Summary
Kombinasjonen av overføring elektronmikroskop og i livmoren signaltransduksjon er en kraftig tilnærming for å studere morfologiske endringer i den fine ultrastructure av nervesystemet under utvikling. Denne kombinerte metoden gir dyp innsikt i endringer i strukturelle detaljer underliggende neuroplasticity med hensyn til deres topografiske representasjon.
Abstract
Studien kombinerer i livmoren signaltransduksjon med overføring elektronmikroskop (TEM) sikte på en presis morphometrical analyse av ultrastructural parametere i entydig identifisert topografiske strukturer, påvirket av et protein av interesse som er innført i organismen via viral overføring. Dette kombinert tilnærming gir en myk overgang fra macrostructural til ultrastructural identifikasjon av følgende topografiske navigasjonskart i en vev atlas. Høyoppløselig elektronmikroskop av i-utero-transduced vev avslører den fine ultrastructure av neuropil og plastisitet parameterne, som kryss-delt synaptic bouton områder, antall synaptic blemmer og mitokondrier innenfor en Bouton profil, lengden på synaptic kontakter, kryss-delt axonal områder, tykkelsen på myelin sheaths, antall myelin lamellae, og kryss-delt områder av mitokondrier profiler. Analyse av disse parameterne avslører viktig innsikt i endringer av ultrastructural plastisitet i områdene av nervesystemet som berøres av viral overføring av genetiske Konstruer. Denne kombinerte metoden kan ikke bare brukes for å studere den direkte effekten av genmodifiserte biomolecules og/eller narkotika på neuronal plastisitet, men åpner også muligheten til å studere i livmoren redning av neuronal plastisitet (f.eks i sammenheng med nevrodegenerative sykdommer).
Introduction
Ingen Foton kan trenge en supertynn vev prøven i dybden klasse til et elektron. Dette attributtene uvurderlig fordeler til TEM fange nanometer oppløsning av fine strukturer sammenlignet med * lys teknikker. For eksempel tillater TEM visualisering av intracellulær organelles som mitokondrier, melanosomes og ulike typer sekretoriske granulater, piskehale som henger, microfilaments, flimmerhårene, microvilli og intercellulære veikryss (celleoverflaten spesialisering), spesielt synapser i nervesystemet1,2,3,4. Det overordnede målet med metodiske studien er ultrastructural anerkjennelse av endringer i nevrale plastisitet under utvikling på prenatal forstyrrelser ved å kombinere state-of-the-art teknikker i livmoren signaltransduksjon og TEM. Virally kodet proteiner rundt har vært transduced i livmoren i sentralnervesystemet5,6,7, inkludert ryggmarg6. For eksempel har i livmoren signaltransduksjon i kombinasjon med TEM blitt brukt for å studere effekten av celle vedheft molekyl L1 på motoren lære plastisitet i L1-mangelfull mus, spesielt med hensyn til samspillet mellom L1 og kjernefysiske reseptor proteiner i lillehjernen neurons7.
Analyse av neuroplasticity parametere krever presis informasjon om lokalisering av de minste områdene nervesystemet. Derfor er det tilstrekkelig å beskrive ultrastructural detaljer og deres nøyaktige topografiske retning når det gjelder andre strukturer. Studien presenteres en bestemt forberedende metode sikte på detaljert etterforskningen av forskjellige morfologiske områder basert på både lys og elektronmikroskop. Denne tilnærmingen kombinerer flere teknikker av vev manipulasjon, starter med i livmoren Albin på musen hjernen og ryggmarg og etterfulgt av perfusjon fiksering, innebygging av mold og behandling vev for TEM. Et viktig skritt inkludert mellom innebygging og behandling av vevet om TEM er dokumentasjon av vevet, ved hjelp av forstyrrelser lyset refleksjon teknikk som tillater presis microphotographic og lav forstørrelse dokumentasjon av vev prøver8,9,10. Innlemmet i den nåværende tilnærmingen, kan denne teknikken forskere å undersøke topografiske og strukturelle detaljer nervøse vev overflater og prøven skive profiler før sine forberedelser til TEM.
En spesiell ramme snitting hele hjernen tilsvarer stereotaxic koordinater. Denne rammen fordeler morfologiske tredimensjonale (3D) gjenoppbyggingen av områdene i nervøse vev og kan brukes for morphometric analyse. Macrographs av visualisert tilordnes topografiske koordinater, og delene serielt nummererte bygge kartene i en vev atlas.
Etter harpiks behandling, innebygde vev er delt inn i ultrathin deler (< 70 nm) som inneholder merkede områder, ifølge kart over nevnte vev atlas. Supertynn delene er utsatt for TEM å få høyoppløselige bilder av plastisitet parametere (f.eks tverrsnitt profil områder av synaptic boutons eller axonal fiber) innholdet og kontakter til nærliggende strukturer i komplekset neuropil.
