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Chemistry

Verbesserung der hohen Viskosität Extrusion der Mikrokristalle für zeitaufgelöste serielle Femtosekunden Kristallographie an x-ray Laser

Published: February 28, 2019 doi: 10.3791/59087
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 3,4, 3,4, 1,5, 1
1Division of Biology and Chemistry - Laboratory for Biomolecular Research, Paul Scherrer Institut, 2Photon Science Division - SwissFEL, Paul Scherrer Institut, 3RIKEN SPring-8 Center, 4Department of Cell Biology, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 5Department of Biology, ETH Zürich

Summary

Der Erfolg eines seriellen Femtosekunden zeitaufgelöste Kristallographie Experiments ist effiziente Musterlieferung abhängig. Hier beschreiben wir Protokolle, um die Extrusion von Bakteriorhodopsin Mikrokristalle aus eine hohe Viskosität Mikro-Extrusion Injektor zu optimieren. Die Methodik setzt auf Probe Homogenisierung mit einem neuartigen Dreiwege Kupplung und Visualisierung mit einer Highspeed-Kamera.

Abstract

Hoher Viskosität Mikro-Extrusion Injektoren haben dramatisch Probe in seriellen Femtosekunden kristallographischen Experimente (SFX) auf Röntgen-freie-Elektronen-Laser (XFELs) reduziert. Eine Reihe von Experimenten mit der lichtgetriebenen Proton Pumpe Bakteriorhodopsin haben als bevorzugte Option Kristalle für serielle Femtosekunden zeitaufgelöste Kristallographie (TR-SFX) strukturelle Veränderungen des aufzulösenden liefern diese Injektoren festgestellt Proteine nach Photoaktivierungen. Um mehrere strukturelle Momentaufnahmen von hoher Qualität zu erhalten, ist es wichtig, große Mengen an Daten zu sammeln und Abfertigung der Kristalle zwischen jedem Laserpuls Pumpe zu gewährleisten. Hier beschreiben wir ausführlich, wie wir die Extrusion von Bakteriorhodopsin Mikrokristalle für unsere jüngsten TR-SFX-Experimente an Linac kohärentes Licht Quelle (LCLS) optimiert. Das Ziel der Methode ist es, Extrusion für eine stabile und kontinuierliche Strömung unter Beibehaltung einer hohen Dichte von Kristallen, die Rate zu erhöhen optimieren experimentieren, auf welche Daten in einem TR-SFX aufgefangen werden können. Dieses Ziel erreichen wir durch die Ausarbeitung von Lipid-kubische Phase mit einer homogenen Verteilung der Kristalle mit einer neuartigen Dreiwege Spritze Gerät gefolgt durch Anpassen der Probenzusammensetzung basierend auf Messungen der Extrusion Stabilität genommen mit einer Highspeed-Kupplung Kamera-Setup. Die Methodik kann den Fluss der anderen Mikrokristalle optimieren angepasst werden. Das Setup wird für die Nutzer der neuen Schweizer freie-Elektronen-Laser-Anlage zur Verfügung.

Introduction

Serielle Femtosekunden Kristallographie (SFX) ist eine strukturelle Biologie-Technik, die die einzigartigen Eigenschaften des Röntgen-freie-Elektronen-Laser (XFEL) auf Raumtemperatur Strukturen bestimmen nutzt aus Tausenden von Mikrometer große Kristalle während schneller als die meisten die Strahlenschäden durch den "Beugung vor Zerstörung" Prinzip1,2,3.

In einer zeitaufgelösten Verlängerung von SFX (TR-SFX) dienen der Femtosekunden-Impulse aus der XFEL, strukturelle Veränderungen in Proteine4,5zu studieren. Das Protein des Interesses ist mit einem optischen Laser (oder eine andere Aktivität Trigger) kurz vor dem Schuss von XFEL in einem Pumpe-Sonde-Setup aktiviert. Durch die präzise Steuerung die Verzögerung zwischen Pumpe und Sonde Impulsen, kann das Zielprotein in verschiedenen Staaten erfasst werden. Molekulare Filme von strukturellen Veränderungen über elf Größenordnungen in der Zeit demonstrieren die Macht der neuen XFEL-Quellen, die Dynamik von mehreren Protein Ziele6,7,8,9zu studieren, 10,11,12,13. Grundsätzlich schließt sich die Methode der dynamischen spektroskopischen und statische strukturelle Techniken ineinander, bietet einen Einblick in Proteindynamik am in der Nähe von atomarer Auflösung.

Einfache Systeme für TR-SFX enthalten eine endogene Auslöser der Aktivierung mit einer lichtempfindlichen Komponente wie Retinal in Bakteriorhodopsin (bR)9,10, die Chromophore in Photosystem II12,13, photoaktiven gelbe Protein (PYP)6,7 reversibel photoschaltbare fluoreszierendes Protein11oder eine Photolyzable Kohlenmonoxid in Myoglobin8. Spannende Varianten der Technik noch in der Entwicklung setzen auf Mischung und Regelungen14,15 enzymatischer Reaktionen oder ein elektrisches Feld verwendet, um strukturelle Veränderungen16induzieren studieren zu injizieren. Angesichts der Tatsache, dass XFEL Quellen nur ein paar Jahre lang zur Verfügung wurden und Erfolge der Vergangenheit in die Zukunft extrapolieren, die Methode potential wie ein richtiges Spiel-Wechsler in Bezug auf unser Verständnis, wie zeigt Proteine Funktion.

Da biologische Proben von einer einzigen Exposition zu einer high-Power-XFEL Puls zerstört werden, wurden neue Ansätze für die Proteinkristallographie notwendig. Die Fähigkeit, große Mengen an einheitliche Mikrokristalle wachsen musste unter diesen Verfahren entwickelten17,18,19sein. Zur Erfassung der Daten auf einem XFEL zu ermöglichen, müssen diese Kristalle geliefert, verworfen und dann für jede XFEL Puls erneuert. Angesichts der Tatsache, dass XFELs nutzbare Impulse bei 10-120 Hz Feuer, muss Musterlieferung schnell, stabil und zuverlässig, dabei auch die Kristalle intakt und Begrenzung Verbrauch. Unter den erfolgreichsten Lösungen ist ein hohe Viskosität Mikro-Extrusion Injektor, der eine kontinuierlich streaming Spalte Raumtemperatur Kristall-beladenen Lipid-kubische Phase (LCP) über die gepulste Röntgen Strahl20liefert. Zufällig orientierte Kristalle, eingebettet in der LCP-Stream, das sind von der XFEL Impulse Scatter Röntgenstrahlen auf einen Detektor, wo ein Beugungsmuster aufgezeichnet wird, abgefangen. LCP war eine natürliche Wahl für ein Probe-Lieferung-Medium, da es häufig als ein Wachstumsmedium für Membran-Protein Kristalle17,21,22,23, noch andere hohe Viskosität Trägermedien verwendet wird 24,25,26,27,28,29,30 und lösliche Proteine31 auch im Injektor verwendet wurden. SFX mit hoher Viskosität Injektor war erfolgreich bei der Strukturaufklärung von Membran Proteine13,32 einschließlich G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs)33,34, 35,36,37, mit der Datenqualität für native Phasenabgleich38,39 dabei Zeit und Probe effizient ausreichend. Derzeit, diese Injektoren werden mehr routinemäßig für Temperatur-Messungen am Synchrotron Quellen28,30,40,41 sowie während der mehr technisch anspruchsvolle TR-SFX-Experimente am XFELs9,10,13,42.

Vergleichbare TR-SFX-Experimente wurden durchgeführt mit anderen Injektor-Typen wie Flüssigphase Lieferung in einem Fluss Düse6,7,12konzentriert, jedoch erfordert diese Methode Protein Mengen nicht verfügbar für viele biologisch interessante Ziele. Zur Bestimmung der statischen Strukturen mit viskosen Extrusion einen durchschnittlichen Verbrauch von 0,072 mg Protein pro 10.000 indizierten Beugungsmuster im Vergleich zu 9,35 mg für Flüssigkeitsstrahls wurden Düsen (d. h. über 130 Mal mehr Probe gemeldet effiziente)20. Die hohe Viskosität-Injektor hat sich gezeigt, eine tragfähige Probe Abgabegerät für TR-SFX zu sein, während nur einige dieser Probe Effizienz43zu opfern. In Nogly Et Al. (2018)10, z. B. Probe Verbrauch war ca. 1,5 mg pro 10.000 indizierten Muster, die günstig im Vergleich zu ähnlichen TR-SFX-Experimenten mit PYP wo durchschnittliche Probe Verbrauch viel höher bei 74 mg Protein pro 10.000 war indizierte Muster6. Hohe Viskosität Injektoren haben somit klare Vorteile, wenn Begrenzung der Höhe des Proteins zur Verfügung oder Kristalle direkt in LCP angebaut werden.

Für TR-SFX mit hoher Viskosität Injektoren den zuverlässigsten Daten liefern mehrere technische Probleme angegangen werden müssen: die Fließgeschwindigkeit muss weiterhin über kritische Mindestwert; die Hit-Rate sollte beibehalten werden, auf einem Niveau, das nicht langsame Datenerfassung dargestellt wird (z. B. mehr als 5 %); und Probe ohne übermäßige Störungen geliefert werden. Im Idealfall werden diese Bedingungen bereits erfüllt lange vor einer geplanten TR-SFX-Experiment zu XFEL Zeit möglichst effizient zu nutzen. Pricipally, können eine Verlangsamung in der LCP-Stream, sondieren Kristalle, die mit mehreren optischen Laserpuls und Ergebnis in gemischten aktive Zustände aktiviert wurden, oder sondieren gepumpte Material, Umpumped Material in den Strahlengang erwartet wird. Ein weiterer Vorteil der Injection Pre-Tests ist, dass Ausfallzeiten während der Datenerfassung in einem XFEL als Zeit verbannt zu ersetzen verstopfte Düsen, ändern sich nicht Extrudieren Proben minimiert und andere Wartungsaufgaben wird reduziert wird.

Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Optimierung der Musterlieferung für TR-SFX-Datenerfassung mit einer hohen Viskosität Mikro-Extrusion Injektor. Der Einfachheit halber uns die beschriebenen Methoden verlassen nicht auf Zugriff auf eine Röntgenquelle, obwohl Arbeit bei einem Synchrotron Strahlrohr29 weiter über erwartete Trefferquoten und Kristall Beugung informieren würde. Unsere Protokolle wurden entwickelt, um Experimente zur Netzhaut Isomerisierung in den-Protonenpumpe Bakteriorhodopsin10 erfassen zu optimieren und erfolgt in zwei Phasen, beginnend mit Kristall Probenvorbereitung für Extrusion, gefolgt von der Überwachung der extrusion verwenden eine High-Speed-Kamera-Setup. In Phase eins wird der Kristall-beladenen LCP mit zusätzlichen LCP, niedrigen Übergang Temperatur Lipide oder andere Zusatzstoffe, um sicherzustellen, dass die endgültige Mischung für die Lieferung in die Probenumgebung geeignet ist, ohne Verstopfung oder Verlangsamung gemischt. Ein neues drei-weg-Spritze-Koppler wurde entwickelt, um die mischenden Leistungsfähigkeit und Probe Homogenität zu verbessern. Die zweite Phase besteht aus einer Extrusion Test aufgezeichnet von einer Hochgeschwindigkeitskamera der Extrusion Drehzahlstabilität direkt zu messen. Nach der Analyse die Videodaten können Anpassungen des Probe-Vorbereitung-Protokolls vorgenommen werden, um experimentelle Ergebnisse zu verbessern. Diese Verfahren können angepasst werden, um andere Proteine für TR-SFX-Datenerhebung, mit minimalen Änderungen vorzubereiten und werden dazu beitragen, die effiziente Nutzung der begrenzten XFEL Strahlzeit. Mit neuen XFEL-Einrichtungen, die gerade erst ihren Betrieb44,45 und die Übertragung der Injektor-basierte serielle Methoden der Datenerhebung an Synchrotrons28,30,40,41 , die nächsten Jahre werden sicherlich weiterhin spannende neue Einblicke in die strukturelle Dynamik von ein immer breiteres Spektrum an Protein-Targets.

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Protocol

(1) Protein Crystal Probenvorbereitung

  1. Ca. 30 min vor die Probe injiziert werden, basieren Last 50 µL Kristall-beladenen Monoolein LCP in einer 100 µL Spritze.
  2. Für die Injektion bei Atmosphärendruck: Last 10 µL Paraffinöl in die Rückseite einer zweiten Spritze. Vertreiben Sie die Spritze senkrecht halten, die Luftblasen aus der Spritze.
    1. Für die Injektion in Vakuum: Last 5 µL MAG 7,9 und 5 µL Paraffinöl in die Rückseite einer zweiten Spritze. Vertreiben Sie die Spritze senkrecht halten, die Luftblasen aus der Spritze.
  3. Verbinden Sie die Spritze mit Paraffin/MAG 7,9 auf eine standard-Spritze-Koppler, die Luft aus der Kupplung entlüften, durch leichtes Drücken auf den Kolben bis zu einem kleinen Volumen (< 1 µL) Paraffin/Lipid ist sichtbar an der Spitze der Nadel Koppler.
  4. Verbinden Sie Probe-Spritze mit der Spritze Koppler, kümmert sich um alle Luft nicht in die Probe einzuführen. Das Lipid/Paraffin indem man das Probenmaterial durch den Koppler mehrfach unterrühren.
  5. Ein weiterer 100 µL Spritze 20 µL vorgemischten LCP (27 % PEG, 100 mM Sorensen pH 5,6 + MO) bestücken. Entfernen Sie Luftblasen nach Bedarf.
  6. Entfernen Sie die leere Spritze aus der Kupplung und den Kristall mit Spritze verwenden eine standard-Spritze-Koppler beimessen Sie vorgemischte LCP. Übergeben Sie die Probe durch den Koppler 100 Mal.
    Hinweis: Probe mischen die Probe erhitzen kann leicht46. Mischen sollte in einem langsamen Tempo durchgeführt werden, wo die Temperatur der Probe kann einigermaßen konstant gehalten werden.
  7. Überprüfen Sie das Beispiel für Transparenz gegen eine Lichtquelle. Wenn eine klare homogene LCP gebildet hat, gehen Sie zu Schritt 1,9.
  8. Um die Probe in die kubische Phase bringen, 3 µL Monoolein und mischen Sie 50mal (wie oben beschrieben). Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis nur eine transparente Phase gebildet hat, um ein Übermaß an Monoolein zu vermeiden.
    Hinweis: Die Bildung der LCPS ist Temperatur abhängige47 und beste Ergebnisse werden erzielt, knapp über 20 ° C. Die Höhe der zusätzlichen Monoolein benötigt das Volumen der verbleibenden Fällungsmittel Lösung aus Kristallisation übertragene abhängen.
  9. Als Vorbereitung für die Probe Steifigkeit (erwartungsgemäß von der LCP-Phase) und Extrudieren-Fähigkeit testen, lösen die leere Spritze aus der Spritze-Koppler und, die Spritze senkrecht halten, drücken Sie eine kleine Menge der Probe (< 2 µL) durch den Koppler. Wenn die extrudierte Probe einen aufrechte Zylinder bildet, ist die Probe bereit für Extrusion zu testen.
  10. Passen Sie das Gesamtvolumen der Probe zu 100 µL durch Zugabe von mehr vorgemischten LCP (wie in Schritt 1.5).
  11. Der drei-weg-Spritze-Koppler (Reinigung der Luft von den Koppler als vor) zuordnen Sie der Probe-Spritze und zwei leere Spritzen. Mischen Sie mindestens 50 Mal (bzw. bis homogene) indem die Hälfte der Probe in die zweite Spritze und dann beide Hälften der Probe in die dritte Spritze gleichzeitig drücken.
  12. Legen Sie die Spritze mit der Mischprobe unter dem Stereo-Mikroskop, eine homogene Verteilung der Kristalle zu überprüfen.

