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Genetics

CRISPR-Cas का उपयोग करके Mammalian कक्ष लाइनों में जीनोम संपादन

Published: April 11, 2019 doi: 10.3791/59086
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2
1Genome Institute of Singapore, Agency for Science Technology and Research, 2School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

Summary

CRISPR-Cas पौधों और जानवरों के जटिल जीनोम को इंजीनियर करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है । यहां, हम विस्तार से एक प्रोटोकॉल के लिए कुशलतापूर्वक अलग कैस endonucleases का उपयोग कर मानव जीनोम संपादित करें । हम संपादन दक्षता का अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण विचार और डिजाइन मापदंडों पर प्रकाश डाला ।

Abstract

संकुल नियमित रूप से interspaced लघु palindromic दोहराता (CRISPR) प्रणाली बैक्टीरियल अनुकूली प्रतिरक्षा में स्वाभाविक रूप से कार्य करता है, लेकिन सफलतापूर्वक कई अलग रहने वाले जीवों में जीनोम इंजीनियरिंग के लिए repurposed किया गया है । सबसे अधिक, से जुड़े वाइल्डटाइप CRISPR 9 (Cas9) या Cas12a endonuclease जीनोम में विशिष्ट साइटों को सट करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जिसके बाद डीएनए डबल-असहाय तोड़ गैर-समजातीय अंत में शामिल होने के माध्यम से मरंमत की है (NHEJ) मार्ग या homology-निर्देशित मरंमत ( HDR) मार्ग पर निर्भर करता है कि क्या एक दाता टेंपलेट अनुपस्थित या वर्तमान में क्रमशः है । तारीख करने के लिए, विभिंन जीवाणु प्रजातियों से crispr सिस्टम को स्तनधारी कोशिकाओं में जीनोम संपादन प्रदर्शन करने में सक्षम होना दिखाया गया है । हालांकि, प्रौद्योगिकी के स्पष्ट सादगी के बावजूद, कई डिजाइन मापदंडों पर विचार किया जा करने की जरूरत है, जो अक्सर कैसे सबसे अच्छा अपने जीनोम संपादन प्रयोगों को पूरा करने के बारे में उलझन में उपयोगकर्ताओं को छोड़ दें । यहां, हम प्रयोगात्मक डिजाइन से सेल क्लोन की पहचान करने के लिए एक पूर्ण कार्यप्रवाह का वर्णन है कि वांछित डीएनए संशोधनों ले, स्तनधारी सेल लाइनों में जीनोम संपादन प्रयोगों के सफल निष्पादन को सुविधाजनक बनाने के लक्ष्य के साथ । हम उपयोगकर्ताओं के लिए कुंजी विचार पर प्रकाश डाला CRISPR प्रणाली, स्पेसर लंबाई, और एक एकल-असहाय ओलिगोडिऑक्सिन्यूकोटाइड (ssODN) दाता टेंपलेट के डिजाइन के विकल्प सहित, का ध्यान रखना । हम कल्पना करते है कि इस कार्यप्रवाह जीन पीटकर अध्ययन, रोग मॉडलिंग के प्रयासों, या रिपोर्टर सेल लाइनों की पीढ़ी के लिए उपयोगी हो जाएगा ।

Introduction

किसी भी जीवित जीव के जीनोम इंजीनियर करने की क्षमता कई जैव चिकित्सा और जैव प्रौद्योगिकीय अनुप्रयोगों, जैसे रोग के सुधार के रूप में परिवर्तन, रोग अध्ययन के लिए सटीक सेलुलर मॉडल के निर्माण, या कृषि के उत्पादन वांछित लक्षण के साथ फसलों । सदी की बारी के बाद से, स्तनधारी कोशिकाओं में जीनोम इंजीनियरिंग के लिए विभिन्न प्रौद्योगिकियों का विकास किया गया है, जिनमें मेगान्यूक्लीसिस1,2,3, जिंक फिंगर न्यूक्लिसेस4,5, या प्रतिलेखन उत्प्रेरक-जैसे अमोघ नाभिकों (टैलेंस)6,7,8,9. हालांकि, इन पहले प्रौद्योगिकियों या तो कार्यक्रम के लिए मुश्किल है या इकट्ठा करना कठिन है, जिससे अनुसंधान और उद्योग में अपने व्यापक अपनाने बाधा ।

हाल के वर्षों में, संकुल नियमित रूप से interspaced लघु palindromic दोहराता (CRISPR)-CRISPR-एसोसिएटेड (कैस) प्रणाली एक शक्तिशाली नए जीनोम इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकी10,11के रूप में उभरा है । मूल रूप से बैक्टीरिया में एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली, यह सफलतापूर्वक पौधों और जानवरों, मनुष्यों सहित में जीनोम संशोधन के लिए तैनात किया गया है । एक प्राथमिक कारण CRISPR-कैस इतने कम समय में इतनी लोकप्रियता प्राप्त की है कि तत्व है कि Cas9 या Cas12a (भी Cpf1 के रूप में जाना जाता है) के रूप में महत्वपूर्ण कैस endonuclease, लाता है, जीनोम में सही स्थान के लिए बस चिमेरिक एकल गाइड का एक छोटा टुकड़ा है RN एक (sgRNA), जो डिजाइन और सस्ते synthesize करने के लिए सीधा है । लक्ष्य स्थल पर भर्ती होने के बाद, कैस एंजाइम आणविक कैंची और cleaves की एक जोड़ी के रूप में कार्य करता है अपने ruvc, hnh, या nuc डोमेन12,13,14के साथ बंधे डीएनए । परिणामस्वरूप डबल फंसे तोड़ (DSB) बाद में या तो गैर-समजातीय अंत में शामिल होने (NHEJ) या homology-निर्देशित मरंमत (HDR) मार्ग के माध्यम से कोशिकाओं द्वारा मरंमत की है । एक मरंमत टेम्पलेट के अभाव में, DSB त्रुटि-प्रवण NHEJ मार्ग द्वारा सुधारा गया है, जो कटौती साइट पर छद्म यादृच्छिक प्रविष्टि या न्यूक्लियोटिडों (indels) के विलोपन को जंम दे सकता है, संभवतः प्रोटीन-कोडिंग जीन में frameshift म्यूटेशन के कारण । हालांकि, एक दाता टेंपलेट है कि वांछित डीएनए परिवर्तन शामिल की उपस्थिति में, DSB उच्च निष्ठा HDR मार्ग द्वारा मरंमत की है । दाता टेम्पलेट्स के आम प्रकार एकल-कतरा हुआ oligonuक्लिओटाइड्स (ssODNs) और plasmids शामिल हैं । पूर्व आम तौर पर अगर इरादा डीएनए परिवर्तन (उदाहरण के लिए, एक एकल आधार जोड़ी के परिवर्तन) छोटे है प्रयोग किया जाता है, जबकि बाद आम तौर पर अगर एक एक अपेक्षाकृत लंबे अनुक्रम (उदाहरण के लिए, एक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के कोडन अनुक्रम डालने की इच्छा है प्रयोग किया जाता है जीएफपी) लक्ष्य लोकस में ।

कैस प्रोटीन की एंडोन्यूक्लिएज गतिविधि के लिए लक्ष्य स्थल15पर एक प्रोटोस्पेसर सटी आकृति (पाम) की उपस्थिति की आवश्यकता होती है । Cas9 का पाम protospacer के 3 ' अंत में है, जबकि Cas12a के पाम (भी Cpf1 कहा जाता है) 5 ' अंत में16के बजाय है । कैस-गाइड आरएनए परिसर में एक DSB पेश करने में असमर्थ है अगर पाम अनुपस्थित है17। अतः पाम उन जीनोमिक स्थानों पर एक बाधा रखता है जहाँ एक विशेष कैस नाभिक सट कर आ जाता है । सौभाग्य से, विभिन्न जीवाणु प्रजातियों से कैस नाभिक आमतौर पर विभिन्न पाम आवश्यकताओं का प्रदर्शन. इसलिए, हमारे इंजीनियरिंग toolbox में विभिन्न CRISPR-Cas सिस्टम को एकीकृत करके, हम एक जीनोम में लक्षित किया जा सकता है कि साइटों की सीमा का विस्तार कर सकते हैं । इसके अलावा, एक प्राकृतिक कैस एंजाइम इंजीनियर या वैकल्पिक पाम दृश्यों को पहचानने के लिए विकसित किया जा सकता है, और अधिक हेरफेर करने के लिए सुलभ जीनोमिक लक्ष्यों की गुंजाइश को चौड़ा करने18,19,20।

हालांकि कई CRISPR-कैस सिस्टम जीनोम इंजीनियरिंग प्रयोजनों के लिए उपलब्ध हैं, प्रौद्योगिकी के अधिकांश उपयोगकर्ताओं को Cas9 nuclease पर मुख्य रूप से कई कारणों के लिए स्ट्रेप्टोकोकस pyogenes (SpCas9) से भरोसा किया है । सबसे पहले, यह एक अपेक्षाकृत बस NGG पाम की आवश्यकता है, कई अंय कैस प्रोटीन के विपरीत है कि केवल अधिक जटिल PAMs की उपस्थिति में सट कर सकते हैं । दूसरा, यह मानव कोशिकाओं21,22,23,24में सफलतापूर्वक तैनात किया जाने वाला पहला कैस एंडोन्यूक्लिएज है । तीसरा, SpCas9 अब तक की तारीख को सबसे अच्छी विशेषता एंजाइम है । यदि एक शोधकर्ता एक और कैस nuclease का उपयोग करना चाहता है, वह या वह अक्सर कैसे सबसे अच्छा प्रयोग डिजाइन और कितनी अच्छी तरह अंय एंजाइमों अलग जैविक संदर्भों में SpCas9 की तुलना में प्रदर्शन करेंगे के बारे में स्पष्ट नहीं होगा ।

अलग CRISPR-Cas सिस्टम के सापेक्ष प्रदर्शन के लिए स्पष्टता प्रदान करने के लिए, हम हाल ही में पांच Cas endonucleases की एक व्यवस्थित तुलना प्रदर्शन किया है – SpCas9, Staphylococcus औरेअस से Cas9 एंजाइम (SaCas9), Cas9 एंजाइम से नेइससेरिया मेनिनगिटिडिस (NmCas9), एसिडमिनोकोकस एसपी. BV3L6 (AsCas12a) से Cas12a एंजाइम, और लच्नोस्पाइरेसी बैक्टीरियम Cas12a (ND2006)25से LbCas12a एंजाइम । एक निष्पक्ष तुलना के लिए, हम विभिंन कैस नाभिक लक्ष्य साइटों और अंय प्रायोगिक शर्तों के एक ही सेट का उपयोग कर मूल्यांकन किया । अध्ययन में प्रत्येक CRISPR-Cas प्रणाली के लिए डिजाइन पैरामीटरों को भी चित्रित किया गया है, जो प्रौद्योगिकी के प्रयोक्ताओं के लिए उपयोगी संदर्भ के रूप में कार्य करेगा । यहां, बेहतर शोधकर्ताओं CRISPR-कैस प्रणाली का उपयोग करने के लिए सक्षम करने के लिए, हम अलग Cas9 और Cas12a एंजाइमों के साथ इष्टतम जीनोम इंजीनियरिंग के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान ( चित्रा 1देखें) । प्रोटोकॉल न केवल प्रयोगात्मक विवरण पर भी महत्वपूर्ण डिजाइन विचार शामिल स्तनधारी कोशिकाओं में एक सफल जीनोम इंजीनियरिंग परिणाम की संभावना को अधिकतम करने के लिए ।

