Summary
Die Kombination von Transmissions-Elektronenmikroskopie und in der Gebärmutter Transduktion ist ein leistungsfähiger Ansatz für das Studium der morphologischer Veränderungen in den feinen Ultrastruktur des Nervensystems während der Entwicklung. Diese kombinierte Methode ermöglicht tiefe Einblicke in Änderungen in Strukturdetails Neuroplastizität in Bezug auf ihre topographische Darstellung zugrunde liegen.
Abstract
Die vorliegende Studie verbindet im Mutterleib Transduktion mit Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) mit dem Ziel einer präzise morphometrischen Analysis der Ultrastrukturforschung Parameter eindeutig identifizierten topographische Strukturen, ein Protein des Interesses betroffen Das wird in den Organismus über virale Übertragung eingeführt. Dieser kombinierte Ansatz ermöglicht einen reibungslosen Übergang vom Macrostructural zum Ultrastrukturforschung Identifikation durch folgende topographische Navigationskarten in einem Gewebe-Atlas. Hochauflösende Elektronenmikroskopie des Gewebes in-Utero-ausgestrahlt verrät das feine Ultrastruktur der Neuropil und dessen Plastizität Parameter, wie z. B. Modellbaugruppe synaptische Bouton Bereiche, die Anzahl der synaptischen Vesikel und Mitochondrien innerhalb einer Bouton Profil, die Länge der synaptischen Kontakte, geschnittenen axonale Bereiche, die Dicke der Myelinscheiden, die Anzahl der Myelin-Lamellen und geschnittenen Flächen der Mitochondrien Profile. Die Analyse dieser Parameter zeigt wesentliche Einblicke in die Veränderungen der Ultrastrukturforschung Plastizität in den Bereichen des Nervensystems, die durch die viralen Übertragung von genetischen Konstrukt betroffen sind. Diese kombinierte Methode kann nicht nur zur Untersuchung der direkten Wirkung von gentechnisch Biomoleküle und/oder Drogen auf neuronale Plastizität, sondern eröffnet auch die Möglichkeit, die im Mutterleib Rettung neuronale Plastizität (z. B. im Rahmen der Studie Neurodegenerative Erkrankungen).
Introduction
Kein Photon kann eine ultradünne Gewebeprobe in die Tiefe Note eines Elektrons eindringen. TEM schreibt das unschätzbare Vorteile bei der Erfassung von Nanometer Auflösung feiner Strukturen im Vergleich zu lichtmikroskopische Techniken. Beispielsweise kann TEM für die Visualisierung von intrazellulären Organellen wie Mitochondrien, Melanosomen und verschiedene Arten von sekretorischen Granulat, Mikrotubuli, Microfili, Cilien, Mikrovilli und interzellulären Verzweigungen (Zelloberfläche Spezialisierungen), insbesondere die Synapsen im Nervensystem1,2,3,4. Das übergeordnete Ziel der vorliegenden Studie methodische ist die Ultrastrukturforschung Anerkennung der Änderungen in neuronale Plastizität während der Entwicklung auf pränatale Störungen durch die Kombination der State-of-the-Art-Techniken in der Gebärmutter Transduktion und TEM. Viral kodierten Proteine des Interesses haben in der Gebärmutter in das zentrale Nervensystem5,6,7, einschließlich Rückenmark6ausgestrahlt wurde. Zum Beispiel wurde in der Gebärmutter Transduktion in Kombination mit TEM verwendet für die Untersuchung der Wirkung von der Zelle Adhäsionsmolekül L1 auf motorischen Lernens Plastizität bei L1-defizienten Mäusen, insbesondere im Hinblick auf das Zusammenspiel zwischen L1 und nukleare Rezeptorproteine zerebelläre Neuronen7.
Die Analyse der Neuroplastizität Parameter erfordert genaue Informationen über die Lokalisation der kleinste Bereiche innerhalb des Nervensystems. Daher ist es angemessen, Ultrastrukturforschung Details und die genaue topographische Orientierung in Bezug auf andere Strukturen zu beschreiben. In der vorliegenden Studie wird eine bestimmte vorbereitende Methode mit dem Ziel der detaillierten Untersuchung von unterschiedlichen morphologischen Bereichen basierend auf Licht- und Elektronenmikroskopie vorgestellt. Dieser Ansatz kombiniert mehrere Techniken der Gewebe Manipulation, beginnend mit der Mausgehirn und Rückenmark im Mutterleib Transduktion und gefolgt von Perfusion Fixierung, Schimmel-einbetten und die Verarbeitung des Gewebes für TEM. Ein wesentlicher Schritt zwischen die Einbettung und die Verarbeitung des Gewebes für TEM ist die Dokumentation des Gewebes, mit Hilfe der Interferenz Lichtreflexion Technik, die für die präzise lichtmikroskopischen und niedrig-Vergrößerung Dokumentation erlaubt Gewebe Proben8,9,10. Das derzeitige Konzept integriert, ermöglicht diese Technik Forscher um topografische und strukturelle Details von Nervengewebe Oberflächen und der Probe Slice Profile vor ihrer Zubereitung für TEM zu untersuchen.
Ein spezieller Rahmen für die ganze Gehirne-Schnitt entspricht stereotaktischen Koordinaten. Dieser Rahmen profitiert die morphologische dreidimensionale (3D) Rekonstruktion der Bereiche im Nervengewebe und morphometrische Analyse einsetzbar. Die Aufnahmen der visualisierten Abschnitte topographische Koordinaten zugewiesen sind, und die seriell nummerierte Abschnitte bauen Karten in einem Gewebe-Atlas.
