Summary
시간이 해결 직렬 펨 결정학 실험의 성공 효율적인 샘플에 따라 달라 집니다. 여기, 우리는 프로토콜 최적화 높은 점도 마이크로 압출 인젝터에서 bacteriorhodopsin microcrystals의 입체 면을 설명 합니다. 방법론은 소설 3 방향 커플러와 샘플 균질 및 고속 카메라와 시각화에 의존합니다.
Abstract
높은 점도 마이크로 압출 인젝터는 극적으로 x 선 자유 전자 레이저 (XFELs)에서 직렬 펨 결정학 실험 (SFX)에서 샘플 소비를 감소 했습니다. 일련의 실험 빛 구동 양성자 펌프 bacteriorhodopsin를 사용 하 여 추가 설정한이 인젝터의 구조 변화를 해결 하려면 시간 해결 직렬 펨 결정학 (TR-SFX)에 대 한 결정을 제공 하는 기본 옵션으로 photoactivation 후 단백질입니다. 높은 품질의 여러 구조 스냅샷, 많은 양의 데이터를 수집 하 고 모든 펌프 레이저 펄스 사이의 결정의 보장에 필수적 이다. 여기, 우리가 어떻게 우리가 우리의 최근 TR SFX 실험 Linac 일관 된 빛 소스 (LCLS)에서 bacteriorhodopsin microcrystals의 입체 최적화 자세히 설명 합니다. 방법의 목표 속도 증가 하는 결정의 높은 밀도 유지 하면서 안정적이 고 지속적인 흐름에 대 한 압출을 최적화 하는 실험에서 TR SFX에 데이터를 수집할 수 있습니다. 우리 커플링 장치는 고속으로 찍은 압출 안정성의 측정에 따라 샘플 구성 조정 하 여 다음 소설 3-방법으로 주사기를 사용 하 여 결정의 균일 분포 lipidic 입방 단계를 준비 하 여이 목표를 달성 카메라 설정입니다. 방법론은 다른 microcrystals의 흐름을 최적화 하기 위해 적용할 수 있습니다. 설치는 새로운 스위스 자유 전자 레이저 시설 사용자가 가능할 것 이다.
Introduction
직렬 펨 결정학 (SFX)은 대부분의 잡기 동안 수천 마이크로미터 크기의 결정에서에서 x 선 자유 전자 레이저 (XFEL) 실 온 구조 결정의 독특한 속성을 이용 하는 구조 생물학 기술 "파괴 전에 회절" 원리1,2,3방사선 손상.
시간 해결 SFX (TR-SFX) 확장,는 XFEL에서 펨 펄스는 단백질4,5에 구조적인 변화를 공부 하는 데 사용 됩니다. 관심사의 단백질 XFEL 펌프-프로브 설치 프로그램에 의해 총 직전 광학 레이저 (또는 다른 활동 트리거) 활성화 됩니다. 정확 하 게 제어 함으로써 펌프와 프로브 펄스 사이의 지연, 다른 주에서 대상 단백질을 캡처할 수 있습니다. 시간 11 배나 통해 구조 변경의 분자 영화 보여 여러 단백질 목표6,7,,89의 역학을 공부 하는 새로운 XFEL 소스의 힘 10,11,,1213. 주로, 메서드 원자 해상도 근처에서 단백질 역동성으로 엿볼 제공 동적 광 및 정적 구조 기술을 하나로, 조인.
TR-SFX에 대 한 간단한 시스템 bacteriorhodopsin (bR)9,10에 망막, photosystem II12,13, chromophores 같은 사진에 민감한 구성 요소 활성화의 내 생 트리거 포함 될 수 있습니다. 광 노란색 단백질 (PYP)6,7 역 photoswitchable 형광 단백질11또는 myoglobin8일산화 탄소 photolyzable. 기술 개발에 여전히의 흥미로운 변이 혼합에 의존 하 고 주사 제도14,15 효소 반응 또는16구조적인 변화 유도 하는 데 사용 하는 전기 분야를 공부 하. XFEL 소스 겨우 사용할 수 있는 몇 년 동안 하 고 미래에 과거의 성공 바탕, 메서드를 보여 줍니다 방법에 대 한 우리의 이해에 관하여 진짜 게임 체인저로 잠재적인 단백질 기능.
생물 학적 샘플 단일 노출 고성능 XFEL 펄스에 의해 파괴 때문에 단백질 결정학에 새로운 접근 필요 했다. 이러한 절차 중 많은 양의 유니폼 microcrystals 성장 능력 개발된17,,1819필요가 있었다. XFEL에 데이터 컬렉션을 사용 하려면 이러한 결정 전달, 삭제, 고 각 XFEL 펄스에 대 한 다음 갱신 있습니다. XFELs 10-120 Hz에서 사용 가능한 펄스 발생, 샘플 배달 해야 되지, 안정, 빠르고 안정적 또한 유지 결정 그대로 제한 소비 하면서. 가장 성공적인 솔루션 중 continiously 펄스 x-선 빔20통해 실내 온도 크리스탈-라덴 lipidic 입방 단계 (LCP)의 열을 스트리밍을 제공 하는 높은 점성 마이크로 압출 인젝터가입니다. 무작위로 지향된 결정, XFEL 펄스 분산형 엑스레이 회절 패턴을 기록 하는 감지기에 의해 도청 하는 LCP 스트림에 포함. 그것은 자주 막 단백질 결정17,21,,2223, 아직 다른 점도 캐리어 미디어 성장 매체로 사용 LCP 샘플 전달 매체에 대 한 자연 선택은 24,25,26,,2728,29,30 및 수용 성 단백질31 또한 인젝터에 사용 되었습니다. 높은 점도 인젝터와 SFX 막 단백질13,32 G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs)33,34, 등의 구조를 결정 하는 동안 성공 했습니다. 35,,3637, 네이티브 위상38,39 시간 및 효율적인 샘플 되는 동안에 대 한 충분 한 데이터 품질. 현재,이 인젝터는 사용 되 고 더 정기적으로 더 동안에 뿐만 아니라 싱크 로트 론 소스28,30,,4041 에서 실내 온도 측정에 대 한 기술적으로 XFELs9,10,,1342에서 TR SFX 실험을 요구.
그러나 유사한 TR SFX 실험 진행 되었습니다 밖으로 액체 단계 흐름에서 배달 집중 노즐6,,712같은 다른 인젝터 종류를 사용 하 여,,이 방법은 많은 단백질 양을 사용할 수 없는 필요 합니다. 생물학적으로 목표를 재미 있는. 액체 제트에 대 한 10000 인덱싱된 회절 패턴 9.35 mg에 비해 당 단백질의 0.072 밀리 그램의 평균 소비 점성 돌출을 사용 하 여 정적 구조체의 결정에 대 한 노즐 (즉, 130 배 더 많은 샘플에 대해 보고 되었습니다. 효율적인)20. 고 점도 인젝터만이 샘플 효율43의 일부 희생 하면서 TR SFX를 위한 실행 가능한 샘플 배달 장치를 보였다. Nogly 외. (2018)에10, 예를 들어 샘플 소비는 약 1.5 m g 10000 인덱싱된 패턴 당 평균 샘플 소비는 74 밀리 그램의 10000 당 단백질의 훨씬 더 높은 PYP를 사용 하 여 비슷한 TR SFX 실험을 호의적으로 비교 하는 인덱싱된 패턴6. 고 점도 인젝터는 따라서 사용 가능한 단백질의 양을 제한 하거나 결정 LCP 직접 재배 명확한 장점이 있다.
TR-SFX 높은 점도 사용 하 여에 대 한 몇 가지 기술적인 문제가 가장 신뢰할 수 있는 데이터를 인젝터 해결 해야: 흐름 속도 최소 임계값; 위에 남아 있어야 히트-속도 느린 데이터 컬렉션을 렌더링 하지 않는 수준에서 유지 되어야 한다 (예를 들어, 보다 큰 5%); 샘플 과도 한 중단 없이 전달 했다. 이상적으로, 이러한 조건을 이미 충족 하는 사용 가능한 XFEL 시간을 가능한 한 효율적으로 사용 하는 예약 된 TR SFX 실험 하기. Pricipally, LCP 스트림의 둔화 이상의 광학 레이저 펄스와 혼합된 활성 상태에 결과 활성화 된 결정 프로 빙 또는 umpumped 물자는 빔에 예상 되는 경우 펌핑된 소재를 프로 빙 수. 있습니다 사출 사전 테스트의 추가 혜택은 강등 압출 비 샘플 변경 막힌된 노즐을 교체 하는 시간으로는 XFEL에서 데이터 수집 하는 동안 가동 중지 시간 최소화 및 기타 유지 관리 작업 감소.
여기, 우리는 높은 점도 마이크로 압출 인젝터와 TR SFX 데이터 컬렉션에 대 한 샘플 배달을 최적화 하는 방법을 제시. 편의상, 설명된 방법 의존 하지 마십시오 X-ray 소스에 액세스할 수 있지만 싱크 로트 론 beamline29 일 것 이다 추가 제공 정보 예상된 적중된 속도 크리스탈 회절에. 우리의 프로토콜 양성자 펌프 bacteriorhodopsin10 에 망막 isomerization 캡처 실험을 최적화 하기 위해 개발 되었다 고 돌출을 모니터링 하 여 다음 돌출 크리스탈 샘플을 준비와 함께 시작 하는 두 단계에서 수행 됩니다. 고속 카메라 설치를 사용 하 여. 1 단계에서 결정-라덴 LCP 최종 혼합물은 막힘 또는 감속 없이 배달 샘플 환경에 적합 하도록 추가 LCP, 낮은 전환 온도 지질 또는 다른 첨가제 혼합입니다. 새로운 3 방향 주사 통 커플러는 혼합 성능 및 샘플 동질성을 개선 하기 위해 개발 되었다. 직접 압출 속도 안정성을 측정 하는 고속 카메라에 의해 기록 된 압출 테스트 두 번째 단계에 의하여 이루어져 있다. 비디오 데이터의 분석에 따라 조정 할 수 있다 샘플 준비 프로토콜에 실험 결과 개선 하기 위해. 이 절차는 최소한의 수정, TR-SFX 데이터 수집을 위해 준비 하는 다른 단백질을 적응 시킬 수 있다 및 제한 XFEL beamtime의 효율적인 사용에 기여할 것입니다. 그냥 그들의 작업44,45 synchrotrons28,30,40,41 인젝터 기반 직렬 데이터 수집 방법의 전송 시작 하는 새로운 XFEL 시설 , 다음 몇 년 동안 확실 하 게 계속 제공할 것 이다 단백질 목표의 적 넓은 범위의 구조 역학에 대 한 흥미로운 새로운 통찰력.
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Protocol
1. 단백질 크리스탈 샘플 준비
- 약 30 분 전에 샘플, 주입 하는 것입니다 monoolein 크리스탈-라덴의 부하 50 µ L 100 µ L 주사기에 LCP을 기반으로.
- 대기압에서 주입에 대 한: 부하 10 µ L 주사기를 두 번째의 뒤쪽으로 액체 파라핀의. 수직으로 주사기를 들고, 주사기에서 공기 방울을 추방.
- 진공 환경으로 주입에 대 한: 매기 7.9와 두 번째 주사기의 뒤쪽으로 액체 파라핀의 5 µ L의 부하 5 µ L. 수직으로 주사기를 들고, 주사기에서 공기 방울을 추방.
- 파라핀/매기 7.9 표준 주사기 커플러에 주사기를 연결, 눌러 부드럽게 플런저에 작은 볼륨까지 커플러에서 공기를 제거 (< 1 µ L) 파라핀/지질의 커플러 바늘의 끝에 표시 됩니다.
- 샘플으로 공기를 소개 하지를 돌보는 주사기 커플러를 샘플 주사기를 연결 합니다. 커플러를 통해 시료를 여러 번 전달 하 여 지질/파라핀에 섞어.
- 또 다른 100 µ L 주사기에 premixed LCP (27% 말뚝, 100 mM 소 렌 슨 pH 5.6 + 모)의 20 µ L를 로드 합니다. 필요에 따라 기포를 제거 합니다.
- 커플러에서 빈 주사기를 제거 하 고 표준 주사기 커플러를 사용 하 여 주사기를 포함 하는 크리스탈에 premixed LCP를 연결 합니다. 100 번 커플러를 통해 샘플을 전달 합니다.
참고: 샘플을 열 수 있습니다 샘플 혼합 약간46. 혼합 할 수 느린 속도로 어디 샘플의 온도 보전 될 수 있다 합리적으로 일정. - 빛의 원천에 대 한 투명성에 대 한 샘플을 검사 합니다. 명확한 균질 LCP, 형성 하는 단계로 1.9 이동 합니다.
- 입방 단계에 샘플을가지고, monoolein의 3 µ L을 추가 하 고 50 번 (위에서 설명한) 혼합. 그냥 투명 한 단계 monoolein의 과잉을 피하기 위해 형성 될 때까지이 절차를 반복 합니다.
참고:는 LCP의 형성 온도 종속47 이며 최상의 결과 20 ° c.의 위 약간 달성 추가 monoolein 양의 필요 결정 화에서이 월 된 잔여 precipitant 솔루션의 볼륨에 따라 달라 집니다. - 예비로 샘플 강성 (예상 대로 LCP 단계에서) 및 돌출 하는 능력에 대 한 테스트, 주사기 커플러에서 빈 주사기를 분리 하 고, 수직으로 주사기를 들고, 시비 거는 작은 양의 샘플 (< 2 µ L) 커플러를 통해. 밀어낸된 샘플 수직 실린더, 형성 하는 경우,이 예제는 압출 테스트에 대 한 준비.
- (1.5 단계)로 더 premixed LCP를 추가 하 여 100 µ L 샘플의 전체 볼륨을 조정 합니다.
- (앞으로 커플러에서 공기를 제거) 하는 3 방향 주사 통 커플러를 샘플 주사기와 두 개의 빈 주사기를 첨부 합니다. 적어도 50 번 (또는 혼합 될 때까지 균질) 두 번째 주사기에는 샘플의 절반을 전달 하 고 다음 눌러 샘플의 두 반쪽 3 주사기로 동시에.
- 결정의 균일 분포를 확인 하기 위해 스테레오 현미경 혼합된 샘플을 포함 하는 주사기를 놓습니다.
2. 테스트 샘플 입체 고속 카메라 설치를 사용 하 여
- 실험적인 매개 변수를 결정합니다.
- 테스트에 대 한 노즐 크기를 선택 합니다.
참고: 노즐 크기는 일반적으로 50 또는 75 µ m 내부 직경 (ID), 모든 크기에서 대략 30-100 µ m ID 간주 될 수 있습니다. 선택 의미 막힘 시간, 배경 산란, 샘플 소비, 명 중 율 사이의 균형을 기반으로 합니다. - 실험적인 레이저 크기 (1/e2 직경), 및 데이터 수집 계획 (예: 인터리빙된 빛과 어둠)는 XFEL에 사용 될에 따라 최적의 흐름 속도 계산 합니다.
- 원하는 흐름 속도 계산 (
) 최적의 흐름 속도에서 샘플의 (
)와 선택 된 노즐 직경 (
):
흐름 속도 결정 (
)는 증폭 요인에 따라 HPLC 펌프에 입력 해야 합니다 (
) 인젝터의.
최대 압력 계산 (
)는 노즐의 정격된 압력에서 (
)와 인젝터의 증폭 요인은 (
):
- 테스트에 대 한 노즐 크기를 선택 합니다.
- 그림 1에서 같이 오프 라인 사용에 대 한 고 점도 압출 인젝터의 설정.
참고: 유압 압출에 의해 인젝터 함수는 HPLC 펌프에 의해 구동 하 고 공동 흐르는 헬륨 가스 칼 집 가스 레 귤 레이 터에 의해 제어를 사용 합니다. 펌프와 레 귤 레이 터 설치 하지이 프로토콜에서 설명 되어 있습니다. 제 4 제임스 (2015)48 에 대 한 상세한 매뉴얼을 참조 하십시오.- 펌프와 정확 하 게는 flowrates를 보장 하기 위해 모든 물 라인을 제거. 인젝터의 유압 단계 제거.
- 프레임 및 고속 동영상에 대 한 집중을 촉진 하는 3 축 단계에는 인젝터 (또는 카메라)를 탑재 합니다. 대물 렌즈, 조명, 반사, 스크린과 잡으려고 보낸된 샘플 작은 비 커에 대 한 주입 점의 주위 공간을 남겨 주세요.
- "더미 노즐" 구성 (노즐 연결 된 빈 저수지) 위치, 초점, 및 조명 인젝터에 설치.
- 목표의 초점 근처 노즐 팁 고속 카메라를 탑재 합니다.
- 인젝터 뒤 반사 화면을 전면 빛 노즐 조명 조정.
- 설정 하 고 제공 된 소프트웨어와 함께 카메라에 연결. 시각적 피드백에 대 한 실행 라이브 비디오, 노즐 팁, 프레임의 중앙에 놓고 3 축 단 초점으로 그것을.
- 노즐은 명확 하 게 표시 될 때까지 배경 균등 하 게 조명 조명을 조정 합니다.
- 고속 기록 시간 경과 비디오 카메라를 구성합니다.
- 1000 fps 설정된 프레임 속도입니다. 512 x 512 픽셀 해상도 설정 합니다.
- 지금 프레임 속도 설정 노출 시간, 조명 레벨 조정 노즐 표시 될 때까지 (즉, 아닌-또는 설쳐). 위치 변경 노즐 팁은 중심을 왼쪽에서 오른쪽 프레임의 최고 세 번째에 위치 하 고.
- 어떤 배경 보정 이나 화이트 밸런스 작업을 실행 합니다.
- 시간 경과 모드로 카메라를 설정 합니다. 간격에 30 s 반복 및 40 시간, 임의의 (또는 임의 리셋), 트리거 모드를 설정 하 고 1000녹화 프레임 수를 입력.
- 테스트 샘플의 20 µ L와 저수지를 로드 하 고 모 세관 노즐 연결 합니다.
- 인젝터 채워진된 저수지를 연결 합니다. 포트 노즐에 가스 관을 연결 하 고 가스 흐름을 시작 합니다.
- 수동으로 인라인 밸브를 개방 하 고 눌러 주사기 피스톤을 사전. 때 피스톤 저수지에서 샘플 고체 접촉 밸브를 닫습니다.
- 계산 된 유량과 펌프를 프로그램 하 고 계산 된 값을 최대 압력을 설정 (단계 2.1.3 참조).
- 펌프 및 카메라 녹화 시작 동시에.
- 돌출 시작으로, 조정 안정성을 증가 하는 가스 압력. 열 대신 노즐의 끝에 한 방울을 형성 하는 액체 가스 압력을 증가. 감소 압력 돌출 한다고 해 서 가스 흐름에서 과도 한 전단 또는 급속 하 게 진동 하는 경우 (흔든 다).
- 돌출을 모니터링 (10 분은 일반적으로 균질 성 흐름 상태를 인식 하는 충분 한) 중단 하 고, 급격히 펌프 압력은 최대 예상된 종료 시간 근처 경사로 때 기록, 펌프, 차단 시스템 압력 릴리프 밸브를 개방 하 여 환기.
- 비디오 파일의 분석
참고: 현실적으로 적절 하지 않은 샘플 압출 상세한 분석을 필요 하지 않습니다. 그러나, 그것은 여전히 실패 모드를 식별 하는 샘플을 최적화할 수 있습니다 유용 합니다.- 분석 소프트웨어 (예: 피지49) 비디오 파일을 열고 측정 도구를 보정 합니다.
- 선 선택 도구로 비디오 이미지에서 알려진 길이의 라인을 선택 하 여 측정을 보정. 분석을 통해 비율 설정 창을 엽니다 | 설정 규모 알려진된 거리와 측정 단위를 입력 하십시오.
참고: 노즐의 알려진된 직경이 측정에 대 한 적절 한 교정 길이 제공합니다. - 비디오에서 한 프레임을 찾아 돌출에 추적 기능 표시 (예, 크리스털)입니다. 프레임 번호를 기록 합니다.
- 프레임 같은 기능 볼 수는 있지만 이전 단계에서의 위치에서 이동 하는 비디오를 사전. 프레임 번호를 기록 합니다.
- 기능 시작 및 분석을 통해 끝점에서 거리 측정 직선 측정 도구를 사용 하 여 | 측정.
참고: 추적 거리 측정에 적은 오류가 더 이상 것입니다 영향을 계산 - 측정된 거리와 경과 시간 (경과 된 프레임 나눈 프레임의 수입니다.)에서 제트 속도 계산
- 동영상의 모든 세그먼트에 대 한 단계 2.11.3-2.11.6 몇 번을 반복 합니다.
- 그림2 데이터 계열을 플롯 합니다.
) 최적의 흐름 속도에서 샘플의 (
)와 선택 된 노즐 직경 (
):
)는 증폭 요인에 따라 HPLC 펌프에 입력 해야 합니다 (
) 인젝터의.
)는 노즐의 정격된 압력에서 (
)와 인젝터의 증폭 요인은 (
):
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Representative Results
여기에 설명 된 절차 (그림 3)에 대 한 이상적인 시작 물자는 인젝터를 위한 점성 운반대 매체에 통합 하는 microcrystals의 높은 밀도 이다. 절차의 크리스탈 라덴 각 준비를 위해 약 50 µ L에 대 한 호출합니다. 이러한 bR9,10 여기, 예를 들어 (그림 4), 사용 또는 기존의 증기 확산 설정에서 성장 하는 결정을 사용 하 여 준비로 LCP에 직접 성장 수 있다. 우수한 비디오 가이드 기밀 주사기에서 직접 결정 화를 찾을 수 있습니다 Ishchenko 외. (2016)37. BR, 결정 플레이트의 이상적인 직경 회절 능력과 펌프 레이저 동질적인 활성화 사이 좋은 타협으로 약 20 μ m입니다. 단백질 결정, 위에서 설명한 대로 프로토콜을 사용 하 여 준비 광자 흡수 (그림 5) 후 발생 하는 초고속 변화 공개 양성자 펌프 bR에 TR SFX 데이터를 수집 하도록 사용 되었다.
샘플 준비 3 방향 커플러 (그림 6AB)를 사용 하 여, 후 주사기에 시료의 검사 모두에서 혼합된 샘플의 샘플 (그림 6 cD), 동질성 및 현미경 이미지 표시는 주사기와 슬라이드, 결정의 밀도 확인할 수 있습니다 크리스탈 크기, 크리스탈 크기 분포, 및 크리스탈 밀도의 측정에 대 한 수 있습니다. 샘플 배달 매체 하다 입방 단계에는 (그림 7)과 점성. 혼 탁 한 혼합물 샘플 단계 또는 플레이트 단계, 스폰지에는 표시 하지만 되지 않습니다 결정적인 높은 크리스탈 밀도 LCPs 선명도 모호한 수 있습니다. 주사기 뒷면 샘플에서 주사기 플런저를 잡아당겨 액체 스폰지 단계를 식별 하는 간단한 저압 테스트를 수행할 수 있습니다. 플레이트 단계 편광된 가벼운 현미경 검사 법으로는 복굴절을 통해 쉽게 식별할 수 있습니다. 사전 압출 테스트와 결합 하 여 이러한 테스트는 일반적으로 인젝터에 있는 시험을 정당화 하기 위해 충분 하다.
XFELs의 높은 반복 속도 낮은 프레임 속도 카메라와 함께 적절 하 게 관찰 될 수 없는 흐름의 속도를 요구 한다. 따라서, 압출 특성 이루어집니다 시간 경과 비디오를 기록할 수 있는 고속 카메라 (고배율 렌즈를 결합 하는)를 사용 하 여. 비디오 데이터는 프레임 1000의 fps에 기록 되어 있는 고속도 시간 경과 비디오 1에 대 한 기록에 s 각 30 s. 이 데이터 컬렉션 시스템 관리 하기 어려운 비디오 파일을 만들지 않고 전체 샘플 테스트 (약 10 분) 동안 데이터 수집을 위해 수 있게 됩니다. 이 감소 된 데이터 세트와도 크기, 비디오 파일 여전히 50 기가바이트 초과 수 있습니다. 적절 한 저장소는 테스트가 시작 되기 전에 비디오 데이터를 저장할 수 있도록 주의 해야 합니다.
테스트 기간 동안에 제트 (그림 1), 샘플 (그림 2)는 거의 일정 한 속도로 이동 하는 LCP의 긴 (200 µ m) 연속 열 압출 성형 한다. 떨어지는 모드에서 실행 되는 샘플 샘플 점도 너무 낮은 임을 나타냅니다 (그림 2). 샘플 자주 복구 하 고 더 많은 monoolein 또는 점도 맞게 파라핀과 혼합 수 있습니다. 샘플 열을 형성 하는 고속 카메라와 함께 시험 되어야 한다. 녹음에서 데이터 돌출 실험적인 매개 변수에 의해 규정 최소 속도 이상 유지 표시 해야 합니다. 압출 속도 LCP 스트림 기능 다양 한 프레임을 통해 이동 하는 선형 거리를 측정 하 여 결정 됩니다. 변칙 나 막 신을 압출 기복이 재검사 보증. 그들은 계속 제트기 개량 되어야 한다 파라핀 같은 첨가제에 의해, 결정의 밀도 감소 시켜 또는 더 큰 직경의 노즐을 선택 하 여. 일반적으로 점성 매체 (예를 들어, 증기 확산)에 성장 하는 결정 peletted 원심 분리 하 여 수 있으며 LCP 또는 다른 점성 사업자에 통합. 예, 이전 간행물24,25,26,27,,2930참조.
그림 1: 고속 카메라 벤치 셋업. 전형적인 벤치탑 설치 표시 필수 부품의 사진. 3 축 단계 프레임과 이미지를 초점에 유연성을 제공 합니다. 인젝터 (노즐 및 저수지 첨부 표시) 대물 렌즈 앞에서 수직으로, 그리고 직접 장착 됩니다. 이 예제에서 조명 축에서 샘플을 밝게 조명 하 고 화면에 밝은 필드를 제공 하는 단일 섬유 빛에 의해 제공 됩니다. 탑재 하 고이 방법으로 조명 샘플 제공 인세트 B. 같은 이미지 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 고속 카메라 테스트 및 데이터 분석. 위의 사진은 두 LCP 압출 테스트가 있습니다. 테스트 A LCP 샘플 최적화 되지 않은 나타내는 떨어지는 모드에서 압출에 bR 결정을 보여줍니다. 테스트 B LCP 압출 LCP 결정, 추적 및 압출 속도 계산할 수의 연속 열 형성을 보여줍니다. 이 예제에서 LCP 열 (50 µ m 직경)에 포함 된 크리스탈 8 ms (37.6 m m/s)에서 301 µ m를 이동 합니다. LCP에 bacteriorhodopsin 결정의 다른 준비에서 두 개의 데이터 집합에 표시 됩니다. 저속 고속 카메라 비디오의 초당에서 4 개의 (또는 더) 데이터 포인트 (1 기록 모든 30의 s s) 표시 했다. 두 번째 데이터 수집 기간 단일에서 촬영 데이터 요소 간의 큰 확산 단기 속도 변화를 나타냅니다. 반면 전체 데이터 계열에 이동 평균 흐름에 이상 변화를 보여 줍니다. 최고 시리즈는 저조한 압출 샘플 (2 연속 펌프 레이저 펄스와 가벼운 오염에 대 한 높은 기회), 및 최적으로 수행 하는 샘플에서 아래 시리즈는. 수평 점선 HPLC 펌프를 통해 대상 압출 속도 집합을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 샘플 준비 순서도. 샘플 준비 LCP에 포함 된 단백질 결정의 높은 밀도로 시작 합니다. 샘플은 다음 낮은 전환 온도 지질, 파라핀와 함께 혼합 하 고 샘플 입방 단계에 전달 하는 일련의 샘플 인젝터에 돌출 하는 것을 나타내는 작은 테스트 때까지 LCP를 준비. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 시작 물자로 Bacteriorhodopsin 결정. 크리스탈 precipitant 솔루션에 LCP와 가스 꽉 주사기 (A)에서 성장 된다. 결정 화 가능성이 좁은 크기 분포 (B) 결정의 높은 밀도 위해 최적화 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 구조 변경 bacteriorhodopsin. TR-SFX 양성자 펌프 bacteriorhodopsin의 구조에서 초고속 변화를 보여준다. 여기이 작품에 제시 된 프로토콜을 사용 하 여 준비 하는 결정에서 가져온 TR SFX 데이터에서 파생 된 bR의 모델 사진. 왼쪽된 패널 망막 바인딩 주머니에 강조 표시 된 기능을 갖춘 모델을 보여 줍니다. 오른쪽 패널 밀리초 femtoseconds에서 망막의 변화를 보여줍니다. 이 그림에서 Nogly 그 외 여러분 (2018)10 동의 재현 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 3 방향 커플러. 3 방향 커플러 기밀 주사기와의 호환성을 위한 감소 된 죽은 볼륨 Y 믹서입니다. 3D 렌더링, 커플러의 분해 뷰는 어셈블리 (A), 고 투명 볼 혼합 보여주는 채널 (B). 그림 3 방향 커플러 (D)에 혼합 후 표준 커플러 (C)와 결과 현 탁 액 혼합 후 휘도가 크리스탈 배포입니다. 혼합은 대략 샘플의 절반으로 밀어 다른 주사기 (E), 그리고 다음 파란색 화살표 (F)에 의해 볼 수 있듯이 함께 나머지 주사기로 두 반쪽을 추진 하 여 수행 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 사전 주입 테스트 표시기. 샘플 준비 하는 동안 몇 가지 작은 테스트 샘플 단계 임을 나타내기 위해 사용 하 고 적절 하 게 점성 있습니다. 광학 선명도 샘플은 입방 단계에서 가능성이 하나의 지표 이다. (A)는 혼 탁 한 샘플 주사기에 표시 됩니다. (B)는 분명 샘플 표시, 마이크로 결정의 높은 밀도도 불구 하 고 샘플을 통해 보이는 졸업 라인을 참고. 지질 매트릭스 입방 단계에 있을 때, 스트레스 아래 때 고체 처럼 남아 있다. 저압 테스트 샘플의 뒷면에서 주사기를 당겨 수행 됩니다. 때 샘플 너무 액체 같은 (스폰지 단계 지표) 샘플을 확장 볼륨 (C)를 입력 합니다. 동일한 테스트 (D)의 긍정적인 결과에 샘플 철회 플런저에도 불구 하 고 정적 남아 있습니다. 마지막으로, 매크로 스케일 압출 테스트 주사기 커플러를 통해 샘플의 작은 금액을 눌러 수행 됩니다. 노즐 팁 (E) 또는 LCP의 신속 하 게 벤딩 실린더에 형성 하는 물방울은 충분히 점성을 나타냅니다. 샘플을 밀어냅니다, 시간 (F)에 직 립 유지, 실린더 형태의 경우 샘플 고속 카메라 테스트를 미리 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
점성 돌출 인젝터와 TR SFX 메서드 bacteriorhodopsin9,10 , photosystem II13 의 구조 역학 연구에 대 한 가능한 기술을 입증 하 고 지금 공부 단백질 다른 운전 준비가 보인다 사진 빛 구동 이온 전송 등 감각 지 각5,50생물 학적 프로세스. 위에서 설명한 프로토콜 bacteriorhodopsin, TR-SFX 데이터 컬렉션의 성공을 극대화 하기 위해 설계 되었습니다 아직 다른 샘플에 데이터 수집을 최적화 하는 템플릿 역할을 할 수 있다고. 이 방법에서는, 귀중 한 beamtime의 많은 현재 막힘으로 인해 손실 또는 가난한 샘플 압출 대신 더 많은 시간 지연에 더 나은 데이터 수집에 사용 될 수 있습니다.
프로토콜에서 가장 어렵고 중요 한 단계 작은 양의 입방 단계 (단계 1.8)으로 지질 매트릭스를 제공 하는 monoolein의 추가 이다. Monoolein 초과에 추가 될 때 어려움 위상 전환 및 샘플에 대 한 부정적인 영향의 미묘에 놓여 있습니다.
방법론에 대 한 수정 다른 단백질 결정을 수용 하기 위해 구현 되어야 합니다. 이 동일한 첨가제 또는 금액 또는 필요한 혼합 호환 되지 않을 수 있습니다. 다른 한편으로, 혼합 과정에서 더 작은 조각으로 크리스탈을 깨고 회절 품질을 타협 하지 않을 수 있습니다 하 고 심지어 예 제트 긴 바늘 짧은 조각으로 휴식을 향상 시킬 수 있습니다. 다른 첨가제 파라핀, 흐름 속도 안정성9를 개선 하기 위해 추가 되는 대신 대체 될 수 있습니다. 매기 7.9/9.7에 주입 하는 경우 발생할 수 있는 플레이트 단계에는 trasnistion를 방지 하기 위해 추가 진공 환경20 (같은 CXI endstation LCLS에서), 그러나 실험은 대기압에서 수행 하는 경우 생략할 수 있다. 우리의 경험에서는, 수용 성 단백질에서 많은 크리스탈 안정적으로에 통합할 수 있습니다 LCP, 아직 다소 아이러니 하 게도 막 단백질 결정 lipidic mesophases에서 직접 재배 하는 자주 분해 아마도 세제 크리스탈에서 추출 하기 때문에 지질 같은 환경으로 그들을 둘러싼. 이러한 경우에는 대체 점성 캐리어24,25,26,27,,2930LCP를 완전히 대체 하 시도 한다.
고속 카메라 테스트에 대 한 수정 샘플 결정 내 캐리어 표시 되지 않습니다을 수용할 수 있습니다. 예를 들어 조명 편광된 가벼운 현미경 검사 법을 사용 하 여 동영상 녹화를 구성할 수 있습니다. 이것 birefringent 결정 (발광)으로 표시 하면 고 birefringent 플레이트 단계에 있는 지질 매트릭스의 부분 보여준다.
수정, 그것은 중요 한 단백질 결정 준비 가능한 한 많이 다음과 같은 기준을 충족입니다. 결정 해야 될 최적의 크기 인젝터 막힘을 최소화 하면서 회절을 극대화. 크리스탈 밀도 충분히 높은 히트 레이트를 완전 한 데이터 집합을 수집 충분 한 항복 해야 하지만 하지 그래서 제트 안정성 손상으로 밀도 (너무 높은 밀도 일반적으로 희석 수 있습니다; bR, 10-30%의 히트 속도 조정의 경우 보통 worke d 잘)입니다. 지질 매트릭스 입방 단계에 주어져야 한다 고 크리스탈 정지 균질 이어야 한다.
때문에 주요 이점이 Laue 회절 같은 다른 시간 해결 결정학 기술 보유 하 고 TR SFX: 방사선 손상 "파괴 하기 전에 회절" 방법론으로 인해 제한, TR-SFX는 광범위 한 시간 분해능의 많은 순서 크기 펨 범위 아래로 작은 결정 허용 더 나은 photoactivation, 그리고 관심의 photocycles 가역 될 필요가 없습니다.
TR-SFX는 XFEL 높은 점도 인젝터를 사용 하 여에서 액체 제트기 인젝터 샘플 비용 절감 측면에서 중요 한 장점이 있다. 수집 된 회절 이미지의 동일한 금액에 대 한 50의 요인에 의해 감소를 나타냅니다 예를 들어 직접 PYP6 및 bR10, 비교. 액체 제트기 반면에 이점을 그 흐름은 빠르고, 데이터 수집 (어둡고 밝은 프레임 교체), 최고 속도로 실행 인젝터 스트림 속도 안정성 (또는 어두운 프레임에 가벼운 오염)에 관계 없이. 점성 제트에서 새로운 과제를 추가 하는 동안 액체 제트 TR SFX에서는 절대적으로 많은 생물학 관련 시스템에 대 한 생산 하는 합리적인 수 있는 단백질의 양을 고려 가치가 있다.
현재, TR-SFX 점성 샘플 준비 전달 매체와 크리스탈 호환성에 의해 제한 됩니다. 여러 대체 점성 사업자 구현 되었습니다, 하지만 아무도 모든 경우에 작동 하도록 발견 되었습니다. 또한, 높은 점도 인젝터와 샘플 배달 항상 막힘, 또는이 프로토콜을 사용 하 여 optomozation도 함께 둔화 됩니다. 기술의 또 다른 한계 때 고유의 감소 적중률에 optomised extrudability를가지고 샘플을 diluting.
미래에, 합성 photoswitches 함께 자연 chromophores 단백질 목표에서 TR SFX 메서드를 확장할 수 있습니다. Photoactivated 수 없는 반응에 측정 시간 해결 혼합, 온도-점프, 전기 분야, 또는 직렬 결정학에 적응 될 아직 다른 정품 인증 기술을 사용 해야 합니다. XFEL beamtime의 증가 가용성 함께 이러한 트리거 기술의 조합 누워 것입니다, 시간이 지남에, 단백질 기능을 원자 수준에서의 구조 역학을 이해 하는 기초.
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Disclosures
저자는 전혀 상반 되는 관심사를 선언합니다.
Acknowledgments
우리 인정 Gebhard Schertler, 라파엘 이탈리아 크리스 Milne PSI에 높은 점도 인젝터의 사용을 지원 합니다. 리처드 Neutze와 그의 팀은 시간 해결 결정학 및 샘플 배달 고 점도 인젝터를 사용 하 여 토론에 대 한 인정 됩니다. 스위스 국립 과학 재단 교부 금 31003A_141235, 31003A_159558 (에 제)에 대 한 재정 지원에 대 한 인정 및 (P.N.)를 PZ00P3_174169. 이 프로젝트는 유럽 연합의 수평선 2020 연구와 마리-Sklodowska-퀴리 부여 계약 아니오 701646 혁신 프로그램에서 자금을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mosquito LCP Syringe Coupling | TTP labtech store | 3072-01050 | |
| Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 µl | Hamilton | HA-81065 | |
| Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 µl | Hamilton | HA-81265 | |
| Monoolein | Nu-Chek Prep, Inc. | M-239 | |
| 7.9 MAG | Avanti Polar Lipids Inc. | 850534O | |
| 50% w/v PEG 2000 | Molecular Dimensions | MD2-250-7 | |
| Paraffin (liquid) | Sigma-Aldrich | 1.07162 | |
| High speed camera | Photron | Photron Mini AX | |
| High magnification lens | Navitar | 12X Zoom Lens System | |
| Three axis stage | ThorLabs | PT3/M | |
| Fiber light | Thorlabs | OSL2 | |
| Fused silica fiber | Molex/Polymicro | TSP-505375 | |
| Lite touch ferrule | IDEX | LT-100 | |
| ASU high viscosity injector | Arizona State University | Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu) | |
| HPLC pump | Shimadzu | LC-20AD | |
| Electronic gas regulator | Proportion Air | GP1 |
References
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