Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

Sonra Ultrastructural nöroplastisite parametrelerinde Utero iletim gelişmekte olan fare beyin ve omurilik değerlendirilmesi

doi: 10.3791/59084 Published: February 26, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Transmisyon elektron mikroskobu ve rahimde iletim sinir sisteminin iyi ultrastructure morfolojik değişiklikler geliştirme sırasında çalışmak için güçlü bir yaklaşımdır. Bu kombine yöntem değişiklikleri içine derin anlayışlar nöroplastisite ile ilgili topografik ifadelerinin temel yapısal detayları verir.

Abstract

Bu da çalışmanın ilgi bir protein tarafından etkilenen belirsizliğe yer bırakmadan tanımlanan topografik yapılarda ultrastructural parametrelerinin kesin morfometrik analizi nişan rahimde iletim transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile birleştirir Bu viral havalesi yoluyla organizma içine giriliyor. Bu kombine yaklaşım aşağıdaki topografik navigasyon haritaları bir doku atlasında tarafından ultrastructural kimlik macrostructural yumuşak bir geçiş sağlar. Yüksek çözünürlüklü elektron mikroskobu içinde-utero-transduced doku ortaya neuropil ve plastisite parametreleri, cross-sectioned sinaptik bouton alanları, sinaptik veziküller ve mitokondri içinde sayısı gibi iyi ultrastructure bir Bouton profil, sinaptik kişiler, cross-sectioned aksonal alanları, miyelin kılıf kalınlığı, miyelin lamellae sayısı ve mitokondri profilleri cross-sectioned alanları uzunluğu. Bu parametreler analizi genetik yapı viral havalesi ile etkilenen sinir sistemi alanlarında ultrastructural plastisite değişiklikleri içine temel görüşler ortaya koymaktadır. Bu kombine yöntem yalnızca nöronal plastisite üzerinde genetiği biomolecules ve/veya uyuşturucu etkisi doğrudan çalışmak için kullanılamaz ancak da (örneğin, bağlamında nöronal plastisite rahimde Kurtarma çalışma imkanı açılır nörodejeneratif hastalıklar).

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Yok foton bir elektron derinlik sınıfta bir ultrathin doku numune nüfuz. Bu çok değerli avantajları TEM için nanometre çözünürlük fotoğraf güzel ışık mikroskobu teknikleri için karşılaştırıldığında yapıları yakalama öznitelikleri. Örneğin, mitokondri, melanosomes ve çeşitli salgı granülleri, mikrotübüller, microfilaments, kirpikler, microvilli ve hücreler arası kavşak (hücre yüzey gibi hücre içi organellerin görselleştirme için TEM sağlar uzmanlık), özellikle sinir sistemi1,2,3,4' te synapses. Metodolojik da çalışmanın genel amacı nöral plastisite değişimler ultrastructural tanıma geliştirme doğum öncesi girişim üzerine rahimde iletim ve TEM state-of--art teknikleri birleştirerek bulunuyor. İlgi virally kodlanmış proteinler rahimde omurilik6dahil olmak üzere merkezi sinir sistemi5,6,7, transduced. Örneğin, rahimde iletim TEM ile birlikte hücre adezyon molekülü L1 etkisi motorlu plastisite L1-eksik farelerde özellikle L1 ve nükleer reseptör proteinler arasında etkileşimi ile ilgili öğrenme eğitimi için kullanılmıştır serebellar nöronlar7' de.

Nöroplastisite parametreler analiz sinir sistemi içinde en küçük alanlarda lokalizasyonu hakkında kesin bilgi gerektirir. Bu nedenle, ultrastructural detayları ve diğer yapıları ile ilgili tam topografik yönelimleri açıklamak yeterli olduğunu. Bu da çalışmanın, hem ışık hem elektron mikroskobu bağlı farklı morfolojik bölgelerin detaylı incelenmesi yönelik belirli bir hazırlık yöntemi gösterilir. Bu yaklaşım doku manipülasyonu, fare beyin ve omurilik rahimde iletim ile başlayan ve perfüzyon fiksasyon tarafından takip çeşitli teknikleri birleştiren kalıp gömme ve doku TEM için işleme. Kesin microphotographic ve düşük-büyütme belgelenmesi için sağlar girişim ışık yansıması tekniği kullanarak doku belgelerine gömme ve TEM için doku işleme arasında dahil önemli bir adım olduğunu doku örnekleri8,9,10. Mevcut yaklaşım dahil, bu teknik araştırmacılar topoğrafik ve yapısal detaylar sinir doku yüzeyler ve numune dilim profilleri onların hazırlık TEM için önce incelemek için sağlar.

Bütün beyin kesit için özel bir çerçeve stereotaksik koordinatlarına karşılık gelir. Bu çerçeve morfolojik üç boyutlu (3D) yeniden inşası sinir doku alanlarda faydaları ve xarakteristikaları analizi için kullanılabilir. Macrographs görüntülenmeyecektir bölümlerin topografik koordinatları atanır ve seri olarak numaralı kesitler doku atlas haritaları oluşturmak.

İşleme reçine sonra katıştırılmış doku ultrathin bölümlere kesitli (< 70 nm) yukarıda belirtilen doku atlas haritaları göre Seçili alanlar içeren. Ultrathin bölümleri TEM içeriklerini ve komşu yapılar kompleksi içinde ilgili kişilere plastisite parametreleri (örneğin, kesit profil alanları sinaptik boutons veya aksonal lifleri) yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde etmek için tabi neuropil.

