Summary
De combinatie van transmissie-elektronenmicroscopie en in de baarmoeder transductie is een krachtige aanpak voor het bestuderen van morfologische veranderingen in de fijne ultrastructuur van het zenuwstelsel in ontwikkeling. Deze gecombineerde methode kunt diep inzicht in veranderingen in structurele bijzonderheden Neuroplasticiteit met betrekking tot hun topografische vertegenwoordiging.
Abstract
De huidige studie combineert in de baarmoeder transductie met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) die gericht zijn op een analyse van de precieze morphometrical van ultrastructurele parameters in ondubbelzinnig geïdentificeerde topografische structuren beïnvloed door een proteïne van belang dat is geïntroduceerd in het organisme via virale overdracht. Deze gecombineerde aanpak zorgt voor een soepele overgang van macrostructural naar ultrastructurele identificatie door volgende topografische navigatie kaarten in een atlas van weefsel. Hoge resolutie elektronenmicroscopie van de in-utero-getransduceerde weefsel onthult de fijne ultrastructuur van de neuropil en bijbehorende plasticiteit-parameters, zoals cross-sectioned synaptic bouton gebieden, het aantal synaptische vesikels- en mitochondriën binnen een Bouton profiel, de lengte van de synaptische contacten, cross-sectioned axonale gebieden, de dikte van myeline omhulsels, het aantal myeline lamellen en cross-sectioned gebieden van mitochondriën profielen. De analyse van deze parameters blijkt essentieel inzicht in veranderingen van ultrastructurele plasticiteit in de gebieden van het zenuwstelsel die worden beïnvloed door de virale overdracht voor de genetische construct. Deze gecombineerde methode kan niet alleen worden gebruikt voor het bestuderen van het directe effect van genetisch gemanipuleerde biomoleculen en/of drugs op de neuronale plasticiteit maar opent ook de mogelijkheid te bestuderen van de in de baarmoeder redding van neuronale plasticiteit (bijvoorbeeld in het kader van neurodegeneratieve ziekten).
Introduction
Geen foton kan doordringen het specimen van een uiterst dun weefsel in de rang van de diepte van een elektron. Dit schrijft de onschatbare voordelen aan TEM in het vastleggen van nanometer resolutiebeelden van fijne structuren in vergelijking met de lichte microscopie technieken. Bijvoorbeeld, zorgt TEM voor de visualisatie van intracellulaire organellen, zoals mitochondriën, melanosomes en verschillende soorten secretoire korrels, microtubuli Microfilamenten, cilia, microvilli en intercellulaire kruispunten (celoppervlak specialisaties), in het bijzonder synapses in het zenuwstelsel1,2,3,4. Het algemene doel van de huidige methodologische studie is de ultrastructurele erkenning van veranderingen in de Neurale plasticiteit tijdens ontwikkeling bij prenatale inmenging door het combineren van de state-of-the-art-technieken in de baarmoeder transductie en TEM. Viraal gecodeerde proteïnen van belang hebben al getransduceerde in de baarmoeder in het centrale zenuwstelsel5,6,7, met inbegrip van het ruggenmerg6. Bijvoorbeeld, is in de baarmoeder signaaltransductie in combinatie met TEM gebruikt voor het bestuderen van het effect van de cel adhesie molecuul L1 op motorisch leren plasticiteit in L1-deficiënte muizen, in het bijzonder met betrekking tot de wisselwerking tussen L1 en nucleaire receptor eiwitten in cerebellaire neuronen7.
De analyse van neuroplasticiteit parameters vereist nauwkeurige informatie over de lokalisatie van de kleinste gebieden binnen het zenuwstelsel. Daarom is het voldoende om ultrastructurele details en hun exacte topografische oriëntatie ten opzichte van andere structuren te beschrijven. In de huidige studie, wordt een specifieke voorbereidende methode die gericht zijn op het gedetailleerde onderzoek van verschillende morfologische gebieden op basis van zowel licht- en elektronenmicroscopie gepresenteerd. Deze aanpak combineert verschillende technieken van weefsel manipulatie, beginnend met in de baarmoeder transductie van muis hersenen en het ruggemerg en gevolgd door perfusie fixatie, schimmel-insluiting en verwerking van het weefsel voor TEM. Een essentiële stap opgenomen tussen het insluiten en de verwerking van het weefsel voor TEM is de documentatie van het weefsel, met behulp van de interferentie licht reflectie techniek dat voorziet in de nauwkeurige microphotographic en laag-vergroting documentatie van weefsel monsters8,9,10. Deze techniek is opgenomen in de huidige aanpak, kan onderzoekers te onderzoeken van de topografische en structurele details van zenuwweefsel oppervlakken en specimen segment profielen voorafgaand aan hun voorbereiding voor TEM.
Een speciaal frame voor afdelen hele hersenen komt overeen met stereotaxic coördinaten. Dit frame profiteert van de morfologische driedimensionale (3D) wederopbouw van gebieden in zenuwweefsel en kan worden gebruikt voor Morfometrische analyse. De macrographs van de gevisualiseerde secties topografische coördinaten worden toegewezen, en de serieel genummerde secties bouwen kaarten in een atlas van weefsel.