Med metoden beskrevet her, tillater den glatte overgangen fra visualisert macrostructures mikro - og nanostrukturer sammenlignende grundige studier av morfologiske neuronal plastisitet etter i utero Albin på utvikle nervøs system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer på dyr fag er godkjent av institusjonelle dyreetikk komiteer av delstatene Hamburg og Nordrhein-Westfalen, Tyskland. Bruk sterilt instrumenter, vernehansker og aseptiske strøk gjennom hele kirurgiske prosedyren.
1. i Utero signaltransduksjon
- Forberede adeno-assosiert virus type 1 (AAV1) coding for ønsket mål (4 x 1011 virus partikler/µL av AAV1) i fosfat-bufret saltvann (PBS) ved pH 7.4. Legge til 0,1 mg/µL Fast Green og beholde AAV1-rask-grønne blandingen på 37 ° C.
- Forberede en tynn kapillær tips med ønsket form (8 mm i lengde, med en utvendig diameter 80 µm og en innvendig diameter på 50 µm), bruker en brønnene avtrekker (innstillingene: Trykk = 500, varme = 700, trekke = 0, hastighet = 80, tid = 200, se tabell for materiale < / c1 >). Bryte spissen av av kapillær slik at det er 4-5 mm.
- Sett sammen en aspirator tube (44 cm x 0.7 cm) kapillær spissen og Sug opp 15 µL av AAV1-rask-grønne blandingen inn av kapillær.
- Hold dyr emner på en konstant fysiologiske kroppstemperatur på 37 ° C gjennom hele prosedyren.
- Plasser en gravid C57Bl/6 mus (embryonale dag 14.5) i det preincubation kammeret og bedøve musen med gass 4% isoflurane (med en volumetriske luftstrømmen rate på 0,6 0,8 L/min).
- Subcutaneously, Injiser buprenorfin (0,1 mg/kg kroppsvekt).
- Plass bedøvet musen på prewarmed kirurgisk platen (37 ° C).
- Dekk øynene med et smøremiddel.
- Passer selve musen med anestesi maske (gass 1,5% isoflurane minst en volumetriske luftstrømmen 0,6 0,8 L/min) på kirurgisk plate og barbering regionen abdominal huden. Tørk barbert regionen med 3 X 75% etanol, og deretter med betadine løsning.
Merk: Overvåke puste virkemåten til bedøvet musen kontinuerlig. Justere konsentrasjonen av isoflurane gass etter inhalasjon-utpust musen. - Sjekk for fraværet av den plantar refleks ved å klemme bakben pote phalanges av musen.
- Åpne bukhulen av gripende huden med buet taggete iris tang (10 cm) og kuttet huden langs linea mediana med rett wolframkarbid saks (10 cm), og deretter ved peritoneal veggen med rett Dumont pinsett (12 cm, 0.2 mm x 0,12 mm) og klippe veggen langs linea alba med rett Vanna saks (8 cm).
- Legg et stykke fenestrated parafin film på abdominal åpningen og fikse filmen på begge ender med mikro-mygg hemostatic tang (12,5 cm, buet).
- Utsett livmor hornene med en skje-lignende enhet å unngå skade embryoene inni livmor hornene. Dryppe noen dråper PBS (37 ° C) på livmor hornene og kontroller embryoene for skader eller misdannelser i livmor sac.
- Dokumentere rekkefølgen og plasseringen av embryoene i livmor hornene. Slå embryoene nøye inni livmor sac til ønsket plassering for injeksjon er nådd.
- Injisere 1-2 µL av AAV1-rask-grønne blandingen av visuelt inspisere injeksjonsstedet (f.eks hjernen ventriklene) og fargestoff penetrasjon under en stereomicroscope.
- Dokumentere de injiserte embryoene og plasser livmor hornene med de injiserte embryoene tilbake i bukhulen.
- Dryppe noen dråper PBS (37 ° C) i bukhulen. Nærheten hulrommet suturing peritoneal veggen (bruk polyamid 6-0-størrelse innebygd) og huden (bruk polyamid 3-0-størrelse innebygd), med Halsteds mygg hemostatic tang (12,5 cm, buet). Også bruke en enkelt avbrutt mønster eller rustfritt stål Sutur/stifter for å lukke bukhulen og huden.
2. Telemacrophotography av isolerte vev
-
Utarbeidelse av buffere
- Forberede Sörensen's buffer (1 L) av oppløsning 14.95 g Na2HPO4 og 2,18 g KH2PO4 1 l destillert vann under omrøring på 200 rpm. For perfusjon av svangerskapet valper og/eller pups inne det postnatal tidsperioder, bruk en passende størrelse av nåler for mage eller intragastric injeksjon og sørg for at konsentrasjonen av terminal natrium pentobarbital anestesi ikke overstiger 180 mg / kg kroppen veier.