Burada açıklanan yöntemi ile mikro - ve taşınımı için yumuşak bir geçiş görüntülenmeyecektir macrostructures üzerinden morfolojik nöronal plastisite karşılaştırmalı ayrıntılı çalışmalar geliştirme rahim içinde iletim sonra gergin verir sistem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hayvan konularda tüm yordamları Hamburg ve Nordrhein-Westfalen, Almanya federal Devletleri kurumsal hayvan etik komiteleri tarafından onaylanmıştır.  Steril aletlerin, koruyucu eldiven ve aseptik kat tüm ameliyat boyunca kullanın.

1 rahim iletim.

  1. Adeno ilişkili virüs tip 1 (AAV1) istenen hedef (4 x 1011 viral parçacıkların/µL, AAV1) için kodlama fosfat tamponlu tuz (PBS) pH 7.4 hazırlayın. 0.1 mg/µL hızlı yeşil ekleyin ve 37 ° C'de AAV1-hızlı-yeşil karışımı tutmak
  2. İnce kılcal bahşiş istediğiniz şekli ile hazırlamak (8 mm uzunluğunda, bir dış çapı 80 µm ve bir iç çapı 50 µm), bir micropipette çektirmenin kullanarak (ayarları: basınç = 500, ısı 700, çekme = = 0, hız = 80, saat = 200, malzemeler tablo bkz: < / c1 >). Böylece 4-5 mm kılcal ucunu kırmak.
  3. Kapiler uç bir aspiratör boru (44 cm x 0.7 cm) Montaj ve AAV1-hızlı-yeşil karışımı 15 µL kılcal damar Aspire edin.
  4. Hayvan konular sürekli fizyolojik vücut ısısı 37 ° c bütün prosedür boyunca tutun.
  5. Hamile C57Bl/6 fare (embriyonik gün 14,5) preincubation odanın içine yerleştirin ve gaz halinde olan yakıtlar % 4 isoflurane fareyle anestezi (hacimsel hava debisi oranı 0,6-0,8 ile L/dk).
  6. Subkutan, buprenorfin (0.1 mg/kg vücut ağırlığı) enjekte et.
  7. İmzalat fare prewarmed cerrahi tabağa (37 ° C) yerleştirin.
  8. Gözleri bir yağ ile kapak.
  9. Fare anestezi maskesi ile uygun (0,6-0,8 hacimsel hava akımı oranında gaz halinde olan yakıtlar % 1.5 isoflurane L/dk) cerrahi plaka ve tıraş karın deri bölgesi. Traş bölgeye betadine solüsyonu ile ve daha sonra 3 X %75 etanol ile silin.
    Not: Nefes alma davranışını imzalat fare sürekli izleyin. Fare inhalasyon Soluk verme desene göre isoflurane gaz konsantrasyonu ayarlayın.
  10. Plantar refleks olmaması için arka pençe parmak kemikleri fare sıkarak kontrol edin.
  11. Karın boşluğu açmak cilt eğri tırtıklı Iris forseps (10 cm) ile sürükleyici ve linea mediana boyunca cilt (10 cm) düz tungsten karbür makasla kesme ve sonra Periton duvar düz Dumont cımbız (12 cm, 0.2 mm ile sürükleyici 0,12 mm) x ve duvar boyunca linea alba ile düz Vanna'nın kesme makası (8 cm).
  12. Karın açılması Poşlu parafin film bir parça yerleştirin ve filmin her iki ucunda mikro-sivrisinek Kan durdurucu sargı forseps (12,5 cm, kavisli) ile düzeltmek.
  13. Rahim boynuzları ile zarar vermemek için embriyolar rahim boynuzları içinde kaşık benzeri bir aletle ortaya çıkarmak. Rahim boynuzları PBS (37 ° C) bir kaç damla damla ve zararların ya da rahim sac içinde malformasyonlar için embriyo incelemek.
  14. Belge düzeni ve pozisyon embriyoların rahim boynuzları. Enjeksiyon için istediğiniz konuma ulaşana kadar embriyolar rahim sac içinde dikkatlice açın.
  15. 1-2 µL AAV1-hızlı-yeşil karışımı enjeksiyon yeri (örneğin, beyin ventrikül) ve bir stereomicroscope altında boya penetrasyon görsel olarak inceleyerek enjekte.
  16. Enjekte embriyo belge ve rahim boynuzları enjekte embriyo ile karın boşluğuna yerleştirin.
  17. Karın boşluğuna PBS (37 ° C) bir kaç damla damla. Kavite Periton duvar (kullanım poliamid 6 0 boyutlu dikiş) ve Halsted'e'nın sivrisinek Kan durdurucu sargı forseps (12,5 cm, kavisli) kullanarak cilt (kullanım poliamid dikiş) 3-0-büyüklük, dikiş kapatın. Alternatif olarak, basit bir kesintiye uğramış desen veya paslanmaz çelik dikiş/zımba karın boşluğu ve cilt kapatmak için kullanın.