Na hars verwerking, het ingesloten weefsel is gesegmenteerd in uiterst dunne secties (< 70 nm) met geselecteerde gebieden, volgens de kaarten van de bovengenoemde weefsel atlas. De uiterst dunne secties zijn onderworpen aan TEM resolutieafbeeldingen van plasticiteit parameters (bijvoorbeeld doorsnede profiel gebieden van synaptic los of axonale vezels) verkrijgen van hun inhoud en contacten aan naburige structuren binnen het complex neuropil.
Met de hierin beschreven methode toelaat de soepele overgang van de gevisualiseerde macrostructures naar micro- en nanostructuren vergelijkende diepgaande studies van morfologische neuronale plasticiteit na in utero transductie van de ontwikkelingslanden nerveus systeem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures over dierlijke onderwerpen zijn goedgekeurd door de institutionele dierenethiek commissies van de deelstaten Hamburg en Niedersachsen, Duitsland. Gebruik beschermende handschoenen, steriele instrumenten en aseptische jassen gedurende de gehele chirurgische ingreep.
1. in Utero transductie
- Bereiden adeno-associated virustype 1 (AAV1) dat codeert voor de gewenste doelgroep (4 x 1011 virale deeltjes/µL van AAV1) in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met een pH van 7,4. Voeg 0,1 mg/µL snel groen en houd het mengsel van AAV1-Fast-groen bij 37 ° C.
- Bereiden een dun capillair tip met de gewenste vorm (8 mm lengte, met een uitwendige diameter van 80 µm en een inwendige diameter van 50 µm), met behulp van een micropipet trekker (instellingen: druk = 500, warmte = 700, pull = 0, snelheid = 80, tijd = 200, zie de tabel van materialen < / c1 >). De tip van het capillair breken zodat het 4-5 mm.
- Monteren van een aspirator buis (44 x 0,7 cm) met de capillaire tip en 15 µL van het mengsel van AAV1-Fast-groen in het capillair gecombineerd.
- Houd de dierlijke onderwerpen op een constante fysiologische lichaamstemperatuur van 37 ° C gedurende de gehele procedure.
- Plaats een zwangere C57Bl/6 muis (embryonale dag 14,5) in de preïncubatiemethode zaal en anesthetize van de muis met gasvormige 4% Isofluraan (met een snelheid van de volumetrische luchtstroom van 0,6-0,8 L/min).
- Injecteren subcutaan, buprenorfine (0,1 mg/kg lichaamsgewicht).
- Plaats de narcose muis op de prewarmed chirurgische plaat (37 ° C).
- Dekking van de ogen met een smeermiddel.
- Passen de muis met het masker van de anesthesie (gasvormige 1,5% Isofluraan tempo een volumetrische luchtstroom van 0,6-0,8 L/min) op de chirurgische plaat en scheren de buikhuid regio. Veeg de geschoren regio met 3 X 75% ethanol en vervolgens met betadine oplossing.
Opmerking: Het gedrag van de ademhaling van de narcose muis voortdurend controleren. De concentratie van het gas Isofluraan volgens het patroon van de inhalatie-uitademing van de muis aanpassen. - Controleren op de afwezigheid van de plantaire reflex door uitknijpen de achterste poot vingerkootjes van de muis.
- Open de buikholte door aangrijpend van de huid met een gebogen getande iris Tang (10 cm) en de huid langs de linea mediana met rechte wolfraamcarbide schaar (10 cm) af te snijden, waarna, door de peritoneale muur aangrijpend met rechte Dumont pincet (12 cm, 0,2 mm x 0,12 mm) en (8 cm) snijden de muur langs de linea alba met rechte Vanna de schaar.
- Een stukje fenêtré paraffine film op de buik opening plaatsen en monteren van de film aan beide uiteinden met een micro-mug hemostatische Tang (12,5 cm, gebogen).
- De baarmoeder horens bloot met een lepel-achtig apparaat om te voorkomen dat schade aan de embryo's in de baarmoeder horens. Een paar druppels van PBS (37 ° C) druppelen op de baarmoeder hoorns en inspecteren van de embryo's voor schade of misvormingen binnen de baarmoeder OSS.
- Het document van de volgorde en de positie van de embryo's in de baarmoeder horens. Draai de embryo's zorgvuldig binnen de baarmoeder sac totdat de gewenste positie voor injectie wordt bereikt.
- Injecteren van 1-2 µL van het mengsel van AAV1-Fast-Green door visueel inspecteren de injectieplaats (bijvoorbeeld hersenen ventrikels) en de kleurstofpenetratie onder een stereomicroscoop.
- De geïnjecteerde embryo's document en plaats de baarmoeder horens met de ingespoten embryo's terug in de buikholte.
- Een paar druppels van PBS (37 ° C) druppelen in de buikholte. Dichtbij de holte wordt de peritoneale muur (gebruik polyamide 6-0-gerangschikte hechtingen) en de huid (gebruik polyamide 3-0-gerangschikte hechtingen), met behulp van Halsted de mug hemostatische pincet (12,5 cm, gebogen). Ook gebruiken een eenvoudig onderbroken patroon of roestvrij staal hechtdraad/nietjes te sluiten de buikholte en de huid.
2. Telemacrophotography van geïsoleerde weefsels
-
Bereiding van buffers
- Bereiden Sörensen van buffer (1 L) door oplossen 14,95 g nb2HPO4 en 2.18 g KH2PO4 in 1 liter gedistilleerd water onder roeren bij 200 omwentelingen per minuut. Voor perfusie van late zwangerschap pups en/of pups in de postnatale perioden, gebruik van een passende omvang van naalden voor buik of intragastric injectie en ervoor te zorgen dat de concentratie van de terminal natrium pentobarbital narcose niet hoger is dan 180 mg / lichaam kg wegen.
- Bereid de Mugnaini fixatie-oplossing (5 L) door verwarming van 500 mL gedestilleerd water tot 75 ° C en 50 g paraformaldehyde poeder onder roeren bij 200 omwentelingen per minuut, het toevoegen van 200 µL van 5 toe te voegen N NaOH, toe te voegen 1500 mL Sörensen van buffer, 1.750 mL gedestilleerd water , en 500 mL 25% Glutaaraldehyde. Vul tot 5.000 mL met gedestilleerd water. Gebruik deze laatste buffer voor perfusie.
Opmerking: Bereid Mugnaini van fixatie oplossing onder de motorkap, beschermende bril en vermijden van dampen. Het toevoegen van methyleenblauw (0.05 g/L) voor een betere visualisatie van de perfusie.
-
Muis perfusie en weefsel isolatie
- Transcardially perfuse de zwangere muizen die dragen de getransduceerde embryo's (in het geval van embryo studies) of de geboren getransduceerde pubs op de gewenste leeftijd (bijvoorbeeld postnatale dag 24) volgens standaardprocedures6,7, 11,12,13,14,15,16,17, met behulp van intraperitoneaal terminal natrium pentobarbital anesthesie (200 mg/kg lichaamsgewicht).
- Injecteren van de transcardially van de muizen met heparine oplossing (500 U) met behulp van een 26 G, 1 in naald en vóór fixatie, de infusie van de muizen transcardially met 10 mL PBS te spoelen van het bloed uit het lichaam, en perfuse hen transcardially met 40 ° C voorverwarmde Mugnaini van 30 mL fixatie oplossing.
Opmerking: Voor volwassen muizen, verrichten een alternatieve retrograde perfusie via de abdominale aorta14. - Isoleren van het perfused weefsel van belang (bijvoorbeeld hele hersenen of ruggenmerg) en postfix het weefsel ten minste 10 ml van de Mugnaini fixatie oplossing voor een andere 24 uur bij 4 ° C.
- Het wassen van het weefsel in 10 mL PBS gedurende 3 uur bij kamertemperatuur.
-
Insluiten in de agarose, plus documentatie en segmenteren
- Het aanpassen van het geïsoleerde weefsel (bijvoorbeeld hele hersenen) in een speciaal frame met een reproduceerbare vectorafbeeldingsbestanden hoek8,9,10. Ook gebruiken een vibratome met een verstelbare snijdikte.
- Plaats van het zenuwweefsel in het frame, aanpassen van het weefsel voor telemacrography en documenteren van de coördinaten.
- 3% laag-smelten agarose-insluiting medium bereiden: Voeg 3 g agarose in 100 mL Sörensen van buffer en verwarm het mengsel in een waterbad tot 90 ° C.
- Giet 3% agarose (30 ° C) in het frame waarin het weefsel. Betrekking op het frame met een warme metalen blok en wacht totdat het verharden. Tijdens verharding, door telemacrographic apparaten te gebruiken om de ingesloten weefsel en de coördinaten in het kader van het beeld.
- Pipetteer het weefsel agarose-ingebed in een frame met snijden hiaten overeenkomt met de coördinaten van het eerste frame.
- Snijd de ingesloten weefsel in secties van de gewenste dikte (bijvoorbeeld 1,5 mm) met een apparaat met een scheermesje dun en trillende (Zie Tabel van materialen).
Opmerking: Ter verbetering van het glijden van het scheermesje, een paar druppels van glycerine op de ingesloten weefsel te druppelen. - Beeld van elke weefselsectie in PBS en de afbeeldingen in een map te verzamelen.
3. voorbereiding van de geïsoleerde weefsel transmissie-elektronenmicroscopie
Opmerking: Alle verdere stappen van incubatie uitvoeren in glas gerechten met strak afsluitbare deksels op een schudden platform onder de motorkap.
- Wassen van de weefselsecties voor 2 x 30 min in PBS. De secties in 2% waterige osmium tetroxide-oplossing (OsO4) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur incuberen.
Let op: Osmium tetroxide is giftig en schadelijk kan zijn, wanneer in contact with skin men. - Wassen van de osmicated secties voor 2 x 30 min in PBS.
- Incubeer de secties in de 30%, 50% en 70% ethanol bij kamertemperatuur gedurende 10-15 min. (optioneel: na een nacht bebroeden in 70% ethanol bij 4 ° C).
- Beeld de osmicated specimens in 70% ethanol onder LED RGB lichte8,9,10 (2 x 15 W) op het voorbeeld van de linker- en rechterkant onder een hoek van 45 toegepast °. Gebruik zwarte gerechten en een saaie zwarte achtergrond om verstrooiing en de reflectie van het licht tijdens de verlichting te minimaliseren.