- Forberede Mugnainis fiksering løsning (5 L) ved oppvarming 500 mL destillert vann til 75 ° C og legge til 50 g av paraformaldehyde pulver under omrøring på 200 rpm, tilføyer 200 µL av 5 N NaOH, legge 1500 mL Sörensens bufferen, 1.750 mL destillert vann , og 500 mL av 25% glutaraldehyde. Fyll opp til 5000 mL med destillert vann. Bruk denne endelig buffer for perfusjon.
Merk: Forberede Mugnainis fiksering løsning under panseret, vernebriller og unngå røyk. Legg methylene Blåfarge (0,05 g/L) for en bedre visualisering av perfusjonen.
-
Musen perfusjon og vev isolasjon
- Transcardially perfuse gravid musene som bærer de transduced embryoene (i tilfelle av embryoet studier) eller født transduced pubene på ønsket alder (f.eks postnatal dag 24) i henhold til standard prosedyrer6,7, 11,12,13,14,15,16,17, bruker intraperitoneal terminal natrium pentobarbital anestesi (200 mg/kg kroppsvekt).
- Injisere mus transcardially med heparin-oppløsningen (500 U) bruker en 26 G, 1 p og før fiksering, tilfører mus transcardially med 10 mL PBS skylle ut blodet fra kroppen, og perfuse dem transcardially med 30 mL av 40 ° C prewarmed Mugnaini fiksering løsning.
Merk: Voksen mus, utføre en alternativ retrograd perfusjon via abdominal aorta14. - Isolere perfused vevet rundt (f.eks hele hjernen eller ryggmargen) og postfix vevet i minst 10 mL av Mugnainis fiksering løsning for en annen 24 h på 4 ° C.
- Vask vevet i 10 mL PBS for 3t ved romtemperatur.
-
Innebygging i agarose, i tillegg til dokumentasjon og skjæring
- Justere isolert vev (f.eks hele hjernen) i en spesiell ramme med en reproduserbar snitting vinkel8,9,10. Alternativt, bruk en vibratome med en justerbar kutte tykkelse.
- Plasser nervøse vev i rammen, justere vev for telemacrography, og dokumentere koordinatene.
- Forberede 3% lav-smeltende agarose-innebygging medium: legge til 3 g av agarose i 100 mL Sörensen's buffer og varm blandingen i et vannbad til 90 ° C.
- Hell 3% agarose (30 ° C) i rammen som inneholder vevet. Dekke rammen med en varm metall blokk og vent til det er hardere. Under herding, bruke telemacrographic enheter til den innebygde vev og koordinatene i rammen.
- Overføre agarose-innebygd vevet inn i en ramme med skjære hull svarer til koordinatene til det første bildet.
- Skjær den innebygde vev i deler av ønsket tykkelse (f.eks 1,5 mm) med en enhet med en tynn og vibrerende razor blad (se Tabell for materiale).
Merk: Dryppe noen dråper av glyserin på den innebygde vev for å forbedre gliding av razor blad. - Bilde avsnittene vev i PBS og samle bildene i en mappe.
3. forberedelse av isolerte vev til overføring elektronmikroskop
Merk: Utfør alle ytterligere skritt med inkubering i glass retter med tett lukkes lokk på en risting plattform under panseret.
- Vask vev avsnittene for 2 x 30 min med PBS. Inkuber avsnittene i 2% vandig osmium tetroxide løsning (OsO4) 2 timer ved romtemperatur.
Forsiktig: Osmium tetroxide er giftig og kan være skadelig når det gjelder hudkontakt. - Vask osmicated avsnittene for 2 x 30 min med PBS.
- Inkuber avsnittene i 30%, 50% og 70% etanol ved romtemperatur for 10-15 minutter (valgfritt: ruge i 70% etanol 4 ° c over natten).
- Bilde av osmicated eksemplarer i 70% etanol under RGB LED lys8,9,10 (2 x 15 W) på prøven fra venstre og høyre side i en vinkel på 45 °. Bruk svart retter og en kjedelig sort miljøet for å minimere spredning og refleksjon av lys i lys.
Forsiktig: Tillat ikke delen tørke ut under bildebehandling. - Opprette en atlas delen bilder med koordinatene ved å samle bilder i serien i en mappe.
- Inkuber eksemplarer i 100% etanol (2 x 30 min) og 100% propylen oksid (2 x 30 min) i romtemperatur.
Forsiktig: Tillat ikke inndelingene du vil tørke ut mens du endrer løsninger. - Bland 260 mL av harpiks med 240 mL dodecenylsuccinic anhydride i et glass fartøyet mens forsiktig under omrøring med en glass bar. Periodisk sjekk for inhomogeneity, bobler og smøres utover. Forsiktig, rør for hånd i minst 45 min.
- Forberede harpiks/propylen oksid i forholdet 1:2 og 1:1 og legge til 3% gasspedalen (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol).
- Inkuber vevet i 1:2 innebygging løsning fra trinn 3.8 for 2t og deretter i 1:1 innebygging løsningen fra trinn 3.8 for 2 timer ved romtemperatur på et roterende hjul.
- Plasser vevet i flat polypropylen retter, dekke vevet med fersk harpiks inneholder 3% gasspedalen, og kurere den innebygde vev ved 65-85 ° C for 12-24 h.
- Kjøle ned den innebygde vev til romtemperatur og Fjern de harpiks-embedded prøvene fra polypropylen retter.
4. valg av Ultrastructural Neuroplasticity parametere for kvantitativ analyse
-
Tilordne området av interesse
- Velg et område av interesse (f.eks hippocampus eller lillehjernen) og lokalisere området i delen atlas ved å velge bildet fra atlas (trinn 3,5) som inneholder dette området.
- Skisse grenser området av interesse på delen bildet og Finn/sammenligne disse regionen grenser mot harpiks prøven.
- Scratch-merke grenser området av interesse (f.eks hippocampus eller lillehjernen) på harpiks prøven, bruke en tynn nål måler (26 G, 1 i).
- Varme harpiks prøven til 85 ° C i en ovn for å bløtgjøre harpiks for trimming eller, alternativt bruke en trimming enhet, tynne barberblad eller sandpapir.
- Avgiftsdirektoratet området av interesse fra harpiks prøven med et barberblad (se Tabell for materiale). Montere prøven på holder barer akryl glass nødvendig caliber f.eks med (8 mm diameter) og en lengde på 1 cm med lim. Trim montert prøven for semi- og supertynn snitting.
- Forberede semithin (0,75 µm) og (70 nm) deler av beskjæringsområdet ved hjelp av en ultramicrotome: sette den på 1,5 mm/s for 0,75 µm tykkelse og på 0,7 mm/s for 70 nm tykkelse.
- Samle de semithin delene på glass operatører og flekken avsnittene med 1% toluidine blå i PBS (for 4 min).
- Vask delene flere ganger i deionisert vann. Undersøke delene farget under lys mikroskop med 4 x (NA av 0,1 ∞ /-), 10 x (NA av 0.22 ∞/0,17), 40 x (NA av 0,65 ∞/0,17), og 100 x (NA av 1,25 ∞/0,17) mål.
- Samle ultrathin deler på nikkel rutenett. Underlagt rutenettene TEM på 180 kV og 3, 200 x 6 000 x, og/eller 8000 x forstørrelse.
-
TEM analyse
- Velg parameterne ultrastructural rundt for kvantitative TEM analyse (f.eks boutons med blemmer og mitokondrier eller myelinated og nonmyelinated axons) og ta TEM bilder av disse parameterne under 3, 500 x, 6000 x og/eller 8000 x forstørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pålitelig og rask anestesi mus, mange sikkerhetsparametere ble vurdert og en optimalisert arbeidsområdet av anestesi viste seg for å være tilstrekkelig (figur 1A). Enheten er utviklet for å styre blanding av flytende isoflurane og luften med en presisjon kreves for vellykket operasjon på små dyr, for eksempel mus og rotter. Luft og isoflurane er blandet i vaporizer etter ønskede innstillinger og leveres i en boks eller gjennom en maske til dyret (figur 1A). Åtseldyr samler og deaktiverer eventuelle overskudd isoflurane gass som kan bli produsert, noe som gir et trygt arbeidsmiljø. Gassen samles og sendes aktivt kull en patron (figur 1A).
En optimalisert sett av instrumenter (figur 1B) tillater forskere å utføre kirurgi raskt på gravid mus. En enkel parafin film med hydrofobe egenskaper hindrer mage mucosa tørker etter eksisjon (figur 1B). Livmor hornene skjuler embryoene vises på parafin film og embryoene nummereres i måten vist i figur 1C. Når lokalisert, justeres embryoene i riktig posisjon for injeksjon av viruset via en tynn kapillær (figur 1D). Injeksjon kontrolleres visuelt ved å observere diffusjon form av gjennomtrengende fargestoff i injisert virus blandingen (figur 1D). Etter i livmoren injeksjon, er livmor hornene plassert i bukhulen tillate utviklingen av de injiserte embryoene til scenen (f.eks til fødsel og nå postnatal dag 24) som kreves for eksperimentet (se, for eksempel Lutz et al.5 ,6 og Kraus et al.7). For studier på synaptiske plastisitet anbefales slutten utviklingsmessige eller voksen stadier.
Etter en transcardial perfusjon av dyrene på ønsket scenen, er nervøse vev (for eksempel hjernen og ryggmargen i figur 2) plassert og orientert i en gjennomsiktig plast ramme med koordinater og innebygd i agarose (figur 2 A, B). Etter klipping, hver seksjon er fotografert (figur 2C, E, G) og deretter osmicated. Etter osmication og inkubasjon i 70% eller 80% etanol, er delene avbildet igjen ved hjelp av forstyrrelser lys telemacrography8,9,10. Delene vev må plasseres i en kjedelig sort rundt for å minimere spredte stråling under obligatorisk høyintensiv belysning. Fiber tracts og ulike områder av vev gjenspeiler iridescent fargene som kontrast mørke vev bakgrunnen, og et spesielt farget mønster av vevet overflaten framgår (figur 2D, F, H). Alle iriserende bilder er lagt med nonosmicated bilder og, sammen med planlagte koordinatene av innebygging trinnet, de genererer navigasjonskart av vev topografi. Deretter er vevet ytterligere dehydrert og innebygd i harpiks. Basert på navigasjonskart, interesseområder er valgt og ytterligere behandlet for TEM-som eksempler på hippocampus (stratum lucidum), lillehjernen (granule celle lag) og ryggmarg (dorsal funiculus) vises i Figur 3A1-C4 .
I hippocampus og lillehjernen, er mosegrodd fiber synapser kjent for å ha unike ultrastructural karakteristikkene sammenlignet med andre synapser, inkludert store presynaptic boutons (Figur 3A1-B5). De kan være lett lokalisert ved hjelp av de iriserende navigasjonskart etablert under tidligere behandlingstrinnene. I deres tverrsnitt profiler, boutons inneholder et stort antall blemmer og mitokondrier og ofte setter flere dendrittiske spines (Figur 3A4, A5, B4, B5). TEM bilder av disse profilene tillate en kvantifisering av kryss-delt synaptic bouton områder, antall synaptic blemmer og mitokondrier i en bouton profil, lengden på synaptic kontakter og antall kontakt nettsteder.
I ryggmargen inneholder det dorsal funiculus mange axonal fiber som er myelinated av oligodendroglia. På tverrgående deler, kan den rygg funiculus finnes mellom begge bakre horn i ryggmargen på tverrgående deler (Figur 3C1, C2). TEM bilder, kryss-delt myelinated axons vises rundt og myelin-hylser som omgir axons organiseres i lamellae (Figur 3C3, C4). En kvantifisering av kryss-delt axonal områder, inkludert tykkelsen av myelin hylser og antall myelin lamellae, samt en kvantifisering av kryss-delt mitokondrier profil områder kan utføres.
Forberedt atlas og micrographic TEM bilder av ultrastructural parametrene er ikke bare nyttig for en sammenligning av morfologiske neuroplasticity på ulike forhold av behandling, men også når en sammenligning mellom parametere i det samme området kreves (f.eks en sammenligning mellom ulike typer synapser i hippocampus18 og mellom tilsvarende strukturer av ulike arter [Figur 4]).
Figur 1 : Forberedelse til i livmoren signaltransduksjon. (A) Isoflurane anestesi oppsett: 1) induksjon kammer for første anesthesia; 2) pumpen; 3) anestesi enhet; 4) ruting bryteren ventil; 5) anestesi forsyning rør; 6) åtseldyr enhet; 7) puste masken. 8) oppvarmet kirurgisk tabellen. 9) kikkert stereoscope med lyskilde; 10) kontrollenheten. (B) kirurgi utstyr: 1) barbermaskin; 2) øyet smøremiddel; 3) fiksering bånd; 4) bind; 5) iris tang (10 cm, buet, taggete); 6 og 7) iris saks (11 cm, rett, tungsten carbide); 8) Dumont pinsett (#3, 12 cm, rett, 0,2 x 0,12 mm); 9) Vanna saks (8 cm, rett); 10 og 11) mikro-mygg hemostatic tang (12,5 cm, buet); 12) parafin filmen; 13) mikro skje; 14) bomull vattpinner; 15 og 16) Halsted mygg hemostatic tang (12,5 cm, rett); 17 og 18) suturer (størrelse 6-0 og 3-0); 19) sprøyte; 20) aspirator tube samlinger for kalibrert microcapillary pipetter. (C) sammenhengen en systematisk nummerering av embryo i livmor hornene på embryonale dag (E) 14.5: L = venstre; R = høyre. (D) strategier for injeksjon: i første og andre hjernen ventriklene (jegve og IIve, henholdsvis), fjerde