Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Microcrystals yüksek viskozite ekstrüzyon için zaman karar vermek seri halinde Femtosecond kristalografisi x-ışını lazerleri iyileştirilmesi

Published: February 28, 2019 doi: 10.3791/59087

Summary

Bir seri femtosecond zaman çözüldü kristalografisi deney başarısı verimli örnek Teslimde bağlıdır. Burada, bacteriorhodopsin microcrystals bir yüksek viskozite mikro-ekstrüzyon enjektör üzerinden ekstrüzyon optimize etmek için iletişim kuralları açıklar. Metodoloji bir roman üç yönlü bağlaştırıcı ile örnek homojenizasyon ve görselleştirme ile yüksek hızlı bir fotoğraf makinesi yararlanır.

Abstract

Yüksek viskozite mikro-ekstrüzyon enjektörleri büyük ölçüde X-ray serbest elektron lazerler (XFELs) seri femtosecond crystallographic deneyler (SFX) örnek tüketimi azaltılmıştır. Işık tahrik proton pompa bacteriorhodopsin kullanarak deneyler bir dizi daha fazla kurduk bu enjektörler kristalleri yapısal değişiklikleri gidermek zaman karar vermek seri halinde femtosecond kristalografisi (TR-SFX) için teslim etmek için tercih edilen bir seçenek olarak proteinler photoactivation sonra. Birden çok yapısal anlık görüntülerini yüksek kalite elde etmek için büyük miktarda veri toplamak ve kristalleri her pompa lazer nabız arasında boşluk sağlamak için önemlidir. Burada, biz nasıl biz bacteriorhodopsin microcrystals ekstrüzyon son TR SFX deneylerimiz Linac tutarlı ışık kaynağı (LCLS), en iyi şekilde ayrıntılı olarak tarif. Yönteminin amacı artış oranı kristallerinin yüksek yoğunluklu koruyarak ekstrüzyon istikrarlı ve sürekli bir akış için en iyi duruma getirmektir deneme veri TR SFX içinde de toplanabilir. Biz lipidik küp aşama kristalleri ile yüksek hızlı alınan ekstrüzyon istikrar tedavinin temel örnek kompozisyon ayarlayarak takip cihazı kaplin roman üç yollu kullanarak homojen dağılımı ile hazırlayarak bu hedefe ulaşmak kamera ayarları. Metodoloji diğer microcrystals akışını optimize etmek için adapte edilebilir. Belgili tanımlık tertibat yeni İsviçre ücretsiz elektron lazer tesis kullanıcıları için kullanılabilir hale gelir.

Introduction

Seri femtosecond kristalografisi (SFX) x-ışını serbest elektron lazerler (XFEL) oda sıcaklığında yapıları belirlemek için benzersiz özellikler yararlanan bir Yapısal Biyoloji mikrometre ölçekli kristalleri binlerce çoğu ekme tekniktir radyasyon hasarı "kırınım imha önce" ilke1,2,3.

Bir zaman çözüldü uzantısı SFX (TR-SFX) içinde XFEL üzerinden femtosecond bakliyat proteinler4,5yapısal değişiklikleri incelemek için kullanılır. Protein ilgi bir optik lazer (ya da başka bir etkinlik tetikleyici) ile sadece bir pompa-sonda kurulumunda XFEL tarafından önce vurulduğunu etkinleştirilir. Tam olarak pompa ve sonda nabız arasında gecikme kontrol ederek, hedef protein farklı eyaletlerde geçirilerek. Onbir büyüklük zamanında üzerinde yapısal değişikliklerin moleküler Filmler çeşitli protein hedefleri6,7,8,9dynamics çalışmaya yeni XFEL kaynakları güç göstermek, 10,11,12,13. Prensip olarak, yöntem dinamik spektroskopik ve statik yapı teknikleri bir, atomik çözünürlük yakınındaki protein dynamics içine bir bakış sağlayan katılır.

TR-SFX için basit sistemleri harekete geçirmek ile bir fotoğraf duyarlı bileşeni retina bacteriorhodopsin (bR)9,10, photosystem II12,13' te kromofor gibi endojen bir tetikleyici içerebilir, fotoaktif sarı protein (PYP)6,7 ters photoswitchable floresan protein11veya photolyzable karbon monoksit miyoglobin8. Hala geliştirme tekniği heyecan verici varyasyonları mix itimat ve enzimatik reaksiyonlar ya da yapısal değişiklikler16ikna etmek için kullanılan elektrik alan eğitim programları14,-15 enjekte. XFEL kaynakları sadece be elde edilebilir için birkaç yıl ve başarıları geleceğe extrapolating, yöntemi nasıl bizim anlayış açısından gerçek bir oyun değiştirici olarak potansiyel gösterir verilen bu proteinlerin işlevi.