Let op: Niet toestaan de sectie te drogen tijdens imaging. - Maak een atlas van de sectie beelden met coördinaten door het verzamelen van beelden in serie in een map.
- Incubeer de specimens in 100% ethanol (2 x 30 min) en 100% propyleenoxide (2 x gedurende 30 minuten) bij kamertemperatuur.
Let op: Laat niet de secties te drogen tijdens het verwisselen van oplossingen. - Meng hars 260 mL met 240 mL dodecenylsuccinic anhydride (en) in een glas ketel terwijl zachtjes roeren met een glazen bar. Geregeld wordt gecontroleerd of heterogeniteit, bubbles, en uitstrijkjes. Zeer zacht, roer met de hand gedurende ten minste 45 min.
- Bereiden van hars/propyleenoxide in een verhouding van 1:2 en 1:1 en voeg 3% accelerator (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol).
- Incubeer het weefsel in de oplossing van stap 3.8 voor 2 h, en vervolgens in de insluiten oplossing van 1:1 uit stap 3.8 gedurende 2 uur bij kamertemperatuur op een roterend wiel te embedding 1:2.
- Plaats het weefsel in plat polypropyleen gerechten, bedek het weefsel met verse hars met 3% accelerator en genezen van de ingesloten weefsel bij 65-85 ° C gedurende 12-24 uur.
- De ingesloten weefsel tot kamertemperatuur afkoelen en verwijder de hars ingesloten specimens uit de polypropyleen gerechten.
4. selectie van ultrastructurele Neuroplasticiteit Parameters voor kwantitatieve analyse
-
Het gebied van belang in kaart te brengen
- Kies een interessegebied (bv, hippocampus of cerebellum) en het lokaliseren van het gebied in de sectie atlas door te kiezen voor de afbeelding uit de atlas (stap 3.5) die dit gebied bevat.
- Schets van de grenzen van het interessegebied op de afdeling beeld en zoeken/superponeren deze regio grenst aan de hars specimen.
- Kras-mark de grenzen van het terrein van belang (b.v., hippocampus of cerebellum) op het hars-model, met een fijne naald gauge (26 G, 1 inch).
- Verwarm de hars specimen tot 85 ° C in een oven om te verzachten de hars voor trimmen of, als alternatief, gebruik een apparaat trimmen, een dun blad of schuurpapier.
- Het terrein van belang uit de hars monster met een scheermesje accijnzen (Zie Tabel van materialen). Monteer het model bij het houden van de balken van acrylglas van de vereiste kaliber bijvoorbeeld met (een diameter van 8 mm) en een lengte van 1 cm met lijm. Trim het gemonteerde model voor semi- en uiterst dunne segmenteren.
- Bereiden van semithin (0,75 µm) en uiterst dunne (70 nm) secties van het bijgesneden gebied met behulp van een ultramicrotome: Stel deze in op 1,5 mm/s voor 0,75 µm dikte en 0.7 mm/s voor 70 nm dikte.
- Verzamelen van de semithin secties over glas vervoerders en vlekken van de secties met 1% toluïdine blauw in PBS (voor 4 min.).
- Wassen van de secties meermaals in gedeïoniseerd water. Onderzoeken van de gekleurde secties onder de lichte Microscoop 4 x gebruikt (nb van 0.1 ∞ /-), 10 x (NA van 0,22 ∞/0.17), 40 x (NA van 0,65 ∞/0.17), en 100 x (nb van 1,25 ∞/0.17) doelstellingen.
- Uiterst dunne secties op nikkel rasters verzamelen. TEM de rasters onverminderd op 180 kV en op 3, 200 x, 6, 000 x, en/of 8.000 x vergroting.
-
TEM analyse
- Kies de ultrastructurele parameters van belang voor de kwantitatieve analyse van de TEM (bijvoorbeeld los met blaasjes- en mitochondriën- of myelinated en nonmyelinated axonen) en nemen TEM beelden van deze parameters onder 3, 500 x, 6.000 x en/of 8.000 x vergroting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor betrouwbare en snelle anesthesie van muizen, talrijke veiligheidsparameters werden onderzocht en een geoptimaliseerde werkruimte van de verdoving eenheid bleek te zijn vanvoldoende (Figuur 1). De eenheid is ontworpen voor controle van het mengsel van vloeibare Isofluraan en de lucht met een precisie vereist voor een succesvolle operatie op kleine dieren, zoals muizen en ratten. Lucht- en Isofluraan zijn gemengd in de vaporizer volgens de gewenste instellingen en geleverd in een doos of via een masker aan het dier(Figuur 1). De scavenger verzamelt en inactiveert eventuele overschot Isofluraan gas dat kan worden geproduceerd, waardoor een veilige werkomgeving. Het gas wordt verzameld en doorgegeven door middel van actieve kolen in een cartridge(Figuur 1).