ventrikkel (IVve), og ryggmargen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Dokumentasjon av isolerte vev av telemacrography. (A og B) Innebygging av en hjerne og en ryggmargen i agarose, cuvettes med et koordinatsystem (rutenett). Etter klipping, delene er utsatt for telemacrography og forstyrrelser refleksjon lys bildebehandling. (C-F) Tverrgående og sagittal deler av hjernen. Skalere barer = 5 mm; co = cortex; m = striatum; di = diencephalon; meg = mesencephalon; Hei = hippocampus; Ped = pedunculi cerebri; CE = lillehjernen; Mo = forlengede. (G og H) tverrgående delen av en cervikal del av ryggmargen. Skala bar = 1 mm; ahR = rett fremre horn; ahL = venstre fremre horn; DF = dorsal funiculus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Topografiske og ultrastructural identifikasjon av plastisitet. (A1) Invertert forstyrrelser lys macrograph av hippocampus. Regionen mosegrodd fiber boutons innen stratum lucidum (sl) er uthevet. PCL = pyramideformet celle laget. gcl = granule celle lag. Skala bar = 500 µm. (A2) lys microphotograph (100 x objektiv) for en semithin (0,75 µm) viser stratum lucidum. Stjernene angir regionene mosegrodd fiber boutons som omgir mange dendrittiske øyer (svart pilspisser). Toluidine blå/OsO4 flekker. Skala bar = 50 µm. (A3) Transmission elektron mikroskop-bilde på en lav forstørrelse, viser mosegrodd fiber boutons (stjerner) rundt en dendrite (D). Rektangelet inneholder en enkelt mosegrodd fiber bouton. Skala bar = 2 µm. (A4) Transmission elektron mikroskop-bilde av tverrsnittet profilen til en enkelt mosegrodd fiber bouton (MFB). Spines (blå) og tverrsnitt bouton området (fiolett) er markert. m = mitokondrie; s = spines. Skala bar = 200 nm. (A5) Synaptiske blemmer inni en MFB. Skala bar = 100 nm. (B1) Invertert forstyrrelser lys macrograph av lillehjernen. Regionen granule celle laget (gcl) som inneholder mosegrodd fiber-boutons er angitt. MCL = molekylær laget. h = hilus. Skala bar = 500 µm. (B2) lys microphotograph (100 x objektiv) for en semithin (0,75 µm) viser en region av granule celle laget som grenser Purkinje celler (PC). Stjernene angir regionene mosegrodd fiber boutons omgitt av mange lillehjernen granule neurons (CGN). Toluidine blå/OsO4 flekker. Skala bar = 50 µm. (B3) Transmission elektron mikroskop-bilde på en lav forstørrelse, viser området av MFBs. Rektangelet inneholder en enkelt MFB. Skala bar = 2 µm. (B4) Transmission elektron mikroskop-bilde av tverrsnittet profilen til en mushroom-lignende MFB innen granule celle laget av lillehjernen. Tverrsnitt bouton området (fiolett) og vesicle-fri spines (blå) er markert. Skala bar = 1 µm. (B5) mitokondrier (fiolett) og synaptic blemmer inni en MFB. Skala bar = 150 nm. (C1) Invertert forstyrrelser lys macrograph i ryggmargen. Regionen av det dorsal funiculus (df) som inneholder tungt myelinated axons utheves. ahR og ahL = høyre og venstre fremre horn, henholdsvis; helsejournal og phL = høyre og venstre bakre horn, henholdsvis. Skala bar = 500 µm. (C2) lys microphotograph (100 x objektiv) for en semithin (0,75 µm) viser det dorsal funiculus som er beriket med tungt myelinated axons (ax) som er klart kan skilles fra nonmyelinated fiber (stjerner). CT = bindevev. Toluidine blå/OsO4 flekker. Skala bar = 50 µm. (C3) Transmission elektron mikroskop-bilde av tverrsnittet profiler av myelinated og nonmyelinated axons (ax, fiolett). min = myelin sheaths. Skala bar = 200 nm. (C4) Rektangelet viser høy-forstørret, tungt myelinated axons myelin lamellae og nonmyelinated fibre. Piskehale som henger (mt) og mitokondrier (m) i axonal fibrene er synlige. Skala bar = 50 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Eksempler på ultrastructural plastisitet parametere i forskjellige dyremodeller. (A) mosegrodd fiber boutons i lillehjernen på en hai. Skala bar = 400 nm. (B) mosegrodd fiber bouton prefiks av en rhesus macaque. Skala bar = 200 