Nach Harz verarbeitet, wird das eingebettete Gewebe in ultradünnen Abschnitte geschnitten (< 70 nm) mit ausgewählten Bereichen nach den Karten des Atlas genannten Gewebe. Die ultradünnen Abschnitte unterliegen TEM, hochauflösende Bilder der Plastizität Parameter (z. B. Querschnitt Profilbereiche der synaptischen Boutons oder axonalen Fasern) ihres Inhalts und der Kontakte zu benachbarten Strukturen innerhalb des Komplexes zu erhalten Neuropil.
Mit der hier beschriebenen Methode ermöglicht der reibungslose Übergang vom visualisierten Performance, Mikro- und Nanostrukturen detaillierte Vergleichsstudien der morphologischen neuronale Plastizität nach in Utero Transduktion des sich entwickelnden nervös System.
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Protocol
Alle Vorgänge an tierische Themen wurden von den institutionellen Tier Ethik-Kommissionen der Bundesländer Hamburg und Nordrhein-Westfalen, Deutschland genehmigt. Sterile Instrumente, Schutzhandschuhe und aseptische Mäntel während des gesamten chirurgischen Verfahrens zu verwenden.
1. in Utero Transduktion
- Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei pH 7.4 bereiten Sie Adeno-assoziierten Virustyp 1 (AAV1) Codierung für das gewünschte Ziel (4 x 1011 virale Partikel/µL AAV1 vor). Hinzufügen von 0,1 mg/µL schnell grün und halten Sie die AAV1-schnell-grün-Mischung bei 37 ° C.
- Bereiten Sie eine dünne Kapillare Spitze mit der gewünschten Form (8 mm lang, mit einem Außendurchmesser von 80 µm und einer inneren Durchmesser von 50 µm), mit einer Mikropipette Puller (Einstellungen: Druck = 500, Wärme = 700, ziehen = 0, Geschwindigkeit = 80, Zeit = 200, sehen die Tabelle der Materialien < / c1 >). Die Spitze der Kapillare zu brechen, so dass es 4-5 mm.
- Montieren Sie eine Absauganlage Rohr (44 x 0,7 cm) mit der Kapillare Spitze und aspirieren Sie 15 µL AAV1-schnell-grün-Mischung in die Kapillare.
- Halten Sie die Tieren Themen physiologische Körpertemperatur konstant 37 ° c während des gesamten Verfahrens.
- Legen Sie eine schwangere C57Bl/6-Maus (embryonale Tag 14,5) in der Vorinkubationsmethode Kammer und die Maus mit gasförmigen 4 % Isofluran zu betäuben (mit einem volumetrischen Luftmenge von 0,6-0,8 L/min).
- Subkutan, injizieren Sie Buprenorphin (0,1 mg/kg Körpergewicht).
- Ort der narkotisierten Maus auf die vorgewärmte chirurgische Platte (37 ° C).
- Decken Sie die Augen mit einem Gleitmittel.
- Passen Sie die Maus mit der Anästhesie-Maske (gasförmige 1,5 % Isofluran auf eine volumetrische Luftmenge von 0,6-0,8 L/min) auf dem chirurgischen Teller und Rasur der Bauchhaut-Region. Wischen Sie die rasierte Region mit 3 X 75 % Ethanol und dann mit Betadine Lösung.
Hinweis: Überwachen Sie kontinuierlich die Atmung Verhalten der narkotisierten Maus. Die Konzentration des Gases Isofluran nach dem Einatmen-Ausatmen-Muster der Maus anpassen. - Überprüfen Sie für das Fehlen der plantar Reflex durch Zusammendrücken der Hinterpfote Phalangen der Maus.
- Öffnen der Bauchhöhle durch greifen die Haut mit gebogenen gezackten Iris Zangen (10 cm) und schneiden die Haut entlang der Linea Mediana mit gerader Hartmetall Schere (10 cm), und dann, durch Festhalten der peritonealen Wand mit geraden Dumont Pinzetten (12 cm, 0,2 mm x 0,12 mm) und Schere schneiden die Wand entlang der Linea Alba mit geraden Vanna (8 cm).
- Ein Stück gefenstert Paraffin-Film über die abdominale Eröffnung und befestigen des Films an beiden Enden mit Mikro-Moskito blutstillende Zangen (12,5 cm, gebogen).
- Setzen Sie die uterine Hörner mit einem Löffel-ähnliches Gerät Beschädigungen der Embryonen in die Gebärmutter Hörner zu vermeiden. Ein paar Tropfen von PBS (37 ° C) auf die Gebärmutter Hörner und die Embryonen für Schäden oder Fehlbildungen im Inneren der Gebärmutter Sac zu inspizieren.
- Die Reihenfolge und Position der Embryonen in die Gebärmutter Hörner zu dokumentieren. Drehen Sie die Embryonen vorsichtig in die Gebärmutter Sac, bis die gewünschte Position für die Injektion erreicht ist.
- Injizieren Sie 1-2 µL AAV1-schnell-grün-Mischung durch die visuell Inspektion der Einstichstelle (z. B. Hirnkammern) und das Eindringen der Farbstoff unter einem Stereomikroskop.
- Dokumentieren Sie die injizierten Embryonen zu und platzieren Sie die uterine Hörner mit den injizierten Embryonen zurück in die Bauchhöhle.
- Ein paar Tropfen von PBS (37 ° C) in die Bauchhöhle. Schließen Sie den Hohlraum durch Vernähen der peritonealen Wand (Verwendung Polyamid 6-0-Größe Nähte) und der Haut (Verwendung Polyamid 3-0-Größe Nähte), mit Halsted Mosquito blutstillende Pinzette (12,5 cm, gebogen). Alternativ verwenden Sie ein einfaches unterbrochene Muster oder Edelstahl-Naht/Klammern, um die Bauchhöhle und die Haut zu schließen.
2. Telemacrophotography der isolierten Gewebe
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Vorbereitung der Puffer
- Sörensen Puffer (1 L) durch auflösende 14,95 g Na2HPO4 und 2,18 g KH2PO4 in 1 L destilliertem Wasser unter Rühren bei 200 u/min vorbereiten. Durchblutung der späten Schwangerschaft Welpen bzw. Jungtiere in der postnatalen Zeiträume, verwenden Sie eine geeignete Größe der Nadeln für Bauch- oder eines-Injektion und stellen Sie sicher, dass die Konzentration der terminal Natrium Pentobarbital Narkose nicht mehr 180 mg als / Gewicht kg des Körpers.
- Bereiten Sie Mugnainis Fixierung Lösung (5 L) 500 mL destilliertem Wasser auf 75 ° C erhitzt und Zugabe von 50 g Paraformaldehyd Pulver unter Rühren bei 200 u/min, Hinzufügen von 200 µL 5 N NaOH, Hinzufügen von 1.500 mL Sörensen Puffer, 1.750 mL destilliertem Wasser , und 500 mL 25 % Glutaraldehyd. Füllen Sie bis zu 5.000 mL mit destilliertem Wasser. Verwenden Sie diesen letzten Puffer für Perfusion.
Hinweis: Bereiten Sie Mugnainis Fixierung Lösung unter der Haube, tragen Sie Schutzbrille und vermeiden Sie Dämpfe zu. Methylenblau (0,05 g/L) für eine bessere Visualisierung der Durchblutung hinzufügen.
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Maus-Perfusion und Gewebe-isolation
- Transcardially durchspülen der schwangeren Mäusen, die tragen die transduced Embryonen (im Falle von Embryo Studien) oder die geborene transduced Pubs im gewünschten Alter (z. B. postnatale Tag 24) nach Standardverfahren6,7, 11,12,13,14,15,16,17, über intraperitoneale terminal Natrium-Pentobarbital Anästhesie (200 mg/kg Körpergewicht).
- Die Mäuse Transcardially injizieren mit Heparin-Lösung (500 U) mit einem 26 G, 1 Nadel und vor Fixierung, ziehen die Mäuse Transcardially mit 10 mL PBS, das Blut aus dem Körper spülen, und Durchspülen sie Transcardially mit 30 mL 40 ° C vorgewärmt Mugnaini Fixierung-Lösung.
Hinweis: Führen Sie für Erwachsenen Mäusen eine alternative retrograde Perfusion über die Bauchaorta14. - Das perfundierten Gewebe von Interesse (z. B. ganze Gehirn oder Rückenmark) zu isolieren und postfix das Gewebe in mindestens 10 mL Mugnaini Fixierung Lösung für ein weiteres 24 h bei 4 ° C.
- Waschen Sie das Gewebe in 10 mL PBS für 3 h bei Raumtemperatur.
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Einbettung in Agarose sowie Dokumentationen und schneiden
- Passen Sie das isolierte Gewebe (z. B. Gesamt-Hirn) in einen speziellen Rahmen mit einer reproduzierbaren Stationspunkte Winkel8,9,10. Alternativ können Sie eine Vibratome mit eine einstellbare Schnittstärke.
- Platzieren Sie das Nervengewebe im Rahmen, stellen Sie das Gewebe für Telemacrography und dokumentieren Sie die Koordinaten.
- Bereiten Sie 3 % niedrig schmelzende Agarose-Einbettung Medium: 3 g Agarose in 100 mL Sörensen Puffer und erhitzen Sie die Mischung in einem Wasserbad bis 90 ° C.
- Gießen Sie 3 % Agarose (30 ° C) in den Rahmen, der das Gewebe enthält. Abdeckrahmen mit einem warmen Metallblock und warten, bis es Härten ist. Während der Aushärtung, verwenden Sie Telemacrographic Geräte, um das eingebettete Gewebe und seine Koordinaten innerhalb des Rahmens-Bild.
- Transfer des Gewebes Agarose eingebettet in einen Rahmen mit Schneidspalten entspricht die Koordinaten des ersten Frames.
- Das eingebettete Gewebe in Abschnitte der gewünschten Stärke (z. B. 1,5 mm) mit einem Gerät mit einer dünnen und vibrierenden Rasierklinge geschnitten (siehe Tabelle der Materialien).
Hinweis: Um das Gleiten der Rasierklinge zu verbessern, Tropfen Sie ein paar Glycerin auf das eingebettete Gewebe. - Bild jedes Gewebe-Abschnitt mit PBS-Puffer und die Bilder in einem Ordner zu sammeln.
3. Vorbereitung des isolierten Gewebes Transmissions-Elektronenmikroskopie
Hinweis: Führen Sie alle weiteren Schritte der Inkubation in Glasschalen mit fest verschließbaren Deckel auf einer schütteln Plattform unter der Haube.
- Waschen Sie die Gewebeschnitte für 2 x 30 min in PBS. Inkubieren Sie in den Abschnitten 2 % igen wässrigen Osmium ausgefällt Lösung (OsO4) für 2 h bei Raumtemperatur.
Vorsicht: Osmium ausgefällt ist giftig und kann schädlich sein, wenn es mit Haut in Berührung kommt. - Waschen Sie die osmicated Abschnitte für 2 x 30 min in PBS.