Een geoptimaliseerde verzameling instrumenten (Figuur 1B) kunt wetenschappers om te voeren operatie snel op zwangere muizen. Een eenvoudige paraffine film met hydrofobe eigenschappen voorkomt dat de buik mucosa drogen na resectie (Figuur 1B). De baarmoeder horens herbergen van de embryo's worden blootgesteld op paraffine film en de embryo's worden genummerd in de manier waarop weergegeven in Figuur 1C. Zodra gelokaliseerd, worden de embryo's in de juiste positie voor injectie van het virus via een dun capillair (Figuur 1D) aangepast. De injectie wordt visueel gecontroleerd door het observeren van de vorm van de verspreiding van de doordringende kleurstof opgenomen in het mengsel van de geïnjecteerde virus (Figuur 1D). Na in utero injectie, worden de baarmoeder horens geplaatst, terug in de buikholte om de ontwikkeling van de geïnjecteerde embryo's tot het werkgebied (bijvoorbeeld tot geboorte en het bereiken van postnatale dag 24) die nodig is voor het experiment (zie, bijvoorbeeld, Lutz et al.5 ,6 en Kraus et al.7). Voor studies over synaptische plasticiteit, worden late developmental of volwassen stadia aanbevolen.
Na een transcardial perfusie van de dieren in de gewenste stadium, is het zenuwweefsel (bijvoorbeeld, de hersenen en het ruggenmerg in Figuur 2) geplaatst en georiënteerd in een transparante plastic frame frame met coördinaten en ingebed in de agarose (Figuur 2 A, B). Na het uitsnijden, wordt elke sectie beeld (Figuur 2C, E, G) en vervolgens osmicated. Na osmication en incubatie in 70% of 80% ethanol, zijn de secties weer beeld met behulp van interferentie lichte telemacrography8,9,10. De weefselsecties moeten worden geplaatst in een saaie zwarte omgeving om te minimaliseren van verspreide straling tijdens de vereiste hoge intensiteit verlichting. Vezel vezelbundels en verschillende gebieden van het weefsel weerspiegelen iriserende kleuren die de achtergrond donker weefsel contrasteren, en een speciaal gekleurde patroon van het oppervlak van het weefsel naar voren (Figuur 2D, F, H). Alle iriserende afbeeldingen zijn bovenop met de nonosmicated beelden en, samen met de geprojecteerde coördinaten van de insluiten stap, ze genereren navigatie kaarten van de topografie van het weefsel. Het weefsel is vervolgens verder gedehydrateerde en ingebed in de hars. Op basis van de kaarten van de navigatie, gebieden die van belang zijn gekozen en verder verwerkt voor TEM-als voorbeelden, hippocampus (stratum lucidum), cerebellum (submodule cellaag), en het ruggemerg (dorsale funiculus) worden weergegeven in Figuur 3A1-C4 .
In de hippocampus en de kleine hersenen, is mossy vezel synapsen bekend dat de unieke ultrastructurele kenmerken in vergelijking met andere synapsen, met inbegrip van grote presynaptische los (Figuur 3A1-B5) vertonen. Ze kunnen gemakkelijk worden gelokaliseerd met behulp van de kaarten van de iriserende navigatie opgericht tijdens de vorige stappen voor verwerking. In hun profielen van de dwarsdoorsnede, de los bevatten een groot aantal blaasjes- en mitochondriën en heel vaak plaats verschillende dendritische spines (Figuur 3A4, A5, B4, B5). TEM beelden van deze profielen toestaan een kwantificering van cross-sectioned synaptic bouton gebieden, nummers van synaptische vesikels- en mitochondriën binnen een bouton-profiel, de duur van de synaptische contacten, en getallen van contact sites.
In het ruggenmerg bevat de dorsale funiculus veel axonale vezels die myelinated door oligodendroglia zijn. Op transversale secties, kan de dorsale funiculus worden gevonden tussen beide posterieure Hoorn van het ruggenmerg op transversale secties (Figuur 3C1, C2). Op TEM beelden, cross-sectioned myelinated axonen verschijnen ronde en de omhulsels van de myeline rondom de axonen zijn georganiseerd in lamellen (Figuur 3C3, C4). Een kwantificering van cross-sectioned axonale gebieden, met inbegrip van de dikte van myeline omhulsels en het aantal myeline lamellen, evenals een kwantificering van cross-sectioned mitochondriën profiel gebieden kunnen worden uitgevoerd.
De atlas bereid en de micrographic TEM beelden van de ultrastructurele parameters zijn niet alleen nuttig voor een vergelijking van morfologische Neuroplasticiteit op verschillende omstandigheden van behandeling, maar ook wanneer een vergelijking tussen parameters binnen hetzelfde gebied is vereist (bijvoorbeeld een vergelijking tussen verschillende soorten synapsen in de hippocampus18 en tussen gelijkwaardige structuren van verschillende soorten [Figuur 4]).