Biyolojik örnekleri tek bir yüksek güç XFEL darbe maruz tarafından yok edilir çünkü protein kristalografisi yeni yaklaşımlar gerekliydi. Bu yordamları arasında Tekdüzen microcrystals büyük miktarda büyümeye yeteneği gelişmiş17,18,19olması gerekiyordu. Bir XFEL, veri toplamayı etkinleştirmek için bu kristaller gerekir teslim, atılan olup her XFEL darbe için yenilendi. XFELs 10-120 Hz'de kullanışlı bakliyat ateş göz önüne alındığında, örnek teslimat da sağlam ve sınırlayıcı tüketimi kristalleri tutarken hızlı, istikrarlı ve güvenilir, olmalıdır. Arasında en başarılı çözümler oda sıcaklığında kristal yüklü lipidik üçüncü aşama (LCP) sütunun pulsed röntgen ışını20akarsu bir işletmesi teslim etmek yüksek viskozite mikro-ekstrüzyon enjektör var. Rastgele odaklı kristalleri, gömülü nerede bir kırınım deseni kaydedilir bir Dedektör üzerine XFEL bakliyat dağılım x-ışınları tarafından yakalanan LCP akışında. Sık sık membran protein kristalleri17,21,22,23için henüz diğer yüksek viskozite taşıyıcı medya bir büyüme aracı olarak kullanıldığı gibi LCP bir örnek teslim orta için doğal bir seçim yapıldı. 24,25,26,27,28,29,30 ve çözünür proteinler31 de kullanıldığını enjektör içinde. SFX yüksek viskozite enjektör ile membran proteinleri13,32 G protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs)33,34dahil yapısı belirlenmesi sırasında başarılı olmuştur, 35,36,37, hem zaman hem de örnek etkili olurken yerli aşamalı38,39 için yeterli veri kalitesiyle. Şu anda, bu enjektörler daha düzenli olarak Oda sıcaklık ölçümleri sinkrotron kaynakları28,30,40,41 yanı sıra daha fazla sırasında için kullanılmakta olan teknik olarak TR-SFX deneyler XFELs9,10,13,42talep.

Karşılaştırılabilir TR SFX deneyler sıvı faz teslim akışı başlığı6,7,12odaklanmış gibi diğer enjektör türleri kullanılarak gerçekleştirilen, ancak, bu yöntem için pek çok protein miktarları mevcut değil gerektirir biyolojik olarak ilginç hedefleri. Viskoz ekstrüzyon bir ortalama tüketimi başına 10.000 dizin oluşturulmuş kırınım desenleri ile karşılaştırıldığında 9,35 mg protein 0,072 mg için sıvı jet kullanarak statik yapılar belirlenmesi için püskürtme (yani, 130 kat daha fazla örnek hakkında bildirilmiştir verimli)20. Yüksek viskozite enjektör sadece bu örnek verim43bazıları feda ederken uygun örnek teslimatı için TR SFX olmak gösterilmiştir. İçinde Nogly ve ark. (2018)10, örneğin, örnek tüketimi yaklaşık 1,5 olumlu nerede ortalama örnek tüketimi çok daha yüksek protein başına 10.000 74 mg ile PYP kullanarak benzer TR SFX deneyleri için karşılaştıran mg başına 10.000 dizin oluşturulmuş desen, yapıldı. Dizin oluşturulmuş desen6. Yüksek viskozite enjektörleri böylece protein mevcut miktarını sınırlayarak veya kristaller doğrudan LCP yetiştirilmektedir açık avantajları vardır.

TR-SFX için yüksek viskozite kullanarak birkaç teknik sorunları en güvenilir veri vermeye enjektörleri ele alınması gerekmektedir: akış hızı en az kritik değeri; kalmaya ihtiyacı isabet oranı veri toplama yavaş işlemez bir düzeyde muhafaza edilmelidir (örneğin, % 5'den büyük); ve örnek aşırı aksamalar teslim edilecek. İdeal olarak, bu koşullar zaten yerine kullanılabilir XFEL zamanı olabildiğince verimli bir şekilde kullanmak için uzun bir zamanlanmış TR SFX deneyin önce. Pricipally, bir yavaşlama LCP akışındaki birden fazla optik lazer nabız ve sonuç karışık etkin Birleşik Devletleri ile etkinleştirildi kristalleri problama veya umpumped malzeme ışının içinde beklenen pompalanan malzeme sondalama izin verebilir. Enjeksiyon öncesi test ek bir yararı, bir XFEL, veri toplama sırasında kapalı kalma saat başlıklarının tıkalı olmayan ekstrüzyon örnekleri, değiştirme, değiştirme için küme olarak küçültülür ve diğer bakım görevleri azaltılır olmasıdır.

Burada, örnek teslim yüksek viskozite mikro-ekstrüzyon enjektör ile TR SFX veri toplama için en iyi duruma getirmek için bir yöntem mevcut. İş yerinde bir sinkrotron beamline29 daha fazla bilgi beklenen isabet oranları ve kristal kırınım sağlamak, ancak kolaylık olması için açıklanan yöntemleri bir x-ışını kaynağına erişim güvenmeyin. Protokolümüze deneyler proton pompa bacteriorhodopsin10 retina isomerization yakalamak için en iyi duruma getirmek için geliştirilmiştir ve Ekstrüzyon ekstrüzyon izleyerek takip için kristal örnekleri hazırlama ile başlayan iki aşamada yapılmaktadır bir yüksek hızlı kamera Kurulumu kullanarak. Bir aşamasında, kristal yüklü LCP ek LCP, düşük geçiş sıcaklığı lipidler veya diğer katkı maddeleri son karışımı tıkanma veya yavaşlama'dır örnek ortamına uygun olduğundan emin olmak için ile karıştırılır. Yeni bir üç yönlü şırınga coupler karıştırma performans ve örnek homojenliği geliştirmek için geliştirilmiştir. İkinci aşama doğrudan ekstrüzyon hızı istikrar ölçmek için yüksek hızlı bir kamera tarafından kaydedilen bir ekstrüzyon testi oluşur. Video veri analizi, deneysel sonuçlar geliştirmek için örnek hazırlama protokolü için ayarlamalar yapılabilir. Bu yordamları en az değişikliklerle TR SFX veri toplama için diğer proteinler hazırlamak için uyarlanmış ve sınırlı XFEL beamtime verimli kullanmak için katkıda bulunacaktır. Sadece onların işlemi44,45 ve enjektör tabanlı seri veri toplama yöntemleri transfer synchrotrons28,30,40,41 başlayan yeni XFEL imkanları ile , önümüzdeki birkaç yıl mutlaka protein hedefleri hiç daha geniş bir yelpazesi yapısal dinamikleri heyecan verici yeni görüşler sağlamaya devam edecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. protein Crystal numune hazırlama