- Die Abschnitte in 30 %, 50 % und 70 % Ethanol bei Raumtemperatur für 10-15 min inkubieren (optional: Übernachtung in 70 % igem Ethanol bei 4 ° C inkubieren).
- Bild osmicated Exemplare in 70 % igem Ethanol unter LED RGB Licht8,9,10 (2 x 15 W) von der linken und rechten Seite in einem Winkel von 45° zur Probe angewendet. Verwenden Sie schwarze Gerichte und einen langweiligen schwarzen Hintergrund, um Streuung und die Reflexion des Lichtes während Beleuchtung zu minimieren.
Vorsicht: Lassen Sie nicht den Abschnitt während der Bildgebung austrocknen. - Erstellen Sie einen Atlas der Sektion Bilder mit Koordinaten, indem Bilder in Serie in einem Ordner sammeln.
- Inkubieren Sie die Proben in 100 % Ethanol (2 X 30 min) und 100 % Propylenoxid (2 X 30 min) bei Raumtemperatur.
Vorsicht: Lassen Sie sich nicht in den Abschnitten zu trocknen, beim Ändern der Lösungen. - Mischen Sie 260 mL Harz mit 240 mL Dodecenylsuccinic-Anhydrid in ein Glasgefäß, sanft unter Rühren mit einem Glasstab. Überprüfen Sie in regelmäßigen Abständen auf Inhomogenität, Bläschen und Schlieren. Rühren Sie sehr leicht von hand für mindestens 45 Minuten.
- Bereiten Sie Harz/Propylenoxid in einem Verhältnis von 1:2 und 1:1 zu und 3 % Beschleuniger (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol).
- Inkubieren Sie das Gewebe in der 1:2 Einbettung Lösung aus Schritt 3,8 für 2 h und dann in der 1:1-Einbettungs-Lösung von 3,8 Schritt für 2 h bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Rad.
- Legen Sie das Gewebe in flachen Polypropylen Geschirr, decken Sie das Gewebe mit frischen Harz enthält 3 % Beschleuniger und heilen Sie die eingebetteten Gewebe bei 65-85 ° C für 12-24 h.
- Das eingebettete Gewebe auf Raumtemperatur kühlen Sie ab und entfernen Sie die Harz eingebettete Proben aus Polypropylen Gerichte.
4. Auswahl der Ultrastrukturforschung Neuroplastizität Parameter für die Quantitative Analyse
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Zuordnung den Bereich von Interesse
- Wählen Sie einen Ort von Interesse (z.B. Hippocampus oder Kleinhirn) und lokalisieren Sie Bereich im Abschnitt Atlas zu, indem Sie das Bild aus der Atlas (Schritt 3.5), der in diesem Bereich befinden.
- Skizzieren Sie die Ränder des Bereichs des Interesses auf dem Abschnitt und überlagern Sie finden/diese Region grenzt an die Harz-Probe.
- Kratzer die Grenzen des Bereichs des Interesses (z.B. Hippocampus oder Kleinhirn) auf das Harz-Präparat, mit einer feinen Nadel-Lehre (26 G, 1 In).
- Erhitzen Sie das Harz Exemplar auf 85 ° C in einem Ofen zu erweichen das Harz zum Trimmen oder alternativ ein trimmen Gerät, eine dünne Klinge oder Sandpapier.
- Den gewünschten Bereich aus der Harz-Probe mit einer Rasierklinge Verbrauchssteuern (siehe Tabelle der Materialien). Montieren Sie die Probe auf halten Bars aus Acrylglas der erforderlichen Kaliber z.B. mit (Durchmesser 8 mm) und einer Länge von 1 cm mit Kleber. Schneiden Sie die montierte Probe für halb- und ultradünnen schneiden.
- Bereiten Sie Ansät (0,75 µm) und ultradünnen (70 nm) Abschnitte des Löschbereichs mit einem regungsloses: setzen Sie ihn auf 1,5 mm/s für 0,75 µm Dicke und 0,7 mm/s für 70 nm Dicke.
- Sammeln Sie die Ansät Abschnitte auf Glas-Trägern und färben Sie die Abschnitte mit 1 % Toluidin blau mit PBS-Puffer (für 4 min).
- Waschen Sie die Abschnitte mehrmals in entionisiertem Wasser. Untersuchen Sie die gefärbten Abschnitte unter dem Lichtmikroskop mit 4 X (NA 0,1 ∞ /-), 10 x (NA von 0,22 ∞/0,17), 40 x (NA von 0,65 ∞/0,17) und 100 x (NA 1.25 ∞/0,17) Ziele.
- Sammeln Sie ultradünnen Abschnitte auf Nickel-Gitter. Vorbehaltlich der Netze TEM bei 180 kV und bei 3, 200 X, 6, 000 X und/oder 8.000 X Vergrößerung.
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TEM Analyse
- Wählen Sie die Ultrastrukturforschung Parameter von Interesse für die quantitative Analyse der TEM (z. B. Boutons mit Bläschen und Mitochondrien oder nonmyelinated und Markhaltige Axone) und nehmen Sie TEM Bilder dieser Parameter unter 3, 500 X, 6.000 x und/oder 8.000 X Vergrößerung.
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Representative Results
Für die zuverlässige und schnelle Anästhesie von Mäusen zahlreiche sicherheitstechnischen Kenngrößen galten, und ein optimierten Arbeitsbereich des Referats Anästhesie erwies sich als ausreichend (Abb. 1A). Das Gerät soll die Mischung aus flüssigen Isoflurane und Umgebungsluft mit einer Genauigkeit erforderlich für eine erfolgreiche Operation auf kleine Tiere wie Mäuse und Ratten zu kontrollieren. Luft und Isofluran im Verdampfer entsprechend der gewünschten Einstellungen gemischt und geliefert in einer Box oder durch eine Maske für dem Tier (Abb. 1A). Die Schnitzeljagd sammelt und inaktiviert überschüssige Isofluran Gas, die produziert werden kann, wodurch ein sicheres Arbeitsumfeld. Das Gas wird gesammelt und durch Aktivkohle in einer Patrone (Abbildung 1A) übergeben.
Ein optimierte Satz von Instrumenten (Abbildung 1B) ermöglicht es Wissenschaftlern, schnell an schwangeren Mäusen operieren. Ein einfache Paraffin-Film mit hydrophoben Eigenschaften verhindert, dass die Abdominal-Schleimhaut trocknen nach der Resektion (Abbildung 1B). Die uterine Hörner beherbergen die Embryonen auf Paraffin Film ausgesetzt sind und die Embryonen werden in die Art und Weise gezeigt in der Abbildung 1Cnummeriert. Sobald lokalisiert, werden die Embryonen in die richtige Position für die Injektion des Virus über eine dünne Kapillare (Abbildung 1D) angepasst. Die Injektion erfolgt optisch durch die Beobachtung der Verbreitung Form der durchdringenden Farbstoff enthalten in der injizierten Virus-Mischung (Abbildung 1D). Nach der Injektion in der Gebärmutter sind die uterine Hörner zurück in die Bauchhöhle für die Entwicklung der injizierten Embryonen bis die Bühne (z. B. bis Geburt und postnatale Tag 24) platziert, die für das Experiment (vgl. z. B. Lutz Et Al.5 benötigt wird ,6 und Kraus Et Al.7). Für Studien über die synaptische Plastizität werden Entwicklungs- oder Erwachsenen Spätstadien empfohlen.
Nach einem Transcardial Perfusion der Tiere zum gewünschten Zeitpunkt das Nervengewebe (zum Beispiel das Gehirn und Rückenmark in Abbildung 2) platziert und ausgerichtet in einer transparenten Kunststoff-Rahmen mit Koordinaten und eingebettet in Agarose (Abbildung 2 " A, B). Nach dem Schneiden, ist jeder Abschnitt abgebildet (Abb. 2C, E, G) und dann osmicated. Nach Osmication und Inkubation in 70 % bzw. 80 % Ethanol werden die Abschnitte wieder mithilfe von Störungen leicht Telemacrography8,9,10abgebildet. Die Gewebeschnitte sind in matt schwarz Umgebung zur Minimierung von Streustrahlung während der erforderlichen Hochleistungs Beleuchtung anzubringen. Faser-Traktate und verschiedene Bereiche des Gewebes reflektieren schillernde Farben, die den dunklen Gewebe Hintergrund dagegen, und ergibt sich ein besonders farbige Muster an die Gewebeoberfläche (Abbildung 2D, F, H). Alle schillernden Bilder überlagern sich mit den nonosmicated Bildern und zusammen mit den projizierten Koordinaten der einbettenden Schritt erzeugen sie Navigationskarten der Gewebe Topographie. Als nächstes wird das Gewebe weiter entwässert und in Harz eingebettet. Basierend auf den Navigationskarten, Interessensgebiete sind ausgewählt und weiterverarbeitet für TEM-als Beispiele der Hippocampus (Stratum Lucidum), Kleinhirn (Granulat Zellschicht) und Rückenmark (dorsale Funiculus) sind in Abbildung 3A1-C4 dargestellt .
Im Hippocampus und Kleinhirn bekanntermaßen moosigen Faser Synapsen Ultrastrukturforschung Besonderheiten im Vergleich zu anderen Synapsen, einschließlich große präsynaptischen Boutons (Abbildung 3A1-B5) aufweisen. Sie können leicht mit Hilfe von der schillernden Navigationskarten während der vorherigen Verarbeitungsschritte lokalisiert werden. In ihre Querschnittsprofile des Boutons enthalten eine große Anzahl von Vesikeln und Mitochondrien und sehr oft mehrere dendritische Stacheln (Abbildung 3A4, A5, B4, B5) umschließen. TEM Bilder dieser Profile ermöglichen eine Quantifizierung der Modellbaugruppe synaptische Bouton Bereiche, Zahl der synaptischen Vesikel und Mitochondrien innerhalb eines Profils Bouton, die Länge der synaptischen Kontakte und Nummern der Kontaktstellen.
Im Rückenmark enthält die dorsalen Funiculus viele axonale Fasern, die durch Oligodendrogliazellen Markhaltige sind. Auf transversale Abschnitten finden Sie die dorsalen Funiculus zwischen den beiden hinteren Hörnern des Rückenmarks auf transversale Sektionen (Abbildung 3C1, C2). Auf TEM Bilder Modellbaugruppe Markhaltige Axone erscheinen Runde und die Myelinscheiden, die rund um die Axone in Lamellen (Abbildung 3C3, C4) organisiert sind. Eine Quantifizierung der Modellbaugruppe axonale Bereiche, darunter die Dicke der Myelinscheiden und die Anzahl der Myelin-Lamellen, sowie eine Quantifizierung der Modellbaugruppe Mitochondrien, die Profilbereiche durchgeführt werden können.
Die vorbereiteten Atlas und die mikrographische TEM Bilder der Ultrastrukturforschung Parameter sind nicht nur hilfreich für einen Vergleich der morphologischen Neuroplastizität bei unterschiedlichen Bedingungen für die Behandlung, sondern auch wenn ein Vergleich zwischen den Parametern innerhalb der gleichen Gegend erforderlich ist (z. B. ein Vergleich zwischen verschiedene Arten von Synapsen im Hippocampus18 und entsprechende Strukturen verschiedener Arten [Abb. 4]).