Figuur 1 : Voorbereiding in de baarmoeder transductie. (A) Isofluraan verdoving setup: 1) inductie kamer voor eerste anesthesie; 2) pomp; 3) verdoving eenheid; 4) routering omschakelklep; 5) verdoving levering buizen; 6) scavenger eenheid; 7) ademhaling mask; 8) verwarmde chirurgische tabel; 9) verrekijker stereoscoop met lichtbron; 10) controle-eenheid. (B) chirurgie apparatuur: 1) elektrisch scheerapparaat; 2) oog smeermiddel; 3) fixatie banden; 4) sanitaire pads; 5) iris pincet (10 cm, gebogen, gekarteld); 6 en 7) iris schaar (11 cm, rechte, wolfraam carbide); 8) Dumont pincet (#3, 12 cm, rechte, 0,2 x 0,12 mm); 9) Vanna schaar (8 cm, rechte); 10 en 11) micro-mug hemostatische pincet (12,5 cm, gebogen); 12) paraffine film; 13) micro lepel; 14) katoen swabs; 15 en 16) Halsted mug hemostatische pincet (12,5 cm, rechte); 17 en 18) hechtingen (grootte 6-0 en 3-0); 19) spuit; 20) aspirator buis assemblages voor gekalibreerde microcapillary pipetten. (C) schema van een systematische nummering van embryo's in de baarmoeder horens ten embryonale dage (E) 14,5: L = links; R = rechts. (D) strategieën voor injectie: in de eerste en tweede hersenen ventrikels (ikve en IIve, respectievelijk), vierde ventrikel (IVve) en het ruggenmerg. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Documentatie van geïsoleerde weefsel door telemacrography. (A en B) Inbedding van een brein en een ruggenmerg in agarose, cuvettes met een coördinatenstelsel (grids). Na het uitsnijden, de secties zijn onderworpen aan telemacrography en interferentie reflectie licht imaging. (C-F) Transversale en Sagittaal secties van de hersenen. Schaal bars = 5 mm; Co = cortex; St = striatum; di = diencephalon; me = mesencephalon; Hi = de hippocampus; PED = pedunculi cerebri; CE = cerebellum; ma = verlengde merg. (G en H) transversale gedeelte van een cervicale segment van het ruggenmerg. Schaal bar = 1 mm; ahR = rechts anterior hoorn; ahL = linker anterior hoorn; DF = dorsale funiculus. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Topografische en ultrastructurele identificatie van plasticiteit parameters. (A1) Omgekeerde interferentie licht macrograph van de hippocampus. De regio van de mossy vezel los binnen de stratum lucidum (sl) wordt gemarkeerd. PCL = piramidale cellaag; gcl = submodule cellaag. Schaal bar = 500 µm. (A2) licht microphotograph (100 x doelstelling) van een semithin deel (0,75 µm) toont stratum lucidum. De sterretjes geven aan de regio's van mossy vezel los die vele dendritische eilanden (zwarte pijlpunten) omringen. Toluïdine blauw/OsO4 kleuring. Schaal bar = 50 µm. (A3) Bluefin bij een lage vergroting, weergegeven: mossy vezel los (sterretjes) rond een dendriet (D). De rechthoek bevat een enkele mossy vezel bouton. Schaal bar = 2 µm. (A4) Bluefin van het profiel van de dwarsdoorsnede van een enkele mossy vezel bouton (MFB). Stekels (blauw) en de dwarsdoorsnede bouton gebied (violet) worden gemarkeerd. m = mitochondrion; s = stekels. Schaal bar = 200 nm. (A5) Synaptische vesikels binnen een MFB. Schaal bar = 100 nm. (B1) Omgekeerde interferentie lichte macrograph van het cerebellum. De regio van de submodule cellaag (gcl) waarin de mossy vezel los wordt aangegeven. mcl = moleculaire laag; h = hilus. Schaal bar = 500 µm. (B2) licht microphotograph (100 x doelstelling) van een semithin deel (0,75 µm) toont een regio van de submodule cellaag die aan het Purkinje cellen (PC grenst). De sterretjes geven aan de regio's van mossy vezel los die zijn omgeven door vele cerebellaire submodule neuronen (CGN). Toluïdine blauw/OsO4 kleuring. Schaal bar = 50 µm. (B3) Bluefin bij een lage vergroting, tonen het gebied van MFBs. De rechthoek bevat een enkele MFB. Schaal bar = 2 µm. (B4) Bluefin van het profiel van de dwarsdoorsnede van een paddestoel-achtige MFB binnen de submodule cellaag van het cerebellum. De dwarsdoorsnede bouton gebied (violet) en vesikel-vrije stekels (blauw) worden gemarkeerd. Schaal bar = 1 µm. (B5) Mitochondria (violet) en synaptische vesikels binnen een MFB. Schaal bar = 150 nm. (C1) Omgekeerde interferentie lichte macrograph van het ruggenmerg. De regio van de dorsale funiculus (df), dat zwaar myelinated axonen bevat wordt gemarkeerd. ahR en ahL = rechts en links anterior hoorn, respectievelijk; phR en phL = rechts en links posterior hoorn, respectievelijk. Schaal bar = 500 µm. (C2) licht microphotograph (100 x doelstelling) van een semithin deel (0,75 µm) toont de dorsale funiculus dat is verrijkt met zwaar myelinated axonen (ax) die duidelijk te onderscheiden van nonmyelinated vezels (sterretjes zijn). CT = bindweefsel. Toluïdine blauw/OsO4 kleuring. Schaal bar = 50 µm. (C3) Bluefin van dwarsdoorsnede profielen van myelinated en nonmyelinated axonen (ax, violet). mijn = myeline omhulsels. Schaal bar = 200 nm. (C4) De rechthoek toont high-vergroot, zwaar myelinated axonen met myeline lamellen en nonmyelinated vezels. De microtubuli (mt)- en mitochondriën (m) binnen de axonale vezels zijn zichtbaar. Schaal bar = 50 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Voorbeelden van ultrastructurele plasticiteit parameters in verschillende diermodellen. (A) Mossy vezel los in het cerebellum van een haai. Schaal bar = 400 nm. (B) Mossy vezel bouton in de hippocampus van een resusaap. Schaal bar = 200 nm. (C) eindplaat van een kat. Schaal bar = 300 nm. (D) Synaptic los in de pars reticularis substantia nigra van een phalanger. De sterretjes geven postsynaptisch dichtheid (PSD; in verzonken vlak: zwarte pijlpunten). De rechthoek toont een vergrote PSD. Schaal bar = 400 nm. (E) A nonmyelinating Schwann cel (SC) rond vele axonale vezels in de spinale ganglion van een muis. In de omgeving zijn zwaar myelinated vezels zichtbaar. Schaal bar = 300 nm. Alle panelen: ax = axon; D = dendriet; m = mitochondrion; MFB = mossy vezel bouton; MF = mossy vezels; mijn = myeline omhulsels; s = wervelkolom; sa = wervelkolom toestellen; SV = synaptische vesikels. Contact sites (postsynaptisch dichtheid) worden aangegeven met een sterretje. Dwarsdoorsnede gebieden worden gemarkeerd in paars en blauw. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een cruciale stap van in de baarmoeder transductie is de injectie-procedure. De nauwkeurige injectie in de ventrikels van de hersenen of in een ander gebied van belang vereist ervaring en praktische vaardigheden. Hoe dunner het uiteinde van de microcapillary, de minder weefselbeschadiging kan optreden; Dit is echter ten koste van de toenemende druk van de injectie. In tegenstelling tot in de baarmoeder electroporation19,20,21,22is de overlevingskans van de geïnjecteerde embryo's na in utero transductie zeer hoog. Alle embryo's van de uteriene hoorn kunnen worden geïnjecteerd, zelfs als embryo's zich op de wortels van de baarmoeder horens bevinden en moeten worden aangepast binnen de baarmoeder OSS. De ontwikkelingsstadia van injectie en analyse kunnen worden aangepast aan de wetenschappelijke vraag.
Wanneer geïnjecteerd in de ventrikels van de hersenen, worden de AAV1 deeltjes gedistribueerd via de cerebrospinale vloeistof via de gehele ventriculaire systeem. Ontwikkeling structuren met oppervlakten die in nauw contact met de drank, zoals de hippocampus en het cerebellum, zijn getransduceerde door de toegepaste virale deeltjes5,6,7. Een analyse van de veranderingen in de ultrastructurele parameters, zoals bouton grootte, cross-sectioned bouton gebieden, getallen van synaptische vesikels, mitochondriën, aantal en nummers en lengte van synaptic contacten in deze structuren, is een elegante uitlezing voor Ultrastructurele plasticiteit. De in de baarmoeder transductie methode kan worden toegepast om te bestuderen van de verschillende hersengebieden, alsmede het ruggenmerg6. Bovendien, andere organen en weefsels kunnen ook worden gekozen als transductie doelen. Tot slot kan de veelgebruikte muismodel worden vervangen door andere soorten zoals vereist.
De fotografie van de plakjes weefsel zorgt voor een zeer nauwkeurige dissectie van hars-embedded monsters voor transmissie-elektronenmicroscopie. Aangezien de ruimtelijke oriëntatie van het monster wordt gedefinieerd, werd uitgebreide en tijdrovende snijden weggelaten. Bovendien kunnen de cruciale naburige regio's in hun oorspronkelijke relatie tot elkaar worden gehouden. Een belangrijk voordeel van de fotografische documentatie stap is de mogelijkheid te waken over de kwaliteit van weefsel fixatie en herkennen van pathologische veranderingen. De kwaliteit van fixatie en inbedding van het materiaal is dus van cruciaal belang. Nonsuitable monsters die artefacten bevatten kunnen worden gedelocaliseerd vóór verdere verwerking.
De serie van de opname van de verbeelde weefsel segmenten bieden een nuttig morfologische atlas. Voor vergelijkende neuroanatomische studies, waaronder ook zeldzame soorten, is de atlas een waardevol archief. De keuze van de dikte van de plakjes weefsel hangt af van de geadresseerde wetenschappelijke vraag en wordt beperkt door de grootte van het specimen van het weefsel. Voor kleine dieren, moet met een dikte van maximaal 1 mm worden aangepast. Zeer dik secties (> 5 mm) worden niet aanbevolen, vanwege de beperkte penetratie capaciteit van osmium tetroxide8,9,10.
De documentatie van de telemacrophotography is essentieel voor morphometrical studies. Het biedt een vaste correlatie van het oppervlak van het weefsel aan de zijkant en de hoogste vliegtuig van het frame en de positie van een bepaalde structuur bepaalt in een ruimtelijke coördinaten systeem. Een combinatie van de beschreven methode met electrofysiologie18 of met het ruggenmerg letsel model, waar plasticiteit een essentiële rol in regeneratie6 speelt, is mogelijk. Voor vergelijkende neuroanatomische studies, waaronder ook zeldzame soorten, zijn de iriserende weefsel atlas en de micrographic TEM beelden van de ultrastructurele parameters waardevolle activa.
Ondanks zijn sterke punten, TEM heeft verscheidene beperkingen vanwege de grootte van de dikte van het monster (70 nm), het cross-sectioned gebied (< 6 mm2), en de complexiteit van de bereiding van de monsters. Echter, wanneer een monster nauwkeurig bereid is, de TEM-beelden van het model van ultrastructuur zijn van superieure kwaliteit in vergelijking met beelden geproduceerd door een licht-microscopische technieken. De techniek in de baarmoeder transductie wordt beperkt door het geïnjecteerde volume en de topografische regio van de injectie. Ontegenzeggelijk, de techniek heeft een sterke translationeel medische potentieel in vroegtijdige developmental behandeling en in de redding van aangeboren neuropathologische ziekten. Bovendien, de huidige combinatie van in de baarmoeder transductie met TEM misschien niet alleen beschouwd als een aanpak voor de toekomstige behandeling van aangeboren ziekten, maar ook voor kwalitatief hoogwaardige ultrastructuur gebaseerde neurologische diagnostiek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken de collega's van het dier faciliteit aan de medische faculteit, Ruhr-Universität Bochum, voor hun steun en dier zorg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol | Serva | 36975 | |
| 26 G x 1'' needle | Henke-Sass, Wolf GmbH | ||
| 410 Anaesthesia Unit for air pump | Biomedical Instruments (Univentor) | 8323102 | |
| Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) | UKE (Viral Core Facility) | - | For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54. |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | low gelling agarose |
| Air Pump | Biomedical Instruments (Univentor) | Eheim 100 | |
| Araldite | CIBA-GEIGY | 23857.9 | resin for embedding of tissue |
| aspirator tune assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium | Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| buprenorphine | Temgesic | ampules | painkiller |
| capillaries | Science-Products | GB100TF-10 | with fillament |
| Dodecenylsuccinic anhydride | Fluka | 44160 | |
| Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) | FST | 11203-23 | |
| electric shaver | Phillips | - | |
| Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) | Ethicon | - | polyamide |
| eye lubricant | Bepanthene | - | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | for visualization of injected liquids |
| Gas Routing Switch 4/2 connectors | Biomedical Instruments (Univentor) | 8433020 | |
| halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) | FST | 13011-12 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 25 000 I.E./5 mL | |
| Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155 mm x 115 mm x 130 mm. Wall thickness: 6 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| iris forceps (10 cm, curved, serrated) | FST | 14007-14 | |
| iris scissors (11 cm, straight, tungsten carbide) | FST | 14501-14 | |
| Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257mm x110 mm x 18 mm. Heating area: 190 mm x 90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations |
Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| isoflurane (Attane) | JD medical | inhalation anesthesia | |
| LED RGB lights | Cameo | CLQS15RGBW | LEDs 2 x 15 W |
| Light microscope Basic DM E | Leica | - | 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives |
| micropipette puller | Science-Products | P-97 | |
| Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, curved) | FST | 13010-12 | |
| Nickel grids, 200 mesh | Ted Pella | 1GC200 | |
| Osmium (VIII)-oxid | Degussa | 73219 | |
| Propylene oxide | Fluka | 82320 | |
| razor blades | Schick | 87-10489 | |
| Sodium pentobarbital (Narcoren) | Merial GmbH | - | |
| TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback | Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| Technovit 4004 two components glue | Kulzer | ||
| Telemacrodevice | Canon | - | Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand. |
| Thermopuller P-97 | Sutter Instruments | - | |
| thin vibrating razor blade device | Krup | - | with Szabo thin blades |
| toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Transmission electron microscope C20 | Phillips | - | up to 200 kV |
| Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6 mm Inner diameter: 4 mm Wa ll thickness: 1 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| Ultracut E | Reichert-Jung | - | ultramicrotome |
| Univentor Scavenger | Biomedical Instruments (Univentor) | 8338001 | |
| Vannas scissors (8 cm, straight) | FST | 15009-08 |
References
- Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers. Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).
- Hamlyn, L. H. The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit. Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).
- Peters, A., Palay, S., Webster, H. The Fine Structure of the Nervous System. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1991).
- Rollenhagen, A., et al. Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses. Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).
- Lutz, D., et al. Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival. Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).
- Lutz, D., et al. Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury. Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).
- Kraus, K., et al. A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination. Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).
- Andres, K. H., von Düring, M. Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung. Mikroskopie. 30, 139 (1974).
- Andres, K. H., von Düring, M. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. Hayat, M. A. , Van Norstrand Reinhild. 246-261 (1997).
- Andres, K. H., von Düring, M. General Methods for Characterization of Brain Regions. Techniques in Neuroanatomical Research. Heym, C., Forssmann, W. -G. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. 100-108 (1981).
- Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).
- Webster, H. F., Collins, G. H. Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).
- Andres, K. H. Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern. Mikroskopie. 21, 169 (1967).
- Forssmann, W. G., et al. Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation. Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).
- Descarries, L., Schröder, J. M. Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit. Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).
- Langford, L. A., Coggeshall, R. E. The use of potassium ferricyanide in neural fixation. Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).
- Liu, J., et al. Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex. Molecular Brain. 7, 84 (2014).
- Lee, S. H., et al. Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway. Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. , Suppl 1 120-125 (2009).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
- Nishiyama, J., et al. Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation. European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).
- Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo. Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).
