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Chemistry

एक्स-रे लेसरों में समय-हल सीरियल femtosecond crystallography के लिए माइक्रोक्रिस्टल की उच्च चिपचिपापन बाहर निकालना में सुधार

Published: February 28, 2019 doi: 10.3791/59087

Summary

एक समय की सफलता का हल सीरियल femtosecond क्रि प्रयोग कुशल नमूना वितरण पर निर्भर है । यहाँ, हम प्रोटोकॉल का वर्णन एक उच्च चिपचिपापन माइक्रो-एक्सट्रूज़न इंटैक्टर से बैक्टीरियोरोहोडोसिन माइक्रोक्रिस्टल के बाहर निकालना का अनुकूलन करने के लिए । कार्यप्रणाली एक उपंयास तीन तरह युग्मक और एक उच्च गति कैमरे के साथ दृश्य के साथ नमूना एकरूपता पर निर्भर करता है ।

Abstract

उच्च चिपचिपापन माइक्रो-बाहर निकालना इंजेक्टर नाटकीय रूप से एक्स-रे मुक्त इलेक्ट्रॉन लेसरों (xfels) में सीरियल femtosecond क्रिस्टलीय प्रयोगों (sfx) में नमूना खपत कम कर दिया है । प्रकाश चालित प्रोटॉन पम्प बैक्टीरियोर्होडोसिन का उपयोग करके प्रयोगों की एक श्रृंखला ने इन इंजेक्टर को समय के लिए क्रिस्टल देने के लिए एक पसंदीदा विकल्प के रूप में स्थापित किया है-हल किए गए सीरियल femtosecond क्रि (TR-sfx) के संरचनात्मक परिवर्तन को हल करने के लिए photoactivation के बाद प्रोटीन । उच्च गुणवत्ता के कई संरचनात्मक स्नैपशॉट प्राप्त करने के लिए, यह डेटा की बड़ी मात्रा में इकट्ठा करने और हर पंप लेजर पल्स के बीच क्रिस्टल की मंजूरी सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है । यहाँ, हम विस्तार से वर्णन कैसे हम हमारे हाल ही में TR-sfx प्रयोगों के लिए बैक्टीरियोरोहोडोसिन माइक्रोक्रिस्टल के बाहर निकालना अनुकूलित linac सुसंगत प्रकाश स्रोत (lcls). इस विधि का लक्ष्य एक स्थिर और सतत प्रवाह के लिए बाहर निकालना का अनुकूलन है, जबकि क्रिस्टल की एक उच्च घनत्व को बनाए रखने के लिए दर जिस पर डेटा एक टी. आर. sfx प्रयोग में एकत्र किया जा सकता है बढ़ाने के लिए है । हम एक उपंयास तीन तरह सिरिंज युग्मन डिवाइस का उपयोग कर एक उच्च गति के साथ लिया बाहर निकालना स्थिरता की माप के आधार पर नमूना संरचना समायोजन द्वारा पीछा किया क्रिस्टल का एक समरूप वितरण के साथ lipidic घन चरण की तैयारी करके इस लक्ष्य को प्राप्त कैमरा सेटअप । कार्यप्रणाली को अन्य माइक्रोक्रिस्टल के प्रवाह को अनुकूलित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । सेटअप नए स्विस मुक्त इलेक्ट्रॉन लेजर सुविधा के उपयोगकर्ताओं के लिए उपलब्ध हो जाएगा ।

Introduction

सीरियल femtosecond क्रि (sfx) एक संरचनात्मक जीव विज्ञान तकनीक है कि एक्स-रे मुक्त इलेक्ट्रॉन लेसरों (xfel) के अद्वितीय गुणों का दोहन माइक्रोमीटर के हजारों से कमरे के तापमान संरचनाओं का निर्धारण करने के लिए है-क्रिस्टल आकार जबकि सबसे अधिक outrunning "विनाश से पहले विवर्तन" सिद्धांत1,2,3द्वारा विकिरण क्षति ।

sfx (TR-sfx) के एक समय हल विस्तार में, xfel से femtosecond दालों प्रोटीन में संरचनात्मक परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है4,5. ब्याज की प्रोटीन एक ऑप्टिकल लेजर के साथ सक्रिय है (या किसी अन्य गतिविधि ट्रिगर) बस एक पंप-जांच सेटअप में xfel द्वारा गोली मार दी जा रही करने से पहले. ठीक पंप और जांच दालों के बीच देरी को नियंत्रित करके, लक्ष्य प्रोटीन विभिन्न राज्यों में कब्जा कर लिया जा सकता है । समय में परिमाण के ग्यारह आदेश पर संरचनात्मक परिवर्तन की आणविक फिल्मों के कई प्रोटीन लक्ष्य की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए नए xfel स्रोतों की शक्ति का प्रदर्शन6,7,8,9, 10,11,12,13. मुख्य रूप से, विधि गतिशील स्पेक्ट्रोस्कोपिक और स्थैतिक संरचनात्मक तकनीकों को एक में जोड़ता है, निकट परमाणु संकल्प में प्रोटीन गतिशीलता में एक झलक प्रदान करता है ।

TR-sfx के लिए सरल प्रणालियों में रेटिनल की तरह एक फोटो-संवेदी घटक के साथ सक्रियण का एक अंतर्जात ट्रिगर हो सकता है बैक्टीरियोरहोडोप्सिन (bR)9,10, फोटोसिस्टम द्वितीय में क्रोमोफोर्स12,13, photoactive पीला प्रोटीन (pyp)6,7 वापस photoswitchable फ्लोरोसेंट प्रोटीन11, या एक photolyzable कार्बन मोनोऑक्साइड में मायोगोलोबिन8। तकनीक के रोमांचक रूपांतरों अभी भी विकास में मिश्रण पर भरोसा करते हैं और योजनाओं14,15 एंजाइमी प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए या एक इलेक्ट्रिक क्षेत्र संरचनात्मक परिवर्तन को प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया16. यह देखते हुए कि xfel सूत्रों केवल कुछ वर्षों के लिए उपलब्ध है और भविष्य में पिछले सफलताओं extrapolating, विधि एक असली खेल के रूप में क्षमता से पता चलता है कि कैसे प्रोटीन समारोह की हमारी समझ के संबंध में परिवर्तक ।

क्योंकि जैविक नमूनों एक उच्च शक्ति xfel पल्स करने के लिए एक ही जोखिम से नष्ट कर रहे हैं, प्रोटीन क्रि के लिए नए दृष्टिकोण आवश्यक थे । इन प्रक्रियाओं के अलावा,17,18,19विकसित किया जा करने के लिए आवश्यक वर्दी microक्रिस्टलों की बड़ी मात्रा बढ़ने की क्षमता । एक xfel पर डेटा संग्रह को सक्षम करने के लिए, इन क्रिस्टल वितरित किया जाना चाहिए, छोड़ दिया, और फिर प्रत्येक xfel पल्स के लिए नवीनीकृत । यह देखते हुए कि xfels आग 10-120 हर्ट्ज पर प्रयोग करने योग्य दालों, नमूना वितरण तेजी से होना चाहिए, स्थिर, और विश्वसनीय, जबकि भी क्रिस्टल बरकरार रखने और खपत सीमित. सबसे सफल समाधानों में से एक उच्च चिपचिपापन माइक्रो-एक्सट्रूज़न इंजैक्टर है, जो स्पंदित एक्स-रे बीम20के पार कमरे के तापमान क्रिस्टल-लादेन lipidic घन चरण (lcp) के एक continiously स्ट्रीमिंग कॉलम बचाता है । बेतरतीब ढंग से उन्मुख क्रिस्टल, lcp स्ट्रीम में एम्बेडेड, कि xfel दलहन तितर-बितर एक्स-किरणों एक डिटेक्टर पर जहां एक विवर्तन पैटर्न दर्ज किया गया है द्वारा रोक रहे हैं. lcp एक नमूना वितरण माध्यम के लिए एक प्राकृतिक विकल्प था क्योंकि यह अक्सर झिल्ली प्रोटीन क्रिस्टल के लिए एक विकास माध्यम के रूप में प्रयोग किया जाता है17,21,22,23, अभी तक अन्य उच्च चिपचिपापन वाहक मीडिया 24,25,26,27,28,29,30 और घुलनशील प्रोटीन31 भी सुई लगानेवाला में इस्तेमाल किया गया है । उच्च चिपचिपापन सुई लगानेवाला के साथ sfx झिल्ली प्रोटीन की संरचना निर्धारण के दौरान सफल रहा है13,३२ जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स सहित (gpcrs)३३,३४, ३५,३६,३७, समय और नमूना कुशल दोनों जा रहा है जबकि देशी चरणबद्ध३८,३९ के लिए पर्याप्त डेटा गुणवत्ता के साथ. वर्तमान में, इन इंजेक्टर सिंक्रोट्रॉन स्रोतों पर कमरे के तापमान मापन के लिए और अधिक नियमित रूप से इस्तेमाल किया जा रहा है28,30,४०,४१ के रूप में के रूप में अच्छी तरह के रूप में अधिक तकनीकी रूप से xfels9,10,13,४२में TR-sfx प्रयोगों की मांग ।

तुलनीय TR-sfx प्रयोगों एक प्रवाह केंद्रित नोक6,7,12में तरल चरण वितरण की तरह अन्य इंटैक्टर प्रकार का उपयोग किया गया है, हालांकि, इस विधि प्रोटीन मात्रा के लिए कई उपलब्ध नहीं है की आवश्यकता जैविक रूप से दिलचस्प लक्ष्य । चिपचिपा बाहर निकालना का उपयोग कर स्थैतिक संरचनाओं के निर्धारण के लिए ०.०७२ प्रति प्रोटीन के मिलीग्राम की औसत खपत १०,००० अनुक्रमित विवर्तन पैटर्न की तुलना में ९.३५ मिलीग्राम तरल जेट नलिका के लिए सूचित किया गया है (यानी, के बारे में १३० बार अधिक नमूना दक्ष)20. उच्च चिपचिपापन इंटैक्टर TR-sfx के लिए एक व्यवहार्य नमूना वितरण उपकरण होने के लिए दिखाया गया है जबकि केवल इस नमूना दक्षता४३के कुछ त्याग । nogly एट अल में (२०१८)10, उदाहरण के लिए, नमूना खपत के बारे में था १.५ १०,००० अनुक्रमित पैटर्न प्रति मिलीग्राम, जो समान TR-sfx प्रयोगों के लिए अनुकूल तुलना pyp जहां औसत नमूना उपभोग के साथ बहुत अधिक था ७४ प्रति प्रोटीन की मिलीग्राम १०,००० अनुक्रमित पैटर्न6। उच्च चिपचिपापन इंजेक्टर इस प्रकार स्पष्ट लाभ है जब उपलब्ध प्रोटीन की मात्रा सीमित है या जब क्रिस्टल सीधे lcp में उगाया जाता है ।

टी. आर.-sfx के लिए उच्च चिपचिपापन इंजेक्टर का उपयोग करने के लिए सबसे विश्वसनीय डेटा कई तकनीकी मुद्दों को संबोधित किया जाना चाहिए उपज: प्रवाह की गति के लिए एक ंयूनतम महत्वपूर्ण मूल्य से ऊपर रहने की जरूरत है; हिट-दर को उस स्तर पर बनाए रखा जाना चाहिए जो डेटा संग्रह को धीमा नहीं करता है (उदा., 5% से अधिक); और नमूना अत्यधिक अवरोधों के बिना डिलीवर किया जाना चाहिए । आदर्श रूप में, इन शर्तों को पहले से ही एक अनुसूचित TR-sfx प्रयोग के लिए उपलब्ध xfel समय के रूप में कुशलता से संभव के रूप में उपयोग करने से पहले मिले हैं । pricipally, lcp स्ट्रीम में मंदी क्रिस्टल है कि एक से अधिक ऑप्टिकल लेजर पल्स और मिश्रित सक्रिय राज्यों में परिणाम के साथ सक्रिय थे की जांच की अनुमति हो सकती है, या पंप सामग्री की जांच जब umpumped सामग्री बीम में उंमीद है । इंजेक्शन पूर्व परीक्षण का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि एक xfel पर डेटा संग्रह के दौरान डाउनटाइम भरा हुआ नलिका की जगह के लिए समय जनमानस के रूप में कम है, बाहर गैर extruding नमूनों को बदलने, और अन्य रखरखाव कार्य कम है.

यहाँ, हम एक उच्च चिपचिपापन माइक्रो-एक्सट्रूज़न इंटैक्टर के साथ TR-sfx डेटा संग्रह के लिए नमूना वितरण का अनुकूलन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । सादगी के लिए, वर्णित तरीकों एक एक्स-रे स्रोत के लिए उपयोग पर भरोसा नहीं करते हैं, हालांकि एक सिंक्रोट्रॉन बीएमलाइन पर काम29 अपेक्षित हिट दरों और क्रिस्टल विवर्तन के बारे में अधिक जानकारी प्रदान करेगा. हमारे प्रोटोकॉल्स को प्रोटॉन-पम्प बैक्टीरियोरोडोसिन10 में रेटिना आइसोमेराइजेशन को कैप्चर करने के लिए प्रयोगों का अनुकूलन करने के लिए विकसित किया गया है और एक्सट्रूज़न की निगरानी के बाद एक्सट्रूज़न के लिए क्रिस्टल नमूनों को तैयार करने के साथ शुरू होने वाले दो चरणों में किए जाते हैं एक उच्च गति कैमरा सेटअप का उपयोग करना । एक चरण में, क्रिस्टल-लादेन lcp अतिरिक्त lcp के साथ मिलाया जाता है, कम संक्रमण तापमान लिपिड, या अन्य additives अंतिम मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए कॉलेस्ट्रॉल या धीमा के बिना नमूना वातावरण में वितरण के लिए उपयुक्त है. एक नया तीन तरह सिरिंज युग्मक मिश्रण प्रदर्शन और नमूना एकरूपता में सुधार करने के लिए विकसित किया गया था. दूसरे चरण में एक बाहर निकालना परीक्षण के एक उच्च गति कैमरे द्वारा दर्ज सीधे बाहर निकालना गति स्थिरता को मापने के लिए होते हैं । वीडियो डेटा के विश्लेषण के बाद, प्रयोगात्मक परिणामों में सुधार करने के लिए नमूना तैयारी प्रोटोकॉल में समायोजन किया जा सकता है । इन प्रक्रियाओं टीटीआर के लिए अन्य प्रोटीन तैयार करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है-sfx डेटा संग्रह, न्यूनतम संशोधनों के साथ, और सीमित xfel beamtime के कुशल उपयोग करने के लिए योगदान देगा. नए xfel सुविधाओं के साथ सिर्फ अपने ऑपरेशन४४,४५ और इंजैक्टर-आधारित धारावाहिक डेटा संग्रह विधियों के हस्तांतरण शुरू करने के लिए synchrotrons28,30,४०,४१ , अगले कुछ वर्षों निश्चित रूप से प्रोटीन लक्ष्य की एक कभी व्यापक रेंज की संरचनात्मक गतिशीलता में रोमांचक नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए जारी रहेगा ।

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Protocol

1. प्रोटीन क्रिस्टल नमूना तैयारी

  1. के बारे में 30 मिनट पहले नमूना इंजेक्शन किया जा करने के लिए है, लोड ५० μl के क्रिस्टल-लादेन monoolein आधारित lcp में एक १०० μl सिरिंज.
  2. वायुमंडलीय दबाव में इंजेक्शन के लिए: एक दूसरे सिरिंज के पीछे में तरल पैराफिन के 10 μl लोड । सिरिंज के लंबवत पकड़े हुए, सिरिंज से हवा के बुलबुले निष्कासित ।
    1. वैक्यूम वातावरण में इंजेक्शन के लिए: एक दूसरे सिरिंज के पीछे में पत्रिका ७.९ और 5 μl के तरल पैराफिन के 5 μl लोड करें । सिरिंज के लंबवत पकड़े हुए, सिरिंज से हवा के बुलबुले निष्कासित ।
  3. एक मानक सिरिंज युग्मक के लिए पैराफिन/पत्रिका ७.९ के साथ सिरिंज कनेक्ट करें, धीरे से एक छोटी सी मात्रा (< 1 μl) के पैराफिन के ऊपर दबाकर युग्मक पर दबाव से हवा पर्ज करें । युग्मक सुई की नोक पर दिखाई देता है ।
  4. नमूने में किसी भी हवा का परिचय नहीं करने के लिए देखभाल कर रही है, सिरिंज युग्मक के लिए नमूना सिरिंज कनेक्ट. एक से अधिक बार युग्मक के माध्यम से नमूना सामग्री को पारित करके लिपिड/पैराफिन में मिलाएं ।
  5. premixed lcp के 20 μl लोड (27% खूंटी, १०० मिमी sorensen पीएच ५.६ + MO) में एक और १०० μl सिरिंज. आवश्यक के रूप में हवा के बुलबुले निकालें ।
  6. युग्मक से खाली सिरिंज निकालें और premixed lcp क्रिस्टल युक्त सिरिंज एक मानक सिरिंज युग्मक का उपयोग करने के लिए देते हैं. युग्मक १०० बार के माध्यम से नमूना पास ।
    नोट: नमूना मिश्रण थोड़ा४६गर्मी हो सकती है । मिश्रण एक धीमी गति से किया जाना चाहिए जहां नमूना के तापमान यथोचित लगातार आयोजित किया जा सकता है ।
  7. प्रकाश के स्रोत के विरुद्ध पारदर्शिता के लिए नमूने का निरीक्षण करें । यदि कोई स्पष्ट सजातीय lcp का गठन किया है, तो चरण १.९ पर जाएं ।
  8. घन चरण में नमूना लाने के लिए, monoolein के 3 μl जोड़ने और मिश्रण ५० बार (जैसा कि ऊपर वर्णित है). इस प्रक्रिया को दोहराएं बस जब तक एक पारदर्शी चरण monoolein की एक अतिरिक्त से बचने के लिए गठन किया है ।
    नोट: lcp के गठन के तापमान पर निर्भर है४७ और सबसे अच्छा परिणाम थोड़ा 20 डिग्री सेल्सियस से ऊपर प्राप्त कर रहे हैं । अतिरिक्त monoolein की राशि की जरूरत अवशिष्ट अवक्षेपक समाधान क्रिस्टलीकरण से अधिक की मात्रा पर निर्भर करेगा ।
  9. नमूना कठोरता के लिए एक प्रारंभिक परीक्षण के रूप में (lcp चरण से उम्मीद के रूप में) और extrude-क्षमता, सिरिंज युग्मक से खाली सिरिंज अलग और, सिरिंज खड़ी पकड़, नमूने की एक छोटी राशि निचोड़ (< 2 μl) युग्मक के माध्यम से. extruded नमूना एक ईमानदार सिलेंडर रूपों, तो नमूना बाहर निकालना परीक्षण के लिए तैयार है.
  10. अधिक premixed lcp (के रूप में चरण १.५ में) जोड़कर १०० μl करने के लिए नमूना की कुल मात्रा समायोजित करें ।
  11. तीन-तरफा सिरिंज युग्मक (पहले की तरह युग्मक से हवा को मिटाने) के लिए नमूना सिरिंज और दो खाली सिरिंज संलग्न करें । मिश्रण से कम ५० बार (या सजातीय तक) दूसरा सिरिंज में नमूना के आधे से गुजर रहा है और फिर एक साथ तीसरे सिरिंज में नमूने के दोनों हिस्सों दबाने से.
  12. क्रिस्टल का एक समरूप वितरण सत्यापित करने के लिए एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत मिश्रित नमूना युक्त सिरिंज रखें ।

2. परीक्षण नमूना बाहर निकालना एक उच्च गति कैमरा सेटअप का उपयोग

  1. प्रायोगिक मापदंडों का निर्धारण करना.
    1. परीक्षण के लिए नोजल आकार का चयन करें ।
      नोट: नोजल आकार आम तौर पर ५० या ७५ μm आंतरिक व्यास (आईडी) हैं, लेकिन मोटे तौर पर 30-100 μm आईडी से किसी भी आकार पर विचार किया जा सकता है । चयन कॉलेस्ट्रॉल समय, पृष्ठभूमि तितर बितर, नमूना उपभोग, और हिट दर के बीच एक संतुलन पर आधारित है ।
    2. प्रयोगात्मक लेजर स्पॉट आकार (1/ई2 व्यास), और डेटा संग्रह योजना (जैसे, इंटरलीव्ड प्रकाश और अंधेरे) है कि xfel पर इस्तेमाल किया जाएगा के आधार पर इष्टतम प्रवाह की गति की गणना ।
    3. इष्टतम प्रवाह गति (Equation 1Equation 2) और चयनित नोक व्यास (Equation 3) से नमूने की वांछित प्रवाह दर () की गणना:
      Equation 4
      प्रवाह दर (Equation 5) कि hplc पंप पर प्रवर्धन कारकEquation 6के आधार पर दर्ज किया जाना चाहिए का निर्धारण () सुई लगानेवाला की.
      Equation 7
      नोजल फिटिंग (Equation 8Equation 9) के रेटेड दबाव से अधिकतम दबाव () की गणना और इंसेप्टर का प्रवर्धन कारक (Equation 10):
      Equation 11
  2. चित्र 1में दिखाए गए अनुसार ऑफ़लाइन उपयोग के लिए उच्च चिपचिपापन एक्सट्रूज़न इंटैक्टर का सेटअप ।
    नोट: एक एचपीएलसी पंप द्वारा संचालित हाइड्रोलिक एक्सट्रूज़न के माध्यम से सुई लगानेवाला कार्य करता है, और गैस नियामक द्वारा नियंत्रित एक सह-बहने वाली हीलियम गैस म्यान का उपयोग करती है । पंप और नियामक सेटअप इस प्रोटोकॉल में चर्चा नहीं कर रहे हैं । एक विस्तृत मैनुअल के लिए जेंस (२०१५)४८ में अध्याय चार देखें ।
    1. पंप और सभी पानी लाइनों को शुद्ध करने के लिए flowrates सुनिश्चित करने के लिए शुद्ध कर रहे हैं । सुई लगानेवाला के हाइड्रोलिक चरण को पुज ।
    2. माउंट इंटैक्टर (या कैमरा) एक तीन अक्ष मंच पर तैयार करने की सुविधा के लिए और उच्च गति वीडियो के लिए ध्यान केंद्रित । उद्देश्य लेंस, रोशनी, चिंतनशील स्क्रीन, और एक छोटे बीकर के लिए इंजेक्शन बिंदु के आसपास अंतरिक्ष छोड़ गुजारे नमूने को पकड़ने के लिए ।
    3. एक "डमी नोक" (संलग्न एक नोक के साथ एक खाली जलाशय) का निर्माण और यह स्थिति, ध्यान, और रोशनी की सुविधा के लिए सुई लगानेवाला पर स्थापित करें ।
    4. उद्देश्य के फोकल प्वाइंट के पास नोक टिप के साथ उच्च गति कैमरा माउंट ।
    5. सुई लगानेवाला के पीछे चिंतनशील स्क्रीन स्थिति और सामने प्रकाश नोक को रोशनी समायोजित करें ।
    6. चालू करें और प्रदान किए गए सॉफ़्टवेयर के साथ कैमरे से कनेक्ट करें. दृश्य प्रतिक्रिया के लिए चल रहे एक लाइव वीडियो के साथ, फ्रेम के केंद्र में नोक टिप स्थिति, और तीन अक्ष मंच के साथ ध्यान में लाने के लिए ।
    7. प्रदीप्ति को तब तक समायोजित करें जब तक नोजल स्पष्ट रूप से दिखाई न दे और पृष्ठभूमि समान रूप से रोशन हो ।
  3. उच्च गति समय-चूक वीडियो रिकॉर्ड करने के लिए कैमरे को कॉन्फ़िगर करना.
    1. १००० एफपीएस के लिए framerate सेट करें । ५१२ x ५१२ पिक्सेल करने के लिए रिज़ॉल्यूशन सेट करें ।
    2. जोखिम समय के साथ अब फ्रेम दर से सेट, नोजल दिखाई दे रहा है जब तक रोशनी स्तर को समायोजित (यानी, के तहत नहीं या overexposed). नोक टिप की स्थिति इतनी है कि यह सही करने के लिए छोड़ दिया केंद्रित है और फ्रेम के शीर्ष तीसरे में स्थित है ।
    3. कोई भी पृष्ठभूमि सुधार या श्वेत संतुलन कार्रवाइयां चलाएं ।
    4. समय-व्यतीत मोड में कैमरा सेट करें । 30 s करने के लिए अंतराल सेट करें और ४० बारकरने के लिए दोहराता, रैंडम (या रैंडम रीसेट) के लिए ट्रिगर मोड सेट करें, और १०००करने के लिए रिकॉर्ड करने के लिए फ्रेम की संख्या दर्ज करें ।
  4. परीक्षण नमूने के 20 μl के साथ जलाशय लोड, और केशिका नोक देते हैं ।
  5. भरे हुए जलाशय को इंटैक्टर में अटैच करें । नोजल पर बंदरगाह के लिए गैस लाइन देते है और गैस का प्रवाह शुरू करते हैं ।
  6. मैन्युअल रूप से पिस्टन में लाइन वाल्व खोलने और सिरिंज दबाने से अग्रिम । वाल्व बंद करें जब पिस्टन जलाशय में नमूने के साथ ठोस संपर्क करता है ।
  7. कार्यक्रम की गणना प्रवाह दर के साथ पंप और गणना मूल्य के लिए अधिकतम दबाव सेट (2.1.3 कदम देखें) ।
  8. इसके साथ ही पंप और कैमरा रिकॉर्डिंग शुरू करें ।
  9. के रूप में बाहर निकालना शुरू होता है, स्थिरता बढ़ाने के लिए गैस के दबाव को समायोजित । गैस के दबाव को बढ़ाएं यदि द्रव एक कॉलम के बजाय नोक की नोक पर एक बूंद बनाता है । दबाव में कमी अगर बाहर निकालना गैस के प्रवाह से अत्यधिक कतरें के कारण टूट गया है, या तेजी से दोलायमान है (कोसा) ।
  10. बाहर निकालना मॉनिटर (10 मिनट एक समरूप प्रवाह हालत पहचान करने के लिए आम तौर पर पर्याप्त है) और, जब पंप दबाव तेजी से अपेक्षित अंत समय के पास रैंप, रिकॉर्डिंग बंद करो, बंद पंप, और राहत वाल्व खोलने के द्वारा प्रणाली के दबाव वेंट ।
  11. वीडियो फ़ाइलों का विश्लेषण
    नोट: नमूना बाहर निकालना है कि स्पष्ट रूप से अपर्याप्त है एक विस्तृत विश्लेषण की आवश्यकता नहीं है । हालांकि, यह अभी भी विफलता मोड की पहचान करने के लिए उपयोगी है ताकि नमूना ऑप्टिमाइज़ किया जा सकता है ।
    1. विश्लेषण सॉफ़्टवेयर (उदा., फिजी४९) के साथ वीडियो फ़ाइल खोलें और मापन उपकरणों को कैलिब्रेट करें ।
    2. लाइन चयन उपकरण के साथ वीडियो छवि में ज्ञात लंबाई की एक पंक्ति का चयन करके माप जांचना । विश्लेषण के माध्यम से सेट स्केल विंडो खोलें । स्केल सेट करें और ज्ञात दूरी और माप की इकाइयां दर्ज करें ।
      नोट: नोजल के ज्ञात व्यास इन मापन के लिए एक पर्याप्त अंशांकन लंबाई प्रदान करता है ।
    3. वीडियो में एक फ्रेम का पता लगाएं, जहां एक trackable सुविधा दिखाई (उदाहरण के लिए, एक क्रिस्टल) बाहर निकालना में । फ़्रेम संख्या रिकॉर्ड है ।
    4. एक फ्रेम जहां एक ही सुविधा दिखाई है, लेकिन पिछले चरण में अपनी स्थिति से स्थानांतरित कर दिया है के लिए वीडियो अग्रिम । फ़्रेम संख्या रिकॉर्ड है ।
    5. सीधे लाइन मापन उपकरण का उपयोग, विश्लेषण के माध्यम से सुविधा शुरू और समापन बिंदु से दूरी को मापने । उपाय.
      नोट: अब trackable दूरी, माप में कम त्रुटियों की गणना को प्रभावित करेगा
    6. मापा दूरी और गुजरे समय से जेट गति की गणना (बीता फ्रेम framerate द्वारा विभाजित की संख्या.)
    7. वीडियो के हर सेगमेंट के लिए कई बार 2.11.3-2.11.6 चरण दोहराएँ.
    8. डेटा श्रृंखला को चित्र 2के रूप में प्लॉट करना ।

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Representative Results

यहां वर्णित प्रक्रियाओं के लिए आदर्श प्रारंभिक सामग्री (चित्रा 3) सुई लगानेवाला के लिए चिपचिपा वाहक माध्यम में शामिल माइक्रोक्रिस्टल के उच्च घनत्व हैं । प्रक्रिया प्रत्येक तैयारी के लिए क्रिस्टल लादेन वाहक के बारे में ५० μl के लिए कहते हैं । ये बीआर9के साथ के रूप में सीधे lcp में उगाया जा सकता है,10 यहाँ इस्तेमाल किया, एक उदाहरण के रूप में (चित्रा 4), या पारंपरिक वाष्प प्रसार setups में उगाए गए क्रिस्टल का उपयोग कर तैयार. सीधे गैसटाइट सिरिंज में क्रिस्टलीकरण के लिए एक उत्कृष्ट वीडियो गाइड इश्चेंको एट अल में पाया जा सकता है (२०१६)३७. बीआर के साथ, क्रिस्टलीय प्लेटों का आदर्श व्यास लगभग 20 μm है जो पंप लेजर द्वारा डिवर्तन शक्ति और समरूप सक्रियण के बीच एक अच्छा समझौता है । प्रोटीन क्रिस्टल, के रूप में ऊपर समझाया प्रोटोकॉल का उपयोग कर तैयार, प्रोटॉन पंप बीआर जो ultrafast परिवर्तन है कि फोटॉन अवशोषण (चित्रा 5) के बाद होने से पता चला पर TR-sfx डेटा इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया गया ।

तीन तरह युग्मक (चित्रा 6a, बी) का उपयोग नमूना तैयारी के बाद, सिरिंज में नमूना सामग्री के दृश्य निरीक्षण नमूना एकरूपता (चित्रा 6a, डी) से पता चलता है, और मिश्रित नमूना के माइक्रोस्कोप छवियों, दोनों में सिरिंज और एक स्लाइड पर, क्रिस्टल के घनत्व की पुष्टि कर सकते हैं और क्रिस्टल आकार, क्रिस्टल आकार वितरण, और क्रिस्टल घनत्व के मापन के लिए अनुमति देता है । नमूना है घन चरण में जब प्रसव के माध्यम स्पष्ट है (चित्रा 7) और चिपचिपा. टर्बिड मिश्रण एक संकेत है कि नमूना एक स्पंज चरण या पटलिका चरण में है, लेकिन उच्च क्रिस्टल घनत्व lcps स्पष्टता अस्पष्ट हो सकता है के रूप में निर्णायक नहीं हैं. तरल स्पंज चरण की पहचान करने के लिए एक संक्षिप्त कम दबाव परीक्षण सिरिंज की पीठ में नमूने से दूर सिरिंज प्लंजर खींच कर किया जा सकता है । पटलिका प्रावस्था को ध्रुवित प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ अपने द्विअपघर्षण के माध्यम से आसानी से पहचाना जा सकता है । ये एक पूर्व-बाहर निकालना परीक्षण के साथ मिलकर परीक्षण आमतौर पर सुई लगानेवाला में एक परीक्षण का औचित्य साबित करने के लिए पर्याप्त हैं.

xfels की उच्च पुनरावृत्ति दर एक प्रवाह की गति है कि पर्याप्त रूप से कम फ्रेम दर कैमरों के साथ मनाया नहीं जा सकता की आवश्यकता है । इसलिए, बाहर निकालना लक्षण वर्णन एक उच्च गति कैमरा का उपयोग किया जाता है (एक उच्च इज़ाफ़ा लेंस के लिए युग्मित) कि समय चूक वीडियो रिकॉर्ड कर सकते हैं । वीडियो डेटा उच्च गति है कि फ्रेम में १००० एफपीएस पर दर्ज कर रहे हैं, और यह भी है कि वीडियो में समय चूक 1 एस हर 30 एस के लिए दर्ज की गई है । इस डेटा संग्रह योजना के पूरे नमूना परीक्षण के दौरान डेटा संग्रह के लिए अनुमति देगा (लगभग 10 मिनट) विकराल वीडियो फ़ाइलों को बनाए बिना । यहां तक कि यह कम डेटा सेट आकार के साथ, वीडियो फ़ाइलों को अभी भी ५० GB से अधिक हो सकता है । परीक्षण शुरू होने से पहले वीडियो डेटा को सहेजने के लिए पर्याप्त भंडारण सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए ।

जेट परीक्षण (चित्रा 1) के दौरान, नमूना एक लंबे समय (से अधिक २०० μm) lcp कि एक लगभग लगातार वेग (चित्रा 2) पर चलता रहता है की सतत कॉलम बाहर निकालना चाहिए । नमूने कि एक टपकता मोड में चलने से संकेत मिलता है कि नमूना चिपचिपापन बहुत कम है (चित्रा 2) । नमूने अक्सर बरामद किया जा सकता है और अधिक monoolein या पैराफिन के साथ मिश्रित चिपचिपापन अनुकूलित करने के लिए । नमूने है कि एक कॉलम के रूप में उच्च गति कैमरे के साथ परीक्षण किया जाना चाहिए । रिकॉर्डिंग से डेटा दिखाना चाहिए कि बाहर निकालना एक ंयूनतम गति अपने प्रयोगात्मक मापदंडों द्वारा निर्धारित से ऊपर रहता है । एक्सट्रूज़न गति रैखिक दूरी को मापने के द्वारा निर्धारित किया जाता है lcp स्ट्रीम में एक सुविधा फ्रेम के एक नंबर पर यात्रा करता है । बाहर निकालना धीमी चढ़ाव है कि असंगत मोज़री वारंट retesting के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । यदि वे जारी रहती है jetting पैराफिन जैसे additives द्वारा सुधार किया जाना चाहिए, क्रिस्टल के घनत्व को कम करने, या एक बड़ा व्यास नोक का चयन करके । क्रिस्टल सामान्य रूप से एक चिपचिपा माध्यम में नहीं उगाया जाता है (जैसे, वाष्प प्रसार) को अपकेंद्रीकरण द्वारा पेलेटेड किया जा सकता है और इसे एलसीपी या अन्य चिपचिपा वाहक में शामिल कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, पिछला प्रकाशन24,25,26,27,29,30देखें ।

Figure 1
चित्रा 1: उच्च गति कैमरा बेंच सेटअप । लेबल आवश्यक भागों के साथ एक ठेठ बेंच टॉप सेटअप की एक तस्वीर । तीन अक्ष मंच तैयार करने में लचीलापन प्रदान करता है और छवि को ध्यान केंद्रित । सुई लगानेवाला (नोक और संलग्न जलाशय के साथ दिखाया गया है) खड़ी घुड़सवार, और सीधे उद्देश्य लेंस के सामने. इस उदाहरण में प्रदीप्ति एक एकल फाइबर प्रकाश द्वारा प्रदान की जाती है जिसका नमूना बंद अक्ष और स्क्रीन पर एक उज्ज्वल क्षेत्र प्रदान करता है । एक नमूना घुड़सवार और इस तरह से प्रबुद्ध इनसेट बी में एक की तरह एक छवि प्रदान करता है कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: उच्च गति कैमरा परीक्षण और डेटा विश्लेषण. ऊपर चित्र दो lcp बाहर निकालना परीक्षण कर रहे हैं । नमूना ऑप्टिमाइज़ नहीं किया गया है जो इंगित करता है कि एक टपकता मोड में extruding lcp में कोई दिखाता है bR क्रिस्टल का परीक्षण । परीक्षण बी lcp बाहर निकालना lcp जहां क्रिस्टल ट्रैक किया जा सकता है की एक सतत कॉलम बनाने से पता चलता है, और बाहर निकालना गति की गणना की जा सकती है । इस उदाहरण में, lcp स्तंभ (५० μm व्यास) में एम्बेडेड क्रिस्टल 8 ms (३७.६ mm/s) में ३०१ μm ले जाता है । एलसीपी में बैक्टीरियोरोडोप्सिन क्रिस्टल की विभिन्न तैयारियों से दो डेटा सेट दिखाए जाते हैं । समय के प्रत्येक सेकंड से चार (या अधिक) डेटा अंक-चूक उच्च गति कैमरा वीडियो (प्रत्येक 30 एस रिकॉर्डिंग के 1 एस) प्लॉट किए गए थे । एकल सेकंड डेटा संग्रह अवधि से लिए गए डेटा बिंदुओं के बीच एक बड़ा स्प्रेड अल्पकालिक गति भिन्नता का संकेत देता है. जबकि पूरे डेटा श्रृंखला पर एक चलती औसत प्रवाह में अब उतार चढ़ाव से पता चलता है । शीर्ष श्रृंखला एक खराब extruding नमूना (दो लगातार पंप लेजर दालों के साथ प्रकाश संदूषण के लिए उच्च मौका) से है, और नीचे श्रृंखला बेहतर प्रदर्शन किया है कि एक नमूने से है । क्षैतिज बिंदीदार रेखा लक्ष्य बाहर निकालना hplc पंप के माध्यम से निर्धारित गति को इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: नमूना तैयारी फ़्लोचार्ट । नमूना तैयारी प्रोटीन lcp में एंबेडेड क्रिस्टल का एक उच्च घनत्व के साथ शुरू होता है । नमूना तो कम संक्रमण तापमान लिपिड, पैराफिन के साथ मिलाया जाता है, और नमूना घन चरण में आता है जब तक lcp तैयार है, और संकेत मिलता है कि नमूना सुई लगानेवाला में बाहर निकालना जाएगा करने के लिए छोटे परीक्षणों की एक श्रृंखला गुजरता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: सामग्री शुरू करने के रूप में बैक्टीरियोरोडोप्सिन क्रिस्टल । क्रिस्टल गैस में बड़े हो रहे है तंग सिरिंज (एक,) lcp के साथ अवक्षेपक समाधान में डूबे । क्रिस्टलीकरण क्रिस्टल के एक संभवतः संकीर्ण आकार वितरण (बी) के साथ एक उच्च घनत्व के लिए अनुकूलित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5: बैक्टीरियोरोडोप्सिन में संरचनात्मक परिवर्तन । TR-sfx प्रोटॉन पम्प बैक्टीरियोरहोडोप्सिन की संरचना में अल्ट्रा तेजी से परिवर्तन का पता चलता है । यहां इस कार्य में उल्लिखित प्रोटोकॉल्स का उपयोग करके तैयार क्रिस्टल से प्राप्त TR-sfx डेटा से प्राप्त bR का एक मॉडल चित्रित किया गया है । बाएँ पैनल रेटिना बाइंडिंग जेब में प्रकाश डाला सुविधाओं के साथ मॉडल से पता चलता है. सही पैनल रेटिनल में फेमटो सेकेन्ड से मिलीसेकंड में परिवर्तन दिखाता है । यह आंकड़ा nogly एट अल से reproduced किया गया था (२०१८)10 अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: तीन तरह युग्मक । तीन-तरफा युग्मक एक कम डेड-वॉल्यूम Y मिक्सर गैसटाइट सिरिंज के साथ संगतता के लिए डिज़ाइन किया गया है । युग्मक की 3d renderings, असेंबली (a) का एक विस्फोट दृश्य दिखाएँ, और एक पारदर्शी मिश्रण चैनल (B) दिखा रहा है देखें । आंकड़ा मानक युग्मक (सी), और तीन तरह युग्मक (डी) में मिश्रण के बाद परिणामी निलंबन के साथ मिश्रण के बाद एक असमघाती क्रिस्टल वितरण से पता चलता है । मिश्रण एक और सिरिंज (ई) में नमूना के मोटे तौर पर आधा धक्का द्वारा पूरा किया है, और फिर शेष सिरिंज में दोनों हिस्सों एक साथ धक्का के रूप में नीले तीर (एफ) द्वारा सचित्र । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: पूर्व इंजेक्शन परीक्षण संकेतक । नमूना तैयारी के दौरान, कई छोटे परीक्षणों का संकेत है कि नमूना चरण में है, और पर्याप्त रूप से चिपचिपा किया जाता है । ऑप्टिकल स्पष्टता एक संकेत है कि नमूना घन चरण में होने की संभावना है । (क) सिरिंज में एक टर्बिड नमूना दिखाया गया है । (ख) एक स्पष्ट नमूना दिखाया गया है, माइक्रो क्रिस्टल के उच्च घनत्व के बावजूद नमूने के माध्यम से दिखाई स्नातक लाइनों नोट. जब लिपिड मैट्रिक्स घन चरण में है, यह ठोस की तरह रहता है जब कोई तनाव के तहत । एक कम दबाव परीक्षण नमूना के पीछे से सिरिंज दूर खींच द्वारा किया जाता है. जब नमूना भी तरल की तरह है (स्पंज चरण का संकेत) नमूना मात्रा (सी) को भरने के लिए फैलता है. एक ही परीक्षण (डी) के एक सकारात्मक परिणाम में, नमूना वापस ले लिया प्लंजर के बावजूद स्थिर रहता है. अंत में, एक स्थूल पैमाने पर बाहर निकालना परीक्षण सिरिंज युग्मक के माध्यम से नमूना की एक छोटी राशि दबाकर किया जाता है. एक छोटी बूंद नोक नोक (ई) या lcp के एक जल्दी झुकने सिलेंडर पर गठन एक नमूना है कि पर्याप्त चिपचिपा नहीं है इंगित करता है । नमूना extrudes, एक सिलेंडर, जो समय के साथ ईमानदार रहता है रूपों (एफ), तो नमूना उच्च गति कैमरा परीक्षण करने के लिए अग्रिम कर सकते हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

चिपचिपा बाहर निकालना इंटैक्टर के साथ टी. आर.-sfx विधि बैक्टीरियोरोहोडोसिन9,10 और photosystem द्वितीय13 के संरचनात्मक गतिशीलता अध्ययन के लिए एक व्यवहार्य तकनीक साबित हो गया है और अब प्रोटीन अन्य ड्राइविंग अध्ययन करने के लिए तैयार लगता है प्रकाश संचालित आयन परिवहन या संवेदी धारणा के रूप में फोटो जैविक प्रक्रियाओं5,५०। ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल टी. आर.-sfx डेटा संग्रह की सफलता बैक्टीरियोरोहोडोसिन पर अधिकतम करने के लिए डिजाइन किए गए थे, फिर भी हमें विश्वास है कि अन्य नमूनों पर डेटा संग्रह का अनुकूलन करने के लिए एक टेम्पलेट के रूप में कार्य कर सकते हैं । इस तरह, कीमती beamtime के बहुत वर्तमान में क्योंकि कॉलेस्ट्रॉल या गरीब नमूना बाहर निकालना के बजाय अधिक समय देरी पर बेहतर डेटा एकत्र करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है खो दिया है ।

प्रोटोकॉल में सबसे कठिन, और महत्वपूर्ण कदम monoolein की छोटी मात्रा के अलावा है कि घन चरण में लिपिड मैट्रिक्स लाता है (चरण १.८). कठिनाई चरण संक्रमण और monoolein अतिरिक्त में जोड़ा जाता है जब नमूने पर नकारात्मक प्रभाव की सूक्ष्मता में निहित है.

विभिन्न प्रोटीन क्रिस्टल को समायोजित करने के लिए कार्यप्रणाली में संशोधनों को लागू किया जाना चाहिए । ये एक ही additives या राशि या आवश्यक मिश्रण के साथ संगत नहीं हो सकता है. दूसरी ओर, मिश्रण की प्रक्रिया के दौरान छोटे टुकड़ों में क्रिस्टल तोड़ने विवर्तन गुणवत्ता समझौता नहीं हो सकता है और यहां तक कि उदाहरण के लिए jetting में सुधार कर सकते हैं जब लंबी सुई छोटे टुकड़ों में तोड़. विभिन्न additives पैराफिन के स्थान पर प्रतिस्थापित किया जा सकता है, जो प्रवाह की गति स्थिरता में सुधार करने के लिए जोड़ा गया है9. पत्रिका 7.9/9.7 जो हो सकता है जब वैक्यूम वातावरण में इंजेक्शन20 (lcls पर cxi endstation की तरह) लैमिलर चरण को रोकने के लिए जोड़ा गया है, लेकिन प्रयोग वायुमंडलीय दबाव में किया जाता है, तो छोड़ा जा सकता है । हमारे अनुभव में, घुलनशील प्रोटीन से कई क्रिस्टल stably lcp में शामिल किया जा सकता है, अभी तक कुछ विडंबना यह है कि झिल्ली प्रोटीन क्रिस्टल सीधे lipidic mesophases में नहीं हो अक्सर संभवतः भंग क्योंकि डिटर्जेंट क्रिस्टल से निकाले जाते है उन्हें आसपास के लिपिड जैसे वातावरण में । ऐसे मामलों में, यह पूरी तरह से एक वैकल्पिक चिपचिपा वाहक24,25,26,27,29,30के साथ lcp की जगह की कोशिश की जानी चाहिए ।

उच्च गति कैमरा परीक्षण में संशोधन नमूनों को समायोजित कर सकते हैं जहां क्रिस्टल वाहक के भीतर दिखाई नहीं दे रहे हैं । उदाहरण के लिए, रोशनी polarized प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर वीडियो रिकॉर्ड करने के लिए विन्यस्त किया जा सकता है । यह birefringent क्रिस्टल का कारण (एक चमक के रूप में) दिखाई देगा, और यह भी लिपिड मैट्रिक्स कि birefringent पटलिका चरण में है के कुछ हिस्सों का पता चलता है ।

एक तरफ संशोधनों, यह महत्वपूर्ण है कि प्रोटीन क्रिस्टल की तैयारी के रूप में ज्यादा के रूप में संभव निंनलिखित मानदंडों को पूरा है । क्रिस्टल इष्टतम रूप से डिफ़वर्तन को अधिकतम करने के लिए आकार का होना चाहिए, जबकि सुई लगानेवाला clogging । क्रिस्टल घनत्व पर्याप्त उच्च एक हिट-पूरा डेटा सेट इकट्ठा करने के लिए पर्याप्त दर उपज के लिए किया जाना चाहिए, लेकिन जेट स्थिरता समझौता करने के रूप में इतना घना नहीं है (एक घनत्व है कि बहुत अधिक है आमतौर पर पतला किया जा सकता है; बीआर के मामले में, 10-30% की हिट दर के लिए समायोजन आमतौर पर worke घ अच्छी तरह से) । लिपिड मैट्रिक्स को घन चरण में लाया जाना चाहिए, और क्रिस्टल निलंबन सजातीय होना चाहिए ।

tr-sfx अन्य समय पर प्रमुख लाभ रखती है-laue विवर्तन की तरह क्रि तकनीक का समाधान है क्योंकि: विकिरण क्षति सीमित है "विनाश से पहले विवर्तन" कार्यप्रणाली के कारण, TR-sfx के कई आदेशों पर एक व्यापक समय संकल्प किया है परिमाण और नीचे femtosecond रेंज के लिए, छोटे क्रिस्टल बेहतर photoactivation के लिए अनुमति देते हैं, और ब्याज की photoactivation प्रतिवर्ती नहीं होना चाहिए ।

TR-sfx पर एक xfel उच्च चिपचिपापन इंजेक्टर का उपयोग कर नमूना बचत के मामले में एक तरल जेट इंजेक्टर पर महत्वपूर्ण लाभ है । सीधे pyp की तुलना6 और bR10, उदाहरण के लिए, के कारक द्वारा एक कमी को इंगित करता है ५० के एक ही राशि के लिए विवर्तन छवियों एकत्र. दूसरी ओर तरल जेट विमानों में एक फायदा है कि प्रवाह तेजी से है और, डेटा संग्रह पूरी गति से चलाता है (बारी अंधेरे और प्रकाश फ्रेम), इंजेक्टर धारा गति स्थिरता (या अंधेरे फ्रेम में प्रकाश संदूषण) के संबंध के बिना । जबकि चिपचिपा जेट नई चुनौतियों को जोड़ता है, यह विचार करने लायक है कि लिक्विड जेट TR-sfx प्रोटीन की मात्रा का उपयोग करता है जो कई जैविक रूप से प्रासंगिक प्रणालियों के लिए उत्पादन करने के लिए बिल्कुल अनुचित हो सकता है ।

वर्तमान में, TR-sfx के लिए चिपचिपा नमूना तैयारी डिलीवरी माध्यम के साथ क्रिस्टल अनुकूलता द्वारा सीमित है । हालांकि कई वैकल्पिक चिपचिपा वाहक कार्यांवित किया गया है, कोई भी सभी मामलों के लिए काम करने के लिए पाया गया है । इसके अतिरिक्त, एक उच्च चिपचिपापन सुई लगानेवाला के साथ नमूना वितरण हमेशा clogging, या भी optomozation इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर के साथ धीमा के अधीन हो जाएगा । तकनीक की एक और सीमा हिट दर में निहित कमी है जब नमूना पतला extrudability के लिए इसे लाने के लिए ।

भविष्य में, TR-sfx तरीकों सिंथेटिक photoswitches के साथ उन लोगों के लिए प्राकृतिक क्रोमोफोरों के साथ प्रोटीन लक्ष्य से बढ़ाया जा सकता है । प्रतिक्रियाओं कि photoसक्रियित नहीं किया जा सकता पर समय हल माप मिश्रण, तापमान-कूद, बिजली के खेतों, या अन्य सक्रियण प्रौद्योगिकियों कि अभी तक सीरियल crystallography करने के लिए अनुकूलित किया जा करने के लिए पर भरोसा करना चाहिए. इन ट्रिगर प्रौद्योगिकियों के एक संयोजन के साथ xfel beamtime की वृद्धि की उपलब्धता के साथ, समय के साथ, एक परमाणु स्तर पर प्रोटीन समारोह की संरचनात्मक गतिशीलता को समझने की नींव रखना होगा ।

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Disclosures

लेखक कोई परस्पर विरोधी हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

हम gebhard schertler, राफेल abela और साई में उच्च चिपचिपापन इंजेक्टर के उपयोग का समर्थन करने के लिए क्रिस milne स्वीकार करते हैं । रिचर्ड neutze और उनकी टीम समय पर विचार विमर्श के लिए स्वीकार कर रहे है-का समाधान किया क्रि और नमूना वितरण उच्च चिपचिपापन इंजेक्टर का उपयोग कर । वित्तीय सहायता के लिए, हम स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन को अनुदान 31003a_141235, 31003a_141235 (जे. एस.) और PZ00P3_174169 (पीएनएस) के लिए स्वीकार करते हैं । इस परियोजना को यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम मैरी-sklodowska-क्यूरी ग्रांट समझौता नहीं ७०१६४६ के तहत से धन प्राप्त हुआ है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mosquito LCP Syringe Coupling TTP labtech store 3072-01050
Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 µl Hamilton HA-81065
Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 µl Hamilton HA-81265
Monoolein Nu-Chek Prep, Inc. M-239
7.9 MAG Avanti Polar Lipids Inc. 850534O
50% w/v PEG 2000 Molecular Dimensions MD2-250-7
Paraffin (liquid) Sigma-Aldrich 1.07162
High speed camera Photron Photron Mini AX
High magnification lens Navitar 12X Zoom Lens System
Three axis stage ThorLabs PT3/M
Fiber light Thorlabs OSL2
Fused silica fiber Molex/Polymicro TSP-505375
Lite touch ferrule IDEX LT-100
ASU high viscosity injector Arizona State University Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu)
HPLC pump Shimadzu LC-20AD
Electronic gas regulator Proportion Air GP1

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References

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रसायन विज्ञान अंक १४४ समय-हल धारावाहिक crystallography लिपिडिक घन चरण बैक्टीरियोरोडोप्सिन झिल्ली प्रोटीन उच्च चिपचिपापन सुई लगानेवाला तीन तरह युग्मक एक्स-रे मुक्त eletron लेजर
एक्स-रे लेसरों में समय-हल सीरियल femtosecond crystallography के लिए माइक्रोक्रिस्टल की उच्च चिपचिपापन बाहर निकालना में सुधार
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James, D., Weinert, T., Skopintsev,More

James, D., Weinert, T., Skopintsev, P., Furrer, A., Gashi, D., Tanaka, T., Nango, E., Nogly, P., Standfuss, J. Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers. J. Vis. Exp. (144), e59087, doi:10.3791/59087 (2019).

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