Abbildung 1 : Vorbereitung auf die im Mutterleib Transduktion. (A) Isofluran-Narkose-Setup: 1) Induktion Kammer für die erste Anästhesie; (2) Pumpe; (3) Anästhesie-Einheit; (4) routing Switch Ventil; (5) Anästhesie Lieferung Schlauch; (6) Scavenger Einheit; (7) Atemmaske; (8) beheizten OP-Tisch; (9) binokulare Stereoskop mit Lichtquelle; (10) Steuereinheit. (B) Chirurgie Ausrüstung: 1) Elektrorasierer; (2) Auge Schmiermittel; (3) Fixierung Bänder; (4) Damenbinden; (5) Iris Zange (10 cm, gebogen, gezahnt); 6 und 7) Iris-Schere (11 cm, gerade, Wolfram-Karbid); (8) Dumont Pinzetten (#3, 12 cm, gerade, 0,2 x 0,12 mm); (9) Vanna Schere (8 cm, gerade); 10 und 11) Mikro-Moskito blutstillende Zange (12,5 cm, gebogen); (12) Paraffin Film; (13) Mikro Löffel; (14) Wattestäbchen; 15 und 16) Halsted Moskito blutstillende Zange (12,5 cm, gerade); 17 und 18) Nähte (Größe 6-0 und 3: 0); (19) Spritze; (20)-Sauger Schlauch Baugruppen für kalibrierte Microcapillary Pipetten. (C) Regelung eine systematische Nummerierung der Embryonen in die Gebärmutter Hörner an embryonalen Tag (E) 14,5: L = links; R = rechts. (D) Strategien der Injektion: in der ersten und zweiten Hirnkammern (ichVe und IIVe, beziehungsweise), vierte Ventrikel (IVVe) und Rückenmark. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Dokumentation der isolierten Gewebe durch Telemacrography. (A und B) Einbettung des Gehirns und Rückenmarks in Agarose, mit Küvetten mit einem Koordinatensystem ("Grids"). Nach dem Schneiden sind die Abschnitte Telemacrography und Störungen Reflexion ausgesetzt Licht Bildgebung. (C-F) Transversale und sagittale Abschnitte des Gehirns. Skalieren von Balken = 5 mm; Co = Kortex; St = Striatum; di = Zwischenhirn; mir = Mittelhirnes; Hallo = Hippocampus; PED = Pedunculi Cerebri; CE = Kleinhirn; Mo = Medulla Oblongata. (G und H) transversaler Abschnitt eines zervikalen Segments des Rückenmarks. Maßstabsleiste = 1 mm; AhR = rechts Vorderhornzellen; AhL = linke Vorderhornzellen; DF = dorsal Funiculus. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Topographische und Ultrastrukturforschung Identifikation der Plastizität Parameter. (A1) Invertierte Störungen leicht Tachograph des Hippocampus. Die Region von den moosigen Faser Boutons innerhalb der Stratum Lucidum (sl) wird hervorgehoben. PCL = pyramidale Zellschicht; GCL = Granulat Zellschicht. Maßstabsleiste = 500 µm. (A2) leichte Abb. (100 X Objektiv) eines Ansät Abschnitts (0,75 µm) Stratum Lucidum zeigen. Die Sternchen zeigen die Regionen des moosigen Faser Boutons, die vielen dendritische Inseln (schwarze Pfeilspitzen) umgeben. Toluidin blau/OsO4 Färbung. Maßstabsleiste = 50 µm. (A3) Transmission Electron Schliffbild an einer niedrigen Vergrößerung zeigt moosigen Faser Boutons (Sternchen) rund um einem Dendriten (D). Das Rechteck enthält eine einzelne moosigen Faser Bouton. Maßstabsleiste = 2 µm. (A4) Transmission Electron Schliffbild der das Querschnittsprofil einen moosigen Faser Bouton (MFB). Stacheln (blau) und die Schnittfläche Bouton (violett) werden hervorgehoben. m = Mitochondrium; s = Stacheln. Maßstabsleiste = 200 nm. (A5) Synaptischen Vesikel innerhalb einer MFB. Maßstabsleiste = 100 nm. (B1) Invertierte Störungen leicht Tachograph des Kleinhirns. Umgebung: das Granulat Zellschicht (Gcl), das die moosigen Faser Boutons enthält wird angezeigt. MCL = molekulare Schicht; h = Hilus. Maßstabsleiste = 500 µm. (B2) leichte Abb. (100 X Objektiv) von einer Ansät Abschnitt (0,75 µm), in einer Region der Granulat-Zellschicht, das grenzt an Purkinje-Zellen (PC). Die Sternchen zeigen die Regionen des moosigen Faser Boutons, die durch viele zerebelläre Granulat Neuronen (CGN) umgeben sind. Toluidin blau/OsO4 Färbung. Maßstabsleiste = 50 µm. (B3) Transmission Electron Schliffbild an einer niedrigen Vergrößerung zeigt die Gegend von MFBs. Das Rechteck enthält ein einzelnes MFB. Maßstabsleiste = 2 µm. (B4) Transmission Electron Schliffbild der das Querschnittsprofil von einem Pilz-wie MFB innerhalb der Granulat-Zellschicht des Kleinhirns. Die Schnittfläche Bouton (violett) und Vesikel-freie Stacheln (blau) werden hervorgehoben. Maßstabsleiste = 1 µm. (B5) Mitochondrien (violett) und synaptischen Vesikel innerhalb einer MFB. Maßstabsleiste = 150 nm. (C1) Invertierte Störungen leicht Tachograph des Rückenmarks. Der Bereich der dorsalen Funiculus (df), die stark Markhaltige Axone enthält ist hervorgehoben. AhR und AhL = rechts und links Vorderhornzellen, beziehungsweise; PhR und PhL = rechts und links hinteren Horn, beziehungsweise. Maßstabsleiste = 500 µm. (C2) leichte Abb. (100 X Objektiv) eines Ansät Abschnitts (0,75 µm) zeigt die dorsalen Funiculus, die mit stark Markhaltige Axone (Ax) angereichert ist, die von nonmyelinated Fasern (Sternchen) deutlich zu unterscheiden sind. CT = Bindegewebe. Toluidin blau/OsO4 Färbung. Maßstabsleiste = 50 µm. (C3) Transmission Electron Schliffbild der Querschnittsprofile Markhaltige und nonmyelinated Axone (Ax, violett). meine = Myelinscheiden. Maßstabsleiste = 200 nm. (C4) Das Rechteck zeigt hohe vergrößert, stark Markhaltige Axone mit Myelin Lamellen und nonmyelinated Fasern. Die Mikrotubuli (Mt) und Mitochondrien (m) innerhalb der axonalen Fasern sind sichtbar. Maßstabsleiste = 50 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Beispiele für Ultrastrukturforschung Plastizität Parameter in verschiedenen Tiermodellen. (A) moosigen Faser Boutons im Kleinhirn eines Hais. Maßstabsleiste = 400 nm. (B) moosigen Faser Bouton im Hippocampus eine Rhesus-Makaken. Maßstabsleiste = 200 nm. (C) neuromuskuläre Synapse einer Katze. Maßstabsleiste = 300 nm. (D) synaptischen Boutons in der Pars Reticularis Substantia Nigra von einem Australien. Die Sternchen geben postsynaptischen Dichte (PSD; im Einschub: schwarze Pfeilspitzen). Das Rechteck zeigt eine vergrößerte PSD-Datei. Maßstabsleiste = 400 nm. (E) A Nonmyelinating Schwann Zelle (SC) rund um viele axonalen Fasern im Rückenmark Ganglion einer Maus. In der näheren Umgebung sind stark Markhaltige Fasern sichtbar. Maßstabsleiste = 300 nm. Für alle Platten: Ax = Axon; D = Dendrit; m = Mitochondrium; MFB = moosige Faser Bouton; MF = moosige Faser; meine = Myelinscheiden; s = Wirbelsäule; SA = Wirbelsäule Apparate; SV = synaptischen Vesikel. Kontaktstellen (postsynaptischen Dichte) sind mit Sternchen gekennzeichnet. Querschnitt-Bereiche werden in violett und blau hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Ein entscheidender Schritt in der Gebärmutter Transduktion ist das Injektionsverfahren. Die präzise Injektion in die Hirnkammern oder in einen anderen Bereich des Interesses erfordert Erfahrung und praktische Fähigkeiten. Je dünner der Microcapillary Spitze, kann weniger Gewebeschäden auftreten; Dies ist jedoch auf Kosten der Einspritzdruck erhöht. Im Gegensatz zu den in der Gebärmutter Elektroporation19,20,21,22ist die Überlebensrate der injizierten Embryonen nach im Mutterleib Transduktion sehr hoch. Alle Embryonen aus der Gebärmutter Horn können injiziert werden, auch wenn Embryonen sich an den Wurzeln der uterinen Hörner befinden und innerhalb der Gebärmutter Sac neu justiert werden müssen. Die Entwicklungsstadien der Injektion und Analyse können die wissenschaftliche Fragestellung angepasst.
Wenn in den Hirnkammern injiziert, werden die AAV1 Partikel über die cerebrospinale Flüssigkeit durch den gesamten Ventrikelsystem verteilt. Entwickelnde Strukturen mit Oberflächen, die in engem Kontakt mit Alkohol, wie z. B. dem Hippocampus und dem Kleinhirn durch die angewandte Viruspartikel5,6,7ausgestrahlt werden. Eine Analyse der Veränderungen in der Ultrastrukturforschung Parameter, z. B. Bouton Größe, geschnittenen Bouton Bereiche, Zahl der synaptischen Vesikel, Zahl der Mitochondrien, und Zahlen und Länge der synaptischen Kontakte in diesen Strukturen ist eine elegante Auslesen für Ultrastrukturforschung Plastizität. Die in der Gebärmutter Transduktion Methode kann angewendet werden, um unterschiedliche Hirnareale, sowie das Rückenmark6zu studieren. Darüber hinaus können andere Organe und Gewebe ebenso als Transduktion Ziele gewählt werden. Zu guter Letzt kann der häufig verwendeten Mausmodell durch andere Arten je nach Bedarf ersetzt werden.
Die Fotografie der Scheiben Gewebe ermöglicht eine sehr präzise Präparation der Harz eingebettete Proben für Transmissions-Elektronenmikroskopie. Da die räumliche Orientierung der Stichprobe definiert, umfangreiche ist und zeitaufwändige schneiden wurde weggelassen. Darüber hinaus können entscheidende Nachbarregionen in ihrer ursprünglichen Beziehung zueinander gehalten werden. Ein wichtiger Vorteil der Fotodokumentation Schritt ist die Möglichkeit, die Qualität der Gewebe Fixierung überwachen und pathologische Veränderungen zu erkennen. Somit ist die Qualität der Fixierung und Einbettung des Materials von entscheidender Bedeutung. Nonsuitable Proben, die Artefakte enthalten können ausgelagert werden, vor der weiteren Verarbeitung.
Baureihe Schliffbild der abgebildeten Gewebe Scheiben bieten einen hilfreichen morphologische Atlas. Der Atlas ist für vergleichende neuroanatomische Studien, die darunter auch seltene Arten, ein wertvolles Archiv. Die Wahl der Dicke der Scheiben Gewebe hängt die adressierten wissenschaftliche Frage und wird begrenzt durch die Größe der Gewebeprobe. Für Kleintiere sollte eine Dicke von bis zu 1 mm eingestellt werden. Sehr dicke Schichten (> 5 mm) werden nicht empfohlen, aufgrund der begrenzten Eindringtiefe von Osmium ausgefällt8,9,10.
Die Telemacrophotography Dokumentation ist unerlässlich für die morphometrischen Studien. Es bietet eine feste Korrelation der Gewebeoberfläche zur Seite und obere Ebene des Rahmens und die Position einer bestimmten Struktur in einem räumlichen Koordinatensystem definiert. Eine Kombination des beschriebenen Verfahrens mit Elektrophysiologie18 oder mit dem Rückenmark Verletzungen Modell, wo Plastizität in Regeneration6eine wesentliche Rolle spielt, ist möglich. Für vergleichende neuroanatomische Studien, die darunter auch seltene Arten, sind die schillernden Gewebe-Atlas und die mikrographische TEM Bilder der Ultrastrukturforschung Parameter ein wertvolles gut.
Trotz ihrer Stärke TEM hat mehrere Einschränkungen aufgrund der Dicke der Probe (70 nm), die Modellbaugruppe Bereich (< 6 mm2), und die Komplexität der Probenvorbereitung. Wenn jedoch ein Exemplar genau vorbereitet ist, sind die TEM-Bilder von der Probe Ultrastruktur von höchster Qualität im Vergleich zu Bildern von jedem Licht-mikroskopischen Techniken produziert. Die in der Gebärmutter Transduktion Technik wird durch das injizierte Volumen und die topographische Region der Injektion beschränkt. Unbestreitbar hat die Technik ein starkes translational medizinische Potenzial in developmental Frühbehandlung und bei der Rettung von neuropathologische Erbkrankheiten. Darüber hinaus könnte die vorliegende Kombination im Mutterleib Transduktion mit TEM nicht nur als Ansatz für die zukünftige Behandlung von Erbkrankheiten, sondern auch für qualitativ hochwertige Ultrastruktur-basierte Neurodevelopmental Diagnostik berücksichtigt.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken die Kollegen aus der Tierhaltung an der medizinischen Fakultät, Ruhr-Universität Bochum, für ihre Unterstützung und Tier Pflege.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol | Serva | 36975 | |
| 26 G x 1'' needle | Henke-Sass, Wolf GmbH | ||
| 410 Anaesthesia Unit for air pump | Biomedical Instruments (Univentor) | 8323102 | |
| Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) | UKE (Viral Core Facility) | - | For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54. |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | low gelling agarose |
| Air Pump | Biomedical Instruments (Univentor) | Eheim 100 | |
| Araldite | CIBA-GEIGY | 23857.9 | resin for embedding of tissue |
| aspirator tune assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium | Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| buprenorphine | Temgesic | ampules | painkiller |
| capillaries | Science-Products | GB100TF-10 | with fillament |
| Dodecenylsuccinic anhydride | Fluka | 44160 | |
| Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) | FST | 11203-23 | |
| electric shaver | Phillips | - | |
| Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) | Ethicon | - | polyamide |
| eye lubricant | Bepanthene | - | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | for visualization of injected liquids |
| Gas Routing Switch 4/2 connectors | Biomedical Instruments (Univentor) | 8433020 | |
| halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) | FST | 13011-12 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 25 000 I.E./5 mL | |
| Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155 mm x 115 mm x 130 mm. Wall thickness: 6 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| iris forceps (10 cm, curved, serrated) | FST | 14007-14 | |
| iris scissors (11 cm, straight, tungsten carbide) | FST | 14501-14 | |
| Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257mm x110 mm x 18 mm. Heating area: 190 mm x 90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations |
Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| isoflurane (Attane) | JD medical | inhalation anesthesia | |
| LED RGB lights | Cameo | CLQS15RGBW | LEDs 2 x 15 W |
| Light microscope Basic DM E | Leica | - | 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives |
| micropipette puller | Science-Products | P-97 | |
| Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, curved) | FST | 13010-12 | |
| Nickel grids, 200 mesh | Ted Pella | 1GC200 | |
| Osmium (VIII)-oxid | Degussa | 73219 | |
| Propylene oxide | Fluka | 82320 | |
| razor blades | Schick | 87-10489 | |
| Sodium pentobarbital (Narcoren) | Merial GmbH | - | |
| TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback | Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| Technovit 4004 two components glue | Kulzer | ||
| Telemacrodevice | Canon | - | Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand. |
| Thermopuller P-97 | Sutter Instruments | - | |
| thin vibrating razor blade device | Krup | - | with Szabo thin blades |
| toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Transmission electron microscope C20 | Phillips | - | up to 200 kV |
| Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6 mm Inner diameter: 4 mm Wa ll thickness: 1 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| Ultracut E | Reichert-Jung | - | ultramicrotome |
| Univentor Scavenger | Biomedical Instruments (Univentor) | 8338001 | |
| Vannas scissors (8 cm, straight) | FST | 15009-08 |
References
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