Summary
Il successo di un esperimento di cristallografia risolti in tempo ai femtosecondi seriale dipende dalla consegna efficiente dei campioni. Qui, descriviamo protocolli per ottimizzare l'estrusione di microcristalli bacteriorhodopsin da un iniettore di micro-estrusione ad alta viscosità. La metodologia si basa sull'omogeneizzazione del campione con un romanzo accoppiatore di tre vie e la visualizzazione con una telecamera ad alta velocità.
Abstract
Iniettori di micro-estrusione ad alta viscosità hanno ridotto drasticamente il consumo del campione nel serial femtosecond cristallografici esperimenti (SFX) al laser a elettroni liberi a raggi x (XFELs). Una serie di esperimenti utilizzando la batteriorodopsina pompa protonica luce-driven ulteriormente hanno stabilito questi iniettori come un'opzione preferita di consegnare cristalli per risolti in tempo ai femtosecondi seriale cristallografia (TR-SFX) risolvere le modifiche strutturali del proteine dopo fotoattivazione. Per ottenere più strutturali istantanee di alta qualità, è essenziale per raccogliere grandi quantità di dati e garantire la liquidazione dei cristalli tra ogni impulso del laser di pompa. Qui, descriviamo in dettaglio come abbiamo ottimizzato l'estrusione di microcristalli bacteriorhodopsin per i nostri esperimenti di TR-SFX risale alle origine Linac della luce coerente (LCL). L'obiettivo del metodo è quello di ottimizzare estrusione per un flusso stabile e continuo, mantenendo un'alta densità di cristalli per aumentare il tasso a cui i dati possono essere raccolti in un TR-SFX sperimentare. Raggiungiamo questo obiettivo attraverso la preparazione di fase lipidica cubico con una distribuzione omogenea dei cristalli utilizzando una siringa di tre vie romanzo dispositivo seguito regolando la composizione del campione sulla base di misurazioni della stabilità dell'estrusione scattate con un'alta velocità di attacco installazione della telecamera. La metodologia può essere adattata per ottimizzare il flusso di altri microcristalli. L'installazione sarà disponibile per gli utenti del nuovo stabilimento svizzero Free Electron Laser.
Introduction
Seriale a femtosecondi cristallografia (SFX) è una tecnica di biologia strutturale che sfrutta le proprietà uniche dei raggi x laser ad elettroni liberi (XFEL) per determinare le strutture di temperatura ambiente da migliaia di cristalli di dimensioni micrometriche mentre outrunning la maggior parte delle il danno da radiazione della "diffrazione prima distruzione" principio1,2,3.
In un'estensione di tempo-risolta di SFX (TR-SFX), gli impulsi a femtosecondi dal XFEL sono utilizzati per studiare i cambiamenti strutturali in proteine4,5. La proteina di interesse viene attivata con un laser ottico (o un'altra attività trigger) appena prima di essere ripresi da XFEL in un'installazione di pompa-sonda. Controllando con precisione il ritardo tra gli impulsi di pompa e sonda, la proteina dell'obiettivo possa essere catturata in Stati diversi. Film molecolare dei cambiamenti strutturali nel corso di undici ordini di grandezza in tempo dimostrare il potere delle nuove fonti XFEL per studiare la dinamica di diverse proteine target6,7,8,9, 10,11,12,13. Principalmente, il metodo unisce le tecniche strutturali con spettroscopiche e statiche dinamiche in uno, fornendo un assaggio nelle dinamiche di proteina a vicino a risoluzione atomica.
Sistemi semplici per TR-SFX possono contenere un trigger endogeno di attivazione con un componente fotosensibile come retinica bacteriorhodopsin (bR)9,10, i cromofori nel fotosistema II12,13, proteina gialla fotoattivi (PYP)6,7 reversibilmente fotomodulabili proteina fluorescente11, o un monossido di carbonio photolyzable in mioglobina8. Emozionanti varianti della tecnica ancora in fase di sviluppo si basano su mix e iniettare schemi14,15 per studiare le reazioni enzimatiche o un campo elettrico usato per indurre cambiamenti strutturali16. Dato che fonti XFEL sono rese disponibili solo per pochi anni e l'estrapolazione successi del passato verso il futuro, il metodo Mostra il potenziale come un vero e proprio gioco-changer rispetto alla nostra comprensione di come funzione di proteine.
Perché campioni biologici sono distrutti da una singola esposizione a un'ad alta potenza impulso XFEL, nuovi approcci alla cristallografia di proteine erano necessari. Tra queste procedure, la capacità di crescere grandi quantità di microcristalli uniforme doveva essere sviluppato17,18,19. Per abilitare la raccolta di dati a un XFEL, questi cristalli devono essere consegnati, scartati e poi rinnovati per ogni impulso XFEL. Dato che XFELs fuoco utilizzabili impulsi a 10-120 Hz, consegna del campione deve essere veloce, stabile e affidabile, mantenendo anche i cristalli intatto e limitando il consumo. Tra le soluzioni di maggior successo è un iniettore di micro-estrusione ad alta viscosità, che trasporta un continiously colonna della temperatura ambiente crystal-carico lipidico cubi fase (LCP) in streaming attraverso il pulsato di fascio raggi x20. Cristalli orientati casualmente, incorporate nel flusso di LCP, che vengono intercettati dallo spargimento di impulsi XFEL raggi x su un rivelatore dove si è registrato un pattern di diffrazione. LCP è stata una scelta naturale per un mezzo di consegna del campione, poiché viene frequentemente utilizzata come mezzo di crescita per membrana proteina cristalli17,21,22,23, ancora altri supporti informatici di alta viscosità 24,25,26,27,28,29,30 e31 di proteine solubili sono stati utilizzati anche nell'iniettore. SFX con l'iniettore ad alta viscosità è riuscita durante la determinazione della struttura della membrana proteine13,32 compreso il G proteina-ha accoppiato i ricevitori (GPCR)33,34, 36, 35,37, con qualità di dati sufficiente per nativo phasing38,39 pur essendo esempio efficiente e tempo. Attualmente, questi iniettori vengono utilizzati più ordinariamente per misure di temperatura al sincrotrone fonti28,30,40,41 , così come durante il più tecnicamente esigente esperimenti TR-SFX a XFELs9,10,13,42.
Esperimenti di TR-SFX paragonabili sono stati effettuati utilizzando altri tipi di iniettori come fase liquida consegna in un flusso concentrato di ugello6,7,12, tuttavia, questo metodo richiede una quantità di proteina non è disponibile per molti biologicamente interessanti destinazioni. Per la determinazione delle strutture statiche mediante estrusione viscoso un consumo medio di 0,072 mg di proteina per diffrazione 10.000 indicizzate rispetto alle 9,35 mg per il getto di liquido ugelli sono stati segnalati (cioè circa 130 volte più campione efficiente)20. L'iniettore ad alta viscosità ha dimostrato di essere un dispositivo di consegna campione valido per TR-SFX mentre solo sacrificare alcuni di questo esempio efficienza43. In Nogly et al (2018)10, ad esempio, il consumo del campione era circa 1,5 mg per 10.000 modelli indicizzate, che paragona favorevole a simili esperimenti di TR-SFX utilizzando il PYP dove il consumo medio del campione era molto più alto con 74 mg di proteina per 10.000 indicizzata modelli6. Iniettori ad alta viscosità sono così evidenti vantaggi quando sta limitando la quantità di proteina disponibile o quando cristalli sono coltivati direttamente in LCP.
Per TR-SFX utilizzando ad alta viscosità iniettori a cedere i dati più affidabili diversi problemi tecnici devono essere affrontate: la velocità di flusso deve rimanere sopra un minimo valore critico; la hit-rate dovrebbe essere mantenuta ad un livello che non esegue il rendering lento di raccolta di dati (ad es., superiore al 5%); e campione deve essere consegnato senza eccessive interruzioni. Idealmente, questi requisiti sono già soddisfatti molto prima che un esperimento di TR-SFX pianificato per utilizzare il tempo disponibile XFEL efficientemente come possibile. Primis, un rallentamento del flusso di LCP può permettere di cristalli che sono stati attivati con più di un impulso laser ottico e risultato in Stati attivi misti di sondaggio sondaggio materiale pompato quando umpumped materiale è previsto nel fascio. Un ulteriore vantaggio dell'iniezione pre-test è che i tempi di inattività durante la raccolta di dati presso un XFEL è ridotta a icona come tempo relegato alla sostituzione ugelli intasati, cambiando i campioni non-espulsione, e altre attività di manutenzione è ridotto.
Qui, presentiamo un metodo per ottimizzare la consegna del campione per la raccolta di dati di TR-SFX con un iniettore di micro-estrusione ad alta viscosità. Per semplicità, i metodi descritti non si basano sull'accesso ad una sorgente di raggi x, anche se lavoro presso un sincrotrone beamline29 sarebbe fornire ulteriori informazioni sui tassi di successo previsti e diffrazione di cristallo. I nostri protocolli sono stati sviluppati per ottimizzare gli esperimenti per catturare isomerizzazione retinica nella pompa protonica bacteriorhodopsin10 e sono svolte in due fasi a partire con la preparazione dei campioni di cristallo per estrusione seguita monitorando l'estrusione utilizzando un programma di installazione di telecamere ad alta velocità. Nella prima fase, il LCP carichi di cristallo è mescolato con ulteriori LCP, lipidi di transizione bassa temperatura o altri additivi per garantire che la miscela finale è adatta per il recapito nell'ambiente campione senza intasamento o rallentando. Un nuovo coupler siringa a tre vie è stato sviluppato per migliorare la miscelazione omogeneità delle prestazioni e del campione. La seconda fase è costituito da una prova di estrusione registrata da una telecamera ad alta velocità per misurare direttamente la stabilità di velocità di estrusione. In seguito all'analisi dei dati video, possono effettuare regolazioni per il protocollo di preparazione del campione per migliorare i risultati sperimentali. Queste procedure possono essere adattate per preparare altre proteine per la raccolta di dati di TR-SFX, con modifiche minime e contribuiranno all'uso efficiente delle limitate XFEL valutazione. Con nuove strutture XFEL appena iniziando la loro operazione44,45 e il trasferimento dei metodi di raccolta dati seriale basata su iniettore a sincrotroni28,30,40,41 , nei prossimi anni saranno sicuramente continuerà a fornire emozionanti nuove intuizioni le dinamiche strutturali di una gamma sempre più ampia di bersagli proteici.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. preparazione del campione di cristallo proteina
- Circa 30 min prima il campione deve essere iniettato, carico 50 µ l di monoolein carichi di cristallo base LCP in siringa 100 µ l.
- Per l'iniezione a pressione atmosferica: carico 10 µ l di paraffina liquida nel retro di una seconda siringa. Tenendo la siringa in posizione verticale, espellere le bolle d'aria dalla siringa.
- Per iniezione in ambiente sottovuoto: carico 5 µ l di MAG 7,9 e 5 µ l di paraffina liquida nel retro di una seconda siringa. Tenendo la siringa in posizione verticale, espellere le bolle d'aria dalla siringa.
- Collegare la siringa con paraffina/MAG 7,9 per un accoppiatore di siringa standard, spurgare l'aria dall'accoppiatore premendo delicatamente lo stantuffo fino a un piccolo volume (< 1 µ l) di paraffina/lipidica è visibile sulla punta dell'ago accoppiatore.
- Collegare la siringa di esempio per l'accoppiatore di siringa, avendo cura di non introdurre aria nel campione. Mescolarvi il lipido/paraffina passando il materiale campione attraverso l'accoppiatore più volte.
- Caricate 20 µ l di premiscelati LCP (27% PEG, 100 mM pH Sorensen 5.6 + MO) in un altro 100 µ l siringa. Rimuovere le bolle d'aria come necessario.
- Rimuovere la siringa vuota dall'accoppiatore e allegare il LCP premiscelata al cristallo contenente la siringa utilizzando un accoppiatore di siringa standard. Passare il campione attraverso l'accoppiatore 100 volte.
Nota: Esempio di miscelazione può riscaldare il campione leggermente46. Miscelazione deve essere eseguita ad un ritmo lento dove la temperatura del campione può essere ritenuta ragionevolmente costante. - Ispezionare il campione per trasparenza contro una sorgente di luce. Se si è formato un LCP chiaro omogeneo, andare al passaggio 1,9.
- Per portare il campione nella fase cubica, aggiungere 3 µ l di monoolein e mescolare 50 volte (come descritto sopra). Ripetere questa procedura fino a quando una fase trasparente ha formato per evitare un eccesso di monoolein.
Nota: La formazione di LCP è temperatura dipendente47 e migliori risultati si ottengono leggermente di sopra di 20 ° C. La quantità di monoolein ulteriori necessarie dipenderà il volume di soluzione precipitante residui riportato da cristallizzazione. - Come preliminare testare campione rigidità (come previsto dalla fase di LCP) e capacità di estrusione, staccare la siringa vuota dall'accoppiatore di siringa e, tenendo la siringa in posizione verticale, spremere una piccola quantità di campione (< 2 µ l) attraverso l'accoppiatore. Se il campione estruso forma un cilindro verticale, il campione è pronto per il collaudo di estrusione.
- Regolare il volume totale del campione a 100 µ l aggiungendo più premiscelato LCP (come al punto 1.5).
- Collegare la siringa campione e due siringhe vuote per l'accoppiatore di siringa a tre vie (spurgo aria da accoppiatore come prima). Mescolare almeno 50 volte (o fino a quando non omogeneo) passando metà del campione nella seconda siringa e quindi premendo contemporaneamente entrambe le metà del campione nella siringa terza.
- Posizionare la siringa contenente il campione miscelato al microscopio stereo per verificare una distribuzione omogenea dei cristalli.
2. estrusione di esempio utilizzando una configurazione di macchina fotografica ad alta velocità di prova
- Determinazione parametri sperimentali.
- Selezionare le dimensioni dell'ugello per il test.
Nota: Ugelli sono in genere 50 o 75 µm diametro interno (ID), ma qualsiasi dimensione da circa 30-100 µm ID può essere considerato. Selezione si basa su un equilibrio tra tempo medio di intasamento, sfondo scattering, consumo del campione e tasso di successo. - Calcolare la velocità di flusso ottimale basato sulla dimensione dello spot laser sperimentale (diametro2 1/e) e il piano di raccolta di dati (ad es., interleaved chiaro e scuro) che verrà utilizzato presso il XFEL.
- Calcolare la portata desiderata (
) del campione dalla velocità di flusso ottimale (
) e il diametro dell'ugello selezionato (
):
Determinare il tasso di flusso (
) che devono essere immessi alla pompa HPLC in base al fattore di amplificazione (
) dell'iniettore.
Calcolare la pressione massima (
) da pressione nominale dei raccordi ugello (
) e il fattore di amplificazione dell'iniettore (
):
- Selezionare le dimensioni dell'ugello per il test.
- Installazione dell'iniettore di estrusione ad alta viscosità per l'utilizzo offline come mostrato in Figura 1.
Nota: Le funzioni di iniettore per estrusione a idraulico alimentato da una pompa HPLC e utilizza una guaina di gas elio co-fluente comandata da un regolatore di gas. Il programma di installazione di pompa e regolatore non sono discussi in questo protocollo. Vedere capitolo quattro James (2015)48 per un manuale dettagliato.- Spurgare la pompa e tutte le linee d'acqua per garantire che le portate sono accurate. Eliminare la fase idraulico dell'iniettore.
- Montare l'iniettore (o la fotocamera) su un palcoscenico di tre assi per facilitare l'inquadratura e messa a fuoco per i video ad alta velocità. Lasciare spazio attorno al punto di iniezione per la lente obiettiva, illuminazione, schermo riflettente e un piccolo Becher per prendere il campione esaurito.
- Costruire un ugello"fittizio" (un serbatoio vuoto con un ugello collegato) e installarlo sull'iniettore per facilitare il posizionamento, la messa a fuoco e l'illuminazione.
- Montare la videocamera ad alta velocità con la punta di ugello vicino al punto focale dell'obiettivo.
- Posizionare lo schermo riflettente dietro l'iniettore e regolare l'illuminazione per luce frontale l'ugello.
- Accendere e collegare la telecamera con il software in dotazione. Con un video live in esecuzione per il feedback visivo, posizionare la punta dell'ugello al centro del telaio e portarlo a fuoco con la tappa di tre assi.
- Regolare l'illuminazione fino a quando l'ugello è chiaramente visibile e lo sfondo è uniformemente illuminato.
- Configurazione della videocamera per registrare un video time-lapse ad alta velocità.
- Impostare framerate a 1000 fps. Impostare la risoluzione a 512 x 512 pixel.
- Con il tempo di esposizione ora impostato il frame rate, regolare il livello di illuminazione fino a quando l'ugello è visibile (cioè, non sotto- o sovraesposta). Riposizionare la punta dell'ugello in modo che si è centrato a sinistra a destra e si trova nel terzo superiore del telaio.
- Eseguire qualsiasi correzione di fondo o le operazioni di bilanciamento del bianco.
- Impostare la fotocamera in modalità Time-lapse. Intervallo di 30 s e si ripete a 40 volte, impostare la modalità di trigger a casuale (o reset casuale) e immettere il numero di fotogrammi per registrare a 1000.
- Caricare il serbatoio con 20 µ l del campione da analizzare e attaccare l'ugello capillare.
- Fissare il serbatoio riempito all'iniettore. Collegare la tubazione del gas alla porta sull'ugello e iniziare il flusso di gas.
- Manualmente è possibile avanzare il pistone aprendo la valvola in linea e premendo la siringa. Quando il pistone rende solido contatto con il campione nel serbatoio, chiudere la valvola.
- Programmare la pompa con la portata calcolata e la pressione massima al valore calcolato (Vedi punto 2.1.3).
- Avviare simultaneamente la pompa e la registrazione.
- Come inizia l'estrusione, regolare la pressione del gas per aumentare la stabilità. Aumentare la pressione del gas se il liquido forma una goccia sulla punta dell'ugello invece di una colonna. Diminuzione della pressione se l'estrusione è rotto a causa di eccessivo taglio dal flusso del gas, o è oscillante rapidamente (da montare).
- Monitorare l'estrusione (10 min è solitamente sufficiente per riconoscere una condizione di flusso omogeneo) e, quando la pressione della pompa acutamente rampe vicino la data di fine prevista, interrompere la registrazione, spegnere la pompa e sfogare la pressione del sistema aprendo la valvola di sfiato.
- Analisi dei file video
Nota: Estrusione di campione che è chiaramente inadeguato non richiede un'analisi dettagliata. Tuttavia, è ancora utile identificare la modalità di guasto, in modo che il campione può essere ottimizzato.- Aprire il file video con il software di analisi (ad es., Fiji49) e calibrare gli strumenti di misurazione.
- Calibrare le misure selezionando una linea di lunghezza nota nell'immagine video con lo strumento di selezione di linea. Aprire la finestra Imposta scala via Analyze | Impostare la scala e immettere la distanza nota e le unità di misura.
Nota: Il diametro dell'ugello noto fornisce una lunghezza adeguata calibrazione per queste misurazioni. - Trovare un fotogramma del video dove c'è una caratteristica tracciabile visibile (ad esempio, un cristallo) nell'estrusione. Registrare il numero di telaio.
- Avanzare il video un fotogramma dove la stessa caratteristica è visibile ma ha spostato dalla sua posizione nel passaggio precedente. Registrare il numero di telaio.
- Utilizzando lo strumento di misurazione di linea retta, misurare la distanza dall'inizio della funzionalità e dell'endpoint tramite Analyze | Misura.
Nota: Più lunga la distanza tracciabile, i meno errori nella misurazione influenzerà i calcoli - Calcolare la velocità di getto dalla distanza misurata e il tempo trascorso (il numero di fotogrammi trascorsi diviso per framerate).
- Ripetere i passaggi 2.11.3-2.11.6 un paio di volte per ogni segmento del video.
- Tracciare le serie di dati come in Figura 2.
) del campione dalla velocità di flusso ottimale (
) e il diametro dell'ugello selezionato (
):
) che devono essere immessi alla pompa HPLC in base al fattore di amplificazione (
) dell'iniettore.
) da pressione nominale dei raccordi ugello (
) e il fattore di amplificazione dell'iniettore (
):
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Il materiale di partenza ideale per le procedure qui descritte (Figura 3) sono alte densità di microcristalli incorporato nel mezzo viscoso dell'elemento portante per l'iniettore. La procedura richiede circa 50 µ l di cristallo laden elemento portante per ogni preparazione. Questi possono essere coltivati direttamente in LCP come con il bR9,10 utilizzato qui, come esempio (Figura 4), o preparati usando cristalli sviluppati nelle configurazioni di diffusione del vapore convenzionale. Un'eccellente video guida per cristallizzazione direttamente a tenuta di gas siringhe si trovano in Ishchenko et al (2016)37. Con bR, il diametro ideale delle piastre cristalline è circa 20 μm come un buon compromesso tra potenza di diffrazione e attivazione omogenea con il laser di pompa. Cristalli della proteina, preparati utilizzando i protocolli come spiegato in precedenza, sono stati utilizzati per raccogliere dati di TR-SFX sul bR di pompa protonica che hanno rivelato i cambiamenti ultraveloci che si verificano dopo assorbimento di fotoni (Figura 5).
Dopo la preparazione del campione mediante l'accoppiatore di tre vie (Figura 6AB), controllo visivo del materiale campione nella siringa Mostra le immagini di omogeneità (Figura 6D) e microscopio campione del campione misto, sia nella siringa e in una diapositiva, può confermare la densità dei cristalli e consente misure di cristalli di dimensioni, distribuzione di dimensione di cristallo e cristallo densità. Il campione è in fase di cubi quando il mezzo di consegna è chiaro (Figura 7) e viscoso. Torbide miscele sono un'indicazione che il campione è in una spugna fase o fase lamellare, ma non sono conclusive come densità alta crystal può oscurare la chiarezza di grandi impianti di combustione. Un breve test a bassa pressione per identificare la fase liquida spugna può essere eseguito tirando lo stantuffo della siringa lontano il campione nella parte posteriore la siringa. Fase lamellare può essere facilmente identificato attraverso la birifrangenza con microscopia in luce polarizzata. Questi test accoppiati con un test di pre-estrusione sono in genere sufficienti a giustificare una prova dell'iniettore.
Il tasso di ripetizione elevata di XFELs richiede una velocità di flusso che non può essere adeguatamente osservata con fotocamere di tasso basso frame. Pertanto, la caratterizzazione di estrusione avviene utilizzando una telecamera ad alta velocità (accoppiata a un obiettivo di alto ingrandimento) che può registrare video time-lapse. Dati video sono ad alta velocità in quanto i fotogrammi vengono registrate a 1000 fps e anche Time-lapse in quanto il video è stato registrato per 1 s ogni 30 s. Questo schema di raccolta dati permetterà per la raccolta di dati durante la prova di intero campione (circa 10min) senza creare file video ingestibili. Anche con questo insieme di dati ridotto dimensioni, video lime possono essere ancora superiore a 50 GB. Prestare la massima attenzione per garantire adeguata archiviazione è disponibile per salvare i dati video prima dell'inizio del test.
Durante la prova di getto (Figura 1), il campione dovrebbe estrudere una colonna continua lungo (più di 200 µm) di LCP che si muove a una velocità quasi costante (Figura 2). Campioni eseguiti in una modalità di gocciolamento indicano che la viscosità del campione è troppo bassa (Figura 2). Campioni possono spesso essere recuperati e mescolati con più monoolein o paraffina per adattare la viscosità. Campioni che formano una colonna devono essere testati con la macchina fotografica ad alta velocità. Dati dalla registrazione dovrebbero mostrare che l'estrusione rimane sopra una velocità minima dettata dai tuoi parametri sperimentali. Velocità di estrusione è determinata misurando la distanza lineare che percorsa da una caratteristica nel flusso del LCP oltre un certo numero di fotogrammi. Rallentamenti di estrusione che possono essere attribuiti a zoccoli anomali garantiscono riprove. Se essi persistono jetting dovrebbe essere migliorato dagli additivi come paraffina, riducendo la densità dei cristalli o selezionando un ugello di diametro più grande. Cristalli non normalmente coltivate in un mezzo viscoso (ad es., diffusione del vapore) possono essere peletted mediante centrifugazione e incorporati in LCP o altri vettori viscosi. Per esempi, vedere precedenti pubblicazioni24,25,26,27,29,30.
Figura 1: impostazione di banco ad alta velocità telecamera. Una fotografia di un setup di benchtop tipico con le parti essenziali con l'etichetta. La fase tre assi fornisce flessibilità nell'inquadratura e messa a fuoco l'immagine. L'iniettore (indicato con l'ugello e il serbatoio collegato) è montato verticalmente e direttamente davanti alla lente dell'obiettivo. L'illuminazione in questo esempio è fornito da una singola fibra luce illuminando il campione fuori asse e fornendo un campo luminoso sullo schermo. Un campione montato e illuminato in questo modo fornisce un'immagine come quella di inserto B. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: analisi test e dati della macchina fotografica ad alta velocità. Nella foto sopra sono due prove di estrusione di LCP. Prova A Mostra cristalli bR in LCP estrusione da una modalità di gocciolamento che indica che il campione non è ottimizzato. Test B Mostra estrusione LCP formando una colonna continua di LCP dove cristalli possono essere monitorati, e velocità di estrusione può essere calcolato. In questo esempio, un cristallo incastonato nella colonna LCP (50 micron di diametro) si muove 301 µm in 8 ms (37,6 mm/s). Vengono visualizzati due insiemi di dati da diverse preparazioni di cristalli bacteriorhodopsin in LCP. Quattro (o più) punti dati da ogni secondo di video time-lapse fotocamera ad alta velocità (1 s di registrazione ogni 30 s) sono state tracciate. Una grande diffusione tra i punti di dati presi da un singolo secondo periodo di raccolta di dati indicano la variazione di velocità a breve termine. Mentre una media mobile sopra la serie completa dei dati Mostra le fluttuazioni più lungo nel flusso. Il top della serie è da un campione mal d'espulsione (alta probabilità per contaminazione chiara con due impulsi laser di pompa consecutivi), e la serie di fondo è da un campione che eseguite in modo ottimale. La linea tratteggiata orizzontale indica la velocità di estrusione destinazione impostata tramite la pompa HPLC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: diagramma di flusso di esempio preparazione. Preparazione del campione inizia con un'alta densità di cristalli proteici incorporati in LCP. Il campione è poi mescolato con del lipido di transizione bassa temperatura, paraffina e preparato LCP fino a quando il campione entra in fase di cubi e passa una serie di piccole prove per indicare che il campione sarà estrudere nell'iniettore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: cristalli Bacteriorhodopsin come materiale di partenza. Cristalli sono coltivate in siringhe a tenuta di gas (A), con LCP immerso nella soluzione precipitante. Cristallizzazione è ottimizzato per un'alta densità di cristalli con una distribuzione delle dimensioni possibilmente stretta (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: i mutamenti strutturali nel bacteriorhodopsin. TR-SFX rivela ultra-veloci cambiamenti nella struttura della batteriorodopsina di pompa protonica. Qui è raffigurato un modello di bR derivato da dati di TR-SFX ottenuti da cristalli preparati utilizzando i protocolli illustrati in questo lavoro. Il pannello di sinistra mostra il modello con caratteristiche evidenziate nella tasca associazione retinica. Il pannello di destra mostra i cambiamenti in retinico da femtosecondi per millisecondi. Questa figura è stata riprodotta da Nogly et al (2018)10 con permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: l'accoppiatore di tre vie. L'accoppiatore di tre vie è un miscelatore di Y spazio morto ridotto progettato per garantire la compatibilità con le siringhe tenuta di gas. Rendering 3D dell'accoppiatore, mostrano un disegno esploso di montaggio (A), e una vista trasparente Mostra la miscelazione di canale (B). La figura mostra una distribuzione disomogenea cristallo dopo la miscelazione con l'accoppiatore standard (C) e la sospensione risultante dopo la miscelazione nell'accoppiatore tre vie (D). Miscelazione avviene spingendo all'incirca la metà del campione in un'altra siringa (E) e poi spingendo entrambe le metà nella siringa rimanente insieme come illustrato dalle frecce blue (F). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: indicatori di pre-iniezione test. Durante la preparazione del campione, parecchie piccole prove sono usati per indicare che il campione sia in fase e adeguatamente viscoso. Chiarezza ottica è un indicatore che il campione è probabile nella fase cubica. (A) un campione torbido è mostrato nella siringa. (B) un chiaro esempio è mostrato, notare le linee di graduazione visibile attraverso il campione nonostante l'alta densità di micro-cristalli. Quando la matrice lipidica è in fase di cubica, rimane solido-come quando sotto senza stress. Tirando la siringa dalla parte posteriore del campione viene eseguito un test a bassa pressione. Quando il campione è troppo simile a liquido (indicativo della fase spugna) il campione si espande per riempire il volume (C). In un risultato positivo del test stesso (D), il campione rimane statico nonostante lo stantuffo ritirato. Infine, viene eseguito un test di estrusione di macro-scala premendo una piccola quantità di campione attraverso l'accoppiatore di siringa. Una gocciolina formando presso la punta dell'ugello (E) o un cilindro rapidamente piegatura di LCP indica un esempio che non è abbastanza viscoso. Se l'esempio le estrusioni, a formare un cilindro, che rimane in posizione eretta nel corso del tempo (F), poi il campione può avanzare al collaudo delle fotocamere ad alta velocità. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il metodo di TR-SFX con l'iniettore di estrusione viscoso ha dimostrato di essere una tecnica valida per gli studi di dinamica strutturale di bacteriorhodopsin9,10 e fotosistema II13 e ora sembra pronto a studiare proteine guida altro processi biologici foto ad esempio trasporto di ioni luce-driven o percezione sensoriale5,50. I protocolli descritti sopra sono stati progettati per massimizzare il successo della raccolta di dati TR-SFX batteriorodopsina, Eppure crediamo che può agire come un modello per ottimizzare la raccolta di dati su altri campioni. In questo modo, gran parte della preziosa valutazione attualmente perso a causa di intasamento o estrusione del campione povero invece poteva essere utilizzati per raccogliere dati migliori alle ulteriori ritardi.
Il passo più difficile e critico nel protocollo è l'aggiunta di piccole quantità di monoolein che porta la matrice lipidica nella fase cubica (passo 1,8). La difficoltà sta nella sottigliezza della transizione di fase e l'effetto negativo sul campione quando monoolein viene aggiunto in eccesso.
Modifiche alla metodologia devono essere implementate per ospitare cristalli proteici differenti. Questi possono non essere compatibili con gli additivi stessi o l'importo o la miscelazione necessaria. D'altra parte, rottura cristalli in pezzi più piccoli durante il processo di miscelazione non può compromettere la qualità di diffrazione e può anche migliorare jetting ad esempio quando aghi lunghi rompono in frammenti più brevi. Gli additivi differenti potrebbero essere sostituiti al posto di paraffina, che viene aggiunto per migliorare la stabilità di flusso velocità9. MAG 7,9/9,7 viene aggiunto per evitare il trasnistion alla fase lamellare che può verificarsi quando si inietta in ambienti20 (come endstation CXI presso LCLS) di vuoto, ma può essere omessa se l'esperimento avviene a pressione atmosferica. Nella nostra esperienza, molti cristalli da proteine solubili possono essere incorporati stabilmente nella LCP, ma ironia della sorte della membrana cristalli non direttamente coltivate in mesofasi lipidico spesso sciogliere presumibilmente perché detergenti vengono estratti dal cristallo nell'ambiente del lipido-come che li circonda. In tali casi, deve essere provato sostituire interamente LCP con un vettore alternativo di viscoso24,25,26,27,29,30.
Modifiche alla prova telecamera ad alta velocità possono ospitare campioni dove i cristalli non sono visibili all'interno del vettore. Ad esempio, illuminazione può essere configurato per registrare un video utilizzando la microscopia a luce polarizzata. Questo farà sì che i cristalli birifrangenti a comparire (come un bagliore) e rivela anche porzioni della matrice lipidica che sono in fase lamellare birifrangente.
Modifiche a parte, è fondamentale che la preparazione di cristallo della proteina quanto più possibile soddisfare i seguenti criteri. I cristalli devono essere ridimensionati in modo ottimale per massimizzare la diffrazione riducendo iniettore intasamento. La densità di cristallo dovrebbe essere sufficiente per produrre una colpo-velocità sufficiente a raccogliere set completi di dati, ma non così denso da compromettere la stabilità di getto (una densità che è troppo alta può solitamente essere diluita; nel caso di bR, regolazione a un tasso di successo del 10-30% solitamente worke d bene). La matrice lipidica dovrebbe essere portata nella fase cubica, e la sospensione di cristallo dovrebbe essere omogenea.
TR-SFX detiene importanti vantaggi rispetto ad altre tecniche di cristallografia tempo-risolta come diffrazione Laue perché: danni da radiazioni sono limitato dovuto la metodologia "diffrazione prima della distruzione", TR-SFX ha una risoluzione di tempo ampio sopra molti ordini di grandezza e giù alla gamma di femtosecondo, i piccoli cristalli consentono per fotoattivazione migliore, e il photocycles di interesse non deve essere reversibile.
TR-SFX presso un XFEL utilizzando l'iniettore ad alta viscosità ha vantaggi significativi rispetto un iniettore di getto liquido in termini di risparmio di campione. Direttamente a confronto PYP6 e bR10, ad esempio, indica una riduzione per il fattore di 50 per la stessa quantità di immagini di diffrazione raccolti. Getti di liquidi d'altra parte hanno un vantaggio in quanto il flusso è rapido e, raccolta dei dati viene eseguito alla massima velocità (alternando cornici di chiaro e scuri), senza riguardo per iniettore flusso velocità stabilità (o contaminazione chiara in cornici scure). Mentre il getto viscoso aggiungere nuove sfide, vale la pena considerare che getto liquido TR-SFX utilizza quantità di proteina che può essere assolutamente irragionevole per produrre per molti sistemi biologicamente rilevanti.
Attualmente, preparazione dei campioni viscosi per TR-SFX è limitata dalla compatibilità di cristallo con il mezzo di consegna. Anche se ci sono stati parecchi elementi portanti viscosi alternativi implementati, nessuno sono stati trovati a lavorare per tutti i casi. Inoltre, la consegna del campione con un iniettore ad alta viscosità sarà sempre soggetto ad intasamento o rallentando anche con optomozation usando questo protocollo. Un'altra limitazione della tecnica è la riduzione intrinseca nella percentuale di successo quando si diluisce il campione per portarla l'estrudibilità optomised.
In futuro, metodi TR-SFX possono essere esteso da bersagli proteici con cromofori naturali a quelli con fotorelè sintetico. Risolta in tempo misure sulle reazioni che non possono essere la fotoattivazione devono affidarsi di miscelazione, temperatura-salto, campi elettrici o altre tecnologie di attivazione che devono ancora essere adattato alla cristallografia seriale. Una combinazione di queste tecnologie scatenante insieme a una maggiore disponibilità di valutazione XFEL sarà, nel corso del tempo, gettare le basi per comprendere le dinamiche strutturali di funzione della proteina a livello atomico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non dichiarano nessun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Riconosciamo Gebhard Schertler, Rafael Abela e Chris Milne per sostenere l'uso di iniettori ad alta viscosità allo PSI. Richard Neutze e il suo team sono riconosciuti per le discussioni sulla cristallografia risolta in tempo e consegna del campione usando gli iniettori ad alta viscosità. Sostegno finanziario, riconosciamo la Swiss National Science Foundation per sovvenzioni 31003A_141235, 31003A_159558 (a J.S.) e PZ00P3_174169 (a P.N.). Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal programma di innovazione nell'ambito della sovvenzione Marie Sklodowska-Curie accordo No 701646 e ricerca Orizzonte 2020 dell'Unione europea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mosquito LCP Syringe Coupling | TTP labtech store | 3072-01050 | |
| Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 µl | Hamilton | HA-81065 | |
| Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 µl | Hamilton | HA-81265 | |
| Monoolein | Nu-Chek Prep, Inc. | M-239 | |
| 7.9 MAG | Avanti Polar Lipids Inc. | 850534O | |
| 50% w/v PEG 2000 | Molecular Dimensions | MD2-250-7 | |
| Paraffin (liquid) | Sigma-Aldrich | 1.07162 | |
| High speed camera | Photron | Photron Mini AX | |
| High magnification lens | Navitar | 12X Zoom Lens System | |
| Three axis stage | ThorLabs | PT3/M | |
| Fiber light | Thorlabs | OSL2 | |
| Fused silica fiber | Molex/Polymicro | TSP-505375 | |
| Lite touch ferrule | IDEX | LT-100 | |
| ASU high viscosity injector | Arizona State University | Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu) | |
| HPLC pump | Shimadzu | LC-20AD | |
| Electronic gas regulator | Proportion Air | GP1 |
References
- Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
- Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
- Barty, A., et al. Self-terminating diffraction gates femtosecond X-ray nanocrystallography measurements. Nature photonics. 6 (December), 35-40 (2012).
- Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Optics express. 20 (3), 2706-2716 (2012).
- Panneels, V., et al. Time-resolved structural studies with serial crystallography: A new light on retinal proteins. Structural Dynamics. 2 (4), 041718 (2015).
- Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
- Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science (New York, N.Y.). 352 (6286), 725-729 (2016).
- Barends, T. R. M., et al. Direct observation of ultrafast collective motions in CO myoglobin upon ligand dissociation. Science (New York, N.Y.). 350 (6259), 445-450 (2015).
- Nango, E., et al. A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
- Nogly, P., et al. Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser. Science. 0094 (June), eaat0094 (2018).
- Coquelle, N., et al. Chromophore twisting in the excited state of a photoswitchable fluorescent protein captured by time-resolved serial femtosecond crystallography. Nature Chemistry. 10 (1), 31-37 (2017).
- Kupitz, C., et al. Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser. Nature. , (2014).
- Suga, M., et al. Light-induced structural changes and the site of O=O bond formation in PSII caught by XFEL. Nature. 543 (7643), 131-135 (2017).
- Stagno, J. R., et al. Structures of riboswitch RNA reaction states by mix-and-inject XFEL serial crystallography. Nature. 541 (7636), 242-246 (2017).
- Wang, D., Weierstall, U., Pollack, L., Spence, J. C. H. Liquid Mixing Jet for XFEL Study of Chemical Kinetics. Journal of synchrotron radiation. , In submiss 1364-1366 (2014).
- Hekstra, D. R., White, K. I., Socolich, M. A., Henning, R. W., Šrajer, V., Ranganathan, R. Electric-field-stimulated protein mechanics. Nature. 540 (7633), 400-405 (2016).
- Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nature. 9 (9), 2123-2134 (2014).
- Kupitz, C., Grotjohann, I., Conrad, C. E., Roy-Chowdhury, S., Fromme, R., Fromme, P. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcus elongatus as a model system. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 369 (1647), (2014).
- Falkner, J. C., et al. Generation of Size-Controlled, Submicrometer Protein Crystals. Chemistry of Materials. 17 (10), 2679-2686 (2005).
- Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature communications. 5, 3309 (2014).
- Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. Lipidic cubic phases: a novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (December), 14532-14535 (1996).
- Caffrey, M. A comprehensive review of the lipid cubic phase or in meso method for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (1), 3-18 (2015).
- Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 21 (4), 559-566 (2011).
- Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (4), 421-430 (2015).
- Sugahara, M., et al. Hydroxyethyl cellulose matrix applied to serial crystallography. Scientific Reports. 7 (1), 703 (2017).
- Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2014).
- Sugahara, M., et al. Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 6 (1), 24484 (2016).
- Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (2), 387-397 (2015).
- Kovácsová, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. IUCrJ. 4 (4), 400-410 (2017).
- Martin-Garcia, J. M., et al. Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 4 (4), 439-454 (2017).
- Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. IUCrJ. 2, 545-551 (2015).
- Caffrey, M., Li, D., Howe, N., Shah, S. T. A. "Hit and run" serial femtosecond crystallography of a membrane kinase in the lipid cubic phase. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130621 (2014).
- Liu, W., et al. Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors. Science (New York, N.Y.). 342 (6165), 1521-1524 (2013).
- Zhang, H., et al. Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography. Cell. 161 (4), 833-844 (2015).
- Fenalti, G., et al. Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor. Nature Structural & Molecular Biology. (February), (2015).
- Kang, Y., et al. Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser. Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).
- Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. Journal of Visualized Experiments. 9 (115), 2123-2134 (2016).
- Batyuk, A., et al. Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor. Science Advances. 2 (9), e1600292 (2016).
- Nakane, T., et al. Native sulfur/chlorine SAD phasing for serial femtosecond crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (12), 2519-2525 (2015).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2 (2), 168-176 (2015).
- Weinert, T., et al. Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons. Nature Communications. 8 (1), 542 (2017).
- Tosha, T., et al. Capturing an initial intermediate during the P450nor enzymatic reaction using time-resolved XFEL crystallography and caged-substrate. Nature Communications. 8 (1), 1585 (2017).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase injector is a viable crystal delivery system for time-resolved serial crystallography. Nature Communications. 7, 12314 (2016).
- Abela, R., et al. Perspective: Opportunities for ultrafast science at SwissFEL. Structural Dynamics. 4 (6), 061602 (2017).
- Marx, V. Structural biology: doors open at the European XFEL. Nature Methods. 14 (9), 843-846 (2017).
- Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chemistry and Physics of Lipids. 95 (1), 11-21 (1998).
- Qiu, H., Caffrey, M. The phase diagram of the monoolein/water system: Metastability and equilibrium aspects. Biomaterials. 21 (3), 223-234 (2000).
- James, D. Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments. , (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Moffat, K. Femtosecond structural photobiology. Science (New York, N.Y.). 361 (6398), 127-128 (2018).
