Summary
A combinação de microscopia eletrônica de transmissão e transdução no útero é uma poderosa abordagem para o estudo de mudanças morfológicas na ultraestrutura fina do sistema nervoso durante o desenvolvimento. Este método combinado permite insights profundos sobre mudanças em detalhes estruturais subjacentes neuroplasticidade no que diz respeito a sua representação topográfica.
Abstract
O presente estudo combina transdução no útero com microscopia eletrônica de transmissão (TEM) com o objetivo de uma análise morfométrica precisos dos parâmetros ultra-estruturais em inequivocamente identificadas estruturas topográficas, afetados por uma proteína de interesse que é introduzido no organismo através de transferência viral. Esta abordagem combinada permite uma transição suave de macrostructural para identificação ultraestrutural pelos seguintes mapas topográficos de navegação em um atlas de tecido. Microscopia eletrônica de alta resolução do tecido em-utero-transfectadas revela a ultraestrutura bem o neurópilo e seus parâmetros de plasticidade, como áreas seccionadas bouton sinápticos, o número de vesículas sinápticas e mitocôndrias dentro de um Perfil de Bouton, o comprimento de contatos sinápticos, áreas axonal seccionadas, a espessura das bainhas de mielina, o número de lamelas de mielina e seccionadas áreas de perfis de mitocôndrias. A análise destes parâmetros revela essenciais insights sobre alterações de plasticidade ultra-estruturais nas áreas do sistema nervoso que são afetados pela transferência viral da construção de genética. Este método combinado não só pode ser usado para estudar o efeito directo de biomoléculas geneticamente modificadas e/ou drogas na plasticidade neuronal, mas também abre a possibilidade de estudar o resgate no útero de plasticidade neuronal (por exemplo, no contexto da doenças neurodegenerativas).
Introduction
O fóton não pode penetrar uma amostra de tecido ultrafinos no grau de profundidade de um elétron. Isto atribui vantagens inestimáveis para TEM na captura de imagens de resolução nanômetros de belas estruturas quando comparado às técnicas de microscopia de luz. Por exemplo, TEM permite a visualização de organelas intracelulares, tais como mitocôndrias, melanossomas e vários tipos de grânulos secretórios, microtúbulos, microfilamentos, cílios, microvilli e junções intercelulares (superfície de célula especializações), em particular as sinapses no sistema nervoso1,2,3,4. O objetivo geral do presente estudo metodológico é o reconhecimento ultra-estrutural do mudanças na plasticidade neural durante o desenvolvimento, após interferência de pré-natal, combinando as técnicas do estado-da-arte de transdução no útero e TEM. Viralmente codificadas proteínas de interesse tem sido transfectadas no útero para o sistema nervoso central5,6,7, incluindo a medula espinhal6. Por exemplo, no útero transdução em combinação com a temperatura tem sido usada por estudando o efeito da molécula de adesão celular L1 na aprendizagem plasticidade em camundongos deficientes em L1, em particular no que se refere a interação entre L1 e proteínas do receptor nuclear de motor em neurônios Cerebelares7.
A análise dos parâmetros de neuroplasticidade requer informações precisas sobre a localização das áreas menores dentro do sistema nervoso. Portanto, é adequada descrever detalhes ultraestrutural e sua orientação topográfica exata em relação a outras estruturas. No presente estudo, é apresentado um método específico preparatório visando a investigação detalhada de áreas morfológicas distintas com base em luz e microscopia eletrônica. Esta abordagem combina várias técnicas de manipulação do tecido, começando no útero transdução da medula espinhal e cérebro de rato e seguido por fixação de perfusão, molde-incorporação e processamento de tecido para dez. Um passo essencial incluído entre a incorporação e a transformação do tecido para TEM é a documentação do tecido, usando a técnica de reflexão da luz de interferência que permite a documentação precisa de microphotographic e baixo-ampliação de espécimes do tecido8,9,10. Incorporada a presente abordagem, esta técnica permite que pesquisadores examinar detalhes topográficos e estruturais das superfícies de tecido nervoso e de perfis de fatia de amostra antes da sua preparação para a temperatura.
Um frame especial para secionar todo cérebro corresponde a coordenadas estereotáxicos. Este quadro beneficia morfológica reconstrução tridimensional (3D) de áreas no tecido nervoso e pode ser usado para Análise morfométrica. Os macrographs das seções visualizadas são atribuídos coordenadas topográficas e as seções numeradas em série construir mapas em um atlas de tecido.
Após processamento de resina, o tecido incorporado é seccionado em seções ultrathin (< 70 nm) que contém áreas selecionadas, de acordo com os mapas do atlas tecido acima mencionados. As seções ultra-finas estão sujeitos a temperatura para obter imagens de alta resolução dos parâmetros de plasticidade (e.g., seção transversal perfil áreas de boutons sinápticas ou fibras axonal) do seu conteúdo e de contatos para estruturas vizinhas, dentro do complexo neurópilo.
Com o método descrito neste documento, a transição suave de macrostructures visualizado para micro e nanoestruturas permite comparativos estudos aprofundados de plasticidade neuronal morfológica depois no utero transdução do desenvolvimento nervosa sistema.
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Protocol
Todos os procedimentos em assuntos animais foram aprovados pelas comissões institucionais de ética animal dos Estados Federados de Hamburgo e Nordrhein-Westfalen, Alemanha. Use instrumentos estéreis, luvas e casacos assépticos ao longo de todo o procedimento cirúrgico.
1. no Utero transdução
- Prepare o tipo de vírus adeno-associado 1 (AAV1) que codifica para o destino desejado (4 x 1011 viral partículas / µ l de AAV1) em tampão fosfato salino (PBS) pH 7,4. Adicionar 0,1 mg / µ l Fast Green e manter a mistura de AAV1-Fast-verde a 37 ° C.
- Preparar uma fina ponta capilar com a forma desejada (8 mm de comprimento, com um diâmetro externo de 80 µm e um interior diâmetro de 50 µm), usando um extrator de micropipeta (configurações: pressão = 500, calor = 700, puxar = 0, velocidade = 80, tempo = 200, consulte a tabela de materiais < / c1 >). Quebre a ponta do capilar para que é de 4-5 mm.
- Montar um tubo aspirador (44 cm x 0,7 cm) com a ponta capilar e Aspire 15 µ l da mistura verde-AAV1-Fast para o capilar.
- Manter os animais sujeitos a uma temperatura de corpo fisiológico constante de 37 ° C ao longo de todo o procedimento.
- Coloque um grávida rato C57Bl/6 (dia embrionário 14,5) na câmara de pré-incubação e anestesiar o mouse com isoflurano gasoso de 4% (com uma taxa de fluxo volumétrico de 0,6-0,8 L/min).
- Injecte por via subcutânea, a buprenorfina (0,1 mg/kg de peso corporal).
- Coloque o mouse anestesiado na placa cirúrgica escaldada (37 ° C).
- Cubra os olhos com um lubrificante.
- Ajustar o mouse com a máscara de anestesia (gasosos isoflurano 1,5% a uma taxa de fluxo volumétrico de 0,6-0,8 L/min) na placa cirúrgica e barba na região da pele abdominal. Limpe a região depilada com 3 X 75% de etanol e, em seguida, com solução de betadine.
Nota: Monitore o comportamento de respiração do rato anestesiado continuamente. Ajuste a concentração do gás de acordo com o padrão de inalação-exalação do mouse isoflurano. - Para verificar a ausência do reflexo plantar apertando as falanges da pata traseira do mouse.
- Abrir a cavidade abdominal, segurando a pele com pinças curvas íris serrilhada (10 cm) e corte a pele ao longo da mediana de linea com tesoura reta carboneto de tungstênio (10 cm) e em seguida, agarrando-se a parede peritoneal com pinça reta de Dumont (12 cm, 0,2 mm x 0,12 milímetros) e corte da parede ao longo da linea alba com Vanna reta tesouras (8 cm).
- Um pedaço de filme de parafina fenestrado sobre a abertura abdominal e fixar o filme em ambas as extremidades com pinça hemostática de micro-mosquito (12,5 cm, curvada).
- Expor os cornos uterinos com um colher-como o dispositivo para não danificar os embriões dentro os cornos uterinos. Pingar algumas gotas de PBS (37 ° C) sobre os cornos uterinos e inspecionar os embriões por danos ou malformações dentro do sac uterina.
- Documente a ordem e a posição dos embriões nos cornos uterinos. Transformar os embriões cuidadosamente dentro do sac uterino até atingir a posição desejada para a injeção.
- Injecte 1-2 µ l da mistura verde-AAV1-Fast inspecionando visualmente o local da injeção (por exemplo, ventrículos do cérebro) e a penetração do corante sob um estereomicroscópio.
- Documentar os embriões injetados e colocar os cornos uterinos com os embriões injetados volta na cavidade abdominal.
- Pinga algumas gotas de PBS (37 ° C) na cavidade abdominal. Feche a cavidade por sutura da parede peritoneal (uso poliamida 6-0 tamanho suturas) e a pele (uso poliamida 3-0 tamanho suturas), usando a pinça hemostática de Halsted mosquito (12,5 cm, curvada). Como alternativa, use um padrão simples interrompido ou sutura/grampos de aço inoxidável para fechar a cavidade abdominal e a pele.
2. Telemacrophotography de tecidos isolados
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Preparação de buffers
- Prepare o tampão do Sörensen (1 L) por dissolução 14,95 g de Na2HPO4 e 2,18 g de KH2PO4 em 1 litro de água destilada sob agitação a 200 rpm. Para perfusão de tarde filhotes de gestação e/ou filhotes no pós-parto a períodos de tempo, use um tamanho adequado de agulhas para injeção abdominal ou intragástrico e certifique-se que a concentração da anestesia terminal de sódio pentobarbital não ultrapasse 180 mg / kg de peso do corpo.
- Preparar a solução de fixação do Mugnaini (5 L) pelo aquecimento de 500 mL de água destilada para 75 ° C e adicionar 50 g de pó de paraformaldeído sob agitação a 200 rpm, adicionando 200 µ l de 5 N NaOH, adicionando 1.500 mL de tampão de Sörensen, 1.750 mL de água destilada e 500 mL de 25% de glutaraldeído. Encha até 5.000 mL com água destilada. Use este buffer final para perfusão.
Nota: Preparar a solução de fixação do Mugnaini sob o capô, usar óculos de protecção e evitar emanações. Adicione o azul de metileno (0,05 g/L) para uma melhor visualização da perfusão.
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Isolamento de perfusão e tecido de mouse
- Transcardially perfundir os ratos grávidas que carregam os embriões transduzidos (no caso de estudos de embrião) ou os pubs transduzidos nasceu com a idade desejada (por exemplo, pós-Natal dia 24), de acordo com os procedimentos padrão6,7, 11,12,13,14,15,16,17, utilizando pentobarbital de sódio terminal intraperitoneal anestesia (200 mg/kg de peso corporal).
- Injetar o transcardially de ratos com solução de heparina (500 U) usando um 26 G, 1 na agulha e, antes da fixação, infundir os ratos transcardially com 10 mL de PBS para lavar o sangue do corpo e perfundi-los transcardially com 30 mL do 40 ° C pré-aquecido Mugnaini solução de fixação.
Nota: Para os ratos adultos, execute uma alternativa perfusão retrógrada através da aorta abdominal,14. - Isolar o tecido perfundido de interesse (por exemplo, todo o cérebro ou medula espinhal) e sufixo o tecido em pelo menos 10 mL da solução de fixação do Mugnaini para outro 24 h a 4 ° C.
- Lave o tecido em 10 mL de PBS para 3h em temperatura ambiente.
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Incorporação em agarose, além de documentação e corte
- Ajuste o tecido isolado (por exemplo, cérebro) em um quadro especial com um reprodutíveis corte ângulo8,9,10. Como alternativa, use um vibratome com uma espessura de corte ajustável.
- Coloque o tecido nervoso no quadro, ajustar o tecido para telemacrography e documentar as coordenadas.
- Prepare 3% suporte de incorporação de agarose de baixo ponto de fusão: Adicionar 3 g de agarose em 100 mL de tampão de Sörensen e aquecer a mistura em um banho de água a 90 ° C.
- Despeje a agarose a 3% (30 ° C) no quadro que contém o tecido. Cobrir a moldura com um bloco de metal quente e esperar até que seja endurecimento. Durante o endurecimento, use dispositivos de telemacrographic para o tecido incorporado e suas coordenadas dentro do quadro da imagem.
- Transferi o tecido de agarose-incorporado em um quadro com as lacunas de corte correspondente para as coordenadas do primeiro quadro.
- Corte o tecido incorporado em seções de espessura desejada (por exemplo, 1,5 mm) com um dispositivo com uma lâmina fina e vibração (ver Tabela de materiais).
Nota: Para melhorar o deslizamento da lâmina da navalha, pinga algumas gotas de glicerina para o tecido incorporado. - Imagem de cada seção de tecido em PBS e coletar as imagens em uma pasta.
3. preparação do tecido isolado para microscopia eletrônica de transmissão
Nota: Execute todos os novos passos de incubação em pratos de vidro com tampas firmemente afixadas em uma plataforma de agitação sob o capô.
- Lave as secções de tecido para 2 x 30 min em PBS. Incube as secções em solução a 2% aquosa tetróxido de ósmio (OsO4) por 2 h à temperatura ambiente.
Atenção: Tetróxido de ósmio é tóxico e pode ser prejudicial quando ele entra em contato com a pele. - Lave as seções osmicated para 2 x 30 min em PBS.
- Incubar as secções em 30%, 50% e 70% de etanol à temperatura ambiente por 10-15 min (opcional: incubar em etanol a 70% em 4 ° C durante a noite).
- Imagem do osmicated espécimes em etanol a 70% sob LED RGB luz8,9,10 (2 x 15 W) aplicados à amostra da esquerda e da direita num ângulo de 45 °. Use pratos pretos e um fundo preto fosco para minimizar o espalhamento e a reflexão da luz durante a iluminação.
Atenção: Não permita que a seção secar durante a imagem latente. - Crie um atlas das imagens seção com coordenadas através da recolha de imagens em série em uma pasta.
- Incube as amostras em 100% de etanol (2 x por 30 min) e 100% óxido de propileno (2 x por 30 min) à temperatura ambiente.
Atenção: Não permita que as seções para secar enquanto alterar soluções. - Mix de 260 mL de resina com 240 mL de anidrido dodecenylsuccinic em um recipiente de vidro, agitando-se suavemente com uma barra de vidro. Verifique periodicamente para homogeneidade, bolhas e manchas. Muito suavemente, mexa com a mão pelo menos 45 min.
- Prepare-se óxido de propileno/resina na proporção de 1:2 e 1:1 e adicionar 3% de accelerator (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol).
- Incube o tecido no 1:2 incorporação de solução do passo 3.8 para 2 h e depois na solução 1:1 incorporação da etapa 3.8 para 2 h à temperatura ambiente em uma roda giratória.
- Coloque o tecido em polipropileno liso pratos, cubra o tecido com resina fresca contendo 3% de accelerator e curar o tecido incorporado em 65-85 ° C por 12-24 h.
- Arrefecer o tecido incorporado à temperatura e retirar as amostras de resina-incorporado os pratos de polipropileno.
4. seleção de neuroplasticidade ultraestrutural parâmetros para análise quantitativa
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Mapeamento da área de interesse
- Escolha uma área de interesse (por exemplo, hipocampo ou cerebelo) e localizar a área no atlas de seção, escolhendo a imagem do atlas (passo 3.5) que contém esta área.
- Esboçar as fronteiras da área de interesse para a imagem de seção e encontrar/sobrepor estas fronteiras da região para a amostra de resina.
- Zero-marca as fronteiras da área de interesse (por exemplo, hipocampo ou cerebelo) sobre a amostra de resina, usando um medidor de agulha fina (26 G, 1 in).
- Aquece a amostra de resina a 85 ° C em um forno para amolecer a resina para o aparamento ou, alternativamente, usar um dispositivo de corte, uma lâmina fina ou lixa.
- A área de interesse, a amostra de resina com uma lâmina de barbear impostos especiais de consumo (ver Tabela de materiais). Monte o espécime segurando barras de vidro acrílico do calibre necessário por exemplo, com (diâmetro de 8 mm) e um comprimento de 1 cm com cola. Desbaste a amostra montada para semie ultrafinos de seccionamento.
- Preparar semithin (0,75 µm) e ultrafinos (70 nm) seções da área aparada usando um ultramicrotome: defini-la a 1,5 mm/s para 0,75 µm de espessura e a 0,7 mm/s para a espessura de 70 nm.
- Recolher as seções semithin em suportes de vidro e as seções com toluidina 1% de mancha azul em PBS (para 4 min).
- Lave as seções várias vezes em água desionizada. Examinar as seções manchadas ao microscópio de luz usando 4x (nd de 0.1 ∞ /-), 10 x (de 0.22 ∞/0.17), 40 x (de 0.65 ∞/0.17) e 100 x objetivos (de 1.25 ∞/0.17).
- Recolha seções ultra-finas nas grades de níquel. Submeter as grades a temperatura em 180 kV e a 3, 200 x, 6, 000 x, e/ou ampliação de x 8.000.
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Análise de temperatura
- Escolha os parâmetros ultraestrutural de interesse para a análise quantitativa da temperatura (por exemplo, boutons com vesículas e mitocôndrias ou axônios mielinizados e nonmyelinated) e tomar TEM imagens desses parâmetros abaixo dos 3, 500 x, x 6.000 e/ou ampliação de x 8.000.
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Representative Results
Para anestesia é confiável e rápida de ratos, inúmeros parâmetros de segurança foram considerados, e uma área de trabalho otimizada da unidade de anestesia provou para ser adequado (Figura 1A). A unidade é projetada para controlar a mistura de isoflurano líquido e ar ambiente com uma precisão exigida para a bem sucedida cirurgia em pequenos animais, como camundongos e ratos. Ar e isoflurano são misturados no vaporizador de acordo com as configurações desejadas e entregue em uma caixa ou através de uma máscara para o animal (Figura 1A). O tesouro recolhe e inactivates qualquer gás de isoflurano excedentes que podem ser produzidos, proporcionando um ambiente de trabalho seguro. O gás é coletado e passado através de carvão ativo em um cartucho (Figura 1A).
Um conjunto otimizado de instrumentos (Figura 1B) permite aos cientistas realizar cirurgia rapidamente em ratos grávidos. Uma película de parafina simples com propriedades hidrofóbicas impede que a mucosa abdominal secagem após a ressecção (Figura 1B). Os cornos uterinos, abrigando os embriões são expostos em película de parafina e os embriões são numerados da forma mostrada na Figura 1C. Uma vez localizado, os embriões são ajustados na posição correta para a injeção do vírus através de um capilar fino (Figura 1D). A injeção é controlada visualmente, observando a forma de difusão do corante penetrante contido na mistura vírus injetado (Figura 1D). Após a injeção no útero, os cornos uterinos são colocados de volta na cavidade abdominal, para permitir o desenvolvimento dos embriões injetados até o estágio (por exemplo, até o nascimento e atingindo pós-Natal dia 24) que é necessário para o experimento (ver, por exemplo, Lutz et al5 ,6 e Kraus et al.7). Por estudos sobre a plasticidade sináptica, estágios finais de desenvolvimento ou adultos são recomendados.
Depois de um transcardial da perfusão dos animais na fase desejada, o tecido nervoso (por exemplo, o cérebro e a medula espinhal na Figura 2) é colocado e orientado em um quadro de plástico transparente com coordenadas e incorporado em agarose (Figura 2 A, B). Após o corte, cada seção é fotografado (Figura 2C, E, G) e em seguida osmicated. Depois de osmication e incubação em etanol a 70% ou 80%, as seções são fotografadas novamente usando interferência luz telemacrography8,9,10. As secções de tecido devem ser colocadas num ambiente preto fosco para minimizar a radiação dispersa durante a iluminação de alta intensidade necessária. Extensões de fibra e diferentes áreas do tecido refletem cores iridescentes que contrastam com o fundo escuro do tecido, e emerge de um padrão especificamente colorido da superfície de tecido (Figura 2D, F, H). Todas as imagens iridescentes são sobrepostas com as imagens nonosmicated e, juntamente com as coordenadas projetadas da etapa de encastre, eles geram mapas de navegação da topografia tecido. Em seguida, o tecido é mais desidratado e incorporado em resina. Baseia-se os mapas de navegação, áreas de interesse são escolhidas e transformadas posteriormente para TEM-como exemplos, o hipocampo (estrato lucidum), cerebelo (camada de células grânulo) e medula espinhal (funículo dorsal) são mostrados na Figura 3A1-C4 .
No hipocampo e cerebelo, fibra musgosa sinapses são conhecidas por apresentar características ultra-estruturais únicas quando comparado a outras sinapses, incluindo grandes boutons pré-sináptica (Figura 3A1-B5). Eles podem ser localizados facilmente com a ajuda dos mapas navegação iridescente estabelecidos durante as etapas de processamento anterior. Em seus perfis de corte transversal, os boutons contêm um grande número de vesículas e mitocôndrias em muito frequentemente, coloque várias espinhas dendríticas (Figura 3A4, A5, B4, B5). TEM imagens destes perfis permitem uma quantificação de áreas seccionadas bouton sináptica, números de vesículas sinápticas e mitocôndrias dentro de um perfil de bouton, o comprimento de contatos sinápticos e números de contatos sites.
Na medula espinhal, o funículo dorsal contém muitas fibras axonal que são mielinizadas por oligodendróglias. Em seções transversais, o funículo dorsal pode ser encontrado entre os dois chifres posteriores da medula espinhal em seções transversais (Figura 3C1, C2). Nas imagens TEM, seccionados mielinizados axônios aparecem redondos e as bainhas de mielina em torno dos axônios são organizadas em lamelas (Figura 3C3, C4). Uma quantificação de áreas axonal seccionadas, incluindo a espessura das bainhas de mielina e o número de lamelas de mielina, bem como uma quantificação das mitocôndrias seccionadas áreas de perfil podem ser realizadas.
O atlas preparado e as imagens TEM MICROGRÁFICO dos parâmetros ultraestrutural não são apenas úteis para uma comparação de neuroplasticidade morfológica em diferentes condições de tratamento, mas também quando uma comparação entre parâmetros dentro da mesma área é necessário (por exemplo, uma comparação entre diferentes tipos de sinapses no hipocampo18 e entre estruturas equivalentes de espécies diferentes [Figura 4]).
Figura 1 : Preparação para a transdução no útero. Isoflurano (A) instalação de anestesia: 1) câmara de indução para anestesia inicial; 2) bomba; 3) unidade de anestesia; 4) válvula de interruptor roteamento; 5) fornecimento de anestesia tubulação; 6) unidade ao tesouro; 7) máscara de respiração; 8) aquecida a mesa cirúrgica; 9) binocular Estereoscópio com fonte de luz; 10) unidade de controle. Equipamento de cirurgia (B): 1) barbeador elétrico; 2) lubrificante de olho; 3) fitas de fixação; 4) absorventes; 5) pinça íris (10 cm, curvada, serrilhada); 6 e 7) tesoura de íris (11 cm, reta, carboneto de tungstênio); 8) pinças de Dumont (#3, 12 cm, reta, 0,2 x 0,12 mm); 9) tesouras do Vanna (8 cm, em linha reta); 10 e 11) micro-mosquito hemostático fórceps (12,5 cm, curvada); 12) película de parafina; 13) micro colher; 14) cotonetes; pinça hemostática de Halsted 15 e 16) mosquito (12,5 cm, em linha reta); 17 e 18) suturas (tamanho 6-0 e 3-0); 19) seringa; 20) montagens tubulares de aspirador para pipetas calibradas conta. (C) esquema de uma numeração sistemática de embriões dentro os cornos uterinos no dia embrionário (E) 14,5: L = esquerda; R = direita. (D) estratégias de injeção: para os ventrículos do cérebro de primeiro e segundo (euve e IIve, respectivamente), quarto ventrículo (IVve) e medula espinhal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Documentação de tecido isolado por telemacrography. (A e B) Incorporação de um cérebro e uma medula espinhal em agarose, usando cubetas com um sistema de coordenadas (grades). Após o corte, as seções são submetidas a reflexão telemacrography e interferência de imagem de luz. (C-F) Seções transversais e sagitais do cérebro. Escala de barras = 5 mm; co = córtex; St = corpo estriado; di = diencéfalo; me = mesencéfalo; oi = hipocampo; PED = pedunculi cerebri; CE = cerebelo; mo = medula oblongata. Seção Transversal (G e H) de um segmento cervical da medula espinhal. Barra de escala = 1 mm; ahR = corno anterior direita; ahL = corno anterior esquerdo; DF = funículo dorsal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Identificação topográfica e ultra-estruturais de parâmetros de plasticidade. (A1) Macrograph luz de interferência invertido do hipocampo. A região dos boutons de fibra musgosa dentro o estrato lucidum (sl) é realçada. PCL = camada de célula piramidal; GCL = camada de célula grânulo. Barra de escala = 500 µm. (A2) luz microfotografia (objetivo de x 100) de uma seção semithin (0,75 µm) mostrando estrato lucidum. Os asteriscos indicam as regiões de boutons de fibra musgosa que circundam muitas ilhas dendríticas (setas pretas). Toluidina coloração azul/OsO4 . Barra de escala = 50 µm. (A3) transmissão micrografia eletrônica em uma ampliação baixa, apresentando boutons de fibra musgosa (asteriscos) em torno de um dendrite (D). O retângulo inclui bouton uma única fibra musgosa. Barra de escala = 2 µm. (A4) transmissão micrografia eletrônica do perfil transversal de bouton uma única fibra musgosa (MFB). Destacam-se espinhos (azuis) e a área de seção transversal bouton (violeta). m = mitocôndria; s = espinhos. Barra de escala = 200 nm. (A5) Vesículas sinápticas dentro um MFB. Barra de escala = 100 nm. (B1) Macrograph luz de interferência invertido do cerebelo. A região da camada de células grânulo (gcl) que contém os boutons de fibra musgosa é indicada. MCL = camada molecular; h = hilo. Barra de escala = 500 µm. (B2) luz microfotografia (objetivo de x 100) de uma seção semithin (0,75 µm), mostrando uma região da camada de células grânulo que faz fronteira com células de Purkinje (PC). Os asteriscos indicam as regiões de boutons de fibra musgosa que estão rodeados por muitos neurônios grânulo cerebelar (CGN). Toluidina coloração azul/OsO4 . Barra de escala = 50 µm. (B3) transmissão micrografia eletrônica em um pequeno aumento, mostrando a área de MFBs. O retângulo inclui uma única botão Multifunção. Barra de escala = 2 µm. (B4) transmissão micrografia eletrônica do perfil transversal de um cogumelo, como MFB dentro da camada de células grânulo do cerebelo. A área de seção transversal bouton (violeta) e livre de vesículas espinhos (azul) são destacados. Barra de escala = 1 µm. (B5) mitocôndrias (violeta) e vesículas sinápticas dentro um MFB. Barra de escala = 150 nm. (C1) Interferência invertido luz macrograph da medula espinhal. A região do funículo dorsal (df) que contém fortemente dendritos é realçada. ahR e ahL = direita e deixou o corno anterior, respectivamente; phR e phL = direita e deixou o corno posterior, respectivamente. Barra de escala = 500 µm. (C2) luz microfotografia (objetivo de x 100) de uma seção semithin (0,75 µm) mostrando o funículo dorsal que é enriquecido com axônios fortemente mielinizados (ax) que são claramente distinguíveis das fibras nonmyelinated (asteriscos). CT = tecido conjuntivo. Toluidina coloração azul/OsO4 . Barra de escala = 50 µm. (C3) transmissão micrografia eletrônica de perfis de corte transversal de axônios mielinizados e nonmyelinated (ax, violeta). meu = bainhas de mielina. Barra de escala = 200 nm. (C4) O retângulo mostra alta-ampliada, fortemente mielinizados axônios com lamelas de mielina e as fibras nonmyelinated. Os microtúbulos (mt) e mitocôndrias (m) dentro das fibras axonal são visíveis. Barra de escala = 50 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Exemplos de plasticidade ultraestrutural parâmetros em diferentes modelos animais. (A) boutons de fibra musgosa no cerebelo de um tubarão. Barra de escala = 400 nm. (B) bouton de fibra musgosa no hipocampo de um macaco rhesus. Barra de escala = 200 nm. (C) junção Neuromuscular de um gato. Barra de escala = 300 nm. (D) sináptica boutons na substância negra pars reticular de um phalanger. Os asteriscos indicam a densidade pós-sináptica (PSD; em baixo-relevo: preto pontas de seta). O retângulo mostra um PSD ampliado. Barra de escala = 400 nm. Nonmyelinating (E) A célula de Schwann (SC) em torno de muitas fibras axonal no gânglio espinhal de um rato. Nas proximidades, fibras mielinizadas fortemente são visíveis. Barra de escala = 300 nm. Para todos os painéis: ax = axônio; D = dendrito; m = mitocôndria; MFB = bouton de fibra musgosa; MF = fibra musgosa; meu = bainhas de mielina; s = coluna vertebral; SA = aparelho de coluna vertebral; SV = vesículas sinápticas. Sites contatos (densidade pós-sináptica) são indicados com asteriscos. Áreas de secção transversal são destacadas em violeta e azul. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Um passo crucial de transdução no útero é o procedimento de injeção. A injeção precisa em ventrículos cerebrais ou em outra área de interesse requer experiência e habilidade de hands-on. A mais fina a ponta de conta, o menor dano tecidual pode ocorrer; no entanto, isto é à custa do aumento da pressão de injeção. Em contraste com eletroporação no útero19,20,21,22, a taxa de sobrevivência dos embriões injetados após transdução no útero é muito alta. Todos os embriões da trompa uterina podem ser injetados, mesmo se embriões estão localizados nas raízes dos cornos uterinos e precisam ser reajustado dentro do sac uterino. Os estágios do desenvolvimento de injeção e análise podem ser adaptados para a questão científica.
Quando injetado dos ventrículos do cérebro, as partículas de AAV1 são distribuídas através do líquido cefalorraquidiano através de todo o sistema ventricular. Estruturas em desenvolvimento com superfícies que estão em contato próximo com o licor, tais como o hipocampo e no cerebelo, são transformados pela aplicada partículas virais5,6,7. Uma análise das mudanças nos parâmetros ultra-estruturais, tais como tamanho bouton, áreas seccionadas bouton, números das vesículas sinápticas, números de mitocôndrias e números e comprimento de contatos sinápticos nessas estruturas, é uma leitura elegante para plasticidade ultraestrutural. O método de transdução no útero pode ser aplicado para estudar áreas diferentes do cérebro, bem como a medula espinhal6. Além disso, outros órgãos e tecidos da mesma forma podem ser escolhidos como alvos de transdução. Finalmente, o modelo do mouse usados com frequência pode ser substituído por outras espécies conforme necessário.
A fotografia das fatias de tecido permite uma dissecação muito precisa de resina-incorporado de amostras para microscopia eletrônica de transmissão. Desde que a orientação espacial da amostra é definida, extensivo e demorado corte foi omitido. Além disso, regiões vizinhas cruciais podem ser mantidas em sua relação original uns aos outros. Uma vantagem importante da etapa de documentação fotográfica é a possibilidade de monitorar a qualidade da fixação de tecidos e de reconhecer alterações patológicas. Assim, a qualidade da fixação e incorporação do material são de importância crucial. Nonsuitable amostras que contêm artefatos podem ser terceirizadas antes da transformação.
A série de Micrografia das fatias de tecido imagem fornece um atlas morfológico útil. Para estudos comparativos neuroanatômica, que podem também incluir espécies raras, o atlas é um valioso arquivo. A escolha da espessura das fatias de tecido depende da pergunta científica dirigida e é limitada pelo tamanho da amostra de tecido. Para pequenos animais, deve ser ajustada a uma espessura de até 1 mm. Seções muito grossas (> 5 mm) não são recomendados, devido a capacidade limitada de penetração de tetróxido de ósmio8,9,10.
A documentação de telemacrophotography é essencial para estudos morfométricos. Oferece uma correlação fixa da superfície do tecido para o lado e o plano superior do quadro e define a posição de uma determinada estrutura em um sistema espacial de coordenadas. Uma combinação do método descrito com eletrofisiologia18 ou com o modelo de lesão da medula espinhal, onde a plasticidade desempenha um papel essencial na regeneração6, é possível. Para estudos comparativos neuroanatômica, que podem também incluir espécies raras, o atlas de tecido furta-cor e as imagens TEM MICROGRÁFICO dos parâmetros ultraestrutural são ativos valiosos.
Apesar de seus pontos fortes, TEM tem várias limitações devido ao tamanho da espessura da amostra (70 nm), a área seccionada (< 6mm2) e a complexidade da preparação da amostra. No entanto, quando uma amostra é preparada com precisão, as imagens TEM ultraestrutura do espécime são de qualidade superior em comparação com imagens produzidas por técnicas qualquer luz-microscópica. A técnica de transdução no útero é limitada pelo volume injetado e a região topográfica da injeção. Indiscutivelmente, a técnica tem um forte potencial de medicina translacional em tratamento precoce no desenvolvimento e no resgate de doenças congênitas neuropatológicas. Além disso, a actual combinação de transdução no útero com temperatura pode não apenas ser considerada como uma abordagem para o tratamento futuro de doenças congênitas, mas também para diagnósticos de alta qualidade baseados na ultraestrutura neurológico.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores Agradecemos aos colegas do centro de animais na faculdade de medicina, Universidade de Ruhr Bochum, seus cuidados de suporte e animal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol | Serva | 36975 | |
| 26 G x 1'' needle | Henke-Sass, Wolf GmbH | ||
| 410 Anaesthesia Unit for air pump | Biomedical Instruments (Univentor) | 8323102 | |
| Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) | UKE (Viral Core Facility) | - | For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54. |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | low gelling agarose |
| Air Pump | Biomedical Instruments (Univentor) | Eheim 100 | |
| Araldite | CIBA-GEIGY | 23857.9 | resin for embedding of tissue |
| aspirator tune assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium | Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| buprenorphine | Temgesic | ampules | painkiller |
| capillaries | Science-Products | GB100TF-10 | with fillament |
| Dodecenylsuccinic anhydride | Fluka | 44160 | |
| Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) | FST | 11203-23 | |
| electric shaver | Phillips | - | |
| Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) | Ethicon | - | polyamide |
| eye lubricant | Bepanthene | - | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | for visualization of injected liquids |
| Gas Routing Switch 4/2 connectors | Biomedical Instruments (Univentor) | 8433020 | |
| halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) | FST | 13011-12 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 25 000 I.E./5 mL | |
| Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155 mm x 115 mm x 130 mm. Wall thickness: 6 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| iris forceps (10 cm, curved, serrated) | FST | 14007-14 | |
| iris scissors (11 cm, straight, tungsten carbide) | FST | 14501-14 | |
| Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257mm x110 mm x 18 mm. Heating area: 190 mm x 90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations |
Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| isoflurane (Attane) | JD medical | inhalation anesthesia | |
| LED RGB lights | Cameo | CLQS15RGBW | LEDs 2 x 15 W |
| Light microscope Basic DM E | Leica | - | 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives |
| micropipette puller | Science-Products | P-97 | |
| Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, curved) | FST | 13010-12 | |
| Nickel grids, 200 mesh | Ted Pella | 1GC200 | |
| Osmium (VIII)-oxid | Degussa | 73219 | |
| Propylene oxide | Fluka | 82320 | |
| razor blades | Schick | 87-10489 | |
| Sodium pentobarbital (Narcoren) | Merial GmbH | - | |
| TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback | Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| Technovit 4004 two components glue | Kulzer | ||
| Telemacrodevice | Canon | - | Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand. |
| Thermopuller P-97 | Sutter Instruments | - | |
| thin vibrating razor blade device | Krup | - | with Szabo thin blades |
| toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Transmission electron microscope C20 | Phillips | - | up to 200 kV |
| Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6 mm Inner diameter: 4 mm Wa ll thickness: 1 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| Ultracut E | Reichert-Jung | - | ultramicrotome |
| Univentor Scavenger | Biomedical Instruments (Univentor) | 8338001 | |
| Vannas scissors (8 cm, straight) | FST | 15009-08 |
References
- Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers. Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).
- Hamlyn, L. H. The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit. Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).
- Peters, A., Palay, S., Webster, H. The Fine Structure of the Nervous System. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1991).
- Rollenhagen, A., et al. Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses. Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).
- Lutz, D., et al. Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival. Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).
- Lutz, D., et al. Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury. Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).
- Kraus, K., et al. A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination. Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).
- Andres, K. H., von Düring, M. Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung. Mikroskopie. 30, 139 (1974).
- Andres, K. H., von Düring, M. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. Hayat, M. A. , Van Norstrand Reinhild. 246-261 (1997).
- Andres, K. H., von Düring, M. General Methods for Characterization of Brain Regions. Techniques in Neuroanatomical Research. Heym, C., Forssmann, W. -G. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. 100-108 (1981).
- Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).
- Webster, H. F., Collins, G. H. Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).
- Andres, K. H. Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern. Mikroskopie. 21, 169 (1967).
- Forssmann, W. G., et al. Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation. Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).
- Descarries, L., Schröder, J. M. Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit. Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).
- Langford, L. A., Coggeshall, R. E. The use of potassium ferricyanide in neural fixation. Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).
- Liu, J., et al. Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex. Molecular Brain. 7, 84 (2014).
- Lee, S. H., et al. Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway. Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. , Suppl 1 120-125 (2009).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
- Nishiyama, J., et al. Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation. European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).
- Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo. Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).