2. testen Probe Extrusion mit einer High-Speed-Kamera-Setup

  1. Bestimmung der Versuchsparameter.
    1. Wählen Sie die Größe der Düse für den Test.
      Hinweis: Düsengrößen sind in der Regel 50 oder 75 µm Innendurchmesser (ID), aber jeder Größe von etwa 30-100 µm ID angesehen werden kann. Auswahl basiert auf einem Gleichgewicht zwischen meine Verstopfung, Hintergrund Streuung, Probe Verbrauch und Hit-Rate.
    2. Berechnen Sie die optimale Fließgeschwindigkeit basierend auf experimentellen Laser spot-Größe (1/e2 Durchmesser) und die Sammlung Datenschema (z. B. interleaved hell und dunkel), die bei der XFEL verwendet werden.
    3. Berechnen Sie die gewünschte Durchflussgeschwindigkeit (Equation 1) der Probe aus der optimale Fließgeschwindigkeit (Equation 2) und die gewählte Düsendurchmesser (Equation 3):
      Equation 4
      Die Durchflussmenge bestimmen (Equation 5) an der HPLC-Pumpe anhand der Verstärkungsfaktor eingegeben werden sollten (Equation 6) des Injektors.
      Equation 7
      Berechnen Sie den maximalen Druck (Equation 8) aus der Nenndruck der Düse Armaturen (Equation 9) und der Verstärkungsfaktor des Injektors (Equation 10):
      Equation 11
  2. Einrichtung von hoher Viskosität Extrusion Injektor zur offline-Nutzung wie in Abbildung 1dargestellt.
    Hinweis: Die Injektor-Funktionen mittels hydraulischen Strangpressen eine HPLC-Pumpe angetrieben und nutzt eine Co fließenden Helium Gas Scheide durch einen Gasregler gesteuert. Die Pumpe und Regler-Setup werden nicht in diesem Protokoll behandelt. Kapitel vier James (2015)48 ein ausführliches Handbuch.
    1. Spülen Sie die Pumpe und alle Wasserleitungen um sicherzustellen, dass die Regelgarnitur korrekt sind. Die hydraulische Bühne des Injektors zu bereinigen.
    2. Montieren Sie den Injektor (oder der Kamera) auf einer 3-Achsen-Bühne, Bildrahmen und Fokus für die High-Speed-Videos zu erleichtern. Lassen Sie Platz rund um die Einstichstelle für das Objektiv, Beleuchtung, reflektierende Bildschirm und einen kleinen Becher, die abgebrannte Probe fangen.
    3. Konstruieren Sie eine "Dummy-Düse" (ein leeres Reservoir mit einer Düse befestigt) und installieren Sie es auf dem Injektor, Positionierung, Ausrichtung und Beleuchtung zu erleichtern.
    4. Montieren Sie die High-Speed-Kamera mit der Düsenspitze in der Nähe der zentrale Punkt des Ziels.
    5. Positionieren Sie die reflektierende Bildschirm hinter dem Injektor und passen Sie die Beleuchtung um Front-Düse Licht.
    6. Und eine Verbindung der Kamera mit der mitgelieferten Software. Positionieren Sie mit einem live-Video läuft für visuelles Feedback die Düsenspitze in der Mitte des Rahmens, und in den Fokus mit der 3-Achsen-Bühne zu bringen.
    7. Passen Sie die Beleuchtung, bis die Düse deutlich sichtbar ist und der Hintergrund wird gleichmäßig ausgeleuchtet.
  3. Konfigurieren der Kamera High-Speed-Zeitraffer-Video aufzeichnen.
    1. Eingestellten Bildrate auf 1000 fps. Stellen Sie die Auflösung auf 512 x 512 Pixel.
    2. Mit der Belichtungszeit stellen Sie nun die Frame-Rate, passen Sie die Beleuchtungsstärke, bis die Düse sichtbar ist (d. h. nicht unter- oder überbelichtet). Positionieren Sie die Düsenspitze, so dass es links nach rechts zentriert ist und sich im oberen Drittel des Rahmens befindet.
    3. Führen Sie keine Untergrundkorrektur oder die Weißabgleich-Operationen.
    4. Richten Sie die Kamera im Zeitraffer-Modus. Eingestellten Intervall, 30 s und wiederholt zu 40-Mal, den Triggermodus auf zufällig (oder zufällige zurücksetzen) festgelegt, und geben Sie die Anzahl der Frames auf 1000aufnehmen.
  4. Laden Sie das Reservoir mit 20 µL der Probe, und befestigen Sie die Kapillare Düse.
  5. Befestigen Sie den gefüllten Behälter zum Injektor. Befestigen Sie die Gasleitung mit dem Anschluss an die Düse und starten Sie den Gasdurchfluss.
  6. Den Kolben manuell durch Inline-Ventil öffnen und die Spritze drücken voraus. Schließen Sie das Ventil, wenn der Kolben festen Kontakt mit der Probe in das Reservoir macht.
  7. Programmieren Sie die Pumpe mit der berechnete Volumenstrom und den maximalen Druck auf den berechneten Wert festgelegt (siehe Punkt 2.1.3).
  8. Gleichzeitig starten der Pumpe und der Kamera-Aufnahme.
  9. Während die Extrusion anfängt, passen Sie den Gas-Druck zur Erhöhung der Stabilität. Gasdruck zu erhöhen, wenn die Flüssigkeit einen Tropfen an der Spitze der Düse anstelle einer Spalte bildet. Rückgang Druck wenn die Extrusion gebrochen durch übermäßige Scherung aus dem Gasstrom ist oder ist schnell oszillierende Schlagsahne ().
  10. Überwachen die Extrusion (10 min ist in der Regel genug, um eine homogene Strömung Bedingung zu erkennen) und, wenn der Pumpendruck stark, in der Nähe der erwartete Endzeit Rampen, stoppen Sie die Aufnahme, die Pumpe abgeschaltet und entlüften den Systemdruck durch das Sicherheitsventil öffnen.
  11. Analyse der video-Dateien
    Hinweis: Probe-Extrusion, die schlicht nicht ausreicht erfordert keine detaillierte Analyse. Es ist jedoch immer noch nützlich, Failure Mode zu identifizieren, so dass die Probe optimiert werden kann.
    1. Öffnen Sie die Videodatei mit der Analysesoftware (z. B. Fidschi49) und kalibrieren Sie die Messgeräte zu.
    2. Kalibrieren Sie die Messungen durch eine Reihe von bekannten Länge im Videobild mit dem Line-Auswahl-Werkzeug auswählen. Öffnen Sie das Fenster Einstellen Skala über analysieren | Maßstab festlegen und geben Sie die bekannten Abstand und die Maßeinheiten.
      Hinweis: Die bekannte Durchmesser der Düse bietet eine adäquate Kalibrierung Länge für diese Messungen.
    3. Suchen Sie einen Frame im Video wo gibt es in der Extrusion ein verfolgbaren Features sichtbar (z. B. ein Kristall). Notieren Sie die Frame-Nummer.
    4. Vorab das Video zu einem Bild, wo die gleiche Funktion ist sichtbar, aber von seiner Position im vorherigen Schritt verschoben hat. Notieren Sie die Frame-Nummer.
    5. Mit der geraden Linie Messwerkzeug messen Sie den Abstand von den Funktion Start- und Endpunkt über analysieren | Maßnahme.
      Hinweis: Je länger der verfolgbaren Abstand, die weniger Fehler bei der Messung der Berechnungen wirken
    6. Berechnung der Austrittsgeschwindigkeit aus der gemessenen Distanz und die verstrichene Zeit (die Anzahl der verstrichenen Frames geteilt durch Framerate.)
    7. Wiederholen Sie die Schritte 2.11.3-2.11.6 ein paar Mal für jedes Segment des Videos.
    8. Zeichnen Sie die Datenreihe wie in Abbildung 2.

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Representative Results

Das ideale Ausgangsmaterial für die hier beschriebenen Verfahren (Abbildung 3) sind hohe Dichten von Mikrokristalle in viskosen Trägermedium für die Einspritzdüse integriert. Das Verfahren erfordert etwa 50 µL Kristall beladenem Träger für jede Zubereitung. Diese können direkt im LCP als mit dem bR-9,-10 diente hier als Beispiel (Abbildung 4), oder Kristalle gewachsen in konventionellen Dampf-Diffusion-Setups zubereitet angebaut werden. Eine hervorragende video Anleitung zur Kristallisation direkt in gasdichten Spritzen finden in Ishchenko Et Al. (2016)37. Mit bR ist der ideale Durchmesser der kristallinen Platten rund 20 μm als einen guten Kompromiss zwischen Diffraction macht und homogene Aktivierung durch die Pumpe Laser. Proteinkristallen, die Protokolle zubereitet, wie oben erklärt, wurden verwendet, um TR-SFX-Daten auf das Proton Pumpe bR zu sammeln, die die ultraschnellen Änderungen ergeben, die nach Photon Absorption (Abbildung 5) auftreten.

Sichtprüfung des Probenmaterials in der Spritze zeigt nach Vorbereitung der Probe mit dem drei-Wege-Koppler (Abbildung 6AB), Homogenität (Abbildung 6D) und Mikroskop Beispielbilder der Mischprobe, sowohl in der Spritze und auf einer Folie kann die Dichte der Kristalle zu bestätigen und zur Messung der Größen Kristall, Kristall Größenverteilung und Kristall Dichte ermöglicht. Die Probe wird in die kubische Phase, wenn das Fördermedium klar ist (Abbildung 7) und zähflüssig. Trübe Mischungen sind ein Hinweis darauf, dass die Probe in einem Schwamm oder lamellare Phase, aber sind nicht abschließend, wie hohe Kristall Dichte die Großfeuerungsanlagen Klarheit verdecken kann. Ein kurzer Niederdruck Test die flüssigen Schwamm Phase identifizieren kann durch Ziehen des Spritzenkolbens Weg von der Probe auf der Rückseite der Spritze durchgeführt werden. Lamellare Phase kann leicht durch seine Doppelbrechung mit polarisierten Lichtmikroskopie identifiziert werden. Diese Tests, gekoppelt mit einem Pre-Extrusion-Test sind in der Regel ausreichend, um einen Test im Injektor zu rechtfertigen.

Die hohe Wiederholrate des XFELs erfordert eine Strömungsgeschwindigkeit, die ausreichend mit niedrigen Frame Rate Kameras beobachtet werden kann. Daher erfolgt die Extrusion Charakterisierung mit einer Highspeed-Kamera (gekoppelt an eine hohe Vergrößerung Objektiv), die Time-Lapse Video aufzeichnen kann. Video-Daten ist High-Speed-in diesem Rahmen mit 1000 Bildern pro Sekunde aufgezeichnet werden, und auch Zeitraffer in diesem Video für 1 aufgezeichnet wird s alle 30 s. Diese Sammlung Datenschema ermöglicht Datenerfassung während der gesamten Probe-Test (ca. 10 min) ohne unüberschaubare video-Dateien zu erstellen. Auch mit dieser reduzierten Datensatz können Größe, video Dateien noch über 50 GB sein. Darauf sollte geachtet werden, um sicherzustellen, dass ausreichend Speicherplatz zur Verfügung, um die video-Daten zu speichern, bevor der Test beginnt.

Während der Jet Test (Abbildung 1) sollte die Probe eine lange (mehr als 200 µm) kontinuierliche Spalte des LCP extrudieren, die mit einer nahezu konstanten Geschwindigkeit (Abbildung 2) bewegt. Proben, die in einem tropfenden Modus laufen darauf hinweisen, dass die Probe Viskosität zu niedrig ist (Abbildung 2). Proben können oft wiederhergestellt und gemischt mit mehr Monoolein oder Paraffin, Viskosität anzupassen. Proben, die eine Spalte bilden sollte mit der High-Speed-Kamera getestet werden. Daten aus der Aufnahme sollte zeigen, dass die Extrusion über eine Mindestgeschwindigkeit diktiert Ihre experimentellen Parameter bleibt. Extrusion-Geschwindigkeit wird bestimmt durch die Messung des linearen Abstand reist ein Feature in der LCP-Datenstrom über eine Anzahl von Frames. Extrusion mitlaufen, die anomale Clogs zugeschrieben werden kann, rechtfertigen die Wiederholung der Prüfungen. Wenn sie fortbestehen sollte jetten durch Zusätze wie Paraffin, durch eine Verringerung der Dichte von Kristallen oder durch die Auswahl einer größeren Durchmesser Düse verbessert werden. Kristalle, die normalerweise nicht in einem viskosen Medium (z. B. Dampf Diffusion) gewachsen können Peletted durch Zentrifugation und LCP oder andere zähflüssige Träger eingearbeitet. Beispiele finden Sie in vorherigen Publikationen24,25,26,27,29,30.

Figure 1
Abbildung 1: High-Speed-Kamera-Bank-Setup. Ein Foto eines typischen Benchtop-Setup mit die wesentlichen Teile beschriftet. Die 3-Achsen-Bühne bietet Flexibilität bei der Gestaltung und Fokussierung des Bildes. Der Injektor (dargestellt mit der Düse und Behälter befestigt) wird vertikal und direkt vor das Objektiv montiert. Die Beleuchtung in diesem Beispiel wird durch eine einzelne Faser Licht beleuchtet die Probe aus Achse und bietet ein helles Feld auf dem Bildschirm zur Verfügung gestellt. Eine Probe montiert und auf diese Weise beleuchtet bietet ein Bild wie in Einschub B. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Highspeed-Kamera testen und Datenanalyse. Im Bild oben sind zwei LCP-Extrusion-Tests. Test A zeigt bR Kristalle in LCP Extrudieren in einem tropfenden Modus darauf hinweist, dass die Probe nicht optimiert ist. Test B zeigt LCP Extrusion bilden eine kontinuierliche Spalte des LCP Kristalle können verfolgt werden, wobei Extrusion Geschwindigkeit errechnet werden. In diesem Beispiel bewegt sich ein Kristall, eingebettet in der LCP-Spalte (50 µm Durchmesser) 301 µm in 8 ms (37,6 mm/s). Zwei Datensätze aus verschiedenen Zubereitungen von Bakteriorhodopsin Kristallen in LCP werden angezeigt. Vier (oder mehr) Datenpunkte pro Sekunde von High-Speed-Zeitraffer-Video (1 s der Aufnahme alle 30 s) gezeichnet wurden. Eine große Spanne zwischen Datenpunkten genommen aus einer zweiten Datenerhebung geben kurzfristige Geschwindigkeitsveränderung. Während ein gleitender Durchschnitt über die gesamte Datenreihe die längeren Schwankungen in der Strömung zeigt. Die Top-Serie ist aus einem schlecht Extrudieren Sample (hohe Wahrscheinlichkeit für leichte Verschmutzungen mit zwei aufeinander folgenden Pumpe Laserpulse) und der unteren Reihe ist aus einer Stichprobe, die optimal ausgeführt. Die horizontale gepunktete Linie zeigt den Zielsatz Extrusion Geschwindigkeit über die HPLC-Pumpe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Beispiel Vorbereitung Flussdiagramm. Vorbereitung der Probe beginnt mit einer hohen Dichte von Proteinkristallen eingebettet in LCP. Die Probe dann gemischt mit niedrigen Übergang Temperatur Lipid, Paraffin, und LCP vorbereitet, bis die Probe in die kubische Phase kommt, und führt eine Reihe von kleinen Tests darauf hin, dass die Probe im Injektor extrudiert wird. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Bakteriorhodopsin Kristalle als Ausgangsmaterial. Kristalle sind in gasdichte Spritzen (A) mit LCP eingetaucht in das Fällungsmittel Lösung gewachsen. Kristallisation ist optimiert für eine hohe Dichte von Kristallen mit einer möglicherweise enge Größenverteilung (B). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: strukturelle Veränderungen in Bakteriorhodopsin. TR-SFX zeigt ultra-schnelle Änderungen in der Struktur der Proton Pumpe Bakteriorhodopsin. Hier im Bild ein Modell der bR TR-SFX Daten aus Kristallen, die unter Verwendung der Protokolle, die in dieser Arbeit beschriebenen abgeleitet. Die linke Tafel zeigt das Modell mit hervorgehobenen Elemente in der Netzhaut Bindungstasche. Im Rechte Bereich zeigt die Veränderungen in der Netzhaut von Femtosekunden auf Millisekunden. Diese Zahl wurde von Nogly Et Al. (2018)10 mit Erlaubnis reproduziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: die drei-Wege-Koppler. Die drei-Wege-Kupplung ist eine reduzierte Toten-Y Lautstärkemixer entwickelt, um die Kompatibilität mit gasdichten Spritzen. 3D Renderings des Kopplers, zeigen eine Explosionszeichnung von der Baugruppe (A), und eine transparente Sicht zeigt die Vermischung Kanal (B). Die Abbildung zeigt eine inhomogene Kristall-Verteilung nach dem Vermischen mit dem standard-Koppler (C) und die daraus resultierende Aussetzung nach dem Mischen in der drei-Wege-Kupplung (D). Mischen wird erreicht, indem ungefähr Hälfte der Stichprobe in eine andere Spritze (E) schieben, und dann beide Hälften in die restlichen Spritze zusammen, wie durch die blauen Pfeile (F). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: Prüfung Indikatoren Voreinspritzung. Während der Probenvorbereitung sind mehrere kleine Tests verwendet, um anzuzeigen, dass die Probe Phase ist und ausreichend zähflüssig. Optischer Klarheit ist ein Indikator, dass die Probe in die kubische Phase dürfte. (A) eine trübe Probe zeigt sich in der Spritze. (B) ein klares Beispiel ist dargestellt, beachten Sie die Teilstriche sichtbar durch die Probe trotz der hohen Dichte der Mikrokristalle. Wenn die Lipid-Matrix in die kubische Phase ist, bleibt es fest-wie unter keinen Stress. Ein Niederdruck-Test erfolgt durch Ziehen der Spritze weg von der Rückseite der Probe. Wenn die Probe auch Flüssigkeit-wie ist erweitert (indikativ für die Schwamm-Phase) die Probe der Band (C) füllen. In ein positives Ergebnis von den gleichen Test (D) bleibt die Probe statisch trotz der Kolben zurückgezogen. Zu guter Letzt ist ein Makro-Maßstab-Extrusion-Test durch Drücken eine kleine Menge der Probe durch die Spritze Koppler durchgeführt. Ein Tröpfchen bilden an der Düsenspitze (E) oder einen schnell biegen Zylinder des LCP zeigt ein Beispiel, das nicht dickflüssig genug ist. Wenn die Probe extrudiert, bildet einen Zylinder, der im Laufe der Zeit (F) aufrecht bleibt, dann die Probe kann voraus, High-Speed-Kamera zu testen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Die TR-SFX-Methode mit dem zähflüssigen Extrusion Injector erweist sich eine praktikable Technik für Strukturdynamik Studien Bakteriorhodopsin9,10 und Photosystem II13 und jetzt scheint bereit, fahren andere Proteine zu studieren Foto biologischen Prozessen wie lichtgetriebenen Ionentransport oder Sinneswahrnehmung5,50. Die oben beschriebenen Protokolle wurden entwickelt, um den Erfolg der TR-SFX Datenerhebung auf Bakteriorhodopsin zu maximieren, aber wir glauben, fungieren als Vorlage zur Erfassung von Daten über andere Proben zu optimieren. Auf diese Weise viel von der kostbaren Strahlzeit derzeit verloren wegen Verstopfung oder schlechte Probe Extrusion könnte stattdessen verwendet werden, um bessere Daten an weitere zeitliche Verzögerungen zu sammeln.

Die schwierigste und kritischen Schritt in das Protokoll ist der Zusatz von geringen Mengen von Monoolein, die die Lipid-Matrix in die kubische Phase (Schritt 1,8) bringt. Die Schwierigkeit liegt in der Subtilität der Phasenübergang und die negativen Auswirkungen auf die Probe, wenn Monoolein im Übermaß hinzugefügt wird.

Änderungen der Methodik sollte umgesetzt werden, um verschiedene Proteinkristallen unterzubringen. Diese dürfen nicht kompatibel mit der gleichen Zusatzstoffe oder den Betrag oder erforderliche mischen. Auf der anderen Seite Kristalle in kleinere Stücke zu brechen, während des Mischvorgangs kann Beugung Qualität keine Kompromisse und kann sogar verbessern, jetten zum Beispiel bei lange Nadeln in kürzere Stücke brechen. Verschiedene Zusatzstoffe könnte anstelle von Paraffin, ersetzt werden, die hinzugefügt wird, um fließen Geschwindigkeit Stabilität9zu verbessern. MAG 7,9/9.7 wird hinzugefügt, um die Trasnistion lamellare Phase zu verhindern, die auftreten, wenn die Injektion in Vakuum-Umgebungen20 (wie die CXI Endstation am LCLS), aber kann weggelassen werden, wenn das Experiment bei atmosphärischem Druck erfolgt. Erfahrungsgemäß können viele Kristalle aus löslichen Proteinen stabil integriert werden LCP, aber ironischerweise Membranprotein Kristalle in Lipid-Mesophases oft nicht direkt angebaut vermutlich aufzulösen, da Reinigungsmittel aus dem Kristall gewonnen werden in der Lipid-ähnlichen Umgebung um sie herum. In solchen Fällen sollte es versucht, ganz LCP Alternative Viskose Träger24,25,26,27,29,30ersetzen.

Änderungen an den High-Speed-Kamera-Test können Proben unterzubringen, wo die Kristalle nicht innerhalb der Träger sichtbar sind. Beispielsweise kann die Beleuchtung zum Aufzeichnen von Videos mit polarisierten Lichtmikroskopie konfiguriert werden. Dies wird dazu führen, dass doppelbrechenden Kristallen (als ein Glühen) angezeigt werden, und zeigt auch Teile der Lipid-Matrix, in der doppelbrechenden lamellare Phase.

Änderungen abgesehen, ist es wichtig, dass die Protein-Kristall-Vorbereitung so weit wie möglich die folgenden Kriterien erfüllen. Die Kristalle sollten optimal dimensioniert sein, um Beugung bei gleichzeitiger Minimierung der Einspritzdüsen verstopfen zu maximieren. Die Kristall-Dichte sollte hoch genug sein, eine Hit-Rate ausreichend vollständige Datensätze sammeln ergeben, aber nicht so dicht wie die Jet-Stabilität gefährden (eine Dichte, die zu hoch ist, kann in der Regel verdünnt werden; bei bR, Anpassung an eine Trefferquote von 10-30 % in der Regel Worke auch d). Die Lipid-Matrix in die kubische Phase gebracht werden sollte, und die Kristallsuspension sollte homogen sein.

TR-SFX hält wesentliche Vorteile gegenüber anderen zeitaufgelöste Kristallographie-Techniken wie Laue Beugung, weil: Strahlenschäden ist begrenzt durch die Methodik der "Beugung vor Zerstörung", TR-SFX hat eine große zeitliche Auflösung über viele Aufträge von Größe im Femtosekunden-Bereich ermöglichen die kleinen Kristalle für bessere Photoaktivierungen und die Photocycles des Interesses müssen nicht umkehrbar sein.

TR-SFX auf eine XFEL mit hoher Viskosität Injektor hat erhebliche Vorteile gegenüber ein Flüssigkeitsstrahl Injektor in Bezug auf Probe Einsparungen. Direkten Vergleich PYP6 und bR10, zeigt beispielsweise eine Reduzierung um den Faktor 50 für die gleiche Menge an gesammelten Beugung Bilder. Flüssigkeitsstrahlen haben auf der anderen Seite einen Vorteil, dass die Strömung schnell ist und Datensammlung läuft auf Hochtouren (abwechselnd dunkle und helle Bilder), ohne Rücksicht auf Injektor Stream Geschwindigkeit Stabilität (oder leichte Verschmutzungen in dunklen Bildern). Während der Viskose Jet neue Herausforderungen hinzufügt, ist es überlegenswert, dass Flüssigkeitsstrahl TR-SFX Proteinmengen, die absolut unzumutbar verwendet, für viele biologisch relevante Systeme produzieren möglicherweise.

Derzeit ist Viskose Probenvorbereitung für TR-SFX durch Kristall-Kompatibilität mit dem Medium der Lieferung begrenzt. Zwar gab es mehrere alternative Viskose Träger umgesetzt, wurden keine gefunden, um für alle Fälle zu arbeiten. Darüber hinaus werden Musterlieferung mit einer hohen Viskosität Injektor immer Verstopfung oder sogar mit Optomozation unter Verwendung dieses Protokolls verlangsamt. Eine weitere Einschränkung der Technik ist die inhärente Reduktion in hit-Rate bei der Verdünnung der Probe um es zu Optomised Extrudability.

In Zukunft können TR-SFX-Methoden von Protein-Targets mit natürlichen Chromophore mit synthetischen Photoschaltern erweitert werden. Zeitaufgelöste Messungen an Reaktionen, die photoaktiviert nicht angewiesen auf mischen, Temperatur-Sprung, elektrische Felder oder andere Aktivierungs-Technologien, die noch nicht an die serielle Kristallographie angepasst werden. Eine Kombination dieser auslösende Technologien zusammen mit der zunehmenden Verfügbarkeit von XFEL Strahlzeit wird, im Laufe der Zeit legen den Grundstein für die strukturelle Dynamik der Proteinfunktion auf atomarer Ebene zu verstehen.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine widerstreitenden Interessen.

Acknowledgments

Wir erkennen Gebhard Schertler, Rafael Abela und Chris Milne zur Unterstützung des Einsatzes von hoher Viskosität Injektoren am PSI. Richard Neutze und sein Team sind für Diskussionen über die zeitaufgelöste Kristallographie und Probeneingang mit hoher Viskosität Injektoren anerkannt. Für die finanzielle Unterstützung, wir erkennen den Schweizerischen Nationalfonds für Zuschüsse 31003A_141235, 31003A_159558 (zu j.s.) und PZ00P3_174169 (um P.N.). Dieses Projekt wird finanziell von der Europäischen Union Horizont 2020 Forschungs- und Innovationsprogramm unter Marie Sklodowska-Curie-Stipendium Vereinbarung Nr. 701646.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mosquito LCP Syringe Coupling TTP labtech store 3072-01050
Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 µl Hamilton HA-81065
Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 µl Hamilton HA-81265
Monoolein Nu-Chek Prep, Inc. M-239
7.9 MAG Avanti Polar Lipids Inc. 850534O
50% w/v PEG 2000 Molecular Dimensions MD2-250-7
Paraffin (liquid) Sigma-Aldrich 1.07162
High speed camera Photron Photron Mini AX
High magnification lens Navitar 12X Zoom Lens System
Three axis stage ThorLabs PT3/M
Fiber light Thorlabs OSL2
Fused silica fiber Molex/Polymicro TSP-505375
Lite touch ferrule IDEX LT-100
ASU high viscosity injector Arizona State University Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu)
HPLC pump Shimadzu LC-20AD
Electronic gas regulator Proportion Air GP1

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References

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Chemie Ausgabe 144 zeitaufgelöste serielle Kristallographie Lipid-kubische Phase Bakteriorhodopsin Membranproteine hohe Viskosität Injektor Dreiwege Kupplung kostenlose Eletron Röntgenlaser
Verbesserung der hohen Viskosität Extrusion der Mikrokristalle für zeitaufgelöste serielle Femtosekunden Kristallographie an x-ray Laser
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James, D., Weinert, T., Skopintsev, P., Furrer, A., Gashi, D., Tanaka, T., Nango, E., Nogly, P., Standfuss, J. Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers. J. Vis. Exp. (144), e59087, doi:10.3791/59087 (2019).

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