  1. Örnek enjekte edilebilir için önce yaklaşık 30 dk monoolein kristal yüklü yük 50 µL 100 µL şırıngada LCP dayalı.
  2. Atmosfer basıncında enjeksiyon için: ikinci bir şırınga arkası içine Sıvı parafin, yük 10 µL. Şırınga dikey tutarak, şırıngadan hava kabarcıkları sınırdışı.
    1. Vakum ortamı içine enjeksiyon için: yük 5 µL MAG 7,9 ve ikinci bir şırınga arkası içine Sıvı parafin 5 µL. Şırınga dikey tutarak, şırıngadan hava kabarcıkları sınırdışı.
  3. Şırınga ile parafin/MAG 7,9 standart şırınga coupler için bağlanmak, pistonu üzerinde bir küçük birim kadar yavaşça basarak baðlantý birimi Hava Temizleme (< 1 µL) parafin/lipid coupler iğne ucunda görülür.
  4. Örnek şırınga herhangi bir hava örnek tanıtmak değil dikkat çekici şırınga baðlantý birimi bağlayın. Lipid/parafin örnek malzeme bağlantı ile birden çok kez geçirerek karıştırın.
  5. Premix LCP (%27 PEG, 100 mM Sorensen pH 5.6 + MO) 20 µL başka bir 100 µL şırınga yükleyin. Hava kabarcıkları gerektiği gibi kaldırın.
  6. Boş şırınga bağlaştırıcı kaldırmak ve bir standart şırınga coupler kullanarak şırınga içeren kristal premix LCP ekleyebilirsiniz. Örnek bağlantı aracılığıyla 100 kere geçmektedir.
    Not: Örnek karıştırma örnek ısı biraz46. Karıştırma yavaş bir hızda nerede örnek sıcaklığını makul sürekli tutulabilen yapılmalıdır.
  7. Örnek karşı bir ışık kaynağı şeffaflık için kontrol edin. NET homojen bir LCP oluşturmuştur, 1.9 adıma gidin.
  8. Örnek küp aşamasında içine getirmek için monoolein 3 µL ve 50 kere (yukarıda açıklandığı gibi) karıştırın. Sadece monoolein aşırı önlemek için şeffaf bir faz kurdu kadar bu yordamı yineleyin.
    Not: LCP oluşumu sıcaklık bağımlı47 ve biraz 20 ° C'nin üzerinde en iyi sonuçlar elde edilir Ek monoolein miktarı kalan precipitant çözüm kristalizasyon taşınan hacmi bağlı olacaktır.
  9. Bir başlangıç olarak test (LCP faz beklendiği gibi) örnek sertlik ve Yükselt-yetenek için şırınga coupler boş şırıngadan ayırmak ve, şırınga dikey tutarak, örnek küçük bir miktar sıkmak (< 2 µL) baðlantý birimi yoluyla. Bir dik silindir haddelenmiş örnek formlar, örnek ekstrüzyon test etmek için hazırsınız.
  10. 100 µL için örnek hacmi (aynı derecede içinde adım 1.5) daha premix LCP ekleyerek ayarlayın.
  11. Örnek şırınga ve iki boş şırınga (coupler önce gelen Hava Temizleme) üç yönlü şırınga coupler iliştirin. En az 50 kez (veya kadar homojen) mix örnek yarısı ikinci şırınga geçen ve örnek iki yarısını üçüncü şırınga aynı anda basarak.
  12. Kristalleri homojen bir dağılım doğrulamak için stereo mikroskop altında karışık örnek içeren şırınga yerleştirin.

2. yüksek hızlı kamera Kurulumu kullanarak örnek ekstrüzyon testi

  1. Deneysel parametrelerin belirlenmesi.
    1. Test için meme boyutunu seçin.
      Not: Meme boyutları genellikle 50-75 µm iç çapı (ID), ama kabaca 30-100 µm kimliği kabul edilebilir herhangi bir boyutu vardır. Seçim ortalama tıkanma zaman, arka plan saçılma, örnek tüketimi ve isabet oranı arasında bir denge temel alır.
    2. Deneysel lazer nokta boyutu (1/e2 çapı) ve (örneğin, araya eklenmiş ışık ve karanlık) düzeni XFEL kullanılacak olan veri toplama göre optimum akış hızı hesaplamak.
    3. Hesaplamak istediğiniz akış hızı (Equation 1) örnek optimum akış hızı (Equation 2) ve seçili meme çapı (Equation 3):
      Equation 4
      Akış hızı belirlemek (Equation 5) amplifikasyon faktör dayalı HPLC pompa girilmelidir (Equation 6), enjektör.
      Equation 7
      Maksimum basınç hesaplamak (Equation 8) meme bağlantı parçaları anma basıncı üzerinden (Equation 9) ve enjektör büyütme faktörü (Equation 10):
      Equation 11
  2. Yüksek viskozite ekstrüzyon enjektör şekil 1' deki gösterildiği gibi çevrimdışı kullanım için kurulumu.
    Not: Çift Kompenantlı hidrolik macun aracılığıyla enjektör işlevleri bir HPLC pompası tarafından desteklenmektedir ve Gaz Regülatörü tarafından denetlenen bir ortak akan helyum gaz kılıf kullanır. Pompa ve regülatör kurulum değil bu protokol için ele alınmıştır. Ayrıntılı bir kılavuz için James (2015)48 yılında dördüncü bölüm bkz.
    1. Pompa ve flowrates doğru olduğundan emin olmak için tüm su hatları temizlemek. Enjektör Hidrolik sahne temizlemek.
    2. Enjektör (ya da kamera) çerçeveleme ve odaklama için yüksek hızlı video kolaylaştırmak için üç eksenli sahnede bağlayın. Objektif lens, aydınlatma, yansıtıcı ekran ve harcanan örnek yakalamak için küçük bir ölçek için enjeksiyon nokta etrafında boşluk bırakın.
    3. Bir "kukla meme" oluşturmak (bağlı bir meme ile boş bir rezervuar) ve enjektör üzerinde konumlandırma, odak ve aydınlatma kolaylaştırmak için yükleyin.
    4. Meme ucu objektif odak noktası yakınındaki yüksek hızlı kamera bağlayın.
    5. Enjektör arkasında yansıtıcı ekran konumlandırın ve aydınlatma açık-meme ışık için ayarlayın.
    6. Açmak ve kameraya verilen yazılımı ile bağlayın. Görsel geribildirim için çalışan bir canlı video ile meme ucunu çerçevesinin ortasında konumlandırın ve üç eksenli sahne ile odak haline getirmek.
    7. Aydınlatma edene kadar meme açıkça görülmeye başlıyor ve arka plan aydınlatılmış eşit olarak ayarlayın.
  3. Kameranın yüksek hızlı time-lapse video kaydetmek için yapılandırma.
    1. 1000 FPS set framerate. Çözünürlük 512 x 512 piksel olarak ayarlayın.
    2. Meme görünene kadar maruz kalma süresi şimdi tarafından kare hızını ayarlamak için aydınlatma düzeyini ayarlayın (yani, altında değil-ya da pozlanmış). Meme ucu bu ortalanacak şekilde yeniden konumlandırmak soldan sağa ve çerçevenin üst üçüncü yer alır.
    3. Herhangi bir arka plan düzeltme veya beyaz dengesi işlemleri çalıştırmak.
    4. Kameranın hızlandırılmış modunda ayarlayın. İçin belirlenen aralıkta 30 s ve tekrarlar 40 kez, rasgele (veya rasgele Sıfırla) tetikleyici modunu ayarlayın ve 1000' e kaydetmek için kare sayısını girin.
  4. Havzanın 20 µL test örneği ile yük ve kapiller başlık ekleyebilirsiniz.
  5. Dolgulu rezervuar enjektör için ekleyin. Gaz borusu meme üzerinde bağlantı noktasına ekleyin ve gaz akışı başlar.
  6. El ile piston hatlı vana açma ve şırınga basarak önceden. Piston rezervuar örnek ile sağlam iletişim kurduğunda vanayı kapat.
  7. Hesaplanan akış hızı ile pompa program ve maksimum basınç hesaplanan değere ayarlayın (bkz. Adım 2.1.3).
  8. Pompa ve kamera kaydı da eşzamanlı olarak başlatılır.
  9. Ekstrüzyon başladığında, istikrarı artırmak için gaz basıncı ayarlayın. Eğer bir sütun yerine meme ucunda bir damla sıvı formlar gaz basıncı artırmak. Ekstrüzyon gaz akışı aşırı makas nedeniyle bozuk veya hızla salınan azalma basınç (kırbaçlanan).
  10. Ekstrüzyon izlemek (10 dk olduğunu genellikle homojen akışı durumu tanımak yeterli) ve pompa basınç keskin beklenen bitiş saati hızlanınca, kaydı, pompa kapatmak kapa durdurmak ve sistem basınç tahliye vanası açarak delik.
  11. Video dosyalarını analizi
    Not: açıkça yetersiz örnek ekstrüzyon detaylı bir analiz gerektirir. Ancak, örnek optimize başarısızlık modu belirlemek yine de yararlıdır.
    1. (Örneğin, Fiji49) analiz yazılımı ile video dosyasını açın ve ölçüm araçları kalibre.
    2. Ölçümler bilinen uzunlukta bir satır satır Seçim aracıyla görüntüyü seçerek kalibre. Analiz yoluyla Ölçeği ayarla penceresini açın | Ayarla ölçek ve bilinen mesafe ve ölçü birimlerini girin.
      Not: Bilinen çapı çıkmasına izin verir bu ölçümler için yeterli kalibrasyon uzunluğu sağlar.
    3. Bir çerçeveyi video bulmak içinde ekstrüzyon izlenebilir özelliği görünür (örneğin, bir kristal) olduğu. Çerçeve kaydedin.
    4. Video nerede aynı özellik görünür ama önceki adımda pozisyonundan taşındı bir çerçeveye ilerlemek. Çerçeve kaydedin.
    5. Düz çizgi ölçüm aracını kullanarak özellik başlangıç ve bitiş noktası analiz yoluyla mesafe ölçmek | Ölçü.
      Not: Artık izlenebilir mesafe, daha az sayıda hataları ölçümdeki hesaplamaları etkiler
    6. Hesaplama jet hızı ölçülen mesafe ve geçen süre (framerate tarafından bölünmüş geçen çerçeve sayısı.)
    7. Adımları 2.11.3-2.11.6 video her segment için bir kaç kere tekrar edin.
    8. Şekil 2gibi veri serisini çizdirme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada açıklanan yordamları (şekil 3) için ideal başlangıç malzeme için enjektör viskoz taşıyıcı orta dahil microcrystals yüksek yoğunlukları vardır. Kristal bin Ladin'in taşıyıcı her hazırlık için yaklaşık 50 µL için yordamı çağırır. Bunlar doğrudan içinde LCP burada, örneğin (şekil 4), kullanılan veya geleneksel buharı difüzyon kurulumları içinde yetiştirilen kristalleri kullanılarak hazırlanan bR9,ile10 yetiştirilen olabilir. Kristalizasyon doğrudan içinde gastight şırınga için mükemmel bir video rehber İşçenko vd (2016)37bulunabilir. BR ile kristal plakaların ideal çapı yaklaşık 20 mikron kırınım güç ve homojen etkinleştirme pompa lazer tarafından arasında iyi bir uzlaşma olarak var. Protein kristalleri, yukarıda açıklandığı gibi protokolleri kullanılarak hazırlanan foton emilim (şekil 5) sonra oluşan ultrafast değişiklikleri ortaya proton pompa bR üzerinde TR SFX veri toplamak için kullanılmıştır.

Üç yönlü bağlaştırıcı (şekil 6AB) kullanarak numune hazırlama sonra görsel denetim şırınga örnek malzemenin karışık örnek, hem de örnek homojenliği (şekil 6CD) ve mikroskop görüntüleri gösterir. şırınga ve bir slaytta, kristaller yoğunluğu teyit edebilir ve kristal boyutları, kristal boyutu dağıtım ve kristal yoğunluk ölçümleri için sağlar. Ne zaman teslim orta net kübik aşamasında örneğidir (Şekil 7) ve yapışkan. Bulanık karışımları bir sünger faz veya lamel faz örnek bir göstergesi, ancak yüksek kristal yoğunluk LCPs netlik belirsiz gibi kesin değil. Sıvı sünger faz tanımlamak için kısa bir alçak basınç test şırınga pistonu şırınga arkasında örnek uzak çekerek gerçekleştirilebilir. Lamellar faz polarize ışık mikroskobu ile onun birefringence ile kolayca tespit edilebilir. Bir öncesi ekstrüzyon testi ile birleştiğinde bu testler genellikle enjektör testinde haklı göstermek yeterlidir.

XFELs yüksek tekrarlama oranı yeterince düşük çerçeve hızı kameralar ile gözlenen cant bir akış hızı gerektirir. Bu nedenle, ekstrüzyon nitelemesi yapılır time-lapse video kaydedebilirsiniz (yüksek büyütme objektif ile birleştiğinde) yüksek hızlı bir kamera ile. Video veri çerçeveleri 1000 fps kaydedilir ki yüksek hızlı ve aynı zamanda hızlandırılmış 1 için kaydedilen video o s her 30 s. Bu veri toplama düzeni yönetilemez video dosyalarını oluşturmadan, veri toplama sırasında tüm örnek testi (yaklaşık 10 dakika) için izin verir. Hatta bu azalma veri kümesi ile boyut, video dosyaları aşan 50 GB kalmış olabilir. Test başlamadan önce video verileri kaydetmek için yeterli depolama sağlamak için özen gösterilmelidir.

Jet test (şekil 1) sırasında uzun (200'den fazla µm) sürekli bir sütun (Şekil 2) neredeyse sabit bir hızda hareket eden LCP, örnek A'ya. Damlama modunda çalıştırmak örnekleri gösterir örnek viskozite çok düşüktür (Şekil 2). Örnekleri sık sık yeniden elde etmek ve daha fazla monoolein veya parafin viskozite uyum ile karışık. Bir sütun oluşturmak örnekleri ile yüksek hızlı kamera test edilmelidir. Kayıt verileri ekstrüzyon deneysel parametrelerinizi tarafından dikte minimum hız yukarıda kalır göstermelidir. Ekstrüzyon hızı bir özellik LCP akışında bir kare sayısı seyahat doğrusal mesafe ölçme tarafından belirlenir. Anormal takunya için bağlanabilir ekstrüzyon kesintiler test garanti. Onlar devam ederse jeti parafin gibi katkı maddeleri, kristaller yoğunluğunu azaltarak veya daha büyük bir çap meme seçerek geliştirilmiş. Normalde viskoz bir ortamda (örneğin, buharı difüzyon) yetiştirilen kristalleri Santrifüjü tarafından peletted olabilir ve LCP ve viskoz diğer gemileri dahil. Örnekler için bkz: önceki yayınları24,25,26,27,29,30.

Figure 1
Şekil 1: yüksek hızlı kamera tezgah Kur. Bir fotoğrafı etiketli parçalar ile tipik benchtop Kur. Üç eksenli sahne çerçeveleme ve odaklama görüntü esneklik sağlar. (Meme ve bağlı rezervuar ile gösterilen) enjektör dikey olarak ve doğrudan önünde objektif lens monte edilir. Bu örnekte aydınlatma örnek eksen kapalı aydınlatıcı ve ekranda parlak bir alan sağlayan bir tek fiber ışık tarafından sağlanır. Monte edilmiş ve bu şekilde aydınlatılmış bir örnek olarak iç metin B. olan gibi bir görüntü sağlar Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: yüksek hızlı kamera test ve veri analiz. Yukarıdaki resimde iki LCP ekstrüzyon testlerdir. Test A bR kristaller bir damlama modunu örnek optimize edilmemiştir gösteren içinde LCP ekstrüzyon gösterir. Test B nerede kristalleri izlenebilir ve Ekstrüzyon hızı hesaplanabilir LCP sürekli bir sütun oluşturan LCP ekstrüzyon gösterir. Bu örnekte, LCP sütununda (50 µm çapı) gömülü bir kristal 301 µm 8 ms (37.6 mm/s) taşır. LCP bacteriorhodopsin kristallerinin farklı ürünleri üzerinden iki veri kümesi gösterilir. Hızlandırılmış yüksek hızlı kamera video her saniyesi dört (veya daha fazla) veri puan (1 her 30 kayıt s s) çizildi. Büyük formaya single ikinci veri toplama aralığı alınan veri noktaları arasındaki kısa süreli hız değişim gösterir. Bütün veri serisini üzerinden bir hareketli ortalama akış uzun dalgalanmalar gösterirken. Kötü extruding örnek (iki ardışık pompa lazer bakliyat ile hafif kirlenme için yüksek şans) üzerinden üst dizisidir ve alt serisi en iyi şekilde gerçekleştiren bir örnek. Yatay noktalı çizgi hedef ekstrüzyon hızı kümesi HPLC pompa yoluyla gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: örnek hazırlama akış çizelgesi. Numune hazırlama protein kristalleri LCP içinde gömülü yüksek yoğunluğu ile başlar. Örnek daha sonra düşük geçiş sıcaklığı lipid, parafin, ile karışık ve örnek küp aşamasında içine geliyor ve bir dizi örnek enjektör bükün belirtmek için küçük test geçer kadar LCP hazır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: malzeme başlangıç olarak Bacteriorhodopsin kristalleri. Kristalleri precipitant çözümünde dalmış LCP ile gaz geçirmez şırıngalarda (A) yetiştirilmektedir. Kristalizasyon muhtemelen dar boyutu dağılımı (B) ile kristallerinin yüksek yoğunluklu için optimize edilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: yapısal değişiklikleri içinde bacteriorhodopsin. TR-SFX ultra-hızlı değişimler proton pompa bacteriorhodopsin yapısını ortaya koymaktadır. İşte bu çalışmada özetlenen protokolleri kullanılarak hazırlanan kristalleri elde TR SFX verilerden elde edilen bR modeli resimde. Sol kapı aynası modeli vurgulanan özellikleri ile retina bağlama cebinde gösterir. Doğru kapı aynası milisaniye femtoseconds üzerinden retina değişiklikleri gösterir. Bu rakam üzerinden Nogly ve ark. (2018)10 izni ile yeniden. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: üç yönlü bağlaştırıcı. Üç yönlü bağlaştırıcı gastight şırınga ile uyumluluk için tasarlanmış azaltılmış bir ölü hacimli Y karıştırıcı olduğunu. Coupler, 3D render göster patladı görüntülemek, derleme (A) ve kanal karıştırma gösterilen bir şeffaf görünümü (B). Şekil çift girişli (C) ve sonuç süspansiyon ile üç yönlü bağlaştırıcı (D) karıştırma sonra karıştırma sonra bir inhomogeneous kristal dağılım gösterir. Karıştırma kabaca yarısı örnek başka bir şırınga (E), itip sonra birlikte mavi oklarla (F) gösterildiği gibi her iki yarım kalan şırınga içine iterek gerçekleştirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: öncesi enjeksiyon test göstergeler. Numune Hazırlama sırasında birkaç küçük örnek aşamasında olduğunu belirtmek için kullanılan ve yeterli yapışkan testlerdir. Optik netlik örnek küp aşamasında olasıdır bir göstergesidir. (A) bulanık bir örnek şırıngada gösterilir. (B) bir açık örnek gösterilir, yüksek yoğunluklu mikro-kristaller rağmen örneği üzerinden görünür mezuniyet çizgileriyle dikkat edin. Lipid matris kübik aşamasında olduğunda, ne zaman hiçbir stres altında katı gibi kalır. Bir alçak basınç testi şırınga örnek arkası uzak çekerek gerçekleştirilir. Örnek çok sıvı gibi olduğunda (sünger faz göstergesi), örnek (C) birim dolduracak şekilde genişler. Aynı testi (D) olumlu bir sonuç, örnek rağmen çekilen pistonu statik kalır. Son olarak, bir makro ölçekli ekstrüzyon test örnek şırınga baðlantý birimi yoluyla az miktarda basarak gerçekleştirilir. Meme ucu (E) oluşturmasına veya LCP bir hızla bükme silindir bir damlacık yeterince viskoz değil bir örnek gösterir. Örnek dışarı, zaman içinde (F) dik kalır, bir silindir oluşturur sonra örnek yüksek hızlı kamera testi için ilerlemek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TR-SFX yöntemi ile viskoz ekstrüzyon enjektör bacteriorhodopsin9,10 photosystem II ve13 yapısal dynamics çalışmaları için uygun bir teknik olduğu kanıtlanmıştır ve şimdi diğer sürüş proteinler çalışmaya hazır görünüyor İyon ışık temelli taşıma veya duyusal algı5,50fotoğraf biyolojik işlemler. Yukarıda açıklanan protokoller bacteriorhodopsin TR-SFX veri toplama başarısı en üst düzeye çıkarmak için tasarlanmıştır, henüz inandığımız diğer örnekleri veri toplama en iyi duruma getirmek için bir şablon olarak hareket edebilir. Bu şekilde, çok değerli beamtime şu anda tıkanma nedeniyle kayıp ya da kötü örnek ekstrüzyon bunun yerine daha fazla zaman gecikmeleri, daha iyi veri toplamak için kullanılan.

İletişim kuralı en zor ve kritik adım az miktarda lipid matris üçüncü aşama (Adım 1.8) getiriyor monoolein eklenmesidir. Monoolein fazla eklendiğinde zorluk faz geçiş ve örnek üzerinde olumsuz etkisi incelik yatıyor.

Metodoloji değişiklikler farklı protein kristalleri karşılamak için uygulanmalıdır. Bunlar aynı katkı tutarı ya da gerekli karıştırma ile uyumlu olmayabilir. Öte yandan, kristaller daha küçük parçalar halinde karıştırma işlemi sırasında değil uzlaşma kırınım kalite kırıp bile uzun iğneler daha kısa parçalara kestiğinizde örnek için jeti artırabilir. Farklı katkı maddeleri akış hızı istikrar9geliştirmek için eklendi parafin yerine yerine. MAG 7,9/9.7 enjekte oluşabilir lamel faz trasnistion engelleyecek biçimde eklenir vakum ortamlar20 (gibi CXI endstation, LCLS) ama deneme atmosferik basınçta yapılır eğer atlanabilir. Deneyim, çözünür proteinler üzerinden birçok kristalleri stabil LCP, henüz biraz ironik membran protein deterjanlar kristal ayıklanır çünkü doğrudan lipidik mesophases kez yetiştirilen kristalleri muhtemelen çözülür içine dahil edilebilir lipid gibi ortama onları çevreleyen. Bu gibi durumlarda, tamamen LCP bir alternatif viskoz taşıyıcı24,25,26,27,29,30ile değiştirmek için denenmelidir.

Değişiklikleri test etmek için yüksek hızlı kamera örnekleri nerede kristalleri taşıyıcı içinde görünür olmayan hizmet verebilir. Örneğin, aydınlatma polarize ışık mikroskobu kullanarak video kaydetmek için yapılandırılabilir. Bu (bir parlaklık) görünmesini birefringent kristaller neden olur ve aynı zamanda birefringent lamel aşamasındadır lipid matris bölümlerini ortaya koymaktadır.

Değişiklikleri bir yana, protein kristal hazırlık mümkün olduğu kadar aşağıdaki ölçütlere uyan önemlidir. Kristalleri tıkanma enjektör en aza indirirken kırınım en üst düzeye çıkarmak için en iyi şekilde boyutta olması. Kristal yoğunluğu bir isabet oranı tam veri kümeleri, toplamak için yeterli verimi yüksek olmalıdır ama jet istikrarı tehlikeye olarak o kadar yoğun değil (çok yüksek bir yoğunluk genellikle seyreltilmiş; bR, bir isabet oranı % 10-30 düzeltmeye söz konusu olduğunda genellikle worke d iyi). Lipid matris küp aşama getirdi ve kristal süspansiyon homojen olmalıdır.

TR-SFX tutan diğer zaman çözüldü kristalografisi teknikleri Laue kırınım gibi büyük avantajlar çünkü: radyasyon hasarı nedeniyle "kırınım imha önce" metodolojisi sınırlı, TR-SFX vardır geniş zaman çözünürlüğü üzerinde birçok emir büyüklüğü ve femtosecond aralığı aşağı küçük kristaller daha iyi photoactivation için izin ve faiz photocycles geri dönüşümlü olması gerekmez.

TR-SFX yüksek viskozite enjektör kullanarak bir XFEL, bir sıvı jet enjektör örnek tasarruf açısından önemli avantajlar vardır. Doğrudan karşılaştırma PYP106 ve bR, örneğin, bir azaltma faktörü için toplanan kırınım görüntüleri aynı miktarda 50 gösterir. Sıvı jetleri Öte yandan bir avantaj akışını hızlı ve veri toplama (karanlık ve aydınlık çerçeveler alternatif), tam hızda çalışır, enjektör akış hızı istikrar (veya koyu karelerde ışık kirliliği) bakılmaksızın sahip. Viskoz jet yeni sorunlar eklemek, sıvı jet TR SFX birçok biyolojik ilgili sistemleri için üretmek kesinlikle mantıksız olabilir protein miktarda kullanan dikkate değer iken.

Şu anda, viskoz numune hazırlama TR SFX için kristal uyumluluk teslim orta ile sınırlıdır. Birkaç alternatif viskoz taşıyıcıları uygulanan rağmen hiçbiri tüm durumlar için işe bulundu. Ayrıca, örnek teslim yüksek viskozite enjektör ile her zaman tıkanma veya bile bu iletişim kuralını kullanan optomozation ile yavaşlama tabi olacaktır. Başka bir teknik doğasında azaltma isabet oranı ne zaman optomised extrudability getirmek için örnek sulandrarak kısıtlamasıdır.

Gelecekte, TR-SFX yöntemleri protein hedefler doğal kromofor ile gelen bu sentetik photoswitches ile uzatılabilir. Photoactivated olamaz tepkiler üzerinde ölçümler zaman çözüldü karıştırma, sıcaklık-atlama, elektrik alanları veya seri kristalografisi için adapte için henüz diğer harekete geçirmek teknolojik güvenmek gerekir. XFEL beamtime, kullanılabilirliğinin artması ile birlikte bu tetikleyici teknolojileri kombinasyonu zamanla, protein işlevi bir atomik düzeyde yapısal dinamiklerini anlamak için temeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir çakışan ilgi bildirin.

Acknowledgments

Gebhard Schertler, Rafael Abela ve Chris Milne yüksek viskozite enjektörleri PSI adlı kullanımını desteklemek için anıyoruz. Richard Neutze ve ekibi tartışmalar zaman çözüldü kristalografisi ve yüksek viskozite enjektörleri kullanarak örnek teslimat için kabul vardır. Mali destek için hibe 31003A_141235, 31003A_159558 (js için) İsviçre Ulusal Bilim Vakfı anıyoruz ve PZ00P3_174169 (için P.N.). Bu proje Avrupa Birliği'nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik programı kapsamında Marie-Sklodowska-Curie hibe sözleşmesi No 701646 fon aldı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mosquito LCP Syringe Coupling TTP labtech store 3072-01050
Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 µl Hamilton HA-81065
Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 µl Hamilton HA-81265
Monoolein Nu-Chek Prep, Inc. M-239
7.9 MAG Avanti Polar Lipids Inc. 850534O
50% w/v PEG 2000 Molecular Dimensions MD2-250-7
Paraffin (liquid) Sigma-Aldrich 1.07162
High speed camera Photron Photron Mini AX
High magnification lens Navitar 12X Zoom Lens System
Three axis stage ThorLabs PT3/M
Fiber light Thorlabs OSL2
Fused silica fiber Molex/Polymicro TSP-505375
Lite touch ferrule IDEX LT-100
ASU high viscosity injector Arizona State University Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu)
HPLC pump Shimadzu LC-20AD
Electronic gas regulator Proportion Air GP1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
  2. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
  3. Barty, A., et al. Self-terminating diffraction gates femtosecond X-ray nanocrystallography measurements. Nature photonics. 6 (December), 35-40 (2012).
  4. Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Optics express. 20 (3), 2706-2716 (2012).
  5. Panneels, V., et al. Time-resolved structural studies with serial crystallography: A new light on retinal proteins. Structural Dynamics. 2 (4), 041718 (2015).
  6. Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
  7. Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science (New York, N.Y.). 352 (6286), 725-729 (2016).
  8. Barends, T. R. M., et al. Direct observation of ultrafast collective motions in CO myoglobin upon ligand dissociation. Science (New York, N.Y.). 350 (6259), 445-450 (2015).
  9. Nango, E., et al. A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
  10. Nogly, P., et al. Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser. Science. 0094 (June), eaat0094 (2018).
  11. Coquelle, N., et al. Chromophore twisting in the excited state of a photoswitchable fluorescent protein captured by time-resolved serial femtosecond crystallography. Nature Chemistry. 10 (1), 31-37 (2017).
  12. Kupitz, C., et al. Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser. Nature. , (2014).
  13. Suga, M., et al. Light-induced structural changes and the site of O=O bond formation in PSII caught by XFEL. Nature. 543 (7643), 131-135 (2017).
  14. Stagno, J. R., et al. Structures of riboswitch RNA reaction states by mix-and-inject XFEL serial crystallography. Nature. 541 (7636), 242-246 (2017).
  15. Wang, D., Weierstall, U., Pollack, L., Spence, J. C. H. Liquid Mixing Jet for XFEL Study of Chemical Kinetics. Journal of synchrotron radiation. , In submiss 1364-1366 (2014).
  16. Hekstra, D. R., White, K. I., Socolich, M. A., Henning, R. W., Šrajer, V., Ranganathan, R. Electric-field-stimulated protein mechanics. Nature. 540 (7633), 400-405 (2016).
  17. Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nature. 9 (9), 2123-2134 (2014).
  18. Kupitz, C., Grotjohann, I., Conrad, C. E., Roy-Chowdhury, S., Fromme, R., Fromme, P. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcus elongatus as a model system. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 369 (1647), (2014).
  19. Falkner, J. C., et al. Generation of Size-Controlled, Submicrometer Protein Crystals. Chemistry of Materials. 17 (10), 2679-2686 (2005).
  20. Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature communications. 5, 3309 (2014).
  21. Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. Lipidic cubic phases: a novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (December), 14532-14535 (1996).
  22. Caffrey, M. A comprehensive review of the lipid cubic phase or in meso method for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (1), 3-18 (2015).
  23. Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 21 (4), 559-566 (2011).
  24. Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (4), 421-430 (2015).
  25. Sugahara, M., et al. Hydroxyethyl cellulose matrix applied to serial crystallography. Scientific Reports. 7 (1), 703 (2017).
  26. Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2014).
  27. Sugahara, M., et al. Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 6 (1), 24484 (2016).
  28. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (2), 387-397 (2015).
  29. Kovácsová, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. IUCrJ. 4 (4), 400-410 (2017).
  30. Martin-Garcia, J. M., et al. Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 4 (4), 439-454 (2017).
  31. Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. IUCrJ. 2, 545-551 (2015).
  32. Caffrey, M., Li, D., Howe, N., Shah, S. T. A. "Hit and run" serial femtosecond crystallography of a membrane kinase in the lipid cubic phase. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130621 (2014).
  33. Liu, W., et al. Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors. Science (New York, N.Y.). 342 (6165), 1521-1524 (2013).
  34. Zhang, H., et al. Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography. Cell. 161 (4), 833-844 (2015).
  35. Fenalti, G., et al. Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor. Nature Structural & Molecular Biology. (February), (2015).
  36. Kang, Y., et al. Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser. Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).
  37. Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. Journal of Visualized Experiments. 9 (115), 2123-2134 (2016).
  38. Batyuk, A., et al. Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor. Science Advances. 2 (9), e1600292 (2016).
  39. Nakane, T., et al. Native sulfur/chlorine SAD phasing for serial femtosecond crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (12), 2519-2525 (2015).
  40. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2 (2), 168-176 (2015).
  41. Weinert, T., et al. Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons. Nature Communications. 8 (1), 542 (2017).
  42. Tosha, T., et al. Capturing an initial intermediate during the P450nor enzymatic reaction using time-resolved XFEL crystallography and caged-substrate. Nature Communications. 8 (1), 1585 (2017).
  43. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase injector is a viable crystal delivery system for time-resolved serial crystallography. Nature Communications. 7, 12314 (2016).
  44. Abela, R., et al. Perspective: Opportunities for ultrafast science at SwissFEL. Structural Dynamics. 4 (6), 061602 (2017).
  45. Marx, V. Structural biology: doors open at the European XFEL. Nature Methods. 14 (9), 843-846 (2017).
  46. Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chemistry and Physics of Lipids. 95 (1), 11-21 (1998).
  47. Qiu, H., Caffrey, M. The phase diagram of the monoolein/water system: Metastability and equilibrium aspects. Biomaterials. 21 (3), 223-234 (2000).
  48. James, D. Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments. , (2015).
  49. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  50. Moffat, K. Femtosecond structural photobiology. Science (New York, N.Y.). 361 (6398), 127-128 (2018).

Tags

Kimya sayı: 144 seri kristalografisi zaman karar vermek lipidik üçüncü aşama bacteriorhodopsin membran proteinlerinin yüksek viskozite Enjektör üç yönlü bağlaştırıcı x-ışını ücretsiz eletron lazer
Microcrystals yüksek viskozite ekstrüzyon için zaman karar vermek seri halinde Femtosecond kristalografisi x-ışını lazerleri iyileştirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

James, D., Weinert, T., Skopintsev,More

James, D., Weinert, T., Skopintsev, P., Furrer, A., Gashi, D., Tanaka, T., Nango, E., Nogly, P., Standfuss, J. Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers. J. Vis. Exp. (144), e59087, doi:10.3791/59087 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter