para ablandar la resina para el ajuste o, alternativamente, utilizar un dispositivo de corte, una lámina fina o papel de lija.
- Suprimir la zona de interés de la muestra de resina con una cuchilla de afeitar (véase Tabla de materiales). Montar al espécimen sobre la celebración de barras de vidrio acrílico del calibre requerido por ejemplo, con (un diámetro de 8 mm) y una longitud de 1 cm con pegamento. Cortar al espécimen montado para semi y seccionamiento ultrafino.
- Preparación Semifinos (0.75 μm) y ultrafino (70 nm) las secciones de la zona recortada utilizando un ultramicrótomo: situado a 1,5 mm/s de 0.75 μm de grosor y a 0,7 mm/s para el grueso de nm 70.
- Recoger las secciones SEMIFINOS en soportes de vidrio y las secciones con toluidina 1% de la mancha azul en PBS (de 4 minutos).
- Lávese las secciones varias veces en agua desionizada. Examinar las secciones manchadas bajo el microscopio óptico usando 4 x (NA de ∞ 0,1 /-), 10 x (NA de ∞/0.17 0.22), 40 x (NA de 0.65 ∞/0.17) y 100 x (NA de 1.25 ∞/0.17) objetivos.
- Recoge secciones ultradelgadas en rejillas de níquel. Utilizadas de las rejillas TEM a 180 kV y a 3, 200 x, 6, 000 x o 8.000 aumentos.
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Análisis TEM
- Elija los parámetros ultraestructurales de interés para el análisis cuantitativo de TEM (p. ej., botones con vesículas y mitocondrias o axones nonmyelinated y mielínicas) y tomar imágenes TEM de estos parámetros menores de 3 x 500, x 6.000 y 8.000 aumentos.
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Representative Results
Para la anestesia rápida y fiable de los ratones, se consideraron varios parámetros de seguridad, y un espacio de trabajo optimizado de la unidad de anestesia demostró para ser adecuada (figura 1A). La unidad está diseñada para controlar la mezcla de isoflurano líquido y aire ambiente con una precisión necesaria para la exitosa cirugía en pequeños animales, como ratones y ratas. Aire e isoflurano se mezclan en el vaporizador de acuerdo con la configuración deseada y entregados en una caja o a través de una máscara para el animal (figura 1A). El Tesoro recoge y hace inactivo cualquier gas isoflurano excedentes que pueden ser producidos, proporcionando así un ambiente de trabajo seguro. El gas se recoge y se pasa a través de carbón activo en un cartucho (figura 1A).
Un sistema optimizado de los instrumentos (figura 1B) permite a los científicos realizar la cirugía rápidamente en ratones embarazadas. Una película de parafina simple con propiedades hidrofóbicas impide que la mucosa abdominal secado después de la resección (figura 1B). Los cuernos uterinos que los embriones están expuestos en la película de parafina y los embriones se numeran de la forma que se muestra en la figura 1C. Una vez localizados, los embriones se ajustan en la posición correcta para la inyección del virus a través de un fino tubo capilar (figura 1D). La inyección es controlada visualmente observando la forma de difusión del tinte penetrante contenida en la mezcla de virus inyectado (figura 1D). Después de la inyección en el útero, los cuernos uterinos se colocan en la cavidad abdominal para permitir el desarrollo de los embriones inyectados hasta la etapa (por ejemplo, hasta el nacimiento y llegando a día postnatal 24) que es necesario para el experimento (véase, por ejemplo, Lutz et al.5 ,6 y Kraus et al.7). Estudios sobre la plasticidad sináptica, se recomiendan últimas etapas del desarrollo o adultos.
Después de una perfusión transcardial de los animales en el momento deseado, se coloca y orientado en un marco de plástico transparente con coordenadas e incrustado en agarosa (figura 2 el tejido nervioso (por ejemplo, el cerebro y la médula espinal en la figura 2) A, B). Después del corte, cada sección es reflejada (figura 2C, E, G) y luego osmicated. Después de incubación en etanol al 70% o 80% y osmication, las secciones son reflejadas otra vez mediante el uso de interferencia luz telemacrography8,9,10. Las secciones de tejidos deben colocarse en un entorno negro mate para minimizar la radiación dispersa durante la necesaria iluminación de alta intensidad. Extensiones de fibra y diferentes áreas del tejido reflejan colores iridiscentes que contrastan el fondo oscuro del tejido, y emerge un patrón concreto coloreado de la superficie del tejido (figura 2D, F, H). Iridiscentes todas las imágenes se superponen con las imágenes nonosmicated y, junto con las coordenadas proyectadas de lo paso de inclusión, generan mapas de navegación de la topografía del tejido. A continuación, el tejido más se deshidrata y se encaja en resina. Basado en los mapas de navegación, áreas de interés son elegidas y procesadas para TEM-como ejemplos, el hipocampo (lucidum del estrato), cerebelo (capa del gránulo de la célula) y la médula espinal (dorsal Spermaticus) se muestran en la figura 3A1-C4 .
En el hipocampo y el cerebelo, las sinapsis de la fibra musgosa se saben que exhiben características ultraestructurales únicas en comparación con otras sinapsis, incluyendo grandes botones presinápticos (figura 3A1-B5). Puede ser localizadas fácilmente con la ayuda de los mapas de navegación iridiscente establecidas durante los pasos anteriores del proceso. En sus perfiles de sección transversal, los botones contienen una gran cantidad de vesículas y mitocondrias y a menudo encierran varias espinas dendríticas (figura 3A4, A5, B4, B5). Imágenes TEM de estos perfiles permiten una cuantificación de bouton sináptico sección áreas, número de vesículas sinápticas y mitocondrias dentro de un perfil de bouton, la longitud de los contactos sinápticos y el número de sitios de contacto.
En la médula espinal, el Spermaticus dorsal contiene muchas fibras axonales que son myelinated por oligodendroglia. En secciones transversales, Spermaticus dorsal se encuentra entre ambos cuernos posteriores de la médula espinal en secciones transversales (figura 3C1, C2). En las imágenes de TEM, sección myelinated axons aparecen redondos y las vainas de mielina que rodea los axones se organizan en láminas (figura 3C3, C4). Una cuantificación de la sección axonales zonas, incluyendo el grueso de las vainas de mielina y del número de laminillas del myelin, así como una cuantificación de las mitocondrias sección áreas de perfil pueden llevarse a cabo.
El atlas preparado y las imágenes TEM micrográficos de los parámetros ultraestructurales no sólo son útiles para una comparación de neuroplasticidad morfológica en diferentes condiciones de tratamiento, sino también cuando una comparación entre los parámetros dentro de la misma área se requiere (por ejemplo, una comparación entre diferentes tipos de sinapsis en el hipocampo18 y estructuras equivalentes de distintas especies [figura 4]).
Figura 1 : Preparación para la transducción en el útero. Instalación de la anestesia isoflurano (A): 1) cámara de inducción de la anestesia inicial; 2) bomba de; 3) unidad de anestesia; 4) válvula del interruptor de distribución; 5) suministro de anestesia de la tubería; 6) unidad carroñero; 7) mascarilla; 8) mesa quirúrgica climatizada; 9) binocular estereoscopio con fuente de luz; 10) unidad de control. Equipo de cirugía (B): 1) máquina de afeitar eléctrica; 2) lubricante ojo; 3) cintas de fijación; 4) compresas; 5) pinza de iris (10 cm, curvado, dentado); 6 y 7) tijeras de iris (11 cm, recta, carburo de tungsteno); 8) pinzas Dumont (#3, 12 cm, recta, 0,2 mm x 0.12 mm); 9) tijeras de Vanna (8 cm, recta); 10 y 11) micro mosquito pinzas hemostáticas (12,5 cm, curvado); 12) película de parafina; 13) micro cuchara; 14) hisopos de algodón; 15 y 16) de pinza Halsted mosquito hemostática (12,5 cm, recta); 17 y 18) suturas (tamaño 6-0 y 3-0); 19) jeringa de; 20) montajes de tubo de aspirador para pipetas calibradas microcapillary. (C) esquema de una enumeración sistemática de embriones dentro de los cuernos uterinos en el día embrionario (E) 14.5: L = izquierda; R = a la derecha. (D) estrategias de la inyección: en los ventrículos de cerebro primero y segundo (love y IIve, respectivamente), cuarto ventrículo (IVve) y la médula espinal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Documentación de tejido aislado por telemacrography. (A y B) Incorporación de un cerebro y una médula espinal en agarosa, usando cubetas con un sistema de coordenadas (rejillas). Después del corte, las secciones son sometidas a telemacrography e interferencia reflexión proyección de imagen de la luz. (C-F) Secciones transversales y sagitales del cerebro. Barras de la escala = 5 mm; Co = corteza; St = estriado; di = diencéfalo; me = mesencéfalo; Hola = hipocampo; PED = cerebri de pedunculi; CE = cerebelo; mo = oblongata de la médula. (G y H) sección Transversal de un segmento cervical de la médula espinal. Barra de escala = 1 mm; ahR = cuerno anterior derecho; ahL = cuerno anterior izquierdo; DF = Spermaticus dorsal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Identificación topográfica y ultraestructural de los parámetros de la plasticidad de. (A1) Macrograph luz de interferencia invertida del hipocampo. Se destaca la región de los boutons de musgo de la fibra dentro del lucidum del estrato (sl). PCL = estrato de células piramidales; GCL = capa de la célula del gránulo. Barra de escala = 500 μm. (A2) luz microphotograph (objetivo de 100 x) de una sección Semifinos (0.75 μm) con lucidum del estrato. Los asteriscos indican las regiones de boutons de fibra musgosa que rodean muchas islas dendríticas (flecha negra). Toluidina azul/OsO4 tinción. Barra de escala = 50 μm. (A3) transmisión micrografía electrónica a bajo aumento, que muestra botones de fibra musgosa (asteriscos) que rodea una dendrita (D). El rectángulo incluye un bouton de fibra musgosa. Barra de escala = 2 μm. (A4) transmisión micrográfo de electrón del perfil transversal de un bouton sola fibra musgosa (MFB). Se destacan las espinas (azul) y el área seccionada transversalmente de bouton (violeta). m = mitocondria; s = espinas. Barra de escala = 200 nm. (A5) Vesículas sinápticas dentro un MFB. Barra de escala = 100 nm. (B1) Macrograph luz de interferencia invertida del cerebelo. Se indica la región de la capa de células de gránulo (gcl) que contiene los botones de fibra musgosa. MCL = capa molecular; h = hilus. Barra de escala = 500 μm. (B2) luz microphotograph (objetivo de 100 x) de una sección Semifinos (0.75 μm) mostrando una región de la capa de células de gránulo que confina con las células de Purkinje (PC). Los asteriscos indican las regiones de boutons de fibra musgosa que están rodeados de muchas neuronas cerebelosas del gránulo (CGN). Toluidina azul/OsO4 tinción. Barra de escala = 50 μm. (B3) transmisión micrografía electrónica en una ampliación baja, que muestra el área de MFBs. El rectángulo incluye una sola MFB. Barra de escala = 2 μm. (B4) transmisión micrográfo de electrón del perfil transversal de un MFB seta-como dentro de la capa de la célula del gránulo del cerebelo. El área seccionada transversalmente de bouton (violeta) y espinas de vesícula-libre (azul). Barra de escala = 1 μm. (B5) (violeta) de mitocondrias y vesículas sinápticas dentro un MFB. Barra de escala = 150 nm. (C1) Macrograph luz de interferencia invertida de la médula espinal. Se destaca la región de la dorsal Spermaticus (df) que contiene pesadamente myelinated axons. ahR y ahL = derecha e izquierda cuerno anterior, respectivamente; phR y phL = derecha e izquierda cuerno posterior, respectivamente. Barra de escala = 500 μm. (C2) luz microphotograph (objetivo de 100 x) de una sección Semifinos (0.75 μm) mostrando la Spermaticus dorsal que se enriquecieron con pesadamente myelinated axons (ax) que son claramente distinguibles de las fibras nonmyelinated (asteriscos). CT = tejido conectivo. Toluidina azul/OsO4 tinción. Barra de escala = 50 μm. (C3) transmisión micrográfo de electrón de perfiles seccionados transversalmente de axones myelinated y nonmyelinated (ax, violeta). mi = envolturas de myelin. Barra de escala = 200 nm. (C4) El rectángulo muestra alta magnificado, pesadamente myelinated axons con laminillas de mielina y fibras nonmyelinated. Los microtúbulos (mt) y mitocondrias (m) dentro de las fibras axonales son accesibles. Barra de escala = 50 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Ejemplos de parámetros de plasticidad ultraestructurales en diferentes modelos animales. Boutons de musgo de la fibra (A) en el cerebelo de un tiburón. Barra de escala = 400 nm. Bouton de fibra musgosa (B) en el hipocampo de un macaque del macaco de la India. Barra de escala = 200 nm. (C) Unión Neuromuscular de un gato. Barra de escala = 300 nm. (D) botones sinápticos en la pars reticularis sustancia negra de un phalanger. Los asteriscos indican la densidad postsináptica (PSD; en recuadro: negro puntas de flecha). El rectángulo muestra un PSD magnificado. Barra de escala = 400 nm. Nonmyelinating (E) A las células de Schwann (SC) que rodean muchas fibras axonales en el ganglio espinal de un ratón. En los alrededores, pesadamente myelinated fibras son visibles. Barra de escala = 300 nm. Para todos los paneles: ax = axón; D = dendrita; m = mitocondria; BMF = bouton de fibra musgosa; MF = Fibra musgosa; mi = vainas de mielina; s = columna; SA = aparato de la espina dorsal; SV = vesículas sinápticas. Contacto sitios (densidad postsináptica) se indican con asteriscos. Áreas de sección transversal se resaltan en azul y violeta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Un paso crucial de transducción en el útero es el procedimiento de inyección. La inyección precisa en ventrículos cerebrales o en otra área de interés requiere experiencia y habilidad práctica. La más fina la punta microcapillary, el menor daño tisular puede ocurrir; sin embargo, esto es a costa de aumentar la presión de la inyección. En contraste con electroporación en el útero19,20,21,22, la tasa de supervivencia de los embriones inyectados después de transducción en el útero es muy alta. Todos los embriones del cuerno uterino pueden ser inyectados, incluso si los embriones se encuentran en las raíces de los cuernos uterinos y necesitan reajustarse dentro del saco uterino. Las etapas del desarrollo de inyección y análisis pueden ser adaptadas a la pregunta científica.
Cuando se inyecta en los ventrículos del cerebro, se distribuyen las partículas AAV1 mediante el líquido cerebroespinal a través de todo el sistema ventricular. Desarrollar estructuras con superficies que están en contacto con el licor, como el hipocampo y el cerebelo, son transduced por las partículas virales aplicada5,6,7. Un análisis de los cambios ultraestructurales parámetros tales como tamaño de bouton, zonas de bouton sección, número de vesículas sinápticas, número de mitocondrias y número y longitud de contactos sinápticos en estas estructuras, es una lectura elegante para plasticidad ultraestructural. El método de transducción en el útero puede ser aplicado para estudiar diversas áreas del cerebro y la médula espinal6. Además, otros órganos y tejidos pueden igualmente elegir como blancos de transducción de señales. Finalmente, el modelo de ratón con frecuencia usados puede reemplazarse por otras especies según se requiera.
La fotografía de los cortes de tejido permite una muy precisa disección de muestras embebido en resina para microscopía electrónica de transmisión. Puesto que se define la orientación espacial de la muestra, corte amplio y lento fue omitido. Además, las regiones vecinas cruciales pueden conservarse en su relación original entre sí. Una ventaja importante de la etapa de documentación fotográfica es la posibilidad de monitorear la calidad de la fijación del tejido y reconocer alteraciones patológicas. Así, la calidad de la fijación y la inclusión del material es de importancia fundamental. Nonsuitable muestras que contienen artefactos pueden contratará antes de procesarla.
La serie de micrografía de las rebanadas de tejido imagen proporciona un atlas morfológico útil. Comparativo estudios neuroanatomical, que también se pueden incluir especies raras, el atlas es un valioso archivo. La elección del grosor de las rebanadas de tejido depende de la pregunta científica dirigida y limitada por el tamaño de la muestra de tejido. Para pequeños animales, se debe ajustar hasta 1 mm de espesor. Secciones muy gruesas (> 5 mm) no son recomendables, debido a la capacidad de penetración limitada de tetróxido de osmio8,9,10.
La telemacrophotography la documentación es esencial para estudios morfométricas. Ofrece una correlación fija de la superficie del tejido al lado y plano superior de la estructura y define la posición de una estructura determinada en un sistema espacial de coordenadas. Una combinación del método descrito con electrofisiología18 o con el modelo de lesión de médula espinal, donde la plasticidad juega un papel esencial en la regeneración6, es posible. Comparativo estudios neuroanatomical, que también se pueden incluir especies raras, el atlas de tejidos tornasolados y las imágenes TEM micrográficos de los parámetros ultraestructurales son activos valiosos.
A pesar de sus puntos fuertes, TEM tiene varias limitaciones debido al tamaño del grueso de la muestra (70 nm), el área de sección (< 6 mm2) y la complejidad de la preparación de la muestra. Sin embargo, cuando un espécimen es preparado con precisión, las imágenes TEM de la ultraestructura de la muestra son de calidad superior en comparación con imágenes producidas por cualquiera de las técnicas luz microscópica. La técnica de transducción en el útero está limitada por el volumen inyectado y la región topográfica de la inyección. Sin lugar a dudas, la técnica tiene un gran potencial médico traslacional en el tratamiento del desarrollo temprano y en el rescate de enfermedades congénitas de neuropathological. Por otra parte, la combinación presente de transducción en el útero con TEM puede solamente considerarse como un enfoque para el tratamiento futuro de enfermedades congénitas, sino también para el diagnóstico de la calidad basado en la ultraestructura del neurodesarrollo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a los colegas de la instalación animal en la Facultad de medicina, Universidad del Ruhr de Bochum, para el cuidado de sus animales y apoyo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol | Serva | 36975 | |
| 26 G x 1'' needle | Henke-Sass, Wolf GmbH | ||
| 410 Anaesthesia Unit for air pump | Biomedical Instruments (Univentor) | 8323102 | |
| Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) | UKE (Viral Core Facility) | - | For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54. |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | low gelling agarose |
| Air Pump | Biomedical Instruments (Univentor) | Eheim 100 | |
| Araldite | CIBA-GEIGY | 23857.9 | resin for embedding of tissue |
| aspirator tune assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium | Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| buprenorphine | Temgesic | ampules | painkiller |
| capillaries | Science-Products | GB100TF-10 | with fillament |
| Dodecenylsuccinic anhydride | Fluka | 44160 | |
| Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) | FST | 11203-23 | |
| electric shaver | Phillips | - | |
| Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) | Ethicon | - | polyamide |
| eye lubricant | Bepanthene | - | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | for visualization of injected liquids |
| Gas Routing Switch 4/2 connectors | Biomedical Instruments (Univentor) | 8433020 | |
| halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) | FST | 13011-12 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 25 000 I.E./5 mL | |
| Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155 mm x 115 mm x 130 mm. Wall thickness: 6 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| iris forceps (10 cm, curved, serrated) | FST | 14007-14 | |
| iris scissors (11 cm, straight, tungsten carbide) | FST | 14501-14 | |
| Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257mm x110 mm x 18 mm. Heating area: 190 mm x 90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations |
Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| isoflurane (Attane) | JD medical | inhalation anesthesia | |
| LED RGB lights | Cameo | CLQS15RGBW | LEDs 2 x 15 W |
| Light microscope Basic DM E | Leica | - | 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives |
| micropipette puller | Science-Products | P-97 | |
| Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, curved) | FST | 13010-12 | |
| Nickel grids, 200 mesh | Ted Pella | 1GC200 | |
| Osmium (VIII)-oxid | Degussa | 73219 | |
| Propylene oxide | Fluka | 82320 | |
| razor blades | Schick | 87-10489 | |
| Sodium pentobarbital (Narcoren) | Merial GmbH | - | |
| TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback | Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| Technovit 4004 two components glue | Kulzer | ||
| Telemacrodevice | Canon | - | Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand. |
| Thermopuller P-97 | Sutter Instruments | - | |
| thin vibrating razor blade device | Krup | - | with Szabo thin blades |
| toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Transmission electron microscope C20 | Phillips | - | up to 200 kV |
| Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6 mm Inner diameter: 4 mm Wa ll thickness: 1 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| Ultracut E | Reichert-Jung | - | ultramicrotome |
| Univentor Scavenger | Biomedical Instruments (Univentor) | 8338001 | |
| Vannas scissors (8 cm, straight) | FST | 15009-08 |
References
- Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers. Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).
- Hamlyn, L. H. The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit. Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).
- Peters, A., Palay, S., Webster, H. The Fine Structure of the Nervous System. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1991).
- Rollenhagen, A., et al. Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses. Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).
- Lutz, D., et al. Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival. Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).
- Lutz, D., et al. Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury. Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).
- Kraus, K., et al. A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination. Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).
- Andres, K. H., von Düring, M. Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung. Mikroskopie. 30, 139 (1974).
- Andres, K. H., von Düring, M. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. Hayat, M. A. , Van Norstrand Reinhild. 246-261 (1997).
- Andres, K. H., von Düring, M. General Methods for Characterization of Brain Regions. Techniques in Neuroanatomical Research. Heym, C., Forssmann, W. -G. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. 100-108 (1981).
- Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).
- Webster, H. F., Collins, G. H. Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).
- Andres, K. H. Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern. Mikroskopie. 21, 169 (1967).
- Forssmann, W. G., et al. Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation. Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).
- Descarries, L., Schröder, J. M. Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit. Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).
- Langford, L. A., Coggeshall, R. E. The use of potassium ferricyanide in neural fixation. Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).
- Liu, J., et al. Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex. Molecular Brain. 7, 84 (2014).
- Lee, S. H., et al. Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway. Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. , Suppl 1 120-125 (2009).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
- Nishiyama, J., et al. Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation. European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).
- Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo. Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).