Figure 1
चित्रा 1 : जीनोम संपादित मानव कोशिका रेखाएँ उत्पन्न करने के लिए कार्यप्रवाह का अवलोकन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Protocol

1. sgRNAs के डिजाइन

  1. एक उपयुक्त CRISPR-Cas सिस्टम का चयन करें ।
    1. सबसे पहले, सभी Cas9 और Cas12a नाभिक कि स्तनधारी कोशिकाओं16, 21-32में कार्यात्मक होना दिखाया गया है की पाम दृश्यों के लिए लक्ष्य क्षेत्र का निरीक्षण किया । पांच अक्सर इस्तेमाल किया एंजाइम उनके संबंधित PAMs के साथ तालिका 1 में दिया जाता है ।
      नोट: तालिका 1में सूचीबद्ध एंडोन्यूक्लिसेस के अलावा, अन्य कम सामान्यतः प्रयुक्त कैस एंजाइमों कि सफलतापूर्वक स्तनधारी कोशिकाओं में भी तैनात किया गया है, जैसे स्ट्रेप्टोकोकस थर्मोफिलस (St1Cas9) से एक Cas9 nuclease के रूप में है कि पाम NNAGAAW पहचानता है । यदि वांछित लक्ष्य साइट एक ज्ञात पाम शामिल नहीं है, तो एक CRISPR-जीनोम इंजीनियरिंग के लिए कैस प्रणाली का उपयोग करने में सक्षम नहीं होगा ।
    2. दूसरा, लक्ष्य जीनोमिक लोकस या जीन के किसी भी ज्ञात गुणों पर विचार करें । कुछ गुणों को ध्यान में रखना जीन अभिव्यक्ति का स्तर या क्रोमेटिन पहुंच शामिल है और क्या वहां अंय बारीकी से संबंधित दृश्यों के रूप में अच्छी तरह से कर रहे हैं ।
      नोट: कुछ एंजाइम विशेष जैविक संदर्भों के लिए बेहतर अनुकूल होते हैं । उदाहरण के लिए, एक दोहराव जीनोमिक लोकस या एक जीन कई अन्य बंद paralogs के साथ संपादित करने के लिए, यह या तो AsCas12a का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है (sgRNA और SpCas9 और LbCas12a से लक्ष्य डीएनए के बीच बेमेल के लिए अपनी कम सहिष्णुता के कारण) या SaCas9 (इसके कारण अधिक लक्ष्यीकरण विशिष्टता प्रदान करता है जो लंबे समय तक spacers, के लिए आवश्यकता)25.
कैस एंडोन्यूक्लिएज पाम अनुकूलतम स्पेसर लंबाई
SpCas9 NGG 17-22 nt इंफॉर्मेशन
SaCas9 NNGRRT ≥ 21 nt
NmCas9 NNNGATT ≥ 19 nt
AsCas12a और LbCas12a TTTV ≥ 19 nt

तालिका 1: कुछ सामांयतः अपने सजाना PAMs और इष्टतम sgRNA लंबाई के साथ कैस एंजाइमों का इस्तेमाल किया । द = किसी भी न्यूक्लियोटाइड (ए, टी, जी, या सी); R = A या G; वी = ए, सी, या जी.

  1. एक उपयुक्त स्पेसर अनुक्रम का चयन करें । के रूप में अद्वितीय एक अनुक्रम की पहचान के रूप में बंद लक्ष्य दरार घटनाओं के जोखिम को कम करने के लिए, या तो विस्फोट३३ के साथ लक्ष्य जीनोम का परीक्षण करके या कई स्वतंत्र रूप से उपलब्ध ऑनलाइन उपकरण का उपयोग करके, जैसे: (क) फेंग जांग प्रयोगशाला से कार्यक्रम३४ (http://crispr.mit.edu/); (ख) चॉपकाटना३५ (http://chopchop.cbu.uib.no/); (ग) ई-नपा३६ (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/); (d) CRISPOR३७ (http://crispor.tefor.net/); (ङ) कैस-ऑफइंदर३८ (http://www.rgenome.net/cas-offinder/) ।
    नोट: स्पेसर की इष्टतम लंबाई 17 से 25 न्यूक्लियोटिडेस (nt) समावेशी से भिन्न हो सकती है, जिसके आधार पर कैस एंजाइम का प्रयोग किया जाता है ( सारणी 1देखें) । Cas9 के लिए, स्पेसर पाम के ऊपर है, जबकि Cas12a के लिए, स्पेसर पाम के बहाव है । साथ ही, HDR दक्षता कटौती साइट से दूरी बढ़ाने के साथ तेजी से गिरता है । इसलिए, सटीक डीएनए संपादन के लिए, इच्छित संशोधन साइट के लिए संभव के रूप में बंद sgRNA स्थिति ।
  2. प्रयोग किया जा रहा है कि crispr प्लाज्मिड के लिए उपयुक्त overhangs के साथ डीएनए ओलिगोन्यूक्लिओटिडेस synthesize.
    1. स्पेसर के सामने एक जी न्यूक्लिओटाइड जोड़ें अगर गाइड की पहली स्थिति नहीं है एक जी. स्पेसर के रिवर्स पूरक अनुक्रम का निर्धारण. क्लोनिंग प्रयोजनों के लिए आवश्यक overhangs में जोड़ें ।
      नोट: उदाहरण के रूप में, हमारे मूल्यांकन अध्ययन25में प्रयुक्त प्लाज़्मीड्स के लिए, संश्लेषित किए जाने वाले ओलिगोन्यूक्लिओटिड्स को सारणी 2में दर्शाया गया है । यदि आवश्यक हो, तो एक मार्गदर्शिका के रूप में चित्रा 2 में दिए गए उदाहरण का उपयोग करें । कई CRISPR plasmids वाणिज्यिक स्रोतों से उपलब्ध हैं (उदा., Addgene) । कुछ और अधिक लोकप्रिय plasmids सामग्री की मेजमें दिए गए हैं ।
CRISPR Plasmid अनुक्रम
pSpCas9 और pSaCas9 भाव: 5 '-CACC (G) NNNNNNNNNNNN-3 '
एंटीसेंस: 3 '-(C) '-' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' '
pNmCas9 भाव: 5 '-CACC (G) NNNNNNNNNNNN-3 '
एंटीसेंस: 3 '-(C) ' '-(ग) ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' '
pAsCas12a और pLbCas12a इंद्रिय: 5 '-AGATNNNNN ' '-3 ' '-इस प्रकार से
एंटीसेंस: 3 '-'-NNNN ' n ' a '-5 '-2 ' '

तालिका 2: एक हाल के मूल्यांकन अध्ययन25में इस्तेमाल किया crispr Plasmids में sgrna दृश्यों क्लोनिंग के लिए आवश्यक Oligonucleotides. ओवरहैंग इटैलिक हैं ।

Figure 2
चित्रा 2 : कैसे CRISPR plasmids में क्लोनिंग के लिए लक्ष्य साइटों और डिजाइन oligonucleotides का चयन करने के लिए illustrating उदाहरण । लक्ष्य जीनोमिक यहां लोकस मानव CACNA1D जीन के एक्सॉन ४५ है । SpCas9 और SaCas9 के लिए PAMs क्रमशः NGG और NNGRRT है और लाल रंग में हाइलाइट किए जाते हैं, जबकि AsCas12a और LbCas12a के लिए पाम TTTN है और हरे रंग में हाइलाइट किया गया है । लाल क्षैतिज पट्टी SpCas9 और SaCas9 के लिए protospacer इंगित करता है, जबकि हरी क्षैतिज पट्टी दो Cas12a एंजाइमों के लिए protospacer इंगित करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

2. एक रीढ़ सदिश में ओलिगोन्यूक्लिओटिडेस की क्लोनिंग

  1. फॉस्फायलेट और एनेयल सेन्स और एंटीसेन्स ओलिगोन्यूक्लिओटिड्स.
    1. यदि ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स lyophilized हैं, तो उंहें tris में एक १०० μM एकाग्रता के लिए resuspend-एथिलिनेडिएमीनेटेट्राएसिटिक एसिड (EDTA) (ते बफर, सामग्री की मेजदेखें) या ddh2O ।
    2. एक 10 μL प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें जिसमें 1 μL नब्ज ओलिजोन्यूक्लिओटाइड, 1 μL एंटीसेंस ओलिगोन्यूक्लिओटाइड, T4 डीएनए लीगज़ बफर (10x) का 1 μl, T4 पॉलीन्यूक्लीयोटाइड किन्से (PNK) का 1 μl, और ddH2O के 6 μl को पिख्ता करके अच्छी तरह मिक्स करें और एक थर्मल cy में रिएक्शन मिक्स प्लेस कलेर निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग: ३७ ° c के लिए 30 मिनट, ९५ ° c के लिए 5 मिनट, और रैंप पर नीचे 25 ° c पर 6 ° c/
    3. रिएक्शन मिक्स 1:100 ddH2o में पतला (उदाहरण के लिए, 2 μl प्रतिक्रिया मिश्रण + १९८ Μl ddh2ओ) ।

Figure 3
चित्रा 3 : एक CRISPR plasmid का एक उदाहरण है । (क) प्लाज्मिड की विभिन्न महत्वपूर्ण विशेषताओं को दर्शाने वाला मानचित्र । यहां, EF-1a प्रमोटर Cas9 की अभिव्यक्ति चलाता है, जबकि U6 प्रमोटर sgRNA की अभिव्यक्ति चलाता है । Amp (R) plasmid में एक एम्पीसिलीन प्रतिरोध जीन इंगित करता है । (ख) प्लाज्मिड में बीबीएसआई-बीपीएलआई क्लोनिंग साइट का अनुक्रम । BbsI की मांयता अनुक्रम GAAGAC है और लाल रंग में दर्शाया गया है, जबकि BplI की मांयता अनुक्रम GAG-N5-सीटीसी है और हरे रंग में दर्शाया गया है । (ग) कॉलोनी पीसीआर के लिए ऐसे प्राइमरों का उपयोग किया जा सकता है जिन्हें यह जांचने के लिए कि क्या sgRNA अनुक्रम को प्लाज्मिड में सफलतापूर्वक क्लोन किया गया है । HU6_forward प्राइमर प्लाज्मिड नक्शे पर एक बैंगनी तीर द्वारा संकेत दिया है, जबकि यूनिवर्सल M13R (-20) प्राइमर प्लाज्मिड नक्शे पर एक गुलाबी तीर द्वारा संकेत दिया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. एक उपयुक्त प्रतिबंध एंजाइम के साथ crispr प्लाज्मिड पचा ।
    नोट: sgRNAs की क्लोनिंग आमतौर पर प्रकार IIs प्रतिबंध एंजाइमों के साथ गोल्डन गेट असेंबली पर निर्भर करते हैं । विभिंन एंजाइमों अलग CRISPR plasmids के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । PSpCas9 के लिए, BbsI या BplI का उपयोग करें ( चित्र 3देखें). PSaCas9, pNmCas9, pAsCas12a और pLbCas12a के लिए, BsmBI का उपयोग करें.
    1. परिपत्र प्लाज्मिड वेक्टर के 1 μg, बफर के 2 μl (10x), प्रतिबंध एंजाइम के 1 μl (जैसे, bbsi, bpli, या bpli), और ddh2ओ से युक्त एक 20 μl प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार 20 μl की एक अंतिम मात्रा के लिए ३७ ° c पर प्रतिक्रिया सेते २.५ एच ।
    2. प्रतिक्रिया करने के लिए चिंराट alkaline फॉस्फेट (एसएपी) के 1 μL जोड़ें, और एक और 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते ।
    3. 6x डीएनए लोडिंग डाई के 5 μL जोड़कर प्रतिक्रिया बुझाने ( सामग्री की मेजदेखें), अच्छी तरह से मिक्स, और 1x tris-एसीटेट-edta (ताे) बफर के साथ एक ०.८% एग्रोस जेल पर प्रतिक्रिया का समाधान । फिर, सही बैंड आबकारी और जेल अर्थवान वेक्टर शुद्ध करने के लिए आगे बढ़ना ।
  2. एनेलिएट ऑलिगोन्यूक्लिओटिड्स को पच CRISPR प्लाज्मिड में लाइजेट कर लीजिये ।
    1. एक 10 μl रिएक्शन मिक्स तैयार: ५० के एनजी अर्थवान वेक्टर, 1 μl पतला annealed oligonucleotides, t4 डीएनए ligase बफर (10x) के 1 μl, t4 डीएनए ligase के 1 μl, और ddh2O 10 μl की एक अंतिम खंड के लिए ( सामग्री की मेजदेखें) । 2 ज के लिए रात में या कमरे के तापमान पर 16 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया सेते ।
      नोट: बंधाव प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए, केंद्रित T4 डीएनए बंधाव का उपयोग करें और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया मिश्रण सेते ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  3. रासायनिक सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं में ligated उत्पादों को बदलने ( अनुपूरक फ़ाइल देखें 1) । १०० μg/मिलीलीटर एम्पीसिलीन के साथ एक पौंड आगर प्लेट पर रूपांतरित जीवाणु कोशिकाओं को फैलाएं ।
  4. डालने के साथ बैक्टीरिया की पहचान करने के लिए कॉलोनी पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) प्रदर्शन करते हैं ।
    1. बाँझ पीसीआर पट्टी ट्यूबों के दो सेट तैयार करते हैं । सेट 1 में, ddh2ओ के ४.७ μl जोड़ें, जबकि सेट 2 में, उपयुक्त एंटीबायोटिक के साथ पौंड शोरबा के ५० μl जोड़ें (जैसे, १०० μg/एमएल एम्पीसिलीन) ।
    2. एक बाँझ पिपेट टिप के साथ, थाली से एक कॉलोनी उठाओ, यह एक सेट 1 ट्यूब में संक्षेप में स्वाइप, और एक सेट 2 ट्यूब में टिप छोड़ दें । कुछ कालोनियों के लिए दोहराएं, हर बार अलग पीसीआर ट्यूबों का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित कर ।
      नोट: आमतौर पर, चार कालोनियों स्क्रीनिंग पर्याप्त है । हालांकि, यह क्लोनिंग दक्षता के आधार पर भिंन हो सकते हैं ।
    3. प्रत्येक सेट के लिए निम्नलिखित अभिकर्मकों जोड़ें 1 ट्यूब (एक 10 μl पीसीआर के लिए): 2x पीसीआर मास्टर मिक्स के 5 μl (लोड हो रहा है डाई के साथ, सामग्री की मेजदेखें), ०.१५ μl भावना या antisense ओलिगोन्यूक्लिओटाइड (१०० μm), प्राइमर के ०.१५ μl (१०० μm) crispr प्लाज्मिड बहाव या ऊपर को लक्षित sgRNA कैसेट की धारा क्रमशः ( चित्रा 3देखें) ।
      नोट: पीसीआर उत्पाद आदर्श लगभग १५० बीपी या बड़ा के एक उत्पाद का आकार उपज चाहिए, ताकि किसी भी सकारात्मक बैंड प्राइमरी dimers के रूप में गलत नहीं कर रहे हैं ।
    4. निंनलिखित मापदंडों का उपयोग कर एक थर्मल cycler में PCRs भागो: 30 s (चरण 2), 30 एस के लिए ६० डिग्री सेल्सियस (चरण 3), 30 एस के लिए ७२ डिग्री सेल्सियस (चरण 4), के लिए ९५ ° c 3 मिनट के लिए, एक और ३४ चक्र के लिए कदम 2 \ u20124, 5 मिनट के लिए ७२ डिग्री सेल्सियस , और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो ।
      नोट: ६० डिग्री सेल्सियस के अनीलन तापमान डिजाइन प्राइमरों के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है । 30 s के बढ़ाव समय भी अपेक्षित पीसीआर amplicon आकार और डीएनए पोलीमरेज़ इस्तेमाल के आधार पर भिंन हो सकते हैं ।
    5. 1% ऐगेरोस जेल 1x TAE बफर का उपयोग पर प्रतिक्रियाओं का समाधान ।
    6. एक कॉलोनी है कि एक उचित एंटीबायोटिक के साथ 5 मिलीलीटर पौंड युक्त एक बड़ा शंकु ट्यूब में इसी सेट 2 ट्यूब से अपनी संस्कृति के ५० μL स्थानांतरित द्वारा पीसीआर में एक सकारात्मक बैंड पैदावार Inoculate । चलो संस्कृति एक ३७ ° c इनसेबटर में रातोंरात विकसित-शेखर ।
    7. रातोंरात एक miniprep किट का उपयोग कर संस्कृति से plasmids को अलग ( सामग्री की मेजदेखें) और अनुक्रम कॉलोनी पीसीआर प्राइमर का उपयोग कर नमूना है कि भावना या antisense ओलिगोन्यूक्लिओटाइड नहीं है (HU6_FORWARD या M13R (-20) चित्रा 3में) ।
      नोट: यदि आवश्यक हो, अनुक्रम-सत्यापित crispr प्लाज्मिड के लिए डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए एक बड़ी राशि प्राप्त करने के लिए एक maxiprep निष्पादित करें ।

3. डिजाइन और मरंमत के संश्लेषण टेंपलेट्स

नोट: प्रेसिजन जीनोम इंजीनियरिंग के लिए, एक वांछित डीएनए संशोधनों को निर्दिष्ट टेम्पलेट CRISPR अभिकर्मकों के साथ एक साथ उपलब्ध कराए जाने की जरूरत है । एक एकल न्यूक्लियोटाइड के परिवर्तन के रूप में छोटे डीएनए संपादन के लिए, ssODN दाता टेम्पलेट्स सबसे उपयुक्त हैं (अनुभाग ३.१ देखें). एक विशेष प्रोटीन कोडन जीन के एक gfp टैग 5 ' या 3 ' की प्रविष्टि के रूप में बड़ा डीएनए संपादन के लिए, प्लाज्मिड दाता टेम्पलेट्स सबसे उपयुक्त हैं (अनुभाग ३.२ देखें).

  1. डिजाइन और एक ssODN दाता टेंपलेट synthesize ( चित्र 4देखें) ।
    1. सही किनारा जिसका अनुक्रम टेम्पलेट का पालन करना चाहिए निर्धारित करें ।
      नोट: Cas12a, जबकि Cas9 लक्ष्य strand अनुक्रम के ssODNs के लिए एक वरीयता दर्शाती गैर लक्ष्य कतरा अनुक्रम के ssODNs के लिए एक वरीयता दर्शाती है25 ( चित्रा 4एदेखें) ।
    2. सुनिश्चित करें कि सुधारे गए अनुक्रम चयनित Cas nuclease द्वारा फिर से लक्षित नहीं है । उदाहरण के लिए, इस तरह से है कि वहां कोई अमीनो एसिड परिवर्तन या अगर यह कोई कार्यात्मक परिणाम है दाता टेंपलेट से पाम को खत्म करने में पाम बदलना । यदि आवश्यक हो, तो एक मार्गदर्शिका के रूप में चित्र 4b में दिए गए उदाहरण का उपयोग करें ।
    3. तय अगर एक सममित या असममित दाता टेंपलेट वांछित है । सममित दानदाताओं के लिए, सुनिश्चित करें कि प्रत्येक समजातता शाखा डीएनए संशोधन साइट अगल बगल कम से कम 17 nt लंबे25है । असममित दाता टेम्पलेट्स के लिए, वांछित डीएनए परिवर्तन के अब हथियार 5 ′ का उपयोग करें ( चित्र 4एदेखें). महत्वपूर्ण बात, यह सुनिश्चित करें कि छोटे हाथ लंबाई में ३७ nt के आसपास है, जबकि अंय समजातता हाथ लंबाई में ७७ nt के आसपास है25,३९।
    4. डिज़ाइन किए गए टेम्पलेट को एकल-असहाय डीएनए के एक टुकड़े के रूप में संश्लेषी करते हैं.
      नोट: असममित ssODNs कर सकते हैं, लेकिन हमेशा नहीं, उच्च HDR दक्षता सममित ssODNs से दर्शाते हैं । सामांय में, एक असममित दाता आम तौर पर करता है के रूप में अच्छी तरह से एक सममित दाता, जब सही ढंग से डिजाइन किया । हालांकि, असममित टेम्पलेट लागत अधिक है, क्योंकि यह अब है और इसलिए polyacrylamide जेल ट्रो (पृष्ठ) शुद्धि या एक विशेष संश्लेषण प्रक्रिया की आवश्यकता है । दिनचर्या जीन knockouts आमतौर पर NHEJ मरंमत मार्ग पर भरोसा करते है और एक मरंमत टेंपलेट की आवश्यकता नहीं है । हालांकि, अगर पीटकर दक्षता कम है, डिजाइन एक ssodn दाता टेंपलेट है कि एक frameshift उत्परिवर्तन शामिल है और कम से १२० nt लंबाई में25,४०।

Figure 4
चित्रा 4 : SsODN दाता टेंपलेट्स के डिजाइन । (क) विभिन्न संभावित डिजाइनों को दर्शाने वाला योजनाबद्ध । लाल क्षैतिज आयत गैर-लक्ष्य (NT) किनारा इंगित करते हैं, जबकि नीले आयत लक्ष्य (T) किनारा इंगित करते हैं । इसके अलावा, छोटे हरे आयत वांछित डीएनए संशोधनों का संकेत (जैसे एकल न्यूक्लियोटाइड परिवर्तन) । जब एक सममित ssodn का उपयोग किया जाता है, प्रत्येक समजातता बांह की ंयूनतम लंबाई कम होना चाहिए 17 nt (लेकिन अब हो सकता है) । 77/37 NT Ssodns Cas12a-प्रेरित HDR के लिए इष्टतम करने के लिए प्रकट होता है, जबकि असममित ssODNs के लिए, 37/77 T Ssodns SpCas9-प्रेरित HDR के लिए इष्टतम होने के लिए प्रकट होता है । एल = वाम समजातता बांह; आर = सही समजातता बांह । (ख) ssODN टेम्पलेट डिज़ाइन करने के लिए कैसे प्रदर्शित करने के लिए एक विशिष्ट उदाहरण है । यहां, लक्ष्य जीनोमिक लोकस मानव CACNA1D जीन की एक्सॉन ४५ है । Cas9 के लिए पाम गुलाबी और रेखांकित है, जबकि Cas12a के लिए पाम ब्राउन और रेखांकित है । लक्ष्य के लिए एक missense उत्परिवर्तन (ग्रीन में प्रकाश डाला) AGU (एंकोडिंग serine) को AGU (एंकोडिंग arginine) को बदलने से बना है । Cas12a द्वारा पुनः लक्ष्यीकरण को रोकने के लिए, tttc पाम cttc को उत्परिवर्तित है । ध्यान दें कि एमिनो एसिड में कोई परिवर्तन नहीं है (UAU और UAC tyrosine के लिए दोनों कोड) । आगे Cas9 द्वारा पुनः लक्ष्यीकरण को रोकने के लिए, एक agu कोडोन एक ucc कोडोन (बोल्ड), दोनों के लिए जो कोड serine के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. डिजाइन और एक उपयुक्त प्लाज्मिड दाता टेंपलेट क्लोन । उदाहरण के लिए, यह एक GFP अनुक्रम लंबे हथियार है कि लक्ष्य जीनोमिक लोकस के लिए समजातीय है द्वारा flanked हो सकता है ( चित्रा 5देखें) ।
    1. सुनिश्चित करें कि संशोधित अनुक्रम चयनित Cas nuclease द्वारा फिर से लक्षित नहीं है । उदाहरण के लिए, प्रोटोस्पेसर को संमिलित (GFP) टैग द्वारा विभक्त किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, पाम उत्परिवर्तित किया जा सकता है या इस तरह से है कि जीन समारोह को प्रभावित नहीं करता में दाता टेंपलेट से हटा दिया ।
    2. पीसीआर का उपयोग कर जीनोमिक डीएनए से समजातता हथियार बढ़ाना । प्रत्येक समजातता बांह की लंबाई आम तौर पर १००० से १५०० बीपी है ।
      नोट: क्लोनिंग की सुविधा के लिए, यह सुनिश्चित करें कि बाईं समजातता बांह के लिए आगे प्राइमर और सही समजातता हाथ प्रत्येक के लिए रिवर्स प्राइमर एक चयनित वेक्टर रीढ़ की हड्डी के साथ एक से कम 20 nt अतिव्यापी अनुक्रम है । इसके अतिरिक्त, यह सुनिश्चित करें कि बाईं समजातता बांह के लिए रिवर्स प्राइमर और सही समजातता हाथ के लिए आगे की किताब के रूप में अच्छी तरह से epitope टैग के साथ कुछ अतिव्यापी दृश्यों है ।
    3. दो समजातता हथियार और (gfp) वेक्टर में gibson विधानसभा४१ का उपयोग कर बैकबोन टैग क्लोन ( सामग्री की मेजदेखें) । आगे और रिवर्स प्राइमरों है कि क्रमशः ऊपर और नीचे दाता टेंपलेट के बहाव कर रहे है का उपयोग कर संगर अनुक्रमण द्वारा प्लाज्मिड की जांच करें ।
      नोट: Sanger अनुक्रमण व्यापक रूप से और सस्ते में एक वाणिज्यिक सेवा के रूप में उपलब्ध है । एक सेवा प्रदाता को अनुक्रमण प्राइमरों के साथ एक साथ प्लाज्मिड के एक aliquot भेजें ।
    4. एक प्रतिबंध एंजाइम है कि प्लाज्मिड केवल एक बार छोड़ समजातता हाथ या सही समजातता बांह के बहाव के ऊपर या तो कटौती के साथ दाता टेम्पलेट linearize ।
      नोट: हाल ही में, एक डबल-कट दाता, जो sgrna-पाम दृश्यों द्वारा flanked है और इसी कैस nuclease द्वारा क्लीवेज के बाद प्लाज्मिड से जारी किया गया है, HDR दक्षता४२को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है । जब sgrna-पाम दृश्यों के ऊपर और बाईं और सही समजातता शस्त्र क्रमशः के बहाव डाला जाता है (उदाहरण के लिए गिब्सन विधानसभा द्वारा), समजातता हाथ लंबाई ३०० बीपी को कम किया जा सकता है और वहां कोई plasmid linearize की जरूरत है ।

Figure 5
चित्रा 5 : डिजाइन और एक प्लाज्मिड दाता टेंपलेट की क्लोनिंग । (क) इस विशिष्ट उदाहरण में लक्ष्य clta प्रोटीन के C-टर्मिनस के लिए P2A-gfp फ्यूज करने के लिए है । नीले क्षैतिज आयत बाईं समजातता हाथ इंगित करता है, जबकि लाल क्षैतिज आयत सही समजातता बांह इंगित करता है । कैपिटल अक्षर प्रोटीन-कोडिंग दृश्यों का संकेत देते हैं, जबकि लोअरकेस अक्षर नॉन-कोडिंग अनुक्रम दर्शाते हैं । SpCas9 और Cas12a के लिए PAMs इटैलिक और रेखांकित कर रहे हैं । (ख) एक प्लाज्मिड दाता टेम्पलेट जिसका उपयोग clta के ग-टर्मिनस पर P2A-gfp को अंतर्जात रूप से टैग करने के लिए किया जा सकता है । प्रदान की प्राइमर दृश्यों gibson विधानसभा द्वारा प्लाज्मिड क्लोन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । पीसीआर की स्थिति निम्नानुसार है: ९८ ° c के लिए 3 min, ९८ ° c के लिए 30 s (चरण 2), ६३ ° c के लिए 30 s (चरण 3), ७२ ° c के लिए 1 मिनट (चरण 4), दोहराएँ चरण 2 \ u20124 अन्य ३४ चक्र के लिए, ७२ ° c 3 मिनट के लिए, और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़. काले पत्र वेक्टर दृश्यों के अनुरूप, नीले पत्र बाईं समजातता हाथ के अनुरूप, हरे अक्षरों P2A-gfp के अनुरूप है, और लाल अक्षरों सही समजातता बांह के अनुरूप । ध्यान दें कि एक बार अनुक्रम कूटबंधन P2A-GFP सफलतापूर्वक लक्ष्य लोकस में एकीकृत है, SpCas9 द्वारा पुनः लक्ष्यीकरण संभव नहीं होगा, के बाद से केवल अपने protospacer के 9 nt (GTGCACCAG) को बरकरार रखा जाएगा । इसके अलावा, Cas12a द्वारा फिर से लक्षित करने को रोकने के लिए, तीन basepairs तुरंत स्टॉप कोडॉन के बहाव (बोल्ड में) प्लाज्मिड अनुक्रम से हटा दिया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

4. सेल ट्रांसफेक्शन

नोट: प्रोटोकॉल के शेष भाग HEK293T कक्षों के साथ मन में लिखे जाते हैं । इस्तेमाल किया संस्कृति मध्यम Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) ४.५ जी/एल ग्लूकोज, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 2 मिमी L-glutamine, और ०.१% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक शामिल हैं । प्रोटोकॉल के विभिंन चरणों के लिए वास्तविक सेल इस्तेमाल किया लाइन के अनुसार संशोधित किया जा सकता है । सभी सेल संस्कृति काम एक काम के माहौल को सुनिश्चित करने के लिए एक वर्ग द्वितीय Biosafety कैबिनेट में किया जाता है ।

  1. बीज १.८ x 105 कोशिकाओं में एक 24-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति थाली एक दिन से पहले transfection ।
    1. मीडिया aspirating द्वारा कोशिकाओं को अलग करना और फिर १५० μL ०.२५% Trypsin-EDTA अच्छी तरह से प्रति जोड़ने । 2 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते ।
    2. सेल संस्कृति मीडिया के १५० μl (या 1x मात्रा) जोड़कर ट्रिप् सिन बेअसर । सेल निलंबन एक शंकु ट्यूब के लिए स्थानांतरण । नीचे एक बेंच शीर्ष सेंट्रीफ्यूज में १००० x g पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं स्पिन ।
    3. Supernatant महाप्राण, और सेल संस्कृति मीडिया के 5 मिलीलीटर के साथ resuspend । एक अलग सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, ०.४% trypan ब्लू समाधान के 10 μL aliquot । फिर, चरण 4.1.2 से 10 μl सस्पेंड कोशिकाओं में जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण ।
    4. मिश्रण का पिपेट 10 μL (कोशिकाओं + trypan नीला) एक hemocytometer में । मैन्युअल रूप से या किसी स्वचालित कक्ष काउंटर का उपयोग करके कक्षों की गणना करने के लिए आगे बढ़ें.
    5. बीज १.८ x 105 कोशिकाओं में एक अच्छी तरह से एक 24-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति थाली ।
  2. एक अभिकर्मक मिश्रण तैयार करें या तो ५०० एनजी से युक्त crispr प्लाज्मिड के (nhej-mediated संपादन के लिए) या ३०० एनजी crispr प्लाज्मिड और ३०० के एनजी दाता टेम्पलेट (HDR-mediated संपादन के लिए), अभिकर्मक अभिकर्मक के साथ प्रदान किए गए निर्देशों के अनुसार (देखें सामग्री की तालिका) । अनुशंसित समय अवधि के लिए कमरे के तापमान पर सेते (आमतौर पर लगभग 10 \ u201220 min) ।
  3. एक बिंदुश: फैशन में कोशिकाओं को अभिकर्मक मिश्रण जोड़ें, और धीरे के बाद थाली भंवर ।
  4. ३७ डिग्री सेल्सियस पर (HDR-आधारित प्रयोगों के लिए) 24 एच (NHEJ-आधारित प्रयोगों के लिए) या ७२ एच के लिए 5% सह2 एयर इनकूबेटर में इनसेबेट ।

5. प्रतिदीप् ति सक्रिय कोशिका छंटाई (transfected कोशिकाओं के FACS)

  1. मीडिया aspirating द्वारा कोशिकाओं को अलग करना और फिर ०.२५% trypsin की १५० μL जोड़ने-EDTA प्रति अच्छी तरह से । 2 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते ।
  2. सेल संस्कृति मीडिया के १५० μl (या 1x मात्रा) जोड़कर ट्रिप् सिन बेअसर । सेल निलंबन एक अपकेंद्री ट्यूब के लिए स्थानांतरण । 5 मिनट के लिए २३५ x g पर एक microcentrifuge में कोशिकाओं को नीचे स्पिन ।
  3. Supernatant महाप्राण और फॉस्फेट में 2% भ्रूण बोवाइन सीरम (FBS) के साथ कोशिकाओं resuspend-buffered खारा (PBS) । एक 5 मिलीलीटर FACS ट्यूब में एक 30 μm मेष या सेल छलनी के माध्यम से कोशिकाओं को फिल्टर ।
  4. लगभग १०० μL संस्कृति मीडिया या कोशिकाओं के संग्रह के लिए पीबीएस में 2% FBS के साथ एक और अपकेंद्री ट्यूब तैयार करें ।
  5. प्रवाह cytometer पर, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में गैर transfected कोशिकाओं के साथ कोशिकाओं फाटक. सॉर्ट करें और transfected कोशिकाओं को इकट्ठा, जो प्रतिदीप्ति मार्कर crispr प्लाज्मिड इस्तेमाल पर मौजूद है के अनुसार । उदाहरण के लिए, यदि प्लाज्मिड एक mCherry जीन, RFP पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए क्रमबद्ध किया जाता है ।
    नोट: अलग CRISPR plasmids अलग चयन मार्कर होगा । Plasmids के सेट (pSpCas9, pSaCas9, pNmCas9, pAsCpf1, और pLbCpf1) इस मूल्यांकन अध्ययन में इस्तेमाल किया या तो नारंगी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (OFP) या mCherry जीन ले ।

6. व्यक्तिगत क्लोन का विस्तार

  1. सेंट्रीफ्यूज एक बेंच शीर्ष सेंट्रीफ्यूज में अधिकतम गति (१८,००० x g) के लिए 5 मिनट के लिए supernatant महाप्राण और ३०० μl संस्कृति मीडिया के साथ गोली resuspend में छांटे गए कक्ष । एक 24-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति थाली में बीज २०० μL कोशिकाओं और उंहें एक ३७ डिग्री सेल्सियस इनसेबेटर में कुछ दिनों के लिए ठीक हो । शेष १०० μL कोशिकाओं को धारा 7 के लिए रखें ।
  2. एक बार कोशिकाओं को संगामी बनने शुरू, उंहें कदम 4.1.1 के अनुसार पारित "u 20124.1.3 । बीज एक १०० मिमी ऊतक संस्कृति डिश में विरल कोशिकाओं को व्यक्तिगत कालोनियों के लिए पर्याप्त स्थान बढ़ने की अनुमति है । 5% सह2 एयर इनकूबेटर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनसेबेट ।
    नोट: विभिन्न कमजोरियां आज़माएं । एकल कोशिकाओं को व्यक्तिगत कालोनियों के रूप में विकसित करने के लिए पर्याप्त स्थान की जरूरत है । हालांकि, वे भी पीढ़ी विरल नहीं हो सकता, के रूप में कुछ सेल लाइनों अच्छी तरह से विकसित नहीं है जब कोशिकाओं की संख्या बहुत कुछ कर रहे हैं ।
  3. एक बार कालोनियों के लिए फार्म शुरू कर रहे हैं, उंहें खुर्दबीन के नीचे लेने (एक 4x इज़ाफ़ा के साथ) और एक 24-अच्छी तरह से थाली है कि सेल संस्कृति मीडिया शामिल है की एक व्यक्ति अच्छी तरह से प्रत्येक क्लोन जगह है । जब तक कोशिकाओं संगामी बन रहे हैं एक humidified 5% सह2 एयर इनकूबेटर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनसेबेट ।
    नोट: धारावाहिक dilutions और कॉलोनी चुनने के लिए एक विकल्प के प्रवाह cytometry का उपयोग करने के लिए एक ९६-well थाली में एकल कोशिकाओं के लिए तरह है । हालांकि, यह कुछ कक्ष रेखाओं के लिए कार्य नहीं कर सकता है जो केवल एक कक्ष मौजूद होने पर अच्छी तरह से नहीं बढ़ता है ।

7. संपादन दक्षता का मूल्यांकन

  1. शेष १०० μL छांटे गए कक्षों (चरण ६.१ से) अधिकतम गति पर एक बेंच शीर्ष सेंट्रीफ्यूज में (१८,००० x g) के लिए 5 मिनट के लिए द्वारा जीनोमिक डीएनए को निकालने के लिए supernatant महाप्राण और एक निष्कर्षण किट का उपयोग कर जीनोमिक डीएनए को अलग करने के लिए आगे बढ़ना ( तालिका देखें सामग्री) ।
  2. T7 endonuclease प्रदर्शन मैं (T7EI) दरार परख ( चित्र 6देखें) ।
    1. पीसीआर रिएक्शन बफर (5x) के 10 μL युक्त एक ५० μL पीसीआर सेट करें, dNTP मिक्स के 1 μL (10 मिमी), उपयोगकर्ता के २.५ μL-परिभाषित फॉरवर्ड प्राइमर (10 μM), उपयोगकर्ता के २.५ μL-परिभाषित रिवर्स प्राइमर (10 μM), डीएनए polymerase के ०.५ μL, 2 \ u20125 μL जीनोमिक डीएनए टेम्पलेट (कितने कोशिकाओं के आधार पर सॉर्ट किया गया), तो ddH2O ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ ५० μl अप करने के लिए ऊपर ।
      नोट: प्राइमरों के लिए लक्ष्य जीनोमिक लोकस पार्श्व और 400 के आसपास के एक पीसीआर उत्पाद उपज तैयार कर रहे है \ u2012700 bp. आमतौर पर एक किताब अंय प्राइमर की तुलना में कैस एंजाइम की कटौती साइट के करीब तैनात है, ताकि T7EI परख का परिणाम एक एजी पर दो अलग बैंड है उठी जेल ( चित्र 6देखें) ।
    2. निम्नलिखित मापदंडों के साथ एक थर्मल चक्र में पीसीआर चलाएँ: ९८ ° c के लिए 3 मिनट, ९८ ° c के लिए 30 s (चरण 2), ६३ ° c के लिए 30 s (चरण 3), ७२ ° c के लिए 30 s (चरण 4), दोहराएँ चरण 2 \ u20124 के लिए एक और ३४ चक्र, ७२ ° c 2 मिनट के लिए , और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो ।
    3. एक 2% ऐगेरोस जेल 1x TAE बफर का उपयोग पर प्रतिक्रिया का समाधान ।
    4. आबकारी ने एक साफ, तेज स्केलपेल के साथ जेल से पीसीआर उत्पाद और एक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग कर डीएनए शुद्ध, निर्माता के निर्देशों के अनुसार । २६० एनएम अवशोषक की तरंगदैर्घ्य पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके पीसीआर उत्पाद की सांद्रता को मापें ( सामग्रियों की सारणीदेखें) ।
    5. एक परख २०० डीएनए, T7EI प्रतिक्रिया बफर (10x) के 2 μL युक्त मिश्रण तैयार है, और ddH2ओ ( सामग्री की मेजदेखें) के साथ 19 μl अप करने के लिए सबसे ऊपर है ।
    6. निम्नलिखित पैरामीटरों का उपयोग करते हुए एक थर्मल साइलर में पीसीआर उत्पाद को पुन अनयल करें: 5 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस, 6 डिग्री सेल्सियस/मिनट पर 25 ° c के लिए नीचे रैंप, फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ ।
    7. फिर से annealed पीसीआर उत्पाद के लिए 5 यू T7EI जोड़ें, पिख्ता द्वारा अच्छी तरह से मिक्स, और ५० मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते ।
    8. T7EI-पचा डीएनए 1x TAE बफर का उपयोग कर एक २.५% ऐगेरोस जेल पर हल ।
    9. छवि जेल, imagej का उपयोग कर बैंड तीव्रता यों तो, और indel गठन की दर की गणना निंनलिखित सूत्र का उपयोग:
      Equation 1
      जहां एक बरकरार पीसीआर उत्पाद और बी और सी की तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है क्लीवेज उत्पादों४३की तीव्रता के अनुरूप ।
      1. Imagej में एक बैंड की तीव्रता यों तो करने के लिए, पहले बैंड के आसपास एक आयताकार बॉक्स आकर्षित संभव के रूप में अपनी सीमा के करीब । दूसरा, विश्लेषण पर क्लिक करें और फिर माप सेट. सुनिश्चित करें कि क्षेत्र, ग्रे मूल्य का मतलबहै, और एकीकृत घनत्व विकल्प की जांच कर रहे हैं । ठीकक्लिक करके सेटिंग्स विंडो से बाहर निकलें । तीसरा, विश्लेषण पर क्लिक करें और फिर उपाय। मतलब या RawIntDen मूल्य बैंड तीव्रता के रूप में प्रयोग किया जाता है ।

