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Developmental Biology

विकासशील माउस मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के utero transduction में के बाद ultrastructural neuroplasticity मापदंडों का आकलन

doi: 10.3791/59084 Published: February 26, 2019
* These authors contributed equally

Summary

संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के संयोजन और utero में पारक्रमण विकास के दौरान तंत्रिका तंत्र की ठीक ultrastructure में रूपात्मक परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है. इस संयुक्त विधि संरचनात्मक विवरण में परिवर्तन में गहरी अंतर्दृष्टि की अनुमति देता है उनके स्थलाकृतिक प्रतिनिधित्व के संबंध में neuroplasticity अंतर्निहित ।

Abstract

वर्तमान अध्ययन संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ utero पारक्रमण में जोड़ती है (उनि) असंदिग्ध पहचान की स्थलाकृतिक संरचनाओं में ultrastructural मापदंडों का एक सटीक morphometrical विश्लेषण पर लक्ष्य, ब्याज की एक प्रोटीन से प्रभावित जिसे वायरल ट्रांसफर के जरिए जीव में पेश किया जाता है । यह संयुक्त दृष्टिकोण स्थूल संरचनात्मक से एक ऊतक एटलस में स्थलाकृतिक नेविगेशन नक्शे का पालन करके ultrastructural पहचान के लिए एक चिकनी संक्रमण के लिए अनुमति देता है । में-utero ट्रांसड्यूड ऊतक के उच्च संकल्प इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी न्यूरोपिल के ठीक ultrastructure और इसके plasticity मापदंडों, इस तरह के पार खोदी synaptic bouton क्षेत्रों के रूप में पता चलता है, synaptic vesicles और mitochondria की संख्या के भीतर एक bouton प्रोफ़ाइल, synaptic संपर्कों की लंबाई, पार खोदी axonal क्षेत्रों, माइलिन sheaths की मोटाई, माइलिन lamellae की संख्या, और क्रॉस-खोदी क्षेत्रों mitochondria प्रोफाइल. इन मापदंडों के विश्लेषण तंत्रिका तंत्र है कि आनुवंशिक निर्माण के वायरल हस्तांतरण से प्रभावित होते है के क्षेत्रों में ultrastructural plasticity के परिवर्तन में आवश्यक अंतर्दृष्टि से पता चलता है । इस संयुक्त विधि आनुवंशिक रूप से इंजीनियर जैव अणु और/न्यूरोनल plasticity पर दवाओं के प्रत्यक्ष प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपयोग नहीं किया जा सकता है, लेकिन यह भी न्यूरोनल plasticity के utero बचाव में अध्ययन करने के लिए संभावना को खोलता है (जैसे, के संदर्भ में न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियां) ।

Introduction

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कोई फोटॉन एक इलेक्ट्रॉन की गहराई ग्रेड में एक ultrathin ऊतक नमूना घुसना कर सकते हैं । यह प्रकाश माइक्रोस्कोपी तकनीक की तुलना में ठीक संरचनाओं के नैनोमीटर संकल्प छवियों पर कब्जा करने में उनि के लिए अमूल्य लाभ का श्रेय । उदाहरण के लिए, उनि, मिटोकॉन्ड्रिया, मेलानोसोम और विभिन्न प्रकार के स्रावी granules, माइक्रोट्यूब्यूल्स, माइक्रोफिलामेंट्स, सिलिया, माइक्रोविली, और इंटरसेलुलर जंक्शन जैसे इंट्रासेल्यूलर ऑर्गेनेल्स के दृश्य के लिए अनुमति देता है (सेल सतह specializations), तंत्रिका तंत्र में विशेष synapses में1,2,3,4. वर्तमान methodological अध्ययन के समग्र लक्ष्य के राज्य-के-the-कला तकनीकों के संयोजन से जंम के पूर्व हस्तक्षेप पर विकास के दौरान तंत्रिका plasticity में परिवर्तन के ultrastructural मांयता है utero पारक्रमण और उनि में । ब्याज की वायरल एन्कोडेड प्रोटीन, रीढ़ की हड्डी6सहित केंद्रीय तंत्रिका तंत्र5,6,7, में यूटरो में ट्रांसड्यूड किया गया है । उदाहरण के लिए, यूएनटी के साथ संयोजन में utero पारक्रमण में सेल आसंजन अणु l1 में मोटर सीखने plasticity के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है l1-कमी चूहों में, विशेष रूप से l1 और परमाणु रिसेप्टर प्रोटीन के बीच परस्पर क्रिया के संबंध में अनुमस्तिष्क न्यूरॉन्स में7.

neuroplasticity मापदंडों के विश्लेषण तंत्रिका तंत्र के भीतर सबसे छोटे क्षेत्रों के स्थानीयकरण के बारे में सटीक जानकारी की आवश्यकता है. इसलिए, यह अन्य संरचनाओं के संबंध में अल्ट्रास्ट्रक्चरल विवरण और उनके सटीक स्थलाकृतिक अभिविन्यास का वर्णन करने के लिए पर्याप्त है । वर्तमान अध्ययन में, प्रकाश और इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी दोनों के आधार पर विशिष्ट रूपात्मक क्षेत्रों की विस्तृत जांच का लक्ष्य एक विशेष तैयारी पद्धति प्रस्तुत की गई है । इस दृष्टिकोण ऊतक हेरफेर के कई तकनीकों को जोड़ती है, माउस मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के यूट्रो पारक्रमण में के साथ शुरू करने और छिड़काव निर्धारण, मोल्ड embedding, और उनि के लिए ऊतक प्रसंस्करण द्वारा पीछा किया । एक आवश्यक कदम embedding और उनि के लिए ऊतक के प्रसंस्करण के बीच शामिल ऊतक के प्रलेखन है, का उपयोग कर हस्तक्षेप प्रकाश प्रतिबिंब तकनीक है कि सटीक microphotographic और कम आवर्धन प्रलेखन के लिए अनुमति देता है ऊतक8,9,10नमूनों । वर्तमान दृष्टिकोण में शामिल, इस तकनीक के शोधकर्ताओं ने तंत्रिका ऊतक सतहों के स्थलाकृतिक और संरचनात्मक विवरण की जांच करने के लिए सक्षम बनाता है और नमूना स्लाइस प्रोफाइल के लिए उनकी तैयारी के लिए पहले ।

पूरे दिमाग को सेक्शनिंग के लिए एक विशेष फ्रेम stereotaxic निर्देशांक से मेल खाती है । इस फ्रेम के रूपात्मक तीन आयामी लाभ (3 डी) तंत्रिका ऊतक में क्षेत्रों के पुनर्निर्माण और रूपात्मक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । कल्पना वर्गों के macrographs स्थलाकृतिक निर्देशांक आवंटित कर रहे हैं, और प्रश्नपत्र गिने वर्गों एक ऊतक एटलस में नक्शे का निर्माण ।

राल प्रसंस्करण के बाद, एम्बेडेड ऊतक ultrathin वर्गों में खोदी है (< 70 एनएम) चयनित क्षेत्रों से युक्त, उपर्युक्त ऊतक एटलस के नक्शे के अनुसार. ultrathin वर्गों के लिए उनि के अधीन है उच्च plasticity मापदंडों के संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए (जैसे, क्रॉस-अनुभाग synaptic बूटोंस या axonal फाइबर के क्षेत्र प्रोफ़ाइल क्षेत्रों) अपनी सामग्री और संपर्कों के परिसर के भीतर पड़ोसी संरचनाओं के लिए न्यूरोपिल.

विधि के साथ साथ वर्णित है, सूक्ष्म और nanostructures के लिए कल्पना macrostructures से चिकनी संक्रमण की अनुमति देता है तुलनात्मक में गहराई से अध्ययन रूपात्मक न्यूरोनल plasticity के utero पारक्रमण में विकासशील तंत्रिका के बाद प्रणाली.

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Protocol

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पशु विषयों पर सभी प्रक्रियाएं हैंबर्ग और nordrhein के संघीय राज्यों की संस्थागत पशु नैतिकता समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया है-westfalen, जर्मनी ।  पूरे सर्जिकल प्रक्रिया के दौरान बाँझ उपकरणों, सुरक्षात्मक दस्ताने और एप्प्टिक कोट का उपयोग करें ।

1. utero में transduction

  1. adeno-संबंधित वायरस प्रकार तैयार करें 1 (AAV1) वांछित लक्ष्य के लिए कोडिंग (4 x 1011 वायरल कणों/AAV1 के μl) फॉस्फेट-buffered खारा (pbs) में पीएच ७.४ । ०.१ मिलीग्राम/μl फास्ट ग्रीन जोड़ें और AAV1-३७ डिग्री सेल्सियस पर तेजी से हरे रंग का मिश्रण रखें ।
  2. वांछित आकार के साथ एक पतली केशिका टिप (लंबाई में 8 मिमी, ८० μm के बाहर व्यास और ५० μm के एक भीतरी व्यास के साथ) तैयार करें, एक micropipette खींचने का उपयोग (सेटिंग्स: दबाव = ५००, हीट = ७००, पुल = 0, वेग = ८०, समय = २००, सामग्री की तालिका देखें ). केशिका की नोक को तोड़ इतना है कि यह 4-5 मिमी है ।
  3. केशिका टिप के साथ एक चूषित्र ट्यूब (४४ सेमी x ०.७ सेमी) को इकट्ठा और केशिका में AAV1-तेजी से हरे रंग के मिश्रण के महाप्राण 15 μl ।
  4. पूरी प्रक्रिया के दौरान ३७ डिग्री सेल्सियस के एक निरंतर शारीरिक शरीर के तापमान पर पशु विषयों रखो ।
  5. preincubation कक्ष में एक गर्भवती C57Bl/6 माउस (भ्रूणीय दिवस १४.५) प्लेस और गैसीय 4% आइसोफ्लूरेन के साथ माउस एनेस्थेटाइज (0.6-0.8 L/मिनट की एक volumetric airflow दर के साथ) ।
  6. subcutaneously, सुई बुप्रेनोरपाइन (०.१ मिलीग्राम/किग्रा शरीर के वजन) ।
  7. prewarmed सर्जिकल प्लेट (३७ डिग्री सेल्सियस) पर एनेस्थेटिज्ड माउस रखें ।
  8. एक स्नेहक के साथ आंखों को कवर ।
  9. सर्जिकल प्लेट पर एनेस्थेसिया मास्क (गैसीय १.५% आइसोफ्लूराने से 0.6-0.8 L/मिनट की एक volumetric airflow दर पर) के साथ माउस फिट और पेट त्वचा क्षेत्र दाढ़ी । 3x ७५% इथेनॉल के साथ और फिर betadine समाधान के साथ मुंडा क्षेत्र पोंछ ।
    नोट: एनेस्थेटाइज्ड माउस के श्वास व्यवहार को लगातार मॉनिटर करें । माउस के इनहेलेशन-एक्सोलेशन पैटर्न के अनुसार आइसोफ्लूराने गैस की एकाग्रता को समायोजित करें ।
  10. माउस के हिंद पंजा phalanges निचोड़ द्वारा तल पलटा के अभाव के लिए जांच करें ।
  11. घुमावदार दांतेदार आईरिस संदंश (10 सेमी) के साथ त्वचा को मनोरंजक और सीधे टंगस्टन कार्बाइड कैंची (10 सेमी) के साथ लीनिया mediana साथ त्वचा को काटने के द्वारा उदर गुहा खोलें, और फिर, सीधे dumont चिमटी के साथ पेरिटोनियल दीवार मनोरंजक द्वारा (12 सेमी, ०.२ मिमी x ०.१२ मिमी) और सीधे है vanna कैंची (8 सेमी) के साथ लीनिया अल्बा साथ दीवार काटने ।
  12. उदर खोलने पर गवाक्षित पैराफिन फिल्म का एक टुकड़ा प्लेस और सूक्ष्म मच्छर hemostatic संदंश (१२.५ सेमी, घुमावदार) के साथ दोनों सिरों पर फिल्म को ठीक ।
  13. गर्भाशय के सींग के अंदर भ्रूण को नुकसान से बचने के लिए एक चम्मच की तरह डिवाइस के साथ गर्भाशय के सींग बेनकाब । गर्भाशय के सींग पर पीबीएस (३७ डिग्री सेल्सियस) की कुछ बूंदें ड्रिप और गर्भाशय थैली के अंदर नुकसान या विकृतियों के लिए भ्रूण का निरीक्षण ।
  14. गर्भाशय के सींग में भ्रूण के आदेश और स्थिति को दस्तावेज़ करें । भ्रूण को ध्यान से गर्भाशय थैली के अंदर मुड़ें जब तक इंजेक्शन के लिए वांछित स्थिति तक पहुँच जाता है ।
  15. AAV1-तेजी से हरे मिश्रण नेत्रहीन इंजेक्शन साइट (जैसे, मस्तिष्क ventricles) और एक stereomicroscope के तहत डाई पैठ का निरीक्षण करके इंजेक्शन 1-2 μl ।
  16. इंजेक्शन भ्रूण दस्तावेज़ और इंजेक्शन भ्रूण के साथ गर्भाशय सींग जगह वापस उदर गुहा में ।
  17. पीबीएस (३७ डिग्री सेल्सियस) की कुछ बूंदें उदर गुहा में ड्रिप । पेरिटोनियल दीवार का उपयोग करके गुहा को बंद करें (पॉलीयामाइड 6-0-आकार के सीवन) और त्वचा (पॉलीयामाइड 3-0-आकार के सीवन का उपयोग करें), halsted के मच्छर हेमोस्टेटिक संदंश (१२.५ सेमी, घुमावदार) का उपयोग करते हुए । वैकल्पिक रूप से, उदर गुहा और त्वचा को बंद करने के लिए एक सरल बाधित पैटर्न या स्टेनलेस स्टील सीवन/स्टेपल का उपयोग करें ।

2. पृथक ऊतकों का टेलीमैक्रोफोटोग्राफी

  1. तैयार थें
    1. तैयार sörensen's बफर (1 l) को भंग करके १४.९५ जी के ना2hpo4 और २.१८ g के KH2PO4 में 1 l में आसुत पानी की २०० rpm पर सरगर्मी के तहत. प्रसव के बाद समय अवधि में देर से हमल पिल्ले और/या पिल्ले के छिड़काव के लिए, पेट या intragastric इंजेक्शन के लिए सुइयों के एक उचित आकार का उपयोग करें और सुनिश्चित करें कि टर्मिनल सोडियम pentobarbital संज्ञाहरण की एकाग्रता से अधिक नहीं है १८० मिलीग्राम/ किलो शरीर बकरों का ।
    2. मुगनैनी के निर्धारण समाधान को तैयार करें (5 एल) ७५ डिग्री सेल्सियस तक आसुत जल की ५०० मिलीलीटर हीटिंग और २०० आरपीएम पर सरगर्मी के तहत पैराफॉर्मालडिहाइड पाउडर के ५० ग्राम जोड़ने, 5 एन naoh के २०० μl जोड़ने, sörensen's बफर के १,५०० एमएल जोड़ने, १,७५० एमएल आसुत पानी की , और ५०० मिलीलीटर की 25% ग्लूटारल्डिहाइड । आसुत जल के साथ ५,००० मिलीलीटर तक भरें । छिड़काव के लिए इस अंतिम बफर का प्रयोग करें ।
      नोट: मुगनैनी के निर्धारण समाधान को हुड के तहत तैयार करें, सुरक्षात्मक चश्मे पहनें, और धुएं से बचें । मिश्रण के एक बेहतर दृश्य के लिए मेथिलीन नीला (०.०५ g/
  2. माउस छिड़काव और ऊतक अलगाव
    1. transcardially गर्भवती चूहों कि transduced भ्रूण ले (भ्रूण अध्ययन के मामले में) या वांछित उंर में जंम transduced पब (उदाहरण के लिए, प्रसव के दिन 24) मानक प्रक्रियाओं के अनुसार6,7, 11,12,13,14,15,16,17, intraperitoneal टर्मिनल सोडियम pentobarbital का उपयोग संज्ञाहरण (शरीर के वजन के २०० मिलीग्राम/
    2. चूहों को हेपरिन समाधान (५०० यू) का उपयोग करके एक 26 जी, सुई में 1 और, निर्धारण से पहले, चूहों को शरीर से रक्त को बाहर निकलवाने के लिए पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ ट्रांसकारडीली में डालना, और उन्हें 30 मिलीलीटर ४० डिग्री सेल्सियस के साथ ट्रांसकार्डिली में शवद करें । मुगनैनी के निर्धारण समाधान ।
      नोट: वयस्क चूहों के लिए, एक वैकल्पिक प्रतिगामी परफ्यूजन के माध्यम से उदर महाधमनी14प्रदर्शन.
    3. (उदाहरण के लिए, पूरे मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी) ब्याज की perfused ऊतक को अलग और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक और 24 एच के लिए मुगनैनी के निर्धारण के समाधान के कम से 10 मिलीलीटर में ऊतक पोस्टफिक्स ।
    4. कमरे के तापमान पर 3 एच के लिए पीबीएस के 10 मिलीलीटर में ऊतक धो लें ।
  3. agarose में embedding, प्लस प्रलेखन और परिच्छेदन
    1. पृथक ऊतक (उदाहरण के लिए, पूरे मस्तिष्क) को एक पुनरुत्प्राप्य परिच्छेदनीय कोण8,9,10के साथ एक विशेष फ्रेम में समायोजित करें । वैकल्पिक रूप से, एक समायोज्य काटने मोटाई के साथ एक vibratome का उपयोग करें ।
    2. फ्रेम में तंत्रिका ऊतक रखें, टेलीमैक्रोग्राफी के लिए ऊतक को समायोजित करें, और निर्देशांक दस्तावेज़ ।
    3. 3% कम पिघलने agarose-embedding मध्यम तैयार करें: १०० में agarose के 3 जी जोड़ें sörensen's बफर के एमएल और एक पानी स्नान में मिश्रण गर्मी ९० डिग्री सेल्सियस के लिए ।
    4. फ्रेम में 3% agarose (30 डिग्री सेल्सियस) डालो कि ऊतक शामिल हैं । एक गर्म धातु ब्लॉक के साथ फ्रेम को कवर और जब तक यह सख्त है रुको । हार्डनिंग के दौरान, एम्बेडेड ऊतक और फ्रेम के भीतर इसके निर्देशांक को छवि के लिए टेलीमैक्रोग्राफिक उपकरणों का उपयोग करें ।
    5. पहले फ्रेम के निर्देशांक को इसी अंतराल काटने के साथ एक फ्रेम में agarose एंबेडेड ऊतक स्थानांतरण ।
    6. एक पतली और हिल रेसर ब्लेड के साथ एक डिवाइस के साथ वांछित मोटाई (जैसे, १.५ मिमी) के वर्गों में एम्बेडेड ऊतक कट ( सामग्री की तालिकादेखें).
      नोट: रेवर ब्लेड की ग्लाइडिंग में सुधार करने के लिए, एम्बेडेड ऊतक पर ग्लिसरीन की कुछ बूंदें ड्रिप ।
    7. छवि pbs में प्रत्येक ऊतक अनुभाग और एक फ़ोल्डर में छवियों को इकट्ठा ।

3. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए अलग ऊतक की तैयारी

नोट: हुड के तहत एक मिलाते हुए मंच पर कसकर closable lids के साथ कांच के व्यंजन में ऊष्मायन के सभी आगे कदम प्रदर्शन ।

  1. pbs में 2x 30 मिनट के लिए ऊतक वर्गों धो लें । कमरे के तापमान पर 2 ज के लिए 2% जलीय आज़मियम टेट्रॉक्साइड समाधान (ओएसओ4) में वर्गों को सेते हैं ।
    सावधानी: osmium टेट्रॉक्साइड विषाक्त है और यह त्वचा के साथ संपर्क में आता है जब हानिकारक हो सकता है.
  2. pbs में 2x 30 मिनट के लिए osmicated वर्गों धो लें ।
  3. 30%, ५०% में वर्गों सेते, और 10-15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ७०% इथेनॉल (वैकल्पिक: 4 डिग्री सेल्सियस पर ७०% इथेनॉल में सेते रातोंरात) ।
  4. छवि के तहत ७०% इथेनॉल में osmicated नमूनों एलईडी आरजीबी प्रकाश8,9,10 (2x 15 डब्ल्यू) ४५ डिग्री के कोण पर बाईं और दाईं ओर से नमूने के लिए आवेदन किया । प्रकीर्णन और रोशनी के दौरान प्रकाश के प्रतिबिंब को कम करने के लिए काले व्यंजन और एक सुस्त काली पृष्ठभूमि का उपयोग करें ।
    सावधानी: इमेजिंग के दौरान सेक्शन को सूखने न दें ।
  5. एक फ़ोल्डर में श्रृंखला में छवियों को इकट्ठा करके निर्देशांक के साथ अनुभाग छवियों का एक एटलस बनाएँ ।
  6. १००% इथेनॉल में नमूनों (30 मिनट के लिए 2x) और १००% प्रोपलीन ऑक्साइड (30 मिनट के लिए 2x) कमरे के तापमान पर सेते हैं ।
    सावधानी: समाधान बदलते समय अनुभागों को सूखने न दें ।
  7. एक गिलास बर्तन में dodecenylsuccinic एनहाइड्राइड के २४० मिलीलीटर के साथ राल के २६० मिलीलीटर मिक्स जबकि धीरे एक गिलास पट्टी के साथ सरगर्मी । आवधिक रूप से असमांकता, बुलबुले, और स्मेयर्स के लिए जांच करें । बहुत धीरे, हाथ से कम से ४५ मिनट के लिए हलचल ।
  8. 1:2 और 1:1 के अनुपात में राल/प्रोपाइलीन ऑक्साइड तैयार करें और 3% एक्सीलरेटर (2, 4, 6-Tris (डाइमेथिल्मिनोमेथिल) फीनॉल जोड़ें) ।
  9. में ऊतक सेते 1:2 embedding समाधान के लिए चरण ३.८ से 2 h और फिर 1:1 embedding समाधान में चरण ३.८ से 2 h के लिए एक घूर्णन व्हील पर कमरे के तापमान पर ।
  10. फ्लैट polypropylene के व्यंजन में ऊतक रखें, 3% एक्सीलेटर युक्त ताजा राल के साथ ऊतक को कवर, और 12-24 एच के लिए 65-85 डिग्री सेल्सियस पर एम्बेडेड ऊतक का इलाज ।
  11. कमरे के तापमान पर एम्बेडेड ऊतक को शांत करें और पॉलीप्रोपाइलीन व्यंजन से राल-एम्बेडेड नमूनों को हटा दें ।

4. मात्रात्मक विश्लेषण के लिए ultrastructural neuroplasticity मापदंडों का चयन

  1. रुचि के क्षेत्र का मानचित्रण
    1. ब्याज का एक क्षेत्र चुनें (जैसे, हिप्पोकैम्पस या सेरिबैलम) और इस क्षेत्र में शामिल एटलस (चरण ३.५) से छवि को चुनकर अनुभाग एटलस में क्षेत्र को स्थानीयकृत करें ।
    2. अनुभाग छवि पर ब्याज के क्षेत्र की सीमाओं को स्केच करें और इन क्षेत्र सीमाओं को राल नमूनों पर लगाएं/
    3. खरोंच-मार्क ब्याज के क्षेत्र की सीमाओं (जैसे, हिप्पोकैम्पस या सेरेबैलम) राल नमूना पर, एक ठीक सुई गेज का उपयोग कर (26 जी, 1 में).
    4. trimming के लिए राल नरम करने के लिए एक ओवन में ८५ डिग्री सेल्सियस के लिए राल नमूना गर्मी या, वैकल्पिक रूप से, एक trimming डिवाइस, एक पतली ब्लेड, या sandpaper का उपयोग करें ।
    5. एक रेज़ ब्लेड के साथ राल नमूना से ब्याज के क्षेत्र Excise ( सामग्री की तालिकादेखें). आवश्यक कैलिबर के एक्रिलिक कांच की सलाखों के पकड़े पर नमूना माउंट (उदाहरण के लिए, 8 मिमी और 1 सेमी की लंबाई के एक व्यास के साथ) गोंद के साथ । अर्द्ध और ultrathin सेक्शनिंग के लिए घुड़सवार नमूना ट्रिम ।
    6. अर्धपतली (०.७५ μm) और ultrathin (७० एनएम) वर्गों छंटनी क्षेत्र के एक ultramicrotome का उपयोग कर तैयार: यह १.५ मिमी पर सेट ०.७५ μm मोटाई के लिए और ०.७ mm/
    7. कांच वाहक पर सेमीथिन वर्गों लीजिए और pbs में 1% टोलुइडीन नीले (4 मिनट के लिए) के साथ वर्गों दाग ।
    8. वर्गों को विआयनीकृत पानी में कई बार धो लें । प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत दाग वर्गों की जांच 4x का उपयोग कर (na of ०.१ ∞/-), 10x (na of ०.२२ ∞/०.१७), 40x (na of ०.६५ ∞/०.१७), और 100x (na of १.२५ ∞/०.१७) उद्देश्य ।
    9. निकल ग्रिड पर ultrathin वर्गों लीजिए । १८० केवी पर और 3, 200x, 6, 000x, और/या 8, 000x इज़ाफ़ा में उनि के लिए ग्रिड विषय ।
  2. उनि विश् लेषण
    1. मात्रात्मक उनि विश्लेषण के लिए ब्याज की ultrastructural मापदंडों चुनें (उदाहरण के लिए, vesicles और माइटोकॉन्ड्रिया या myelinated और nonmyelinated axons के साथ बूटोंस) और 3, 500x, 6, 000x और के तहत इन मानकों के उनि छवियों को ले/

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Representative Results

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चूहों की विश्वसनीय और तेजी से संज्ञाहरण के लिए, कई सुरक्षा मापदंडों पर विचार किया गया, और संज्ञाहरण इकाई के एक अनुकूलित कार्यक्षेत्र के लिए पर्याप्त साबित (चित्रा 1एक) । इकाई चूहों और चूहों जैसे छोटे जानवरों पर सफल सर्जरी के लिए आवश्यक एक परिशुद्धता के साथ तरल आइसोफ्लूराने और परिवेश हवा के मिश्रण को नियंत्रित करने के लिए बनाया गया है । वायु और आइसोफ्लूराने वांछित सेटिंग्स के अनुसार vaporizer में मिलाया जाता है और एक बॉक्स में या पशु (चित्रा 1) के लिए एक मुखौटा के माध्यम से दिया । मेहतर एकत्र करता है और किसी भी अधिशेष आइसोफ्लूरेन गैस है कि उत्पादन किया जा सकता है, इस प्रकार एक सुरक्षित काम के माहौल प्रदान निष्क्रिय कर देता है । गैस एकत्र की है और एक कारतूस (चित्रा 1) में सक्रिय कोयले के माध्यम से पारित कर दिया ।

उपकरणों का एक अनुकूलित सेट (चित्रा 1बी) वैज्ञानिकों गर्भवती चूहों पर जल्दी सर्जरी प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देता है । हाइड्रोफोबिक गुणों के साथ एक साधारण पैराफिन फिल्म लकीर (चित्रा 1बी) के बाद सुखाने से उदर म्यूकोसा रोकता है । भ्रूण शरण गर्भाशय सींग पैराफिन फिल्म पर उजागर कर रहे है और भ्रूण चित्रा 1सीमें दिखाए गए रास्ते में गिने जाते हैं । एक बार स्थानीयकृत होने पर, भ्रूण को एक पतली केशिका (चित्रा 1डी) के माध्यम से वायरस के इंजेक्शन के लिए सही स्थिति में समायोजित किया जाता है । इंजेक्शन नेत्रहीन इंजेक्शन वायरस मिश्रण में निहित मर्मज्ञ डाई के प्रसार के आकार को देख कर नियंत्रित किया जाता है (चित्रा 1डी). utero इंजेक्शन के बाद, गर्भाशय के सींग वापस उदर गुहा में रखा जाता है जब तक मंच (उदाहरण के लिए, जंम और प्रसव के 24 दिन तक पहुंचने) कि प्रयोग के लिए आवश्यक है इंजेक्शन भ्रूण के विकास की अनुमति के लिए (देखें, जैसे, lutz एट अल.5 ,6 और kraus एट अल.7) । synaptic plasticity पर अध्ययन के लिए, देर से विकास या वयस्क चरणों की सिफारिश कर रहे हैं.

वांछित चरण में जानवरों के एक transcardial छिड़काव के बाद, तंत्रिका ऊतक (उदाहरण के लिए, मस्तिष्क और चित्रा 2में रीढ़ की हड्डी) रखा और निर्देशांक के साथ एक पारदर्शी प्लास्टिक फ्रेम में उन्मुख है और agarose में एम्बेडेड (चित्रा 2 ए, बी). काटने के बाद, हर अनुभाग imaged है (चित्रा 2सी, ई, जी) और फिर osmicated । osmication और ७०% या ८०% इथेनॉल में ऊष्मायन के बाद, वर्गों फिर से हस्तक्षेप प्रकाश टेलीमैक्रोग्राफी8,9,10का उपयोग करके imaged हैं । ऊतक वर्गों के लिए आवश्यक उच्च तीव्रता रोशनी के दौरान बिखरे हुए विकिरण को कम करने के लिए एक सुस्त काले आसपास रखा जाना चाहिए । फाइबर ट्रैक्ट और ऊतक के विभिन्न क्षेत्रों इंद्रधनुषी रंग है कि इसके विपरीत अंधेरे ऊतक पृष्ठभूमि को प्रतिबिंबित, और ऊतक सतह के एक विशेष रूप से रंग का पैटर्न उभर (चित्रा 2डी, एफ, एच). सभी इंद्रधनुषी छवियों nonosmicated छवियों के साथ अध्यारोपित कर रहे है और, एक साथ embedding कदम के अनुमानित निर्देशांक के साथ, वे ऊतक स्थलाकृति के नेविगेशन नक्शे उत्पंन करते हैं । अगले, ऊतक आगे और निर्जला है राल में एंबेडेड । नेविगेशन नक्शे के आधार पर, रुचि के क्षेत्रों को चुना जाता है और आगे उनि के लिए संसाधित किया जाता है-उदाहरण के रूप में, हिप्पोकैम्पस (स्ट्रेटम ल्यूसिडम), सेरिबैलम (ग्रेन्युल सेल लेयर), और स्पाइनल कॉर्ड (पृष्ठीय फनीकुलस) चित्रा 3A1-C4 में दिखाए गए हैं .

हिप्पोकैम्पस और सेरेबैलम में, मॉसी फाइबर synapses अद्वितीय ultrastructural विशेषताओं का प्रदर्शन करने के लिए जाना जाता है जब अन्य synapses की तुलना में, बड़े presynaptic बूटोंस सहित (चित्रा 3A1-B5). वे आसानी से पिछले प्रसंस्करण चरणों के दौरान स्थापित इंद्रधनुषी नेविगेशन नक्शे की मदद से स्थानीयकृत किया जा सकता है । उनके पार अनुभाग प्रोफाइल में, बूटोंस vesicles और माइटोकॉन्ड्रिया की एक विशाल संख्या में होते हैं और बहुत बार कई द्रुमाकृतिक कांटा संलग्न (चित्रा 3A4, A5, B4, B5). इन प्रोफाइल के उनि छवियों एक bouton प्रोफ़ाइल, synaptic संपर्कों की लंबाई, और संपर्क साइटों की संख्या के भीतर synaptic vesicles और mitochondria की संख्या पार से खोदी गई synaptic bouton क्षेत्रों की एक परिमाणन की अनुमति देते हैं ।

रीढ़ की हड्डी में, पृष्ठीय फनीकुलस में कई axonal फाइबर होते हैं जो ओलिगोडोंड्रोलिया द्वारा myelinated होते हैं । आड़ा वर्गों पर, पृष्ठीय फनीकुलस आड़ा वर्गों पर रीढ़ की हड्डी के दोनों पीछे सींग के बीच पाया जा सकता है (चित्रा 3c1, C2). उनि छवियों पर, पार खोदी myelinated axons दौर दिखाई देते हैं और axons आसपास myelin म्यान पटलिका में आयोजित कर रहे हैं (चित्रा 3C3, C4). क्रॉस-खोदी हुई axonal क्षेत्रों का एक परिमाणन, माइलिन आवरण की मोटाई और माइलिन lamellae की संख्या सहित, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से क्रॉस-sectioned mitochondria प्रोफ़ाइल क्षेत्रों का एक परिमाणन किया जा सकता है ।

तैयार एटलस और ultrastructural मापदंडों के micrographic उनि छवियों उपचार की विभिन्न शर्तों पर रूपात्मक neuroplasticity की तुलना के लिए ही उपयोगी नहीं हैं, लेकिन यह भी जब एक ही क्षेत्र के भीतर मापदंडों के बीच एक तुलना (उदा., हिप्पोकैंपस18 में विभिन्न प्रकार के synapses के बीच की तुलना और विभिन्न प्रजातियों के समतुल्य संरचनाओं के बीच की आवश्यकता है [चित्रा 4]) ।

Figure 1
चित्रा 1 : के लिए तैयारी में utero transduction । (A) आइसोफ्लूराने एनेस्थेसिया सेटअप: 1) प्रारंभिक संज्ञाहरण के लिए प्रेरण कक्ष; 2) पम्प; 3) निश्चेतना इकाई; 4) रूटिंग स्विच वाल्व; 5) संज्ञाहरण आपूर्ति ट्यूबिंग; 6) मेहतर इकाई; 7) श्वास मास्क; 8) गर्म शल्य चिकित्सा तालिका; 9) प्रकाश स्रोत के साथ द्विनेत्री त्रिविमदर्शी; 10) नियंत्रण इकाई । () शल्य चिकित्सा उपकरण: 1) इलेक्ट्रिक शेवर; 2) नेत्र स्नेहक; 3) फिक्सेशन टेप; 4) स्वच्छता पैड; 5) आइरिस संदंश (10 सेमी, घुमावदार, दांतेदार); 6 और 7) आईरिस कैंची (11 सेमी, सीधे, टंगस्टन कार्बाइड); 8) dumont चिमटी (#3, 12 सेमी, सीधे, ०.२ मिमी x ०.१२ मिमी); 9) वान्ना की कैंची (8 सेमी, स्ट्रेट); 10 और 11) माइक्रो-मच्छर हेमोस्टैटिक संदंश (१२.५ सेमी, घुमावदार); 12) पैराफिन फिल्म; 13) माइक्रो चंमच; 14) कपास swabs; 15 और 16) हैलेस्टेड मच्छर हेमोस्टैटिक संदंश (१२.५ सेमी, स्ट्रेट); 17 और 18) टांके (आकार 6-0 और 3-0); १९) सिरिंज; 20) calibrated microcapillary पिट्स के लिए चूषित्र ट्यूब विधानसभाओं । (ग) भ्रूणीय दिवस में गर्भाशय के सींग के भीतर भ्रूण के एक व्यवस्थित क्रमांकन की योजना (ई) १४.५: एल = वाम; R = right. (घ) इंजेक्शन की रणनीतियाँ: प्रथम और द्वितीय मस्तिष्क निलय में (मैंve और द्वितीयve, क्रमशः), चौथे वेंट्रिकल्स (चतुर्थve), और रीढ़ की हड्डी. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : टेलीमैक्रोग्राफी द्वारा पृथक ऊतक के प्रलेखन । (A और B) एक मस्तिष्क की एम्बेडिंग और agarose में एक रीढ़ की हड्डी, एक निर्देशांक प्रणाली (ग्रिड) के साथ cuvettes का उपयोग. काटने के बाद, वर्गों टेलीमैक्रोग्राफी और हस्तक्षेप प्रतिबिंब प्रकाश इमेजिंग के अधीन हैं । (सी-एफ) मस्तिष्क के आड़ा और समरूप वर्गों । स्केल पट्टियां = 5 मिमी; सह = प्रांतस्था; st = स्ट्रिएटम; डि = डाईएनसेफेलस; me = mesencephalon; hi = हिप्पोकैम्पस; ped = पेडुंकुली सेरेबरी; ce = अनुमस्तिष्क; मो = मेडुला ओब्लांगता. ( और ) रीढ़ की हड्डी के एक गर्भाशय ग्रीवा खंड के अनुप्रस्थ खंड । स्केल बार = 1 मिमी; ahr = सही पूर्वकाल हॉर्न; ahl = वाम पूर्वकाल हॉर्न; df = पृष्ठीय फनीकुलस । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : plasticity मापदंडों की स्थलाकृतिक और ultrastructural पहचान । (A1) हिप्पोकैंपस के उल्टे हस्तक्षेप प्रकाश मैक्रोग्राफ । दायिनी ल्यूसिडम (sl) के भीतर मॉसी फाइबर बूटोंस के क्षेत्र पर प्रकाश डाला है । pcl = पिरामिडी कोशिका परत; gcl = ग्रेन्युल सेल परत. स्केल बार = ५०० μm. (A2) एक सेमीथिन खंड (०.७५ μm) की लाइट माइक्रोफोटोग्राफ (100x उद्देश्य) स्ट्रैटम ल्यूसिडम दिखा रहा है । तारक मॉसी फाइबर बूटोंस के क्षेत्रों है कि कई द्रुमाकृतिक द्वीप (काले arrowheads) के चारों ओर से संकेत मिलता है । टोलुइडीन ब्लू/ओसो4 धुंधला । स्केल बार = ५० μm. (A3) एक कम आवर्धन पर संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ, एक डेन्ड्राइट (डी) के आसपास मॉसी फाइबर बूटोंस (तारक) दिखा रहा है. आयत एक एकल मॉसी फाइबर bouton शामिल हैं । स्केल बार = 2 μm. (A4) एक एकल मॉसी फाइबर bouton (एमएफबी) के पार अनुभाग प्रोफ़ाइल के संचरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मालेख. spines (नीला) और पार अनुभाग bouton क्षेत्र (बैंगनी) पर प्रकाश डाला है । m = mitochondrion; s = spines. स्केल बार = २०० एनएम । (A5) एक mfb के अंदर synaptic vesicles. स्केल बार = १०० एनएम । (B1) प्रमस्तिष् क का व्युत्क्रम व्यतिकरण प्रकाश स्थूल ग्राफ ग्रेन्युल सेल लेयर (जीसीएल) का क्षेत्र जिसमें मोसी फाइबर बूटूंस दर्शाया गया है । mcl = आणविक परत; ज = हिल्स. स्केल बार = ५०० μm. (B2) एक सेमीथिन खंड (०.७५ μm) का लाइट माइक्रोफोटोग्राफ (100x उद्देश्य) ग्रेन्युल सेल परत का एक क्षेत्र दिखा रहा है जो पुरकिनजे कोशिकाओं (पीसी) पर सीमाओं । तारक मॉसी फाइबर बूटोंस कि कई अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल ंयूरॉंस (cgn) से घिरे रहे है के क्षेत्रों से संकेत मिलता है । टोलुइडीन ब्लू/ओसो4 धुंधला । स्केल बार = ५० μm. (B3) एक कम आवर्धन पर संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ, mfbs के क्षेत्र दिखा । आयत में एक mfb भी शामिल है । स्केल बार = 2 μm. (B4) सेरिबैलम की ग्रेन्युल कोशिका परत के भीतर एक मशरूम की तरह mfb के क्रॉस-सेक्शन प्रोफाइल का ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ । क्रॉस-सेक्शन bouton क्षेत्र (बैंगनी) और vesicle-मुक्त कांटा (नीला) पर प्रकाश डाला जाता है । स्केल बार = 1 μm. (B5) माइटोकॉन्ड्रिया (बैंगनी) और एक mfb के अंदर synaptic vesicles. स्केल बार = १५० एनएम । (C1) रीढ़ की हड्डी का उलटा हस्तक्षेप प्रकाश मैक्रोग्राफ । पृष्ठीय फनिकल् स (df) है कि भारी myelinated axons शामिल के क्षेत्र पर प्रकाश डाला है । ahr और ahr = दाएं और बाएं पूर्वकाल हॉर्न, क्रमशः; phr और phr = दाएँ और बाएँ पीछे सींग, क्रमशः. स्केल बार = ५०० μm. (C2) एक सेमीथिन अनुभाग (०.७५ μm) का लाइट माइक्रोफोटोग्राफ (100x उद्देश्य) जो कि भारी myelinated axons (ax) से समृद्ध है, जो कि स्पष्ट रूप से nonmyelinated फाइबर (तारक) से पहचाना जा सके । सीटी = संयोजी ऊतक. टोलुइडीन ब्लू/ओसो4 धुंधला । स्केल बार = ५० μm (C3) myelinated और nonmyelinated axons (कुल्हाड़ी, बैंगनी) के पार अनुभाग प्रोफाइल के संचरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मालेख. मेरी = माइलिन sheaths । स्केल बार = २०० एनएम । (C4) आयत माइलिन पटलिका और nonmyelinated फाइबर के साथ उच्च बढ़ाया, भारी myelinated axons से पता चलता है । माइक्रोट्यूब्यूल्स (मीट्रिक टन), और माइटोकॉन्ड्रिया (एम) अक्षोनल फाइबर के भीतर दिखाई दे रहे हैं । स्केल बार = ५० एनएम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4 : विभिन्न पशु मॉडलों में ultrastructural plasticity मापदंडों के उदाहरण. () एक शार्क के सेरिबैलम में मॉसी फाइबर बूटोंस. स्केल बार = ४०० एनएम । () एक रेसस समूल के हिप्पोकैम्पस में मॉसी फाइबर bouton. स्केल बार = २०० एनएम । () एक बिल्ली के neuromuscular जंक्शन । स्केल बार = ३०० एनएम । () एक फलंगर के पारस रेटिकोलेरिस हस्तक नाइग्रा में अन्तर्निद्रात्मक बूटंस. तारक संकेत postsynaptic घनत्व (इनसेट में PSD;: काले arrowheads) । आयत एक आवर्धित PSD से पता चलता है । स्केल बार = ४०० एनएम । () एक nonmyelinating schwann सेल (अनुसूचित जाति) एक चूहे की रीढ़ की हड्डी में गुच्छिका में कई axonal फाइबर आसपास । आसपास के क्षेत्र में, भारी myelinated फाइबर दिखाई दे रहे हैं । स्केल बार = ३०० एनएम । सभी पैनलों के लिए: ax = axon; D = डेंडराइट; m = mitochondrion; mfb = मॉसी फाइबर bouton; म्युचुअल फंड = मॉसी फाइबर; my = माइलिन म्यान; s = रीढ़ की हड्डी; sa = स्पाइन उपकरण; sv = synaptic vesicles । संपर्क साइटें (postsynaptic घनत्व) तारों के साथ संकेत कर रहे हैं. क्रॉस-सेक्शन क्षेत्र बैंगनी और नीले रंग में हाइलाइट किए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

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के एक महत्वपूर्ण कदम में utero पारक्रमण इंजेक्शन प्रक्रिया है । मस्तिष्क निलय में सटीक इंजेक्शन या ब्याज की एक और क्षेत्र में अनुभव और हाथों पर कौशल की आवश्यकता है । पतले microcapillary टिप, कम ऊतक क्षति हो सकती है; हालांकि, यह इंजेक्शन दबाव बढ़ाने की कीमत पर है । यूट्रो इलेक्ट्रोपोरेशन में19,20,21,22के विपरीत, गर्भाशय में भ्रूण की उत्तरजीविता दर बहुत अधिक है । गर्भाशय सींग के सभी भ्रूण इंजेक्शन किया जा सकता है, भले ही भ्रूण गर्भाशय सींग की जड़ों में स्थित है और गर्भाशय थैली के भीतर पुनः समायोजन की आवश्यकता है । इंजेक्शन और विश्लेषण के विकासात्मक चरणों वैज्ञानिक प्रश्न के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

जब मस्तिष्क ventricles में इंजेक्शन, AAV1 कणों पूरे वेंट्रिकुलर प्रणाली के माध्यम से मस्तिष्कमेरु द्रव के माध्यम से वितरित कर रहे हैं । सतहों कि शराब के साथ निकट संपर्क में हैं के साथ संरचनाओं का विकास, हिप्पोकैम्पस और सेरिबैलम के रूप में, लागू वायरल कणों द्वारा transduced कर रहे हैं5,6,7. इस तरह के bouton आकार के रूप में ultrastructural मापदंडों में परिवर्तन का एक विश्लेषण, पार खोदी bouton क्षेत्रों, synaptic vesicles की संख्या, माइटोकॉन्ड्रिया की संख्या, और इन संरचनाओं में synaptic संपर्कों की संख्या और लंबाई, एक सुरुचिपूर्ण पढ़ने के लिए बाहर है अल्ट्रास्ट्रक्चरल प्लास्टिसिटी । utero में पारक्रमण विधि अलग मस्तिष्क क्षेत्रों का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है, साथ ही रीढ़ की हड्डी6. इसके अलावा, अन्य अंगों और ऊतकों को इसी तरह पारक्रमण लक्ष्य के रूप में चुना जा सकता है । अंत में, अक्सर इस्तेमाल किया माउस मॉडल की आवश्यकता के रूप में अंय प्रजातियों द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है ।

ऊतक स्लाइस की फोटोग्राफी राल-संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए एंबेडेड नमूनों की एक बहुत ही सटीक विच्छेदन के लिए अनुमति देता है । नमूना के स्थानिक अभिविन्यास परिभाषित किया गया है के बाद से, व्यापक और समय लेने वाली काटने छोड़ा गया था. इसके अलावा, महत्वपूर्ण पड़ोसी क्षेत्रों को एक दूसरे के अपने मूल रिश्ते में रखा जा सकता है । फोटोग्राफिक प्रलेखन कदम का एक महत्वपूर्ण लाभ ऊतक निर्धारण की गुणवत्ता पर नजर रखने और रोग परिवर्तन को पहचानने की संभावना है । इस प्रकार, निर्धारण की गुणवत्ता और सामग्री की embedding निर्णायक महत्व का है । कलाकृतियों शामिल nonsuitable नमूने आगे प्रसंस्करण करने से पहले आउटसोर्स किया जा सकता है.

imaged ऊतक स्लाइस की सूक्ष्मालेख श्रृंखला एक सहायक रूपात्मक एटलस प्रदान करते हैं । तुलनात्मक neuroसंरचनात्मक अध्ययन के लिए, जो भी दुर्लभ प्रजातियों में शामिल हो सकते हैं, एटलस एक मूल्यवान संग्रह है । ऊतक स्लाइस की मोटाई का विकल्प संबोधित वैज्ञानिक प्रश्न पर निर्भर करता है और ऊतक नमूना के आकार से सीमित है । छोटे जानवरों के लिए, 1 मिमी तक की मोटाई समायोजित किया जाना चाहिए । बहुत मोटी वर्गों (> 5 मिमी) की सिफारिश नहीं कर रहे हैं, आज़मियम टेट्रॉक्साइड की सीमित प्रवेश क्षमता के कारण8,9,10.

टेलीमैक्रोफोटोग्राफी प्रलेखन morphometrical अध्ययन के लिए आवश्यक है. यह ऊतक सतह के पक्ष और फ्रेम के शीर्ष विमान के लिए एक निश्चित सहसंबंध प्रदान करता है और निर्देशांक के एक स्थानिक प्रणाली में एक दी गई संरचना की स्थिति को परिभाषित करती है । 18 इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी या रीढ़ की हड्डी चोट मॉडल के साथ वर्णित विधि का एक संयोजन है, जहां plasticity6उत्थान में एक आवश्यक भूमिका निभाता है, संभव है । तुलनात्मक neuroसंरचनात्मक अध्ययन के लिए, जो भी दुर्लभ प्रजातियों में शामिल हो सकते हैं, इंद्रधनुषी ऊतक एटलस और ultrastructural मापदंडों के micrographic उनि छवियों मूल्यवान संपत्ति हैं.

अपनी ताकत के बावजूद, उनि नमूना (७० एनएम), पार खोदी क्षेत्र (< 6 मिमी2), और नमूना तैयारी की जटिलता की मोटाई आकार के कारण कई सीमाएं हैं । हालांकि, जब एक नमूना सही ढंग से तैयार है, नमूना ultrastructure के उनि छवियों किसी भी प्रकाश microscopical तकनीकों द्वारा उत्पादित छवियों की तुलना में बेहतर गुणवत्ता के हैं । यूट्रो पारक्रमण तकनीक में इंजेक्शन की मात्रा से सीमित है और अंत में इस क्षेत्र की है । निर्विवाद रूप से, इस तकनीक में प्रारंभिक विकासात्मक उपचार में और जन्मजात न्यूरोपेथोलॉजिकल बीमारियों के बचाव में एक मजबूत शोधों की चिकित्सा क्षमता है । इसके अलावा, utero के साथ पारक्रमण में वर्तमान संयोजन केवल जंमजात रोगों के भविष्य के इलाज के लिए एक दृष्टिकोण के रूप में नहीं माना जा सकता है, लेकिन यह भी उच्च गुणवत्ता ultrastructure आधारित neuroविकासात्मक निदान के लिए ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों चिकित्सा संकाय में पशु सुविधा के सहयोगियों का शुक्र है, ruhr-विश्वविद्यालय bochum, उनके समर्थन और पशु देखभाल के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol Serva 36975
26 G x 1'' needle Henke-Sass, Wolf GmbH
410 Anaesthesia Unit for air pump Biomedical Instruments (Univentor) 8323102
Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) UKE (Viral Core Facility) - For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54.
Agarose Sigma-Aldrich A9414 low gelling agarose
Air Pump Biomedical Instruments (Univentor) Eheim 100
Araldite CIBA-GEIGY 23857.9 resin for embedding of tissue
aspirator tune assemblies Sigma-Aldrich A5177-5EA
Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium Biomedical Instruments (Univentor) -
buprenorphine Temgesic ampules painkiller
capillaries Science-Products GB100TF-10 with fillament
Dodecenylsuccinic anhydride Fluka 44160
Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) FST 11203-23
electric shaver Phillips -
Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) Ethicon - polyamide
eye lubricant Bepanthene -
Fast Green Sigma-Aldrich F7252 for visualization of injected liquids
Gas Routing Switch 4/2 connectors Biomedical Instruments (Univentor) 8433020
halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) FST 13011-12
Heparin-Natrium Ratiopharm 25 000 I.E./5 mL
Induction box for mice
with horizontally moving lid.
Inner dimensions: LxBxH: 155 mm x 115 mm x 130 mm.
Wall thickness: 6 mm
Biomedical Instruments (Univentor) -
iris forceps (10 cm, curved, serrated) FST 14007-14
iris scissors (11 cm, straight, tungsten carbide) FST 14501-14
Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm
Outer dimensions: 257mm x110 mm x 18 mm.
Heating area: 190 mm x 90 mm
The removal of the isoflurane escaping
the breathing mask is downwards in compliance with the
regulations
Biomedical Instruments (Univentor) -
isoflurane (Attane) JD medical inhalation anesthesia
LED RGB lights Cameo CLQS15RGBW LEDs 2 x 15 W
Light microscope Basic DM E Leica - 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives
micropipette puller Science-Products P-97
Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, curved) FST 13010-12
Nickel grids, 200 mesh Ted Pella 1GC200
Osmium (VIII)-oxid Degussa 73219
Propylene oxide Fluka 82320
razor blades Schick 87-10489
Sodium pentobarbital (Narcoren) Merial GmbH -
TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback Biomedical Instruments (Univentor) -
Technovit 4004 two components glue Kulzer
Telemacrodevice Canon - Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand.
Thermopuller P-97 Sutter Instruments -
thin vibrating razor blade device Krup - with Szabo thin blades
toluidine blue Sigma-Aldrich 89640
Transmission electron microscope C20 Phillips - up to 200 kV
Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts
Outer diameter: 6 mm
Inner diameter: 4 mm
Wa
ll thickness: 1 mm
Biomedical Instruments (Univentor) -
Ultracut E Reichert-Jung - ultramicrotome
Univentor Scavenger Biomedical Instruments (Univentor) 8338001
Vannas scissors (8 cm, straight) FST 15009-08

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References

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विकासशील माउस मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के utero transduction में के बाद ultrastructural neuroplasticity मापदंडों का आकलन
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Lutz, D., von Düring, M., Corvace, F., Augustinowski, L., Trampe, A. K., Nowak, M., Förster, E. Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord. J. Vis. Exp. (144), e59084, doi:10.3791/59084 (2019).More

Lutz, D., von Düring, M., Corvace, F., Augustinowski, L., Trampe, A. K., Nowak, M., Förster, E. Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord. J. Vis. Exp. (144), e59084, doi:10.3791/59084 (2019).

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