Summary
השילוב של מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים התמרה חושית ברחם היא גישה חזקה ללמוד שינויים מורפולוגיים במוצא ultrastructure בסדר של מערכת העצבים במהלך הפיתוח. שיטה משולבת זו מאפשרת תובנות שינויים בפרטים מבניים שבבסיס והנוירולוגיה הפלסטית ביחס ייצוגן הטופוגרפי.
Abstract
המחקר הנוכחי משלב התמרה חושית ברחם במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) מכוון ניתוח morphometrical מדויק של פרמטרים ultrastructural במבנים הטופוגרפי חד משמעית מזוהה, מושפע חלבון עניין זה הוא הציג לתוך האורגניזם באמצעות העברה ויראלי. גישה משולבת זו מאפשר מעבר חלק מ macrostructural כדי ultrastructural זיהוי על ידי מפות ניווט הטופוגרפי הבאים באטלס רקמות. מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה של הרקמה בעם רחם-transduced חושף את ultrastructure בסדר של מורכב ואת הפרמטרים שלה פלסטיות, כגון אזורים בוטון סינפטית בחתך רוחב, מספר הסינפטיות, המיטוכונדריה בתוך פרופיל בוטון, האורך של קשרים סינפטיים, אזורים עצב בחתך רוחב, העובי של עטיפות המיאלין, המספר של מיאלין lamellae ואזורי בחתך רוחב של המיטוכונדריה פרופילים. הניתוח של פרמטרים אלה מגלה חיוני תובנות שינויים של ultrastructural פלסטיות באזורים של מערכת העצבים המושפעות על-ידי העברת ויראלי הבונה גנטי. שיטה משולבת זו לא ניתן להשתמש רק ללמוד על השפעה ישירה של מולקולות מהונדס גנטית ו/או סמים על פלסטיות עצביים אבל פותח גם את האפשרות ללמוד חילוץ ברחם פלסטיות עצביים (למשל, בהקשר של מחלות ניווניות).
Introduction
פוטון לא יכולים לחדור של דגימות רקמה ודק במיוחד בכיתה עומק של אלקטרון. זה מייחסת יתרונות שלא יסולא בפז TEM בלכידת ננומטר תמונות ברזולוציה של המבנים המרשימים לעומת טכניקות במיקרוסקופ אור. לדוגמה, TEM מאפשר החזיית תאיים organelles כגון המיטוכונדריה, melanosomes, סוגים שונים של הפרשה בגרגרים, microtubules, שמתרגם, cilia, microvilli, והצמתים המערכת (תא השטח מתמחה), בפרט synapses מערכת העצבים1,2,3,4. המטרה הכוללת של מתודולוגי במחקר הוא ההכרה ultrastructural של שינויים פלסטיות עצבית במהלך הפיתוח על הפרעה לפני הלידה על-ידי שילוב טכניקות המדינה-of-the-art של התמרה חושית ברחם, TEM. לשווק מקודד חלבונים עניין יש כבר transduced ברחם לתוך מערכת העצבים המרכזית5,6,7, כולל את חוט השדרה6. למשל, נעשה שימוש ברחם התמרה חושית בשילוב עם TEM לימוד ההשפעה של המולקולה אדהזיה תא L1 על למידה פלסטיות בעכברים חשוכת-L1, בפרט לגבי יחסי הגומלין בין L1 חלבונים גרעיניים קולטן מוטורית בנוירונים אסטרוציטומה7.
הניתוח של פרמטרים והנוירולוגיה הפלסטית דורש מידע מדויק על הלוקליזציה של האזורים הקטנים בתוך מערכת העצבים. לכן, זה מספיק כדי לתאר פרטים ultrastructural ונטיותיהם הטופוגרפי המדויק לגבי מבנים אחרים. במחקר הנוכחי, מוצגת שיטת הכנה ספציפיים מכוון החקירה נתונים היסטוריים של תחומים ברורים מורפולוגי המבוסס על אור והן מיקרוסקופ אלקטרונים. גישה זו משלבת מספר טכניקות של רקמות מניפולציה, החל ברחם התמרה חושית של העכבר המוח ואת חוט השדרה ואחריו יציבות זלוף, הטבעה-עובש, עיבוד הרקמה TEM. צעד חיוני כללה בין את ההטמעה, העיבוד של הרקמה עבור TEM הוא התיעוד של הרקמה, בטכניקה הפרעות השתקפות אור המאפשר מדויק microphotographic והגדלה נמוכה תיעוד רקמות דגימות8,9,10. טכניקה זו שולבו הגישה הנוכחית, מאפשר לחוקרים לבחון פרטים הטופוגרפי ומבניים של רקמות עצבים משטחים ושל הדגימה פרופילים פרוסה לפני שלהם לקראת TEM.
מסגרת מיוחדת עבור חלוקתה המוח כולו מתאים קואורדינטות stereotaxic. מסגרת זו מועילה מורפולוגי תלת מימדי (3D) בבניה מחדש של אזורי ברקמות עצבים, והוא יכול לשמש לניתוח morphometric. Macrographs הסעיפים מטמיעים מוקצים קואורדינטות הטופוגרפי, ולבנות הסעיפים ממוספרים באופן סדרתי מפות אטלס רקמות.
לאחר שרף עיבוד, הרקמה מוטבע הוא למחלקה למקטעים זגוגית (< 70 ננומטר) המכילים אזורים נבחרים, לפי המפות של הרי האטלס הרקמות הנ ל. הסעיפים זגוגית ותוחלת TEM להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה של פלסטיות פרמטרים (למשל, חתך פרופיל תחומי עם העיתון ons סינפטית או סיבי עצב) של התוכן שלהם ושל אנשי קשר למבנים הסמוכים בתוך המתחם מורכב.