nm. (C) nevromuskulær krysset av en katt. Skala bar = 300 nm. (D) Synaptic boutons i pars reticularis substantia nigra av en phalanger. Stjernene angir postsynaptic tetthet (PSD; innfelt: svart pilspisser). Rektangelet viser en forstørret PSD. Skala bar = 400 nm. (E) A nonmyelinating Schwann celle (SC) rundt mange axonal fibre i spinal ganglion med musen. I nærheten er tungt myelinated fiber synlige. Skala bar = 300 nm. For alle paneler: ax = axon; D = dendrite; m = mitokondrie; MFB = mosegrodd fiber bouton; MF = mosegrodd fiber; min = myelin sheaths; s = ryggraden; sa = ryggraden apparater; Sv = synaptic blemmer. Kontakt nettsteder (postsynaptic tetthet) identifiseres med stjerner. Tverrsnitt områder utheves i fiolett og blå. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et avgjørende skritt i i livmoren signaltransduksjon er injeksjon prosedyren. Presis injeksjon i hjernen ventriklene eller et annet område av interesse krever erfaring og praktiske ferdigheter. Det tynnere microcapillary spissen, jo mindre vevsskade kan oppstå; Dette er imidlertid på bekostning av økende injeksjon press. I motsetning til i livmoren electroporation19,20,21,22, overlevelse av de injiserte embryoene etter i livmoren signaltransduksjon er svært høy. Alle embryoer av livmor horn kan injiseres, selv om embryoer på røttene av livmor hornene og må justeres i livmor sac. Utviklingsstadier av injeksjon og analyse kan tilpasses på vitenskapelige spørsmålet.
Når injiseres i hjernen ventriklene, er AAV1 partikler distribuert via cerebrospinalvesken gjennom hele ventrikkel systemet. Utvikle strukturer med overflater i nær kontakt med sprit, som hippocampus og lillehjernen er transduced av anvendt virus partikler5,6,7. En analyse av endringene i ultrastructural parametere, for eksempel bouton størrelse, kryss-delt bouton områder, antall synaptic blemmer, antall mitokondrier, og tall og lengden av synaptic kontakter i disse strukturene, er en elegant lese-out for ultrastructural plastisitet. Metoden i livmoren signaltransduksjon kan brukes for å studere ulike hjernen områder, samt ryggmargen6. Andre organer og vev kan dessuten tilsvarende velges som signaltransduksjon mål. Til slutt, brukte musemodell kan erstattes av andre arter som kreves.
Fotografiet av vev skiver gir en svært nøyaktig Disseksjon av harpiks-innebygd eksempler for overføring elektronmikroskop. Siden den romlig orienteringen av prøven er definert, ble omfattende og tidkrevende kutte utelatt. Dessuten kan avgjørende nærliggende områder holdes i deres opprinnelige forhold til hverandre. En viktig fordel av fotografisk dokumentasjon trinnet er muligheten til å overvåke kvaliteten på vev fiksering og gjenkjenne patologiske forandringer. Dermed er kvaliteten på fiksering og innebygging av materialet av avgjørende betydning. Nonsuitable eksempler som inneholder gjenstander kan bli outsourcet før videre behandling.
Mikroskop-bilde serien fotografert vev sektorene gir en nyttig morfologiske atlas. Komparativ nevroanatomi studier som kan også inkludere sjeldne arter, er atlas en verdifull arkiv. Tykkelsen på vev skiver avhenger adressert vitenskapelige spørsmålet og er begrenset av størrelsen på vev prøven. For liten dyrene, skal en tykkelse på inntil 1 mm justeres. Tykke lagene (> 5 mm) anbefales ikke, på grunn av begrenset penetrasjon antall osmium tetroxide8,9,10.
Den telemacrophotography er avgjørende for morphometrical studier. Det tilbyr en fast korrelasjon av vevet overflaten til side og topp fly av rammen og definerer plasseringen av en gitt struktur i en romlig system med koordinater. En kombinasjon av metoden beskrevet med elektrofysiologi18 eller ryggmarg skade modellen, der plastisitet spiller en viktig rolle i gjenfødelse6, er mulig. Komparativ nevroanatomi studier som kan også inkludere sjeldne arter, er iriserende vev atlas og micrographic TEM bilder av parameterne ultrastructural verdifulle aktiva.
Til tross for sin styrke, TEM har flere begrensninger på grunn av tykkelsen størrelsen på utvalget (70 nm), kryss-delt området (< 6 mm2), og kompleksiteten av prøven utarbeidelse. Når en prøve er nøyaktig forberedt, er imidlertid TEM bilder av prøvens ultrastructure av overlegen kvalitet i forhold til bildene produsert av noen lys-microscopical teknikker. I livmoren signaltransduksjon teknikken er begrenset av injisert volumet og topografiske regionen injeksjon. Udiskutabelt, teknikken har en sterk translasjonsforskning medisinsk potensial i tidlig utviklingsmessige behandling og redning av medfødte neuropathological sykdommer. Videre kan finnes kombinasjonen av i livmoren signaltransduksjon med TEM ikke bare bli vurdert som en tilnærming for fremtidige behandling av medfødte sykdommer, men også for høy kvalitet ultrastructure-baserte neurodevelopmental diagnostikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takke kolleger av dyr anlegget medisinske fakultetet, Ruhr Universitetet Bochum, for deres støtte og dyr omsorg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol | Serva | 36975 | |
| 26 G x 1'' needle | Henke-Sass, Wolf GmbH | ||
| 410 Anaesthesia Unit for air pump | Biomedical Instruments (Univentor) | 8323102 | |
| Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) | UKE (Viral Core Facility) | - | For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54. |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | low gelling agarose |
| Air Pump | Biomedical Instruments (Univentor) | Eheim 100 | |
| Araldite | CIBA-GEIGY | 23857.9 | resin for embedding of tissue |
| aspirator tune assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium | Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| buprenorphine | Temgesic | ampules | painkiller |
| capillaries | Science-Products | GB100TF-10 | with fillament |
| Dodecenylsuccinic anhydride | Fluka | 44160 | |
| Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) | FST | 11203-23 | |
| electric shaver | Phillips | - | |
| Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) | Ethicon | - | polyamide |
| eye lubricant | Bepanthene | - | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | for visualization of injected liquids |
| Gas Routing Switch 4/2 connectors | Biomedical Instruments (Univentor) | 8433020 | |
| halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) | FST | 13011-12 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 25 000 I.E./5 mL | |
| Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155 mm x 115 mm x 130 mm. Wall thickness: 6 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| iris forceps (10 cm, curved, serrated) | FST | 14007-14 | |
| iris scissors (11 cm, straight, tungsten carbide) | FST | 14501-14 | |
| Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257mm x110 mm x 18 mm. Heating area: 190 mm x 90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations |
Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| isoflurane (Attane) | JD medical | inhalation anesthesia | |
| LED RGB lights | Cameo | CLQS15RGBW | LEDs 2 x 15 W |
| Light microscope Basic DM E | Leica | - | 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives |
| micropipette puller | Science-Products | P-97 | |
| Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, curved) | FST | 13010-12 | |
| Nickel grids, 200 mesh | Ted Pella | 1GC200 | |
| Osmium (VIII)-oxid | Degussa | 73219 | |
| Propylene oxide | Fluka | 82320 | |
| razor blades | Schick | 87-10489 | |
| Sodium pentobarbital (Narcoren) | Merial GmbH | - | |
| TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback | Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| Technovit 4004 two components glue | Kulzer | ||
| Telemacrodevice | Canon | - | Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand. |
| Thermopuller P-97 | Sutter Instruments | - | |
| thin vibrating razor blade device | Krup | - | with Szabo thin blades |
| toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Transmission electron microscope C20 | Phillips | - | up to 200 kV |
| Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6 mm Inner diameter: 4 mm Wa ll thickness: 1 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| Ultracut E | Reichert-Jung | - | ultramicrotome |
| Univentor Scavenger | Biomedical Instruments (Univentor) | 8338001 | |
| Vannas scissors (8 cm, straight) | FST | 15009-08 |
References
- Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers. Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).
- Hamlyn, L. H. The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit. Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).
- Peters, A., Palay, S., Webster, H. The Fine Structure of the Nervous System. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1991).
- Rollenhagen, A., et al. Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses. Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).
- Lutz, D., et al. Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival. Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).
- Lutz, D., et al. Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury. Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).
- Kraus, K., et al. A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination. Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).
- Andres, K. H., von Düring, M. Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung. Mikroskopie. 30, 139 (1974).
- Andres, K. H., von Düring, M. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. Hayat, M. A. , Van Norstrand Reinhild. 246-261 (1997).
- Andres, K. H., von Düring, M. General Methods for Characterization of Brain Regions. Techniques in Neuroanatomical Research. Heym, C., Forssmann, W. -G. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. 100-108 (1981).
- Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).
- Webster, H. F., Collins, G. H. Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).
- Andres, K. H. Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern. Mikroskopie. 21, 169 (1967).
- Forssmann, W. G., et al. Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation. Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).
- Descarries, L., Schröder, J. M. Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit. Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).
- Langford, L. A., Coggeshall, R. E. The use of potassium ferricyanide in neural fixation. Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).
- Liu, J., et al. Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex. Molecular Brain. 7, 84 (2014).
- Lee, S. H., et al. Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway. Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. , Suppl 1 120-125 (2009).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
- Nishiyama, J., et al. Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation. European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).
- Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo. Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).