Figure 6
चित्रा 6 : सफल जीनोम संपादन परिणामों के लिए कोशिकाओं की जांच । (क) एक योजनाबद्ध दो सामांयतः प्रयुक्त assays, अर्थात् बेमेल दरार परख T7 endonuclease मैं (T7EI) एंजाइम और अगली पीढ़ी अनुक्रमण (ngs) या लक्षित amplicon अनुक्रमण के साथ । नीले क्षैतिज आयत डीएनए का संकेत है और पीले हलकों CRISPR-कैस प्रणाली द्वारा प्रेरित संशोधनों का संकेत मिलता है । T7E1 परख के लिए प्राइमरों हरे रंग में चिह्नित कर रहे हैं, जबकि ngs के लिए amplicons पैदा करने के लिए प्राइमरों लाल रंग में चिह्नित कर रहे हैं । (ख) T7EI क्लीवेज परख के लिए और ngs के लिए प्राइमर दृश्यों का डिजाइन । यहां, लक्ष्य जीनोमिक लोकस मानव CACNA1D जीन की एक्सॉन ४५ है । अभीष्ट संशोधन स्थल तारांकन द्वारा दर्शाया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. लक्षित amplicon अनुक्रमण निष्पादित करें ( चित्र 6देखें) ।
    1. डिजाइन पीसीआर प्राइमरों लक्ष्य जीनोमिक locus बढ़ाना । प्रिमर्स में से एक को १०० bp से कम होना चाहिए लेकिन प्रोटोस्पेसर से 20 से अधिक bp.
      नोट: सामान्यतया, कुल PCR उत्पाद आकार लगभग 150 \ u2012300 bp ( चित्र 6देखें) के लिए डिज़ाइन किया गया है ।
    2. इस प्रकार के रूप में प्राइमरों के लिए अतिरिक्त दृश्यों संलग्न: (क) 5 ' \u2012gcgttatcgaggtc-nnnn-[फॉरवर्ड प्राइमर]-3 '; (b) 5 '-GTGCTCTTCCGATCT-[रिवर्स प्राइमर] – 3 '.
    3. पीसीआर रिएक्शन बफर (5x) के 10 μL युक्त एक ५० μL पीसीआर रिएक्शन मिक्स सेट करें, dNTP के 1 μL (10 मिमी), प्राइमर के 5 μL एक (10 μM), प्राइमर बी के 5 μL (10 μM), ०.५ μL डीएनए polymerase, 2 \ u20125 μL जीनोमिक डीएनए टेम्पलेट (कितने कोशिकाओं को हल किया गया है पर निर्भर करता है) , तो ddH20 के साथ ५० μl अप करने के लिए ऊपर ।
    4. निम्नलिखित मापदंडों के साथ एक थर्मल चक्र में पीसीआर चलाएँ: ९८ ° c के लिए 3 मिनट, ९८ ° c के लिए 30 s (चरण 2), ६३ ° c के लिए 30 s (चरण 3), ७२ ° c के लिए 15 s (चरण 4), दोहराएँ चरण 2 \ u20124 के लिए एक और ३४ चक्र, ७२ ° c 2 मिनट के लिए , और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो ।
    5. 2% ऐगेरोस जेल पर प्रतिक्रिया को हल करने और निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग कर पीसीआर उत्पाद को शुद्ध । २६० एनएम अवशोषक की तरंगदैर्घ्य पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का प्रयोग करते हुए डी एन ए का परिमाण निर्धारित करना ( सामग्रियों की सारणीदेखें) ।
    6. निम्नलिखित दौर 2 पीसीआर प्राइमरों Synthesize: (ग) 5 ' \u2012 AATGATACGGCGACCGAGATCTACACCCTACACगगCGTTATCGAGGTC – 3 '; (d) 5 ' \u2012CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-[बारकोड]-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT – 3 '
    7. पीसीआर रिएक्शन बफर (5x) के 4 μL, dNTP के ०.४ μL (10 मिमी), प्राइमरी सी (10 μM) के 2 μl, प्राइमर डी के 2 μl (10 μM), डीएनए polymerase के दो-1, डीएनए टेम्पलेट के 2 μl से युक्त एक 20 μL पीसीआर रिएक्शन मिश्रण सेट (चरण 7.3.5 से , पतला 1:100), और ddH2ओ के ९.४ μl ।
      नोट: डीएनए टेम्पलेट के लिए कमजोर पड़ने वाला कारक इसकी मूल सांद्रता के आधार पर भिन्न हो सकता है. यदि एकाग्रता के आसपास है 20 \ u201240 ng/μL, एक 1:100 कमजोर पड़ने का कारक का उपयोग करें । इसके अलावा, प्रत्येक प्रयोगात्मक नमूने के लिए एक अलग बारकोड उठाओ, अगर एक ही प्राइमरी एक और प्राइमरी बी कदम 7.3.3 में इस्तेमाल किया जाता है ।
    8. निम्नलिखित मापदंडों के साथ एक थर्मल cycler में पीसीआर चलाएँ: 30 s (चरण 2) के लिए 3 मिनट, ९८ ° c के लिए ९८ ° c 30 s (चरण 3), के लिए ७२ ° c 30 s (चरण 4) के लिए, के साथ 2 चरणों को दोहराएँ कदम \ u20124 2 मिनट के लिए एक और 14 चक्र के लिए, ७२ ° c , और 4 डिग्री सेल्सियस पकड़ो ।
    9. एक 2% पर प्रत्येक प्रतिक्रिया के 5 μl हल करने के लिए pcrs की सफलता निर्धारित करने के लिए ऐगेरोस जेल । सभी नमूनों को एक साथ संयोजित करें (यह मानते हुए कि एक अलग बारकोड प्रत्येक नमूने के लिए उपयोग किया गया है) और एक पीसीआर शोधन किट का उपयोग कर परित डीएनए को साफ निर्माता के अनुसार निर्देश. यदि कुछ PCRs के एक से अधिक बैंड प्रदर्शन (गैर विशिष्ट उत्पादों की उपस्थिति का संकेत), एक अतिरिक्त जेल निष्कर्षण कदम प्रदर्शन ।
    10. एक उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण साधन पर पुस्तकालय अनुक्रम ( सामग्री की तालिकादेखें) युग्मित १५१ bp का उत्पादन करने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार पढ़ता है । पढ़ें 1 अनुक्रमण प्राइमर कस्टम डिजाइन किया है और अलग से प्रदान किया जाना है । इसका अनुक्रम इस प्रकार है: Read1_seq: 5 ' – CCACCGAGATCTACACCCTACACGAGCGTTATCGAGGTC – 3 ' । पढ़ें 2 अनुक्रमण प्राइमरी और सूचकांक अनुक्रमण प्राइमर मानक है और अभिकर्मक कारतूस में प्रदान की जाती हैं ।
      नोट: T7EI परख और लक्षित amplicon अनुक्रमण सामांयतः जीनोम संपादन की दक्षता की जांच करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । हालांकि, अंय प्रयोग संपादन दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है, डीएनए संशोधनों के प्रकार के आधार पर शुरू की । उदाहरण के लिए, यदि कोई प्रतिबंध साइट लक्ष्य साइट पर बनाया गया है, एक प्रतिबंध खंड लंबाई बहुरूपता (rflp) परख किया जा सकता है । यह T7EI परख के समान है सिवाय इसके कि एक प्रतिबंध एंडोन्यूक्लीस के बजाय पीसीआर उत्पाद को पचाने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

8. व्यक्तिगत क्लोन की स्क्रीनिंग

  1. ६.३ कदम से, कोशिकाओं को विभाजित एक बार वे संगामी हो रही शुरू करते हैं । प्रत्येक व्यक्ति क्लोन के लिए, शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने और कदम ७.१ के अनुसार जीनोमिक डीएनए निकालने ।
  2. सभी व्यक्तिगत क्लोन के लिए T7EI परख अनुभाग ७.२ के अनुसार प्रदर्शन, एक संशोधन के लिए छोड़कर । वाइल्डटाइप कोशिकाओं से लक्ष्य जीनोमिक लोकस बढ़ाना और कदम 7.2.5 में, बजाय परीक्षण डीएनए का केवल एनजी २०० का उपयोग कर, मिश्रण १०० वाइल्डटाइप डीएनए के १०० एनजी के साथ परीक्षण डीएनए के एनजी ।
    नोट: संशोधित कदम के लिए कारण यह है कि कुछ क्लोन सफल द्वि विकल्पी रूपांतरण आया हो सकता है और समयुग्मजी म्यूटेंट हैं । ऐसे मामलों में, वहां T7EI परख में कोई दरार बैंड होगा अगर wildtype डीएनए में मिलाया नहीं है ।
  3. अनुक्रम में लक्ष्य साइट क्लोन कि प्रदर्शन T7EI परख में दरार बैंड ।
    1. संशोधित जीनोमिक लोकस कदम 7.2.1-7.2.4 के अनुसार बढ़ाना ।
    2. निंनलिखित क्लोनिंग प्रतिक्रिया सेट करें: पीसीआर उत्पाद के 4 μL, नमक समाधान के 1 μL, TOPO वेक्टर के 1 μL ( सामग्री की मेजदेखें) ।
    3. न्यूनतम 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर धीरे से और इनसेबेट करके मिक्स करें ।
    4. रासायनिक सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं (जैसे TOP10 या Stbl3) में प्रतिक्रिया मिश्रण के 3 Μl रूपांतरण ( अनुपूरक फ़ाइल 1देखें) । ५० μg/मिलीलीटर kanamycin के साथ एक पौंड आगर प्लेट पर बदल बैक्टीरिया की कोशिकाओं फैला ।
    5. अगले दिन, पौंड तरल मीडिया ५० μg/मिलीलीटर kanamycin युक्त में कम से कम 10 कालोनियों संरोपण ।
    6. जब जीवाणु संस्कृतियों turbid रहे हैं, एक miniprep किट का उपयोग कर plasmids अलग ( सामग्री की मेजदेखें) और उंहें मानक M13 आगे या M13 रिवर्स प्राइमर का उपयोग कर अनुक्रम ।
  4. एक पश्चिमी दाग (भी immunoblot के रूप में जाना) प्रदर्शन अनुपस्थिति या लक्षित प्रोटीन की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए (यदि जीनोम संपादन प्रयोग एक प्रोटीन बाहर दस्तक frameshift परिवर्तन के द्वारा जीन कोडिंग शामिल है) । अनुपूरक फ़ाइल देखें 1.
    नोट: अन्य प्रयोगों वांछित जीनोमिक संशोधनों ले क्लोन की पहचान करने के लिए किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, एक लक्षणप्ररूपी परख किया जा सकता है अगर बाहर दस्तक एक विशेष जीन सेलुलर व्यवहार में कुछ परिवर्तन के कारण जाना जाता है ।

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Representative Results

एक जीनोम संपादन प्रयोग करने के लिए, एक crispr प्लाज्मिड एक sgrna के लोकस-हित लक्ष्यीकरण को व्यक्त करने के लिए क्लोन किया जाना चाहिए । सबसे पहले, प्लाज्मिड एक प्रतिबंध एंजाइम के साथ पचा जाता है (आमतौर पर एक प्रकार IIs एंजाइम) यह linearize करने के लिए. यह एक पचाया प्लाज्मिड के साथ एक पूर्ण और आंशिक पाचन के बीच अंतर करने के लिए एक 1% ऐगेरोस जेल पर पचा उत्पाद को हल करने के लिए सिफारिश की है । के रूप में पचाया plasmids supercoiled रहे हैं, वे अपने अर्थवान समकक्षों की तुलना में तेजी से चलाने के लिए करते है ( चित्र 7एदेखें) । दूसरा, sgRNA के लिए दो ओलिगोन्यूक्लिओटिडेस annealed और कटौती plasmid में ligated किया जाना है । यह निर्धारित करने के लिए कि यदि ओलिगोन्यूक्लिओटिडेस को सफलतापूर्वक CRISPR प्लाज्मिड बैकबोन में क्लोन किया गया है, तो कॉलोनी पीसीआर निष्पादित की जाती है ( चित्र 7bदेखें). इसके बाद प्लाज़मिडों को निकाला जाता है और सैन्गर अनुक्रमण के लिए भेजा जाता है ।

Figure 7
चित्रा 7 : SgRNA की क्लोनिंग-CRISPR plasmids व्यक्त । (क) जेल वैद्युत् जनन के बाद पचता हुआ और पचाया हुआ प्लाज़ीड दर्शाने वाला प्रतिबिंब । लेन 1 \ u20123 दिखाएं plasmids कि bbsi द्वारा पूरी तरह से अर्थवान किया गया है । लेन 4 मूल पचाया plasmid है, जो supercoiled है और इसलिए एक ऐगेरोस जेल पर तेजी से migrates से पता चलता है । (ख) कॉलोनी पीसीआर उत्पादों की प्रतिनिधि जेल छवि । सकारात्मक क्लोन एक हरे रंग की टिक द्वारा चिह्नित कर रहे है (यह दर्शाता है कि oligonucleotides सफलतापूर्वक वेक्टर रीढ़ में ligated किया गया है), जबकि नकारात्मक क्लोन एक रेड क्रॉस द्वारा चिह्नित हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एक बार constructs अनुक्रम सत्यापित किया गया है, वे एक वांछित सेल लाइन (जैसे HEK293T) में transduced किया जा सकता है । CRISPR plasmids अक्सर एक चयन मार्कर ले (जैसे, एक mCherry जीन), जिससे सफलतापूर्वक transduced कोशिकाओं को चुना जा करने के लिए अनुमति देता है । प्रतिदीप्ति आसानी से plasmids के सफल प्रसव पर एक खुर्दबीन के नीचे कल्पना की जा सकती है ( चित्र 8एदेखें) । कोशिकाओं के आसपास प्रवाह cytometry द्वारा हल कर रहे है 24 \ u201272 h पोस्ट-transfection । गेटिंग एक नॉन-ट्रांसफेक्टेड नियंत्रण पर आधारित सेट है ( चित्र 8bदेखें). हल कोशिकाओं का हिस्सा एक ऊतक संस्कृति थाली पर वरीयता प्राप्त कर रहे है वसूली के लिए अनुमति देते हैं ।

Figure 8
चित्रा 8 : CRISPR अभिकर्मकों का मानव कोशिकाओं में परिचय । (क) HEK293T कोशिकाओं के प्रतिनिधि माइक्रोस्कोपी छवि सफलतापूर्वक एक crispr प्लाज्मिड एक mcherry मार्कर असर ( सामग्री की मेजदेखें) के साथ transfected । ट्रांसफेक्शन दक्षता लाल प्रतिदीप्ति प्रदर्शित कोशिकाओं के प्रतिशत से अनुमान लगाया जा सकता है । 10x आवर्धन, स्केल बार २०० μm का प्रतिनिधित्व करता है । (ख) प्रतिनिधि facs भूखंडों. Transfected कोशिकाओं (सही पैनल) एक गैर transfected नियंत्रण (बाएं पैनल) के खिलाफ gated हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

सॉर्ट किए गए कक्ष पुनर्प्राप्त करते समय, संपादन दक्षता का मूल्यांकन किया जाता है कि यह निर्धारित करें कि क्या प्रयोग जारी रखा जाना चाहिए । जीनोमिक डीएनए (gDNA) शेष अन-मढ़वाया कोशिकाओं से अलग है । एक T7EI परख दरार दक्षता है, जो एक एगरोस जेल पर मनाया बैंड की तीव्रता से गणना की है की जांच करने के लिए किया जाता है ( चित्र देखें 9ए) । इसके अतिरिक्त, यदि एक HDR-आधारित प्रयोग लक्ष्य लोकस पर एक प्रतिबंध साइट को शामिल करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, एक RFLP परख इसी प्रतिबंध एंजाइम के साथ किया जा सकता है ( चित्र 9बीदेखें) ।

Figure 9
चित्र 9 : जीनोम संपादन की हद तक मूल्यांकन । (क) प्रतिनिधि जेल छवि एक T7E1 परख के परिणाम दिखा । गलियाँ 1 \ u20128 विभिन्न प्रायोगिक नमूनों का प्रतिनिधित्व करते हैं । प्रत्येक नमूने के लिए, शीर्ष बैंड बिना खतना के डीएनए को इंगित करता है, जबकि नीचे दो बैंड क्लीवेज उत्पादों का संकेत देते हैं । नमूनों में बदलती हुई नहेज क्षमता को देखा जा सकता है । गैर-transfected कोशिकाओं से पीसीआर amplicons के पाचन एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है और एक "-" द्वारा चिह्नित है । (ख) प्रतिनिधि जेल छवि एक RFLP परख के परिणाम दिखा । गलियाँ 1 \ u20126 विभिन्न प्रायोगिक नमूनों का प्रतिनिधित्व करते हैं । प्रत्येक नमूने के लिए, शीर्ष बैंड बिना खतना के डीएनए को इंगित करता है, जबकि नीचे दो बैंड प्रतिबंध पचाने के बाद क्लीवेज उत्पादों का संकेत देते हैं । अलग HDR क्षमता नमूनों में देखा जा सकता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

यदि संपादन दक्षता स्वीकार्य है (उदाहरण के लिए, T7EI परख द्वारा कम से 5%), हम व्यक्तिगत क्लोन की पहचान है कि वांछित डीएनए संशोधनों ले आगे बढ़ना । चढ़ाया कोशिकाओं, जो ठीक करने के लिए छोड़ दिया गया है, कम से कम व्यक्तिगत कालोनियों के लिए बढ़ने की अनुमति के लिए वरीयता प्राप्त कर रहे हैं । बाद में, व्यक्तिगत कालोनियों उठाया और विस्तारित कर रहे हैं, इससे पहले कि gDNA इन व्यक्तिगत क्लोन से अलग है । T7EI परख का एक और दौर लक्ष्य साइट पर संशोधित डीएनए के साथ क्लोन की पहचान करने के लिए किया जाता है । TOPO क्लोनिंग और Sanger अनुक्रमण तो सभी alleles के सटीक दृश्यों का निर्धारण करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं । आदर्श रूप में, जीन knockouts के लिए, indels तीन के गुणकों में नहीं होना चाहिए, जो frameshift परिवर्तन का कारण नहीं है ( चित्र 10एदेखें) । यह भी प्रमाणित करने के लिए कि प्रोटीन कोडन जीन सफलतापूर्वक निष्क्रिय हो गया है, एक वेस्टर्न ब्लॉट को यह सुनिश्चित करने के लिए किया जा सकता है कि कोई लक्षित प्रोटीन मौजूद नहीं है ( चित्र 10खदेखें) ।

Figure 10
चित्रा 10 : जीन knockouts के लिए स्क्रीनिंग । (क) प्रतिनिधि संगर अनुक्रमण डाटा । मूल असंशोधित डीएनए अनुक्रम (शीर्ष पंक्ति) को अनुक्रमण परिणाम प्राप्त (निचली पंक्ति) के साथ संरेखित किया जा सकता है यह जांचने के लिए कि क्या कोई संपादन हुआ है । यहां, लक्ष्य साइट पर 1 bp संमिलन और 7 bp हटाना है (जैसा कि लाल बक्सों द्वारा दर्शाया गया है, जो संरेखण में अंतराल दर्शाते हैं) । (ख) प्रतिनिधि वेस्टर्न ब्लॉट छवि । यहां, कई क्लोन (एकल कोशिकाओं से विस्तारित) उपस्थिति या GLUL प्रोटीन की अनुपस्थिति के लिए जांच कर रहे हैं । लाल तीर क्लोन जहां GLUL जीन सफलतापूर्वक बाहर खटखटाया गया है संकेत मिलता है । "WT" वाइल्डटाइप कोशिकाओं के लिए खड़ा है, जहां GLUL अत्यधिक व्यक्त की है । ACTB (β-actb) एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में कार्य करता है ( सामग्री की तालिकादेखें) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

CRISPR-कैस प्रणाली एक शक्तिशाली, क्रांतिकारी प्रौद्योगिकी के लिए जीनोम इंजीनियर और पौधों और जानवरों के transcriptomes है । कई जीवाणु प्रजातियों CRISPR-कैस सिस्टम, जो संभवतः जीनोम और transcriptome इंजीनियरिंग प्रयोजनों४४के लिए अनुकूलित किया जा सकता है शामिल पाया गया है । हालांकि स्ट्रेप्टोकोकस pyogenes (SpCas9) से Cas9 endonuclease पहला एंजाइम सफलतापूर्वक मानव कोशिकाओं21,22,23,24, अंय जीवाणु से एंजाइमों में तैनात किया गया था प्रजातियों, सहित तालिका 1में दिखाया गया है, भी मानव16,26,27,28में इंजीनियरिंग उपकरण के रूप में अच्छी तरह से कार्य करने के लिए दिखाया गया है । नतीजतन, शोधकर्ताओं के लिए प्रौद्योगिकी का उपयोग उत्सुक अक्सर अनिश्चित जो प्रणाली को अपने काम के लिए चुनते है और कैसे इष्टतम परिणामों के लिए अपने प्रयोगों को डिजाइन करने के लिए कर रहे हैं ।

यहां, हम प्रौद्योगिकी के अपने उपयोग को अधिकतम करने में CRISPR उपयोगकर्ताओं की सहायता करना चाहते हैं । किसी भी जीनोम संपादन प्रयोग करने के लिए मौलिक चयन और लक्ष्यीकरण के लिए एक उपयुक्त sgRNA की क्लोनिंग है । हमारे द्वारा किए गए कार्य और दूसरों को पता चलता है कि अलग CRISPR-कैस सिस्टम अलग स्पेसर लंबाई में बेहतर सक्रिय है ( तालिका 1देखें)25। इसके अतिरिक्त, शोधकर्ता का चयन करना चाहिए जो सिस्टम लक्ष्य साइट के ज्ञान के आधार पर उपयोग करने के लिए । आम तौर पर, हमारे मूल्यांकन अध्ययन में परीक्षण एंजाइमों के बीच, SpCas9 और LbCas12a सबसे अधिक क्लीवेज दक्षता प्रदर्शन, विशेष रूप से अधिक उच्च व्यक्त जीन में संभवतः अधिक खुला और सुलभ chromatin का एक परिणाम के रूप में. इसलिए, हम नियमित जीनोम संपादन प्रयोगों के लिए इन दो एंजाइमों की सलाह देते हैं । तथापि, हमने पाया है कि दोनों नाभिक sgRNA और AsCas12a से लक्षित डीएनए के बीच बेमेल के लिए उच्च सहिष्णुता का प्रदर्शन । इसलिए, यदि शोधकर्ता कई बारीकी से संबंधित homologs या जीनोम के एक दोहराव क्षेत्र के साथ एक जीन को लक्षित कर रहा है, हम AsCas12a का उपयोग करने के लिए बंद लक्ष्य प्रभाव को कम करने की सलाह देते हैं । वैकल्पिक रूप से, SaCas9 भी उपयोग किया जा सकता है के रूप में यह मजबूत गतिविधि के लिए लंबे समय तक स्पेसर लंबाई की आवश्यकता है, जिससे SpCas9 और LbCas12a से अधिक आंतरिक विशिष्टता की पेशकश की ।

एक जीनोमिक लोकस के सटीक संपादन CRISPR अभिकर्मकों के साथ एक मरंमत टेम्पलेट के परिचय की आवश्यकता है । टेंपलेट एक अनुदेश मैनुअल के रूप में कार्य करता है कोशिकाओं को बताने के लिए कैसे HDR मार्ग के माध्यम से डबल-फंसे तोड़ मरंमत के लिए । टेंपलेट के दो सामांय रूपों एक ssODN और एक plasmid हैं । इस मरंमत टेंपलेट के डिजाइन इष्टतम HDR दक्षता25,३९,४२,४५,४६,४७के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । SsODNs के लिए, डीएनए से किनारा जो Ssodns के अनुक्रम व्युत्पंन है महत्वपूर्ण है । AsCas12a और LbCas12a प्रदर्शन गैर-लक्ष्य strand अनुक्रम के ssODNs के लिए एक प्राथमिकता है, जबकि SpCas9 लक्ष्य strand अनुक्रम के ssODNs के लिए एक प्राथमिकता के बजाय प्रदर्शन । इसके अलावा, एचडीआर दक्षता संभावित रूप से असममित दानदाताओं का उपयोग करके सुधार किया जा सकता है । हालांकि, शोधकर्ता के लिए सावधान रहना होगा जो समजातता हाथ बढ़ाया है ( चित्रा 2देखें) । गलत बांह की लंबाई बढ़ाने के बजाय HDR दक्षता अपमानजनक खत्म हो जाएगा । प्लाज्मिड दाताओं के लिए, टेंपलेट अक्सर प्रतिबंध के द्वारा अर्थवान है सेल transduction से पहले पचा । इसके अलावा, एक "डबल कटौती" प्लाज्मिड दाता, जहां स्पेसर-पाम दृश्यों से पहले और बाईं और सही समजातता हथियार क्रमशः के बाद रखा जाता है, के लिए अतिरिक्त स्पेसर-पाम दृश्यों के बिना एक प्लाज्मिड दाता से एक उच्च HDR दक्षता उपज दिखाया गया है ४२.

आवश्यक CRISPR अभिकर्मकों के साथ या एक मरंमत टेम्पलेट के बिना तैयार करने के अलावा, संशोधित सेल लाइनों की पीढ़ी (जैसे, विशिष्ट जीन knockouts युक्त) भी सेल ट्रांसडक्शन, एकल कोशिका विस्तार, और व्यक्तिगत क्लोन की स्क्रीनिंग शामिल है । प्रोटोकॉल उपयोगकर्ताओं को एक पूर्ण जीनोम संपादन प्रयोग करने के लिए सक्षम करने के लिए सभी डाउनस्ट्रीम चरणों की रूपरेखा । कुछ विवरण सेल लाइन-विशिष्ट हैं । उदाहरण के लिए, कुछ सेल लाइनों transfect करने के लिए आसान हो सकता है, जबकि दूसरों को अलग ट्रांसडक्शन तरीकों के साथ व्यापक अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है, nucleofection और इलेक्ट्रोपोरेशन सहित. महत्वपूर्ण बात, हमारे अनुभवों से, प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम एकल सेल क्लोनिंग है । कुछ सेल प्रकार जब वे एक अच्छी तरह से एक सेल के रूप में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, शायद स्रावित वृद्धि कारकों की कमी के कारण पैदा नहीं हो सकता है । उदाहरण के लिए, मानव भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं और कई रोगी प्राथमिक सेल लाइनों आमतौर पर अलग एकल कोशिकाओं के रूप में बहुत खराब हो जाना । इसलिए, transduction के बाद, हम कोशिकाओं को कम चढ़ाना सलाह देते है और फिर प्रवाह cytometry का उपयोग करने के लिए एक ९६-well थाली के विभिंन कुओं में एकल कोशिकाओं को सॉर्ट करने पर एक थाली पर अलग कालोनियों उठा । वहां भी एक समर्थक जोड़ने की जरूरत हो सकती है सेल संस्कृति मीडिया के लिए अस्तित्व कारकों, जैसे रॉक अवरोध करनेवाला४८, के लिए वियोजित कोशिकाओं की वसूली में सुधार होगा । इसके अलावा, सिंगल सेल क्लोनिंग की प्रक्रिया के दौरान, ऐसे अवसर हो सकते हैं जहां दो अलग सेल एक दूसरे के बहुत करीब होते हैं और विलय को खत्म कर देते हैं, जिससे केवल एक कॉलोनी का झूठा रूप दिया जा सकता है । ऐसी स्थितियों में, जीनोमिक म्यूटेशन का निर्धारण करने के चरणों के दौरान, एक अंत में तीन या अधिक विशिष्ट alleles की पहचान कर सकते हैं । फिर भी, यह कम से कम इन कोशिकाओं को फिर से चढ़ाना और फिर अतिरिक्त व्यक्तिगत कालोनियों उठा द्वारा व्यक्तिगत क्लोन ठीक करने के लिए संभव है ।

अंत में, CRISPR-कैस प्रौद्योगिकी जैव चिकित्सा और जैव प्रौद्योगिकी अनुसंधान में क्रांति है । हालांकि, यह वर्तमान में कई सीमाओं से ग्रस्त है (जैसे सीमित लक्ष्यीकरण रेंज और बड़े प्रोटीन आकार के रूप में) है कि कुछ अनुप्रयोगों में अपने व्यापक गोद लेने, जीन थेरेपी सहित । फिर भी, के रूप में समय की प्रगति, अधिक से अधिक स्वाभाविक रूप से होने वाली कैस एंजाइमों माइक्रोबियल प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला में खोज की जाएगी और इन नए एंजाइमों में से कुछ मौजूदा नाभिकी पर लाभप्रद गुण हो सकता है । विस्तृत अध्ययन तो इन उपंयास CRISPR के डिजाइन मापदंडों को ठीक से समझने के लिए प्रदर्शन किया जाना होगा-कैस सिस्टम जब वे जीनोम और transcriptome इंजीनियरिंग उपकरण के रूप में तैनात हैं । इसलिए, जबकि हमारे प्रोटोकॉल वर्तमान जीनोम संपादन के प्रयासों के लिए एक अच्छा संदर्भ के रूप में कार्य करता है, यह लगातार नए सिस्टम के बारे में नवीनतम जानकारी के साथ अद्यतन के रूप में वे उभरने की आवश्यकता होगी ।

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Disclosures

लेखकों के पास वित्तीय हितों की होड़ नहीं है ।

Acknowledgments

M.H.T. के लिए एक एजेंसी द्वारा समर्थित है विज्ञान प्रौद्योगिकी और अनुसंधान के संयुक्त परिषद कार्यालय अनुदान (1431AFG103), एक राष्ट्रीय चिकित्सा अनुसंधान परिषद अनुदान (OFIRG/0017/2016), राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन अनुदान (NRF2013-THE001-046 और NRF2013-THE001-093), एक शिक्षा मंत्रालय टियर 1 अनुदान (RG50/17 (S)), Nanyang प्रौद्योगिकी विश्वविद्यालय से एक स्टार्टअप अनुदान, और Nanyang प्रौद्योगिकी विश्वविद्यालय से अंतरराष्ट्रीय आनुवंशिक रूप से इंजीनियरिंग मशीन (iGEM) प्रतियोगिता के लिए धन ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T4 Polynucleotide Kinase (PNK) NEB M0201
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) NEB M0371
Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X 1st Base BUF-3000-50X4L Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.
Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X 1st Base BUF-3020-10X4L Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA. 
BbsI NEB R0539
BsmBI NEB R0580
T4 DNA Ligase NEB M0202 400,000 units/ml
Quick Ligation Kit NEB M2200 An alternative to T4 DNA Ligase.
Rapid DNA Ligation Kit Thermo Scientific K1423 An alternative to T4 DNA Ligase.
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit Thermo Scientific 451245 The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix NEB E2621L Kit for Gibson assembly.
One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli Thermo Scientific C737303
LB Broth (Lennox), powder Sigma Aldrich L3022 Reconstitute in ddH20, and autoclave before use
LB Broth with Agar (Lennox), powder Sigma Aldrich L2897 Reconstitute in ddH20, and autoclave before use
SOC media - - 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth
Ampicillin (Sodium), USP Grade Gold Biotechnology A-301
REDiant 2X PCR Mastermix 1st Base BIO-5185
Agarose 1st Base BIO-1000
T7 Endonuclease I NEB M0302
Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit Favorgen FAPDE 300
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose Hyclone SH30081.01 4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate
L-Glutamine, 200mM Gibco 25030
Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL Gibco 15140
0.25% Trypsin-EDTA, 1X Gibco 25200
Fetal Bovine Serum Hyclone SV30160 FBS is heat inactivated before use at 56 oC for 30 min
Phosphate Buffered Saline, 1X Gibco 20012
jetPRIME transfection reagent Polyplus Transfection 114-75
QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0 Epicentre LUCG-QE09050
ISOLATE II Genomic DNA Kit Bioline BIO-52067 An alternative to QuickExtract
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0491
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix NEB N0447
6X DNA Loading Dye Thermo Scientific R0611 10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA
Protease Inhibitor Cocktail, Set3 Merck 539134
Nitrocellulose membrane, 0.2µm Bio-Rad 1620112
Tris-glycine-SDS buffer, 10X Bio-Rad 1610772 Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.
Tris-glycine buffer, 10X 1st base BUF-2020 Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.
Ponceau S solution Sigma Aldrich P7170
TBS, 20X 1st base BUF-3030 Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.
Tween 20 Sigma Aldrich P9416
Skim Milk for immunoassay Nacalai Tesque 31149-75
WesternBright Sirius-femtogram HRP Advansta K12043
Antibody for β-actin (C4) Santa Cruz Biotechnology sc-47778 Lot number: C0916
MiSeq system Illumina SY-410-1003
NanoDrop spectrophotometer Thermo Scientific ND-2000
Qubit fluorometer Thermo Scientific Q33226
EVOS FL Cell Imaging System Thermo Scientific AMF4300
CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) Addgene 48138 Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA Addgene 61591 Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: xCas9 3.7 Addgene 108379 Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 Addgene 42230 Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: hCas9 Addgene 41815 Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1) Addgene 71814 Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1) Addgene 72247 Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.

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References

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आनुवंशिकी मुद्दा १४६ CRISPR Cas9 Cas12a जीनोम संपादन गैर-समजातीय अंत में शामिल होने homology-मरंमत का निर्देशन
CRISPR-Cas का उपयोग करके Mammalian कक्ष लाइनों में जीनोम संपादन
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Liu, K. I., Sutrisnoh, N. A. B.,… More

Liu, K. I., Sutrisnoh, N. A. B., Wang, Y., Tan, M. H. Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas. J. Vis. Exp. (146), e59086, doi:10.3791/59086 (2019).

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