בשיטת המתוארים בזאת, חלקה המעבר macrostructures מטמיעים מיקרו - ו nanostructures היתרי השוואתי מעמיק של פלסטיות מורפולוגית עצביים לאחר בתוך הרחם התמרה חושית לפתח לחוצה מערכת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדות האתיקה בעלי חיים מוסדיים של הברית הפדרלית של המבורג, Nordrhein-Westfalen, גרמניה. השתמש בכלים סטריליים, כפפות מגן ומעילים aseptic לאורך כל תהליך כירורגי.
1. ב. פשוט תאכל התמרה חושית
- להכין וירוס adeno-הקשורים סוג 1 (AAV1) קידוד עבור היעד הרצוי (4 x 1011 ויראלי חלקיקים/µL של AAV1) בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ב- pH 7.4. להוסיף 0.1 mg/µL מהר ירוק ולהשאיר את התערובת AAV1-מהיר-ירוק-37 מעלות צלזיוס.
- להכין טיפ נימי דק לצורה הרצויה (8 מ מ אורך, בקוטר חיצוני מיקרומטר 80 ו מבפנים בקוטר של 50 מיקרומטר), שימוש של פולר micropipette (הגדרות: לחץ = 500, חום = 700, משיכה = 0, מהירות = 80, זמן = 200, לראות את טבלה של חומרים < / c1 >). שבור את הקצה של נים כך שהוא 4-5 מ מ.
- להרכיב על צינור ליניקת (44 ס מ x 0.7 ס מ) עם קצה נימי, האחות µL 15 של תערובת AAV1-מהיר-ירוק לתוך נימי.
- לשמור על הנבדקים בעלי חיים בטמפרטורה קבועה הגוף הפיזיולוגיות של 37 מעלות צלזיוס לאורך ההליך כולו.
- למקם את עכבר C57Bl/6 בהריון (עובריים יום 14.5) אל החדר preincubation, עזים ומתנגד את העכבר עם גזי איזופלוריין 4% (עם קצב זרימת אוויר הנפחי של 0.6-0.8 L/min).
- . Subcutaneously, להזריק הבופרנורפין (0.1 mg/kg של משקל גוף).
- הנח את העכבר anesthetized בצלחת כירורגי prewarmed (37 מעלות צלזיוס).
- מכסים את העיניים עם חומר סיכה.
- להתאים את העכבר עם המסכה הרדמה (גזי איזופלוריין 1.5% בקצב זרימת אוויר הנפחי של 0.6-0.8 L/min) על צלחת כירורגי, לגלח האזור בעור בטן. יש לנגב את האזור מגולח עם 3 X 75% אתנול ולאחר מכן עם betadine פתרון.
הערה: לפקח על אופן הפעולה של הנשימה של העכבר anesthetized ללא הרף. התאם את ריכוז הגז איזופלוריין על פי התבנית שאיפה-נשיפה של העכבר. - בדוק היעדר רפלקס plantar לוחצת פרקי האצבעות כפת האחוריות של העכבר.
- פתיחת חלל הבטן לפי כשתפסת את העור עם איריס משונן מעוגל מלקחיים (10 ס מ) וחיתוך העור לאורך mediana לינאה במספריים ישר טונגסטן קרביד (10 ס מ), ולאחר מכן, על-ידי כשתפסת הקיר הצפק עם פינצטה דומונט ישר (12 ס מ, 0.2 מ מ x 0.12 מ"מ), חיתוך חומה לאורך לינאה אלבה עם ואנה ישר מספריים (8 ס"מ).
- מניחים חתיכת סרט פרפין fenestrated על פתיחת בטן ולתקן את הסרט בשני הקצוות עם מלקחיים hemostatic מיקרו-יתושים (12.5 ס מ, מעוקל).
- לחשוף את הקרניים הרחם באמצעות מכשיר דמוי כפית כדי למנוע פגיעה העוברים בתוך הרחם קרניים. לטפטף מספר טיפות של PBS (37 ° C) על קרנות הרחם ולבדוק את העוברים על נזקים או מומים בתוך השק. הרחם.
- תעד את ההזמנה ואת המיקום של העוברים הקרניים הרחם. להפוך את העוברים בזהירות בתוך השק. הרחם עד לתנוחה הרצויה עבור הזרקה.
- מזריקים µL 1-2 של תערובת AAV1-מהיר-ירוק על-ידי בדיקה חזותית של ההזרקה (למשל, החדרים במוח) וחדירת צבע תחת stereomicroscope.
- לתעד את העוברים מוזרק ולמקם את הקרניים הרחם עם העוברים מוזרק בחזרה לתוך חלל הבטן.
- לטפטף מספר טיפות של PBS (37 מעלות צלזיוס) לתוך חלל הבטן. לסגור את החלל על ידי תפירת הקיר הצפק (להשתמש פוליאמיד 6 0-בגודל של התפרים) ועור (להשתמש פוליאמיד 3 0-בגודל של התפרים), שימוש יתוש hemostatic מלקחיים של האלסטד (12.5 ס מ, מעוקל). לחלופין, השתמש דפוס קטע פשוט או תפר מפלדת/סיכות כדי לסגור את חלל הבטן של העור.
2. Telemacrophotography של רקמות מבודד
-
הכנה של מאגרי
- להכין מאגר של Sörensen (1 ליטר) מאת g 14.95 הממיס של Na-2-HPO-4 ו- g 2.182פו ח'4 ב- 1 ליטר של מים מזוקקים תחת ערבוב במהירות של 200 סל ד. עבור זלוף של המנוח ההיריון הגורים ו/או כלבים. אחרי לידה פרקי זמן, להשתמש בגודל המתאים של מחטים להזרקה הבטן או intragastric ולוודא כי הריכוז של ההרדמה מסוף סודיום פנטוברביטל אינו עולה על 180 מ"ג / שוקלים ק ג של הגוף.
- להכין פתרון קיבוע של Mugnaini (5 L) על ידי חימום 500 מ"ל של מים מזוקקים עד 75 ° C, להוסיף 50 גר' אבקת paraformaldehyde תחת ערבוב ב 200 סל"ד, הוספת µL 200 של 5 N NaOH, הוספת מל 1,500 מאגר של Sörensen, 1,750 מ ל מים מזוקקים , ו- 500 מ"ל של 25% גלוטראלדהיד. למלא עד 5,000 מ ל מים מזוקקים. השתמש מאגר הסופי זלוף.
הערה: להכין פתרון קיבוע של Mugnaini מתחת למכסה המנוע, משקפיים מגן ולהימנע האדים. להוסיף מתילן כחול (0.05 g/L) עבור ויזואליזציה טובה יותר של זלוף.
-
בידוד זלוף ורקמות העכבר
- Transcardially perfuse העכברים בהריון שנושאים את העוברים transduced (במקרה של מחקרים העובר) או את הפאבים transduced נולד בגיל הרצוי (למשל, כמחנכת יום 24) על פי נהלי6,7, 11,12,13,14,15,16,17, שימוש בקרום הבטן פנטל מסוף הרדמה (200 mg/kg של משקל גוף).
- להזריק את transcardially עכברים עם הפרין פתרון (500 U) באמצעות G 26, 1 המחט ו, לפני קיבוע, להשרות העכברים transcardially עם 10 מ"ל של PBS כדי לשטוף את הדם מן הגוף, perfuse אותם transcardially עם 30 מ של 40 ° C prewarmed Mugnaini קיבוע פתרון.
הערה: עבור עכברים בוגרים, לבצע זלוף רטרוגרדית חלופית של דרך העורק14. - לבודד את הרקמה perfused עניין (למשל, כל המוח או חוט השדרה), postfix הרקמה לפחות 10 מ"ל של פתרון קיבוע של Mugnaini עוד 24 שעות-4 מעלות צלזיוס.
- לשטוף את הרקמה ב 10 מ"ל של PBS עבור 3 שעות בטמפרטורת החדר.
-
הטבעה agarose, בתוספת התיעוד ואת חלוקתה
- התאם את הרקמה מבודד (למשל, כל המוח) בתוך מסגרת מיוחדת עם לשחזור אופטים זווית8,9,10. לחלופין, להשתמש vibratome עם עובי חיתוך מתכווננת.
- המקום רקמת העצבים במסגרת, להתאים את הרקמה עבור telemacrography, ולתעד את נקודות הציון.
- להכין 3% התכה נמוכה הטבעה agarose בינוני: מוסיפים 3 גר' agarose 100 מ של המאגר של Sörensen, מחממים את התערובת בתוך אמבט מים עד 90 מעלות צלזיוס.
- יוצקים 3% agarose (30 ° C) בתוך המסגרת הכוללת את הרקמה. מכסה את המסגרת עם גוש מתכת חמה, המתן עד התקשות. במהלך התקשות, להשתמש telemacrographic המכשירים לשיקוף הרקמה מוטבע והקואורדינטות שלה בתוך המסגרת.
- העבר את הרקמה agarose-מוטבע לתוך מסגרת חיתוך פערים התואם הקואורדינטות של המסגרת הראשונה.
- לחתוך את הרקמה מוטבע למקטעים של עובי הרצוי (למשל, כ- 1.5 מ מ) עם מכשיר עם תער דק וקל רוטטת (ראה טבלה של חומרים).
הערה: כדי לשפר את הדאייה. הסכין גילוח, לטפטף כמה טיפות גליצרין אל הרקמה מוטבעים. - תמונה בכל קטע רקמה של PBS ולאסוף את התמונות לתוך תיקיה.
3. הכנה של רקמה מבודדת במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים
הערה: בצע שלבים נוספים של דגירה במנות זכוכית עם מכסים closable בחוזקה על פלטפורמה חזק מתחת למכסה המנוע.
- לשטוף את קטעי רקמה 2 x 30 דקות ב- PBS. דגירה הסעיפים בתמיסה מימית אוסמיום ארבע-חמצני 2% (OsO4) עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
התראה: אוסמיום ארבע-חמצני רעיל, שעשויות להזיק יותר. כשזה מגיע במגע עם העור. - לשטוף את הסעיפים osmicated 2 x 30 דקות ב- PBS.
- דגירה בסעיפים 30%, 50% ו- 70% אתנול בטמפרטורת החדר למשך 10-15 דקות (אופציונלי: דגירה 70% אתנול ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה).
- תמונת דגימות osmicated 70% אתנול תחת LED RGB אור8,9,10 (2 x 15 W) חלה על המדגם שמאל, צד ימין בזווית של 45 °. השתמש מנות שחור רקע שחור משעמם כדי למזער את הפיזור ואת את השתקפות האור בזמן תאורה.
התראה: אל תאפשר את המקטע להתייבש במהלך דימות. - צור אטלס של תמונות סעיף עם נקודות הציון על ידי איסוף תמונות בסדרה בתיקיה.
- דגירה דגימות ב 100% אתנול (2 x במשך 30 דקות) ו 100% פרופילן אוקסיד (2 x במשך 30 דקות) בטמפרטורת החדר.
התראה: אל תאפשר הסעיפים להתייבש בזמן שינוי פתרונות. - מערבבים 260 מ של שרף עם 240 מיליליטר אנהידריד dodecenylsuccinic בתוך כלי זכוכית תוך ערבוב בעדינות עם בר זכוכית. בדוק מעת לעת inhomogeneity, בועות, מריחות. מאוד בעדינות, מערבבים ביד למשך לפחות 45 דקות.
- להכין שרף/פרופילן אוקסיד על יחס של 1:2 ו- 1:1, הוספת מאיץ 3% (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol).
- דגירה הרקמה 1:2 הטמעת הפתרון משלב 3.8 כבר שעתיים ולאחר מכן בפתרון ההטבעה 1:1 מ שלב 3.8 כבר שעתיים בטמפרטורת החדר על גלגל מסתובב.
- למקם את הרקמה במנות במול פוליפרופילן, לכסות את הרקמה עם שרף טריים המכיל 3% מאיץ, לרפא את הרקמה מוטבעים ב- 65-85 מעלות צלזיוס במשך 12-24 שעות.
- לקרר את הרקמה מוטבע לטמפרטורת החדר דגימות שרף-מוטבע ולהסיר הכלים פוליפרופילן.
4. בחירת והנוירולוגיה הפלסטית Ultrastructural פרמטרים עבור ניתוח כמותי
-
מיפוי האזור עניין
- לבחור אזור התעניינות (למשל, ההיפוקמפוס או המוח הקטן), בתרגום האזור בהרי האטלס מקטע על-ידי בחירת התמונה של הרי האטלס (שלב 3.5) המכיל את האזור הזה.
- לשרטט את גבולות האזור של ריבית על גבי התמונה סעיף ו חפש להרכיב אלה גבולות אזור על גבי הדגימה שרף.
- שריטה-מארק לגבולות האזור של ריבית (למשל, ההיפוקמפוס או המוח הקטן) על הדגימה שרף, באמצעות מחט בסדר לאמוד (26 G, מס ' 1).
- מחממים את הדגימה שרף עד 85 מעלות צלזיוס בתנור כדי לרכך את השרף עבור חיתוך או, לחלופין, להשתמש מכשיר חיתוך, להב דק או נייר זכוכית.
- לסלק את תחום העניין מן הדגימה שרף עם סכין גילוח (ראה טבלה של חומרים). הר הדגימה בהחזקת פסי זכוכית אקרילית של הענק נדרשת, למשל עם (בקוטר של 8 מ מ), באורך של 1 ס מ עם דבק. חתוך את הדגימה הנטען עבור חצי ואת חלוקתה ודק במיוחד.
- הכנת semithin (0.75 מיקרומטר) ו ודק במיוחד (70 ננומטר) מקטעים של האזור המקוצץ באמצעות ultramicrotome של: להגדיר אותו ב- 1.5 מ מ/s עבור עובי 0.75 מיקרומטר וב -0.7 מ מ/s עבור 70 עובי ננומטר.
- לאסוף את הסעיפים semithin על זכוכית נשאים, כתם הסעיפים עם 1% טולדין כחולה ב- PBS (עבור 4 דקות).
- לשטוף את המקטעים מספר פעמים במים יונים. לבחון את החלקים המוכתמים במיקרוסקופ אור באמצעות 4 x (נה של 0.1 ∞ /-), 10 x (NA של 0.22 ∞/0.17), 40 x (NA של 0.65 ∞/0.17), ו- 100 x (NA של 1.25 ∞/0.17) מטרות.
- איסוף מקטעים ודק במיוחד על רשתות ניקל. נושא הרשתות TEM ב 180 kV ו- 3, 200 x, 6, 000 x, ו/או 8,000 x הגדלה.
-
ניתוח TEM
- לבחור את הפרמטרים ultrastructural עניין לניתוח TEM כמותית (עם העיתון ons, למשל עם שלפוחית, המיטוכונדריה או אקסונים ו ו nonmyelinated), TEM תמונות של פרמטרים אלה מתחת לגיל 3, 500 x, 6,000 x ו/או 8,000 x הגדלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הרדמה מהיר ואמין של עכברים, בטיחות פרמטרים רבים נחשבו, סביבת העבודה של אופטימיזציה של יחידת הרדמה התבררה נאותה (איור 1א'). יחידת נועד לשלוט התערובת של איזופלוריין נוזלי, אויר עם דיוק הנדרש לניתוח מוצלח-חיים קטנים, כגון עכברים וחולדות. אוויר, איזופלוריין מעורב מאדה את בהתאם להגדרות הרצויות, נמסר לתוך תיבת או דרך מסיכה החיה (איור 1א'). נבלה אוספת ולא חלבונית כל גז איזופלוריין עודפים עשויים להיווצר, ובכך לספק על סביבת עבודה בטוחה. הגז שנאספו, עברו דרך פחם פעיל במחסנית (איור 1א').
ערכה אופטימיזציה של מכשירים (איור 1B) מאפשרת למדענים לבצע ניתוח במהירות על עכברים בהריון. סרט פשוט פרפין עם מאפיינים הידרופובי מונעת רירית בטן ייבוש לאחר כריתה (איור 1B). הקרניים הרחם מסתירים את העוברים חשופים על גבי הסרט פרפין, העוברים ממוספרים כפי שמוצג באיור 1C. ברגע מקומי, העוברים מותאמים בתנוחה הנכונה עבור הזרקה של הנגיף דרך נימי דק (איור 1D). הזריקה נשלטת מבחינה ויזואלית על ידי התבוננות צורת דיפוזיה לצבוע חודר הכלול התערובת הוירוס שהוחדר (איור 1D). לאחר ההזרקה ברחם, הקרניים הרחם מוצבים בחזרה בתוך חלל הבטן כדי לאפשר התפתחות העוברים מוזרק עד השלב (למשל, עד הלידה ופנייה כמחנכת היום 24) הדרוש לניסוי (ראו, לדוגמה, לאץ ואח5 ,6 ו- et al. קראוס7). במחקרים על פלסטיות סינפטית, מומלץ שהאח התפתחותית או למבוגרים.
לאחר זלוף transcardial של בעלי החיים בשלב הרצוי, רקמת העצבים (לדוגמה, המוח ואת חוט השדרה באיור2) הניח מונחה עצמים בתוך מסגרת פלסטיק שקוף עם נקודות הציון ואני בתוך agarose (איור 2 A, B). לאחר חיתוך, כל קטע הוא עם תמונה (איור 2C, E, G) ולאחר מכן osmicated. לאחר osmication, דגירה ב-70% או 80% אתנול, הסעיפים הם צילמו שוב באמצעות הפרעות קלות telemacrography8,9,10. יש להניח הסעיפים רקמות המקיפים שחור משעמם כדי למזער את הקרינה פזורים במהלך התאורה בעוצמה גבוהה הנדרשת. סיבים נרחבים באזורים שונים של רקמת משקפים הצבעים בעלי ניגודיות רקע כהה רקמה, דפוס צבעוני במיוחד של פני השטח רקמות מתגלה (איור 2D, F, H). כל התמונות ססגוני הן נקודות המגע המוצגים עם תמונות nonosmicated ו, יחד עם הקואורדינטות הצפויות של השלב ההטבעה, שהם יוצרים מפות ניווט של הטופוגרפיה רקמות. בשלב הבא, הרקמה עוד יותר מיובש, מוטבע שרף. בהתבסס על המפות ניווט, תחומי עניין שנבחרו הינם עיבוד נוסף עבור TEM-כדוגמאות, ההיפוקמפוס (שכבה מחזירת אור), המוח הקטן (שכבת תאים גרגר), חוט השדרה (funiculus הגבי) מוצגים באיור 3A1-C4 .
היפוקמפוס, המוח הקטן, סיבים מוסי הסינפסות ידועים להפגין מאפיינים ייחודיים ultrastructural בהשוואה הסינפסות אחרים, כולל גדול עם העיתון ons presynaptic (איור 3A1-B5). הם יכולים להיות בקלות מקומי בעזרת המפות ניווט ססגוני נוסדה במהלך השלבים הקודמים עיבוד. בפרופילים שלהם חתך רוחב ', עם העיתון ons מכיל מספר עצום של שלפוחית, המיטוכונדריה והקף לעיתים קרובות מספר הדנדריטים (איור 3A4, A5, B4, B5). TEM תמונות של פרופילים אלה מאפשרות של כימות של אזורים בוטון סינפטית בחתך רוחב, מספרים של הסינפטיות, המיטוכונדריה בתוך פרופיל בוטון, האורך של קשרים סינפטיים ומספרים של קשר אתרים.
בחוט השדרה, funiculus הגבי מכיל סיבי עצב רבים אשר סיבי העצב על-ידי oligodendroglia. במקטעי חציה, ניתן למצוא את funiculus הגבי בין שתי הקרניים האחורי של חוט השדרה במקטעי חציה (איור 3C1, C2). בתמונות TEM, בחתך רוחב ו דנדריטים מופיעים עגול, עטיפות המיאלין סביב האקסונים מסודרים לפי סדר lamellae (איור 3C3, C4). על כימות של אזורים עצב בחתך רוחב, כולל את העובי של עטיפות המיאלין ואת המספר של מיאלין lamellae, וכן על כימות של המיטוכונדריה בחתך רוחב פרופיל אזורי יכול להתבצע.
הרי האטלס מוכן ותמונות TEM micrographic של הפרמטרים ultrastructural אינם רק מועיל עבור השוואה של מורפולוגי והנוירולוגיה הפלסטית על מצבים שונים של טיפול, אלא גם בעת השוואה בין הפרמטרים בתוך באותו אזור נדרש (למשל, השוואה בין סוגים שונים של סינפסות ההיפוקמפוס18 לבין מבנים המקבילה של מינים שונים [איור 4]).
איור 1 : הכנה התמרה חושית ברחם. (א) איזופלוריין הרדמה ההתקנה: 1) תא אינדוקציה הרדמה הראשונית; 2) משאבת; 3) יחידת הרדמה; 4) ברז מתג ניתוב; 5) הרדמה אספקת צינורות; 6) יחידה נבלות; 7) מסכת נשימה; 8) שולחן הניתוחים מחוממת; 9) סטריאוסקופ המשקפת עם מקור אור; 10) יחידת בקרה. ציוד ניתוח (B): 1) גילוח; 2) סיכה עין; 3) קיבעון קלטות... 4) היגייניות; 5) איריס מלקחיים (10 ס מ, מעוקל, משונן); מספריים איריס 6 ו-7) (11 ס מ, ישר, טונגסטן קרביד); 8) פינצטה דומונט (#3, 12 ס מ, ישר, 0.2 מ"מ x 0.12 מ"מ); 9) מספריים ואנה (8 ס"מ, ישר); 10 ו 11) מיקרו-יתושים hemostatic מלקחיים (12.5 ס מ, מעוקל); 12) הסרט פרפין; 13) כפית מיקרו; 14) ספוגיות כותנה; יתוש hemostatic מלקחיים 15 ו-16) האלסטד (12.5 ס מ, ישר); התפרים 17 ו 18) (גודל 6-0, 3-0); 19) מזרק; 20) ליניקת מכלולים צינור עבור פיפטות microcapillary מכויל. (ג) ערכה שיטתית במספור העובר בתוך הרחם קרניים ביום עובריים (E) 14.5: L = שמאל; R = ימין. (ד) אסטרטגיות של הזרקת: לתוך מתגלה המוח הראשון והשני (אניve ו- IIve, בהתאמה), בחלל הנוזלים הרביעי (IVve), ואת חוט השדרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : תיעוד של רקמה מבודדת מאת telemacrography. (A ו- B) הטבעה של המוח וחוט השדרה ב- agarose, באמצעות וואקום עם מערכת קואורדינטות (רשתות). לאחר חיתוך, הסעיפים נחשפים על telemacrography והפרעות השתקפות אור הדמיה. (C-F) חציה והחלק הווריד של המוח. גודל ברים = 5 מ מ; co = קליפת; רח' = סטריאטום; di = diencephalon; לי = mesencephalon; שלום = ההיפוקמפוס; פדים = pedunculi cerebri; לסה נ = המוח הקטן; מו = המוח המוארך. סעיף חציה (G ו- H) של קטע צוואר הרחם של חוט השדרה. סרגל קנה מידה = 1 מ מ; אמפר לשעה = קרן נכון הקדמי; אהל = קרן הקדמי השמאלי; df = funiculus הגבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : זיהוי הטופוגרפי ואת ultrastructural של פרמטרים פלסטיות. (A1) הפוך הפרעות macrograph האור של ההיפוקמפוס. האזור של עם העיתון ons מוסי סיבים בתוך שכבה מחזירת אור (sl) מודגשת. pcl = שכבת תאים כפירמידה; שזכתה = שכבת תאים גרגר. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (A2) אור microphotograph (100 x אובייקטיבי) של מקטע semithin (0.75 מיקרומטר) מציג שכבה מחזירת אור. הכוכביות מציינות האזורים עם העיתון ons סיבים מוסי המקיפים איים דנדריטים רבים (חץ שחור). טולדין כחול/OsO4 מכתים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (A3) העברת אלקטרונים micrograph בהגדלה גדולה נמוך, מראה מוסי סיבים עם העיתון ons (כוכביות) המקיפים של דנדריט (לזוג). המלבן כוללת של בוטון סיבים מוסי יחיד. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר. (A4) העברת אלקטרונים micrograph של הפרופיל חתך רוחב של בוטון סיבים מוסי יחיד (MFB). קוצים (כחול) ואזור בוטון חתך רוחב (סגול) מודגשים. m = מיטוכונדריון; s = קוצים. סרגל קנה מידה = 200 ננומטר. (A5) הסינפטיות בפנים MFB. סרגל קנה מידה = 100 ננומטר. (B1) הפוך הפרעות macrograph האור של הצרבלום. האזור של שכבת תאים גרגר (שזכתה) המכיל עם העיתון ons סיבים מוסי מסומן. mcl = שכבה מולקולרית; h = hilus. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (B2) אור microphotograph (100 x אובייקטיבי) של מקטע semithin (0.75 מיקרומטר) מציג אזור של השכבה תא גרגר זה גובל Purkinje בתאים (PC). הכוכביות מציינות האזורים עם העיתון ons סיבים מוסי המוקפים נוירונים גרגר אסטרוציטומה רבים (CGN). טולדין כחול/OsO4 מכתים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B3) העברת אלקטרונים micrograph בהגדלה גדולה נמוך, מציג את האזור של MFBs. המלבן כוללת של MFB יחיד. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר. (B4) העברת אלקטרונים micrograph של הפרופיל חתך רוחב של MFB כמו פטריות בתוך שכבת תאים גרגר של הצרבלום. האזור בוטון חתך רוחב (סגול) והינו מודגש שלפוחית ללא קוצים (כחול). סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר. (B5) המיטוכונדריה (סגול) ו הסינפטיות בפנים MFB. סרגל קנה מידה = 150 ננומטר. (C1) הפוך הפרעות macrograph האור של חוט השדרה. האזור של funiculus הגבי (df) המכיל בכבדות ו דנדריטים מודגשת. אמפר לשעה, אהל = ימין והשאיר הורן הקדמי, בהתאמה; רופאים לזכויות אדם ו phL = ימין והשאיר הורן האחורי, בהתאמה. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (C2) אור microphotograph (100 x אובייקטיבי) של מקטע semithin (0.75 מיקרומטר) מציג את funiculus הגבי זה מועשר בכבדות ו דנדריטים (ax) כי הם ניתן להבחנה ברורה מסיבי nonmyelinated (כוכביות). ct = רקמת חיבור. טולדין כחול/OsO4 מכתים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (C3) העברת אלקטרונים micrograph של חתך הרוחב פרופילים של אקסונים ו ו nonmyelinated (ax, סגול). שלי = עטיפות המיאלין. סרגל קנה מידה = 200 ננומטר. (C4) המלבן מראה אקסונים בהגדלה גבוהה, סיבי העצב בכבדות עם מיאלין lamellae וסיבים nonmyelinated. Microtubules (mt) של המיטוכונדריה (ז) בתוך סיבי עצב גלויים. סרגל קנה מידה = 50 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : דוגמאות של פלסטיות ultrastructural פרמטרים במודלים של בעלי חיים שונים. (א) מוסי סיבים עם העיתון ons המוח הקטן של כריש. סרגל קנה מידה = 400 nm. (B) סיבים מוסי בוטון בהיפוקמפוס של מקוק רזוס. סרגל קנה מידה = 200 ננומטר. (ג) צומת עצב-שריר של חתול. סרגל קנה מידה = 300 ננומטר. (ד) סינפטית עם העיתון ons ב reticularis pars הסובסטנציה ניגרה של phalanger. הכוכביות מציינות צפיפות postsynaptic (PSD; בשיבוץ: שחור ראשי חץ). המלבן מראה PSD המוגדל. סרגל קנה מידה = 400 nm. Nonmyelinating (אי) A שוואן (SC) סביב סיבי עצב רבים גנגליון השדרה של עכבר. בסביבה, סיבי בכבדות סיבי העצב גלויים. סרגל קנה מידה = 300 ננומטר. עבור כל לוחות: ax = האקסון; D = דנדריט; m = מיטוכונדריון; MFB = סיבים מוסי בוטון; MF = מוסי סיבים; שלי = עטיפות המיאלין; s = עמוד השדרה; sa = מכשיר עמוד השדרה; sv = הסינפטיות. קשר אתרים (צפיפות postsynaptic) מסומנים באמצעות כוכביות. חתך רוחב אזורים מסומנים סגול וכחול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
צעד מכריע של התמרה חושית ברחם הוא ההליך הזרקה. הזרקה מדויקת לתוך המוח החדרים או תחום התעניינות נוסף דורש ניסיון ומיומנות מעשית. רזה הטיפ microcapillary, הנזק רקמות עלולות להתרחש; עם זאת, זה על חשבון הגדלת הזרקה בלחץ. בניגוד אלקטרופורציה ברחם19,20,21,22, שיעור ההישרדות של העוברים מוזרק לאחר התמרה חושית ברחם היא גבוהה מאוד. יכול להיות מוזרק כל העוברים של ' קרן ' הרחם, גם אם העוברים ממוקמים בלב ליבה של הקרניים הרחם, צריך להיות והשתלב בתוך השק. הרחם. בשלבים התפתחותיים של הזרקת וניתוח ניתן להתאים השאלה המדעית.
כאשר מזריקים לתוך המוח מתגלה, החלקיקים AAV1 מופצים באמצעות נוזל מוחי שדרתי דרך המערכת חדרית כולה. פיתוח מבנים עם משטחים הנמצאים קשר הדוק עם המשקאות, כגון ההיפוקמפוס של המוח הקטן, transduced על ידי נגיפים יישומית6,5,, או7. ניתוח של השינויים בפרמטרים ultrastructural, כמו גודל בוטון, אזורים בוטון בחתך רוחב, מספרים של הסינפטיות, מספרים של המיטוכונדריה, ו מספרים אורך של קשרים סינפטיים במבנים אלה, היא read-out אלגנטי עבור פלסטיות ultrastructural. ניתן להחיל את שיטת התמרה חושית ברחם ללמוד אזורים שונים במוח, כמו גם את חוט השדרה6. יתר על כן, איברים ורקמות אחרות באופן דומה ניתן לבחור כמטרות התמרה חושית. בסופו של דבר, המודל העכבר בשימוש תכוף יכול להיות מוחלף על ידי מינים אחרים כנדרש.
צילומים של הפרוסות רקמות מאפשרת ניתוח מדויק מאוד דוגמאות שרף-מוטבע במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. מאז הכיוון המרחבי של המדגם מוגדר, חיתוך נרחב ולגזול הושמט. יתר על כן, האזורים הסמוכים מכריע ניתן לשמור במערכת היחסים המקורית שלהם אחד לשני. יתרון חשוב של השלב תיעוד צילומי היא האפשרות לעקוב אחר האיכות של קיבוע הרקמה וכדי לזהות שינויים פתולוגיים. לפיכך, האיכות של קיבעון והטבעה של החומר היא בעלת חשיבות מרכזית. יכול להיות במיקור חוץ דגימות nonsuitable המכילות חפצים לפני עיבוד נוסף.
הסדרה micrograph הפרוסות רקמות הדמיה מספקות של אטלס מורפולוגי מועיל. ללימודים neuroanatomical השוואתית, אשר עשוי לכלול גם מינים נדירים, הוא הרי האטלס ארכיון יקרי ערך. הבחירה של עובי הפרוסות רקמות תלויה השאלה המדעית הממוענת אלי, מוגבל על ידי גודל הדגימה רקמות. לבעלי-חיים קטנים, צריך להיות מותאם עובי של עד 1 מ מ. סעיפים עבה מאוד (> 5 מ מ) אינם מומלצים, בשל יכולת חדירה מוגבל של אוסמיום ארבע-חמצני8,9,10.
התיעוד telemacrophotography הכרחי ללימודי morphometrical. הוא מציע התאמה קבועה של המשטח רקמות בצד, המטוס העליון של המסגרת, מגדירה את המיקום של מבנה נתון במערכת מרחבית של קואורדינטות. שילוב של השיטה המתוארת עם אלקטרופיזיולוגיה18 או עם המודל פגיעה בחוט השדרה, שם פלסטיות משחקת תפקיד חיוני התחדשות6, אפשרי. ללימודים neuroanatomical השוואתית, אשר עשוי לכלול גם מינים נדירים, הרי האטלס רקמות ססגוני ותמונות TEM micrographic של הפרמטרים ultrastructural הם נכסים יקרי ערך.
למרות החוזק שלה, TEM יש מספר מגבלות בשל עובי גודל המדגם (70 nm), האזור בחתך רוחב (< 6 מ מ2), ואת המורכבות של הכנת המדגם. עם זאת, כאשר הדגימה מוכן במדויק, הדימויים TEM ultrastructure של הדגימה הם באיכות מעולה בהשוואה תמונות המיוצר על ידי כל טכניקות אור-microscopical. הטכניקה התמרה חושית ברחם הוא מוגבל על ידי אמצעי האחסון מוזרק, האזור הטופוגרפי של הזריקה. עוררין, הטכניקה יש פוטנציאל רפואי translational חזק בטיפול התפתחותי מוקדם וב -החילוץ של מחלות מולדות neuropathological. יתר על כן, השילוב הנוכחי של התמרה חושית ברחם עם TEM עשוי לא רק להיחשב בגישה לטיפול עתידי של מחלות מולדות, אלא גם עבור אבחון התפתחותיות מבוססי ultrastructure באיכות גבוהה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים תודה העמיתים של המתקן בעלי חיים בפקולטה לרפואה, אוניברסיטת הרוהר בוכום, תמיכה וטיפול החיה שלהם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol | Serva | 36975 | |
| 26 G x 1'' needle | Henke-Sass, Wolf GmbH | ||
| 410 Anaesthesia Unit for air pump | Biomedical Instruments (Univentor) | 8323102 | |
| Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) | UKE (Viral Core Facility) | - | For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54. |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | low gelling agarose |
| Air Pump | Biomedical Instruments (Univentor) | Eheim 100 | |
| Araldite | CIBA-GEIGY | 23857.9 | resin for embedding of tissue |
| aspirator tune assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium | Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| buprenorphine | Temgesic | ampules | painkiller |
| capillaries | Science-Products | GB100TF-10 | with fillament |
| Dodecenylsuccinic anhydride | Fluka | 44160 | |
| Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) | FST | 11203-23 | |
| electric shaver | Phillips | - | |
| Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) | Ethicon | - | polyamide |
| eye lubricant | Bepanthene | - | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | for visualization of injected liquids |
| Gas Routing Switch 4/2 connectors | Biomedical Instruments (Univentor) | 8433020 | |
| halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) | FST | 13011-12 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 25 000 I.E./5 mL | |
| Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155 mm x 115 mm x 130 mm. Wall thickness: 6 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| iris forceps (10 cm, curved, serrated) | FST | 14007-14 | |
| iris scissors (11 cm, straight, tungsten carbide) | FST | 14501-14 | |
| Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257mm x110 mm x 18 mm. Heating area: 190 mm x 90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations |
Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| isoflurane (Attane) | JD medical | inhalation anesthesia | |
| LED RGB lights | Cameo | CLQS15RGBW | LEDs 2 x 15 W |
| Light microscope Basic DM E | Leica | - | 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives |
| micropipette puller | Science-Products | P-97 | |
| Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, curved) | FST | 13010-12 | |
| Nickel grids, 200 mesh | Ted Pella | 1GC200 | |
| Osmium (VIII)-oxid | Degussa | 73219 | |
| Propylene oxide | Fluka | 82320 | |
| razor blades | Schick | 87-10489 | |
| Sodium pentobarbital (Narcoren) | Merial GmbH | - | |
| TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback | Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| Technovit 4004 two components glue | Kulzer | ||
| Telemacrodevice | Canon | - | Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand. |
| Thermopuller P-97 | Sutter Instruments | - | |
| thin vibrating razor blade device | Krup | - | with Szabo thin blades |
| toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Transmission electron microscope C20 | Phillips | - | up to 200 kV |
| Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6 mm Inner diameter: 4 mm Wa ll thickness: 1 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| Ultracut E | Reichert-Jung | - | ultramicrotome |
| Univentor Scavenger | Biomedical Instruments (Univentor) | 8338001 | |
| Vannas scissors (8 cm, straight) | FST | 15009-08 |
References
- Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers. Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).
- Hamlyn, L. H. The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit. Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).
- Peters, A., Palay, S., Webster, H. The Fine Structure of the Nervous System. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1991).
- Rollenhagen, A., et al. Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses. Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).
- Lutz, D., et al. Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival. Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).
- Lutz, D., et al. Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury. Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).
- Kraus, K., et al. A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination. Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).
- Andres, K. H., von Düring, M. Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung. Mikroskopie. 30, 139 (1974).
- Andres, K. H., von Düring, M. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. Hayat, M. A. , Van Norstrand Reinhild. 246-261 (1997).
- Andres, K. H., von Düring, M. General Methods for Characterization of Brain Regions. Techniques in Neuroanatomical Research. Heym, C., Forssmann, W. -G. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. 100-108 (1981).
- Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).
- Webster, H. F., Collins, G. H. Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).
- Andres, K. H. Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern. Mikroskopie. 21, 169 (1967).
- Forssmann, W. G., et al. Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation. Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).
- Descarries, L., Schröder, J. M. Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit. Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).
- Langford, L. A., Coggeshall, R. E. The use of potassium ferricyanide in neural fixation. Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).
- Liu, J., et al. Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex. Molecular Brain. 7, 84 (2014).
- Lee, S. H., et al. Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway. Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. , Suppl 1 120-125 (2009).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
- Nishiyama, J., et al. Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation. European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).
- Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo. Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).