2. Telemacrophotography izole dokuların

  1. Arabellekleri hazırlanması
    1. Sörensen'ın arabellek (1 L) eriterek 14.95 g Na2HPO4 ve KH2PO4 1 L 200 devirde karıştırma altında distile su içinde 2.18 g hazırlayın. Perfüzyon geç gebelik pups ve/veya pups içinde doğum sonrası, dönemlere uygun bir boyut iğne karın veya intragastric enjeksiyon için kullanın ve terminal sodyum Fentobarbital anestezi konsantrasyonu 180 mg geçmediği emin olun / vücudun kg ağırlığında.
    2. Mugnaini'nın fiksasyon çözüm (5 L) 500 mL distile su ile 75 ° C Isıtma tarafından hazırlamak ve paraformaldehyde toz karıştırma altında 50 gr 200 rpm'de 5 200 µL ekleme ekleme N NaOH, Sörensen'ın arabelleği ekleyerek 1500 mL, 1750 mL distile su ve % 25 oxazolidin 500 mL. 5000 mL distile su ile doldurun. Bu son arabellek perfüzyon için kullanın.
      Not: Mugnaini'nın fiksasyon çözüm başlık altında hazırlamak, koruyucu gözlük ve duman kaçının. Metilen mavisi (0,05 g/L) perfüzyon daha iyi görselleştirme için ekleyin.
  2. Fare perfüzyon ve doku yalıtım
    1. Transcardially sıvı (durumunda embriyo çalışmalar) transduced embriyo veya istenen yaşta (örneğin, doğum sonrası gün 24) Standart prosedürler6,7göre d. transduced pub taşıyan hamile fareler, mayi terminal sodyum Fentobarbital kullanarak 11,12,13,14,15,16,17, Anestezi (200 mg/kg vücut ağırlığı).
    2. Fareler transcardially enjekte heparin çözüm (500 U) ile fareler demlemek 26 G, 1 iğne've fiksasyon önce kullanarak transcardially 10 mL kan vücuttan dışarı floş ve onları transcardially ile 40 ° C prewarmed Mugnaini'nın 30 mL sıvı için PBS ile fiksasyon çözüm.
      Not: Yetişkin fareler için alternatif bir retrograd perfüzyon abdominal aort14üzerinden gerçekleştirin.
    3. Faiz (örneğin, tüm beyin ya da omurilik) perfused dokusunun yalıtmak ve Mugnaini'nın fiksasyon çözüm için başka bir 24 h 4 ° C'de en az 10 mL dokusunda postfix
    4. Doku PBS 10 mL oda sıcaklığında 3 h için yıkayın.
  3. Özel artı belgelerine gömme ve kesit
    1. Bir tekrarlanabilir parça açısı8,9,ile10özel bir çerçeve içinde izole doku (örneğin, tüm beyin) ayarlayın. Alternatif olarak, bir vibratome bir ayarlanabilir kesme kalınlığı ile kullanın.
    2. Sinir doku çerçevesine yerleştirin, doku telemacrography için ayarlamak ve koordinatları belge.
    3. % 3 düşük erime özel gömme orta hazırlamak: 100 mL Sörensen'ın arabellek özel 3 g ekleyin ve karışımı bir su banyosu ile 90 ° c ısı
    4. %3 özel (30 ° C) doku içeren çerçevesinin içini dökmek. Bir sıcak metal blok ile çerçeve kapak ve sağlamlaştırma tamamlanana kadar bekleyin. Sertleştirme sırasında katıştırılmış doku ve koordinatlarını çerçeve içinde resim için telemacrographic cihazlar kullanın.
    5. Özel katıştırılmış doku kesme boşluklar ilk çerçeve koordinatları için karşılık gelen bir çerçeve içine aktarabilirsiniz.
    6. Bir ince ve titreşimli tıraş bıçağı olan bir cihaz ile istediğiniz kalınlıkta (örneğin, 1.5 mm) bölümlere katıştırılmış doku kesmek ( Tablo malzemelerigörmek).
      Not: Jilet kayma artırmak için katıştırılmış doku üzerine gliserin birkaç damla damla.
    7. PBS her doku bölümünde resim ve belgili tanımlık imge içine a ağıl toplamak.

3. iletim elektron mikroskopi için izole doku hazırlanması

Not: Cam yemekleri ile sıkı bir şekilde closable kapakları başlık altında sallayarak bir platformda, kuluçka tüm diğer adımları gerçekleştirin.

  1. 2 x 30 dk içinde PBS için doku bölümleri yıkayın. Oda sıcaklığında 2 h için % 2 sulu Osmiyum tetroxide çözüm (OsO4) bölümlerinde kuluçkaya.
    Uyarı: Osmiyum tetroxide zehirli ve deri ile temas geldiğinde zararlı olabilir.
  2. 2 x 30 dk içinde PBS için osmicated bölümleri yıkayın.
  3. 10-15 dakika oda sıcaklığında % 30, % 50 ve % 70 etanol bölümlerde kuluçkaya (isteğe bağlı: 4 ° C'de % 70 etanol gecede kuluçkaya).
  4. Sol ve sağ tarafta 45 ° açılı LED RGB ışık8,9,10 (2 x 15 W) altında % 70 etanol osmicated numuneler için örnek uygulamayı görüntü. Siyah yemekler ve mat siyah bir arka plan saçılma ve ışık yansıma aydınlatma sırasında en aza indirmek için kullanın.
    Uyarı: Bölüm görüntüleme sırasında kurumasına izin vermez.
  5. Bölüm resimleri bir atlas serisi bir klasördeki görüntüleri toplayarak koordinatları ile oluşturun.
  6. % 100 etanol (2 x 30 dk için) ve % 100 propilen oksit (2 x 30 dk) oda sıcaklığında numuneler kuluçkaya.
    Uyarı: Bölümler çözümler değiştirirken kurumasına izin vermez.
  7. 260 mL reçine dodecenylsuccinic anhidrit bir cam kap içinde 240 mL cam çubuk ile karıştırarak yavaşça karıştırın. İnhomogeneity, kabarcıklar ve smear için düzenli olarak kontrol edin. Yavaşça, el ile en az 45 dakika karıştırın.
  8. 1:2 ve 1:1 oranında reçine/propilen oksit hazırlamak ve % 3 Hızlandırıcı (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol). Ekle
  9. 1:2 3.8, 2 h ve sonra 1:1 gömme çözümündeki 3.8 için adım 2 h oda sıcaklığında dönen bir tekerlek üzerinde adım çözümden katıştırma dokusunda kuluçkaya.
  10. Doku düz polipropilen yemekleri yer, doku % 3 kısayol tuşu içeren taze reçine ile kapak ve 12-24 h 65-85 ° c doku katıştırılmış tedavi.
  11. Oda sıcaklığı için katıştırılmış doku sakin ve reçine katıştırılmış örneklerden gelen polipropilen yemekler kaldırın.

4. Ultrastructural nöroplastisite parametreleri nicel analiz yelpazesi

  1. İlgi alanı eşleme
    1. İlgi (örneğin, Hipokampus veya beyincik) bir alan seçin ve bu alanı içeren atlas en (Adım 3.5) görüntü seçerek bölüm atlas alanında yerelleştirilmesine.
    2. Bölüm görüntü üzerine ilgi alanı sınırları kroki ve bu bölge sınırları üzerine reçine numune bul/üst üste.
    3. Çizik-işareti bir ince iğne ölçer (26 G, 1 inç) kullanarak reçine numune üzerinde (örneğin, Hipokampus veya beyincik) ilgi alanı sınırları.
    4. Düzeltme için reçine yumuşatmak veya alternatif olarak, bir düzeltme aygıt, ince bıçak veya zımpara kağıdı kullanmak için reçine numune ile 85 ° C arasında bir fırın ısı.
    5. Bir tıraş bıçağı ile reçine örnekten ilgi alanı tüketim ( Tablo malzemelerigörmek). Örnek üzerinde tutan tutkal ile örneğin, ile (çapı 8 mm) ve 1 cm uzunluğunda kalibre gerekli akrilik cam çubukları bağlayın. Yarı - ve ultrathin kesit için monte numune kırpın.
    6. Semithin (0,75 µm) hazırlamak ve ultrathin (70 nm) bir ultramicrotome kullanarak bölünen alanı bölümleri: 1,5 mm/s 0,75 µm kalınlık ve 0.7 mm/s'de 70 nm kalınlık ayarlamak.
    7. Semithin bölümleri cam taşıyıcılara toplamak ve % 1 toluidin bölümlerle (4 min için) PBS mavi leke.
    8. Bölümlerde birkaç kez deiyonize suyla yıkayın. 4 x kullanarak ışık mikroskop altında lekeli kısımlar inceler (0.1 ∞ NA /-), 10 (NA 0,22 ∞/0.17), x 40 (0.65 ∞/0.17 NA), x ve 100 x (NA 1,25 ∞/0.17) hedefler.
    9. Ultrathin bölümleri nikel Izgaralar üzerinde toplamak. Izgaralar TEM için 180 konu kV ve 3, 200 x, 6, 000 x ve/veya 8.000 x büyütme.
  2. TEM analizi
    1. Nicel TEM analiz (örneğin, boutons veziküller ve mitokondri veya myelinated ve nonmyelinated akson ile) için ilgi ultrastructural parametrelerini seçin ve bu parametrelerin 3 altında 500 x, 6.000 x ve/veya 8.000 x büyütme TEM fotoğraf çekmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Güvenilir ve hızlı anestezi farelerin için çok sayıda güvenlik parametreleri kabul edildi ve en iyi duruma getirilmiş bir çalışma alanı anestezi biriminin yeterli (şekil 1A) kanıtladı. Birimi fare ve sıçanlar gibi küçük hayvanlar üzerinde başarılı ameliyat için gerekli bir hassasiyetle sıvı isoflurane ve ortam havası karışımı kontrol etmek için tasarlanmıştır. Hava ve isoflurane Buharlaştırıcı istenen ayarlara göre karışık ve bir kutu içine veya maske ile hayvan (şekil 1A) teslim. Çöpçü toplar ve böylece güvenli bir çalışma ortamı sağlayan üretilen, herhangi bir fazla isoflurane gaz inaktive. Gaz toplanır ve bir kartuş (şekil 1A) aktif kömür delip geçmiş.

Aletleri (şekil 1B) en iyi duruma getirilmiş bir dizi ameliyat hızlı bir şekilde hamile fareler üzerinde gerçekleştirmek bilim adamları sağlar. Hidrofobik özellikleri ile basit parafin film karın mukoza rezeksiyon (şekil 1B) sonra kurumasını önler. Yataklık embriyoların rahim boynuzları parafin film sunulur ve embriyo şekil 1' deCgösterildiği şekilde numaralandırılır. Yerelleştirilmiş bir kez embriyoların enjeksiyon yolu ile ince kılcal (şekil 1D) şunun için doğru olarak ayarlanır. Enjeksiyon delici boya enjekte virüs karışımı (şekil 1D) yer alan Difüzyon şeklinde gözlemleyerek görsel olarak kontrol edilir. Rahimde enjeksiyon sonra rahim boynuzları deneme (bkz, örneğin, Lutz ve ark.5 için gerekli enjekte embriyo gelişimi (örneğin, kadar doğum ve doğum sonrası gün 24 ulaşan) sahne kadar izin vermek için geri karın boşluğu yerleştirilir ,6 ve Kraus vd.7). Sinaptik plastisite üzerinde çalışmalar için geç gelişim veya yetişkin aşamaları tavsiye edilir.

Bir transcardial perfüzyon hayvanların sonra istenen aşamada, sinir dokusu (örneğin, beyin ve omurilik Şekil 2) yerleştirilir ve şeffaf plastik çerçeve koordinatları ile odaklı ve özel (Şekil 2 katıştırılmış A, B). Kesme sonra her bölümdür (Şekil 2C, E, G) görüntüsü ve sonra osmicated. Osmication ve % 70 veya % 80 etanol kuluçka sonra bölümleri tekrar girişim ışık telemacrography8,9,10kullanarak yansıma. Bir donuk siyah dağınık radyasyon gerekli yoğun aydınlatma sırasında en aza indirmek için çevreleyen doku bölümleri yerleştirilmesi gerekir. Fiber yolları ve dokusunun farklı alanlarda karanlık doku arka plan kontrast yanardöner renkleri yansıtacak ve özellikle renkli desen doku yüzeyinin (Şekil 2D, F, H) ortaya çıkar. Tüm yanardöner görüntüleri nonosmicated görüntülerle üst üste ve navigasyon haritaları doku topografya, ürettikleri gömme adım öngörülen koordinatları ile birlikte. Ardından, doku daha fazla sıvı kaybı ve reçine gömülü. Navigasyon haritalar üzerinde bağlı olarak, ilgi alanları seçilen ve daha fazla işlenen için TEM-örnek olarak hippocampus (stratum Lucidium), beyincik (granül hücre Katmanı) ve spinal kord (dorsal funiculus) şekil 3' teA1-C4 gösterilmektedir .

Hipokampus ve beyincik yosunlu fiber sinapslarda büyük presynaptic boutons (şekil 3A1-B5) dahil olmak üzere diğer sinapslarda için karşılaştırıldığında benzersiz ultrastructural özellikleri sergilemek için bilinir. Önceki işlem adımları sırasında kurulan yanardöner navigasyon haritaları yardımıyla kolayca yerelleştirilebilir. Kendi kesit profillerinde boutons veziküller ve mitokondri geniş bir dizi içerir ve çok sık çeşitli dendritik spines (şekil 3A4, A5, B4, B5) içine alın. Bu profilleri görüntülerini TEM bir miktar cross-sectioned sinaptik bouton alanları, sinaptik veziküller ve mitokondri bouton profili içinde numaraları, sinaptik kişiler ve iletişim siteleri sayıda uzunluğu izin.

Spinal kord dorsal funiculus oligodendroglia tarafından myelinated birçok aksonal lifleri içerir. Enine bölümlerde dorsal funiculus her iki arka boynuz omurilik enine bölümlerinde (şekil 3C1, C2) arasında bulunur. TEM görüntülerde cross-sectioned myelinated akson yuvarlak görünür ve akson çevresindeki miyelin kılıf lamellae (şekil 3C3, C4) düzenlenir. Bir miktar kalınlığı miyelin kılıf ve miyelin lamellae, sayısı da dahil olmak üzere cross-sectioned aksonal alanlarının yanı sıra bir miktar cross-sectioned mitokondri profil alanları yapılabilir.

Hazırlanan atlas ve ultrastructural parametreleri micrographic TEM görüntülerini sadece ama aynı zamanda bir karşılaştırma aynı alanı içinde parametreleri arasında tedavi, farklı koşullar üzerine morfolojik nöroplastisite karşılaştırması için yararlı değildir gereklidir (örneğin, bir karşılaştırma sinapslarda Hipokampus18 farklı türü arasında farklı türlerin [şekil 4] eşdeğer yapıları arasında).

Figure 1
Resim 1 : Rahimde iletim için hazırlık. (A)Isoflurane anestezi Kurulum: 1) indüksiyon odası için ilk anestezi; 2) pompa; 3) anestezi birimi; 4) yönlendirme anahtarı Vana; 5) anestezi tedarik boru; 6) hazine birimi; 7) solunum maskesi; 8) ısıtmalı cerrahi tablo; 9) ışık kaynağı ile dürbün stereoscope; 10) kontrol ünitesi. (B) cerrahi ekipman: 1) Elektrikli tıraş makinesi; 2) göz yağ; 3) fiksasyon bantlar; 4) sıhhi yastıkları; 5) Iris forseps (10 cm, eğri, tırtıklı); 6 ve 7) Iris makas (11 cm, düz, tungsten karbid); 8) Dumont cımbız (#3, 12 cm, düz, 0.2 mm x 0,12 mm); 9) Vanna'nın makas (8 cm, düz); 10 ve 11) mikro-sivrisinek Kan durdurucu sargı forseps (12,5 kavisli cm,); 12) parafin film; 13) mikro kaşık; 14) pamuk temizleme bezi; 15 ve 16) Halsted'ın sivrisinek Kan durdurucu sargı forseps (12,5 cm, düz); 17 ve 18) dikiş (boyutu 6-0 ve 3-0); 19) şırınga; 20) aspiratör tüp derlemeler kalibre edilmiş microcapillary Pipetler için. (C) bir sistematik embriyolar rahim boynuzları içinde embriyonik gününde (E) 14,5 numaralandırma düzeni: L = left; R = sağ. (D) stratejileri enjeksiyon: birinci ve ikinci beyin ventrikül içine (Benve ve IIve, sırasıyla), dördüncü ventrikül (IVve) ve spinal kord. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Telemacrography tarafından izole doku belgelenmesi. (A ve B) Bir beyin ve spinal kord cuvettes bir koordinat sistemi (Izgaralar) kullanarak özel katılmasını. Kesme sonra telemacrography ve parazit yansıma'bölümleri tabi olan ışık görüntüleme. (C-F) Beyin enine ve sagittal bölümleri. Ölçek çubukları = 5 mm; Co korteks; = St striatum; = di diencephalon; = Beni mesencephalon; = Merhaba Hipokampus =; ped pedunculi cerebri; = CE beyincik; = Mo medulla oblongata =. Servikal segmentin omurilik enine bölüm (G ve H). Ölçek çubuğu = 1 mm; ahR şu ön boynuz; = ahL sol ön boynuz; = DF dorsal funiculus =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Topografik ve ultrastructural kimlik plastisite parametrelerinin. (A1) Ters girişim hipokampüs ışık macrograph. Yosunlu fiber boutons tabaka Lucidium (sl) içinde bölge vurgulanır. PCL piramit hücre katmanı; = un granül hücre katmanı =. Ölçek çubuğu 500 µm. (A2) hafif microphotograph (100 x amaç) tabaka Lucidium gösterilen semithin bölümün (0,75 µm) =. Yıldız işaretlerini birçok dendritik Adaları (siyah ok uçları) çevreleyen yosunlu fiber boutons bölgeleri gösterir. Toluidin blue/OsO4 boyama. Ölçek çubuğu 50 µm. (A3) transmisyon elektron test düşük büyütmede gösteren yosunlu fiber boutons (yıldızlar) bir dendrite (D) çevreleyen =. Dikdörtgen bir tek yosunlu fiber bouton içerir. Ölçek çubuğu 2 µm. (A4) transmisyon elektron test tek yosunlu fiber bouton (MFB) kesit profilinin =. Dikenleri (mavi) ve kesit bouton alan (Menekşe) vurgulanır. m = mitokondri; s dikenleri =. Ölçek çubuğu = 200 nm. (A5) Sinaptik veziküller içinde bir MFB. Ölçek çubuğu = 100 nm. (B1) Ters girişim beyincik ışık macrograph. Yosunlu fiber boutons içeren granül hücre Katmanı (un) bölge belirtilir. mcl moleküler katmanı; = h hilus =. Ölçek çubuğu 500 µm. (B2) hafif microphotograph (100 x amaç) bir bölge Purkinje hücreleri (PC) sınırları granül hücre tabakasının gösterilen semithin bölümün (0,75 µm) =. Yıldız işaretlerini birçok serebellar granül nöronlar (CGN) tarafından çevrili yosunlu fiber boutons bölgeleri gösterir. Toluidin blue/OsO4 boyama. Ölçek çubuğu 50 µm. (B3) transmisyon elektron test MFBs alanında gösterilen bir düşük büyütmede =. Dikdörtgenin tek bir MFB içerir. Ölçek çubuğu 2 µm. (B4) transmisyon elektron test beyincik granül hücre tabakası içinde mantar gibi MFB kesit profilinin =. Kesit bouton alan (Menekşe) ve vezikül ücretsiz spines (mavi) olan vurgulanır. Ölçek çubuğu 1 µm. (B5) = mitokondri (Menekşe) ve sinaptik veziküller içinde bir MFB. Ölçek çubuğu = 150 nm. (C1) Omurilik ters girişim ışık macrograph. Ağır myelinated akson içerir dorsal funiculus (df) bölge vurgulanır. ahR ve ahL = sağ ve sol ön boynuz, sırasıyla; phR ve phL = sağ ve arka boynuz, sırasıyla yaptı. Ölçek çubuğu 500 µm. (C2) hafif microphotograph (100 x amaç) nonmyelinated lifleri (yıldız) açıkça ayırt ağır myelinated akson (ax) ile zenginleştirilmiş dorsal funiculus gösterilen semithin bölümün (0,75 µm) =. CT bağ dokusu =. Toluidin blue/OsO4 boyama. Ölçek çubuğu 50 µm. (C3) transmisyon elektron test kesit profilleri, myelinated ve nonmyelinated akson (ax, Menekşe) =. benim miyelin kılıf =. Ölçek çubuğu = 200 nm. (C4) Dikdörtgen yüksek büyütülmüş, ağır myelinated akson miyelin lamellae ve nonmyelinated lifleri ile gösterir. Mikrotübüller (mt) ve mitokondri (m) aksonal lifleri içinde görülebilir. Ölçek çubuğu = 50 nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Ultrastructural plastisite parametreleri farklı hayvan modelleri, örnekleri. Bir köpekbalığı beyincik içinde(a)yosunlu fiber boutons. Ölçek çubuğu = 400 nm. (B) yosunlu fiber bouton rhesus makak oluşur içinde. Ölçek çubuğu = 200 nm. (C) nöromüsküler kavşak bir kedi. Ölçek çubuğu 300 = nm. (D) sinaptik boutons pars reticularis gözlemliyorum Nigra'da, bir phalanger. Yıldız işaretlerini postsinaptik yoğunluğu gösterir (PSD; iç metin: siyah ok başları). Dikdörtgen büyütülmüş bir PSD gösterir. Ölçek çubuğu = 400 nm. (E) A nonmyelinating Schwann hücresi (SC) spinal sinir düğümü bir fare birçok aksonal lifler çevreleyen. Otelin yakınında, ağır myelinated lifleri görülebilir. Ölçek çubuğu 300 = nm. Tüm panelleri için: ax akson; = D = dendrite; m = mitokondri; MFB yosunlu fiber bouton; = MF yosunlu fiber; = benim miyelin kılıf; = s omurga; = sa omurga aparatı; = SV sinaptik veziküller =. İletişim siteleri (postsinaptik yoğunluk) yıldız işareti ile gösterilir. Kesit alanları mor ve mavi vurgulanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Çok önemli bir adım rahimde iletim / enjeksiyon işlemdir. Hassas Enjeksiyon beyin ventrikül veya ilgi başka bir alan içine deneyim ve uygulamalı beceri gerektirir. Daha ince microcapillary uç, daha az doku hasarı oluşabilir; Ancak, bu enjeksiyon basıncı arttırmak pahasına. Rahimde elektroporasyon19,20,21,22aksine, enjekte embriyo rahimde iletim sonra hayatta kalma oranı çok yüksektir. Embriyolar rahim boynuzları kökleri bulunur ve içinde rahim sac ayarlamalara gidilmesi gerekiyor olsa bile tüm embriyoların rahim korna, enjekte edilebilir. Enjeksiyon ve analiz gelişim aşamalarında bilimsel soru için adapte edilebilir.

Beyin ventrikül enjekte edildiğinde AAV1 parçacıkları tüm Ventriküler sistemi aracılığıyla beyin omurilik sıvısı üzerinden dağıtılır. Hipokampus ve beyincik, transduced tarafından uygulanan viral parçacıkların5,6,7gibi gelişmekte olan yapıları olan yüzeyler ile içki ile yakın. Zarif bir okuma için bouton boyutu, cross-sectioned bouton alanları, sinaptik veziküller sayıda, mitokondri, numaraları ve numaraları ve sinaptik kişiler bu yapılarda uzunluğu gibi ultrastructural parametreleri değişiklikleri bir analizidir ultrastructural plastisite. Rahimde iletim yöntemi farklı beyin bölgeleri, hem de omurilik6eğitim için uygulanabilir. Ayrıca, diğer organ ve dokularda benzer şekilde iletim hedef olarak seçilebilir. Son olarak, sık kullanılan fare modeli gerektiği gibi diğer türler tarafından değiştirilebilir.

Fotoğraf dokusu dilimlerin reçine gömülü örnekleri transmisyon elektron mikroskopi için çok hassas bir diseksiyon sağlar. Bu yana örnek uzamsal yönünü tanımlanır, geniş ve zaman alıcı kesim ihmal. Ayrıca, özgün ilişkilerini birbirlerine çok önemli komşu bölgeler tutulabilir. Fotoğraf adım önemli bir avantajı doku fiksasyon kalitesini izlemek için ve patolojik değişiklikler tanımak imkanı vardır. Böylece, fiksasyon kalitesini ve malzeme gömme kilit öneme sahiptir. Eserler içeren nonsuitable örnekleri daha fazla işleme önce dış kaynaklı.

Test serileri görüntülü dokusu dilimlerin yararlı bir morfolojik atlas sağlar. Ayrıca nadir türler içerebilir, karşılaştırmalı nöroanatomik çalışmalar için atlas değerli bir arşividir. Kalınlığı dokusu dilimlerin seçimi ele bilimsel soru üzerine bağlıdır ve doku numune boyutuyla sınırlıdır. Küçük hayvanlar için ilâ 1 mm kalınlığında ayarlanmalıdır. Çok kalın kesitler (> 5 mm), Osmiyum tetroxide8,9,10sınırlı penetrasyonu kapasitesi nedeniyle önerilmez.

Telemacrophotography belgeleri morfometrik araştırmalar için esastır. Bu sabit bir korelasyon yan ve çerçevenin üst uçak doku yüzeyinin sunar ve kayma koordinat sisteminde belirli bir yapı konumunu tanımlar. Açıklanan yöntemin Elektrofizyoloji18 veya nerede plastisite rejenerasyon6' da önemli bir rol oynar, omurilik yaralanma modeli ile mümkündür. Ayrıca nadir türler içerebilir, karşılaştırmalı nöroanatomik çalışmalar için yanardöner doku atlas ve ultrastructural parametreleri micrographic TEM görüntülerini değerli varlıklarıdır.

Onun güçlü rağmen TEM örnek kalınlığı büyüklüğü nedeniyle bazı sınırlamaları vardır (70 nm), cross-sectioned alanı (< 6 mm2) ve numune hazırlama karmaşıklığı. Bir örnek doğru bir şekilde hazır olduğunda, ancak, TEM örnek'ın ultrastructure herhangi bir ışık microscopical tekniklerle üretilen görüntüleri ile karşılaştırıldığında üstün kalite görüntülerdir. Rahimde iletim tekniği enjekte birimi ve enjeksiyon topografik bölge sınırlıdır. Tartışmasız, teknik erken gelişimsel tedavi ve konjenital neuropathological hastalıkların kurtarma güçlü bir translasyonel tıbbi potansiyele sahiptir. Ayrıca, rahimde iletim TEM ile mevcut kombinasyonu sadece Konjenital hastalıklar gelecekteki tedavisi için aynı zamanda yüksek kaliteli ultrastructure tabanlı nörogelişimsel tanılama bir yaklaşım olarak kabul.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar meslektaşları hayvan tesisi Tıp Fakültesi, Bochum Ruhr Üniversitesi, onların desteği ve hayvan bakımı için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol Serva 36975
26 G x 1'' needle Henke-Sass, Wolf GmbH
410 Anaesthesia Unit for air pump Biomedical Instruments (Univentor) 8323102
Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) UKE (Viral Core Facility) - For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54.
Agarose Sigma-Aldrich A9414 low gelling agarose
Air Pump Biomedical Instruments (Univentor) Eheim 100
Araldite CIBA-GEIGY 23857.9 resin for embedding of tissue
aspirator tune assemblies Sigma-Aldrich A5177-5EA
Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium Biomedical Instruments (Univentor) -
buprenorphine Temgesic ampules painkiller
capillaries Science-Products GB100TF-10 with fillament
Dodecenylsuccinic anhydride Fluka 44160
Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) FST 11203-23
electric shaver Phillips -
Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) Ethicon - polyamide
eye lubricant Bepanthene -
Fast Green Sigma-Aldrich F7252 for visualization of injected liquids
Gas Routing Switch 4/2 connectors Biomedical Instruments (Univentor) 8433020
halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) FST 13011-12
Heparin-Natrium Ratiopharm 25 000 I.E./5 mL
Induction box for mice
with horizontally moving lid.
Inner dimensions: LxBxH: 155 mm x 115 mm x 130 mm.
Wall thickness: 6 mm
Biomedical Instruments (Univentor) -
iris forceps (10 cm, curved, serrated) FST 14007-14
iris scissors (11 cm, straight, tungsten carbide) FST 14501-14
Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm
Outer dimensions: 257mm x110 mm x 18 mm.
Heating area: 190 mm x 90 mm
The removal of the isoflurane escaping
the breathing mask is downwards in compliance with the
regulations
Biomedical Instruments (Univentor) -
isoflurane (Attane) JD medical inhalation anesthesia
LED RGB lights Cameo CLQS15RGBW LEDs 2 x 15 W
Light microscope Basic DM E Leica - 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives
micropipette puller Science-Products P-97
Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, curved) FST 13010-12
Nickel grids, 200 mesh Ted Pella 1GC200
Osmium (VIII)-oxid Degussa 73219
Propylene oxide Fluka 82320
razor blades Schick 87-10489
Sodium pentobarbital (Narcoren) Merial GmbH -
TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback Biomedical Instruments (Univentor) -
Technovit 4004 two components glue Kulzer
Telemacrodevice Canon - Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand.
Thermopuller P-97 Sutter Instruments -
thin vibrating razor blade device Krup - with Szabo thin blades
toluidine blue Sigma-Aldrich 89640
Transmission electron microscope C20 Phillips - up to 200 kV
Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts
Outer diameter: 6 mm
Inner diameter: 4 mm
Wa
ll thickness: 1 mm
Biomedical Instruments (Univentor) -
Ultracut E Reichert-Jung - ultramicrotome
Univentor Scavenger Biomedical Instruments (Univentor) 8338001
Vannas scissors (8 cm, straight) FST 15009-08

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers. Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).
  2. Hamlyn, L. H. The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit. Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).
  3. Peters, A., Palay, S., Webster, H. The Fine Structure of the Nervous System. Oxford University Press. Oxford, UK. (1991).
  4. Rollenhagen, A., et al. Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses. Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).
  5. Lutz, D., et al. Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival. Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).
  6. Lutz, D., et al. Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury. Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).
  7. Kraus, K., et al. A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination. Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).
  8. Andres, K. H., von Düring, M. Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung. Mikroskopie. 30, 139 (1974).
  9. Andres, K. H., von Düring, M. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. Hayat, M. A. Van Norstrand Reinhild. 246-261 (1997).
  10. Andres, K. H., von Düring, M. General Methods for Characterization of Brain Regions. Techniques in Neuroanatomical Research. Heym, C., Forssmann, W. -G. Springer-Verlag. Berlin, Germany. 100-108 (1981).
  11. Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).
  12. Webster, H. F., Collins, G. H. Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).
  13. Andres, K. H. Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern. Mikroskopie. 21, 169 (1967).
  14. Forssmann, W. G., et al. Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation. Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).
  15. Descarries, L., Schröder, J. M. Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit. Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).
  16. Langford, L. A., Coggeshall, R. E. The use of potassium ferricyanide in neural fixation. Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).
  17. Liu, J., et al. Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex. Molecular Brain. 7, 84 (2014).
  18. Lee, S. H., et al. Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway. Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).
  19. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. Suppl 1 120-125 (2009).
  20. dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
  21. Nishiyama, J., et al. Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation. European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).
  22. Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo. Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).
Sonra Ultrastructural nöroplastisite parametrelerinde Utero iletim gelişmekte olan fare beyin ve omurilik değerlendirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lutz, D., von Düring, M., Corvace, F., Augustinowski, L., Trampe, A. K., Nowak, M., Förster, E. Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord. J. Vis. Exp. (144), e59084, doi:10.3791/59084 (2019).More

Lutz, D., von Düring, M., Corvace, F., Augustinowski, L., Trampe, A. K., Nowak, M., Förster, E. Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord. J. Vis. Exp. (144), e59084, doi:10.3791/59084 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter