Summary
Aqui nós relatamos métodos comuns para analisar a função fagocitária de macrófagos alveolares murino e apuramento bacteriano do pulmão. Esses métodos estudam in vitro fagocitose dos grânulos de isotiocianato de fluoresceína e fagocitose in vivo de Pseudomonas aeruginosa verde proteína fluorescente. Também descrevemos um método para limpar p. aeruginosa em camundongos.
Abstract
Macrófagos alveolares (AMs) guardam o espaço alveolar do pulmão. Fagocitose por AMs tem um papel fundamental na defesa contra a invasão de agentes patogénicos, a remoção de células mortas ou partículas estranhas e na resolução de respostas inflamatórias e remodela o tecido, processos que são mediadas por diversos receptores de superfície de o AMs. Aqui, nós relatamos métodos para a análise da função fagocitária do AMs usando estratégias experimentais e ensaios in vitro e in vivo para diferenciar os receptores de reconhecimento padrão-, complemento do receptor e gama Fc mediada fagocitose. Finalmente, discutimos um método para estabelecer e caracterizar um modelo de uma pneumonia de p. aeruginosa em camundongos para avaliar bacteriana liberação in vivo. Estes ensaios representam os métodos mais comuns para avaliar funções AM e também podem ser usados para estudar a função de macrófagos e liberação bacteriana em outros órgãos.
Introduction
MGA é os principais fagócitos residentes no alvéolo na fase de repouso e um dos principais players de inatas respostas imunes através do reconhecimento e internalização dos patógenos inalados e partículas estranhas1,2. Tem sido relatado que AMs são essenciais para a habilitação rápida de muitos patógenos pulmonares tais como p. aeruginosa e Klebsiella pneumonia3,4, por uma deficiência na fagocitose AM muitas vezes resulta em respiratória infecções, como pneumonia aguda, que causam maiores taxas de mortalidade e morbidade.
AMs também iniciar inatas respostas inflamatórias no pulmão através da produção de citocinas e quimiocinas como TNF-α e IL-1 β, que conversa cruzada com outras células do ambiente alveolar para produzir quimiocinas e recrutar inflamatórios neutrófilos, monócitos, e células do sistema imunológico adaptativas no pulmão5. Por exemplo, a IL-1 β, produzido por AMs ajuda a prime a liberação do neutrófilos chemokine CXCL8 de células epiteliais6. Além disso, AMs contribuam para a fagocitose de apoptotic leucócitos polimorfonucleares (PMN), falha de que leva para o escapamento sustentado de enzimas intracelulares de PMN ao tecido circundante, resultando em danos nos tecidos e inflamação prolongada 7 , 8 , 9.
Fagocitose por AMs é mediada por um reconhecimento direto de padrões moleculares associados patógeno na superfície do patógeno pelos receptores de reconhecimento padrão (PRRs) do AMs ou pela ligação de patógenos opsonized com receptores efetoras imune da AMs 10. por último, AMs podem reconhecer os alvos opsonizados com imunoglobulina (IgG) através de seus receptores Fcγ (FcγR) ou os patógenos revestidos com fragmentos de complemento, C3b e C3bi, através de seus receptores de complemento (CR)11. Entre receptores de complemento, o CR da superfamília imunoglobulina (CRIg) seletivamente é expresso em macrófagos de tecido12, e uma recente descoberta destacou o papel do CRIg na fagocitose do AM no contexto de pneumonia de p. aeruginosa 13.
Muitos estudos originais usam métodos para avaliar a fagocitose de macrófagos para descrever os mecanismos moleculares do macrófago função14,15. No entanto, métodos como fagocitose in vivo requerem uma quantificação exacta da fagocitose. Aqui, podemos resumir uma metodologia detalhada para a fagocitose in vitro e in vivo usando o isotiocianato de fluoresceína (FITC)-pérolas de vidro e proteína de p. aeruginosa verde fluorescente (GFP), respectivamente. Além disso, vamos explicar o método de diferenciação entre PRR, CR e fagocitose mediada por FcγR. Finalmente, nós relatamos um método para caracterizar o apuramento bacteriano no mouse no que diz respeito uma pneumonia de p. aeruginosa .
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Protocol
Este protocolo segue as diretrizes do cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da faculdade de medicina de Virgínia Oriental.
1. fluorescente grânulos fagocitose
- Eutanásia o mouse (C57BL/6J, 6 semanas de idade, sexo feminino) por CO2 asfixia conforme protocolos IACUC para a ética eutanásia de animais.
- Coloque o mouse de barriga para cima em um tabuleiro de dissecação, coberto com toalhas de papel. Segure as patas com seus membros abertos e ligar uma cadeia de caracteres em seus dentes da frente para puxar sua cabeça de volta para que a traqueia está posicionada em linha reta e nível.
- Molhe a garganta, peito e barriga com etanol a 70% para desinfetar e evitar as peles de degola para as ferramentas do rato.
- Usando pinças regulares, puxe a pele na linha central do corpo e corte com tesoura cirúrgica acima da linha central para a parte superior da garganta.
- Usando a extremidade sem corte de tesoura cirúrgica padrão, cuidadosamente afastar os músculos e tecidos conectivos na garganta e usar tesouras de primavera (micro-tesouras) para expor a traqueia.
- Segurando um anel de cartilagem com a pinça, cuidadosamente faça uma pequena incisão (~1.5 mm), utilizando micro-tesouras, na face da traqueia de ventrículo e introduza uma cânula de 18 G na traqueia.
- Delicadamente lavagem 3 mL de tampão fosfato salino (PBS), 1 mL de cada vez. Cada vez que retirar delicadamente o líquido na seringa e reinfuse-lo de volta para o pulmão, 3x na sucessão. Depois de coletar a LBA, realize deslocamento cervical para garantir a eutanásia. Transfira a PBS coletada (~2.8 mL), que é o líquido de lavagem broncoalveolar (LBA), para um tubo, centrifugar a 1.000 x g por 10 min e coletar o sedimento. Adicione 1 mL de PBS fresco para o tubo e centrifugar a 1.000 x g durante 10 minutos lavar os detritos e coletar os macrófagos alveolares peletizados.
- Resuspenda o pellet em 2 mL do meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM) com 10% inactivadas nonheat fetal de soro bovino (FBS) e cultura primária macrófagos alveolares na mesma mídia para 2 dias em um prato de vidro-inferior a 37 ° C numa atmosfera umidificada.
- Aspire a velha mídia, lave-a com 1 mL de PBS e adicionar 2 mL de mídia fresca. Adicionar contas FITC (decapeptídeo látex grânulos, 2 µm de diâmetro, 50 contas/celular) e incubar durante 1 h a 37 ° C numa atmosfera umidificada.
- Lave extensivamente com PBS (1 mL por vez, para um total de cinco lavagens) para remover contas extracelulares. Imagem 100 células aleatoriamente e contar as células com grânulos intracelulares (488 nm).
Nota: índices Phagocytic são o número de grânulos ingeridos, dividido pelo número total de macrófagos; a percentagem de células fagocíticas é o número de macrófagos que ingerir pelo menos um grânulo dividido pelo número total de macrófagos16.- Alternativamente, após uma incubação de 1 h com miçangas, lavam-se as células com 3 mL de PBS e processá-los por citometria de fluxo para a quantificação de fagocitose. Da mesma forma, o processo AMs sem grânulos como células imaculadas ou controle. Calcular a percentagem de positividade e dizer a intensidade da fluorescência, utilizando software de citometria de fluxo, selecionando as opções no software.
2. FcγR e CR-mediada por fagocitose
- Para a opsonização, incube 2 x 108 ovelhas células vermelhas do sangue (SRBCs) com 50 µ l de coelho anti-SRBC-IgM ou 50 µ l de coelho anti-SRBC-IgG por 30 min em temperatura11.
- Incube SRBCs IgM-opsonizada com 50 µ l de soro humano C5-deficiente (C5D) por 30 min a 37 ° C para corrigir os fragmentos do complemento C3b e C3bi na SRBCs IgM-revestido.
- Murino macrófagos células (MH-S) da semente (10.000 células/poço) em uma placa de 96 poços e incubar durante a noite para obter uma confluência de ~ 70%. Adicione 100 µ l de 1 x 107/mL opsonizada SRBCs a cada poço das células MH-S e incubar durante 1 h a 37 ° C. Lavagem sem uma ligação SRBCs muito rapidamente (~ 1 min) com 100 µ l de tampão de lise de cloreto de amônio-potássio (ACK).
- Lisar as células com SDS 0,1% e adicionar 50 µ l de 2,7-diaminofluorene (DAF) contendo 3% de peróxido de hidrogênio e ureia 6m. Medir a absorvância da formação de hemoglobina-catalisada fluorene azul a 620 nm.
- Determine o número de SRBCs por meio de uma curva padrão em valores de absorvância 620 nm com um número conhecido de SRBCs. Da mesma forma, o processo MH-S células incubadas com nonopsonized SRBCs para usar como controles negativos.
3. PRR mediada por fagocitose
- Siga os passos 1.1-1.9 para o isolamento e cultivo de macrófagos alveolares primário de rato.
- Depois de 2 dias, remova a mídia, lavam-se as células com 1 mL de PBS e adicione 500 µ l de mídia fresca contendo bioparticles de ZnPPIX-A Alexa Fluor-488-conjugado (100 partículas/prato).
- Incubar durante 1 h a 37 ° C. Pare a fagocitose adicionando 500 µ l de PBS gelado.
- Lave as células extensivamente com PBS (1 mL por vez, para um total de cinco lavagens). Fixe as células com paraformaldeído 4% durante 10 minutos à temperatura ambiente.
- Lavar as células extensivamente com PBS (1 mL por vez, para um total de cinco lavagens) e manter as células em 500 µ l de PBS.
- Imagem as células sob contraste de interferência diferencial e um canal fluorescente em 488 nm. Contar AMs contendo ZnPPIX-A bioparticles e determinar a porcentagem de fagocitose.
4. in Vivo a fagocitose por macrófagos alveolares
Nota: Inocular a p. aeruginosa GFP em uma placa de ágar nutriente e incubar a placa a 37 ° C durante a noite. No dia seguinte, inocular a colônia única a 2 mL de caldo nutriente e crescer a bactéria a 37° C durante a noite.
- No dia seguinte, anestesia os ratos com uma administração intraperitoneal de 100 mg/kg quetamina e 10 mg/kg de xilazina. Confirme anesthetization adequada através de uma falta de resposta para o aperto de dedo do pé.
- Coloque o mouse sobre uma placa plana com um elástico entre os incisivos superiores e coloque-o numa posição semirecumbente (45°) com a superfície ventral e rostro virado para cima. Usando a pinça curvada, parcialmente retrai a língua. Usando um microsprayer, intratraquealmente administrar 50 µ l (5 x 106 formadoras unidades [CFU])17 de p. aeruginosa GFP para os pulmões dos ratos anestesiados.
- Após 1 h de infecção, siga os passos 1.1-1.7.
- Ressuspender as células em PBS e cytocentrifuge-los (1.000 x g, 1 min à temperatura ambiente) numa lâmina de vidro.
- Diferencialmente manche os slides cytospin para macrófagos alveolares, neutrófilos e linfócitos, de acordo com as instruções do fabricante.
- Selecione 100 AMs aleatoriamente, contar o AMs contendo bactérias intracelulares e determinar a porcentagem de fagocitose.
5. in Vivo bactérias autorização usando p. aeruginosa
- Inocular a p. aeruginosa em uma placa de ágar de isolamento de p. aeruginosa e incubar a placa a 37 ° C durante a noite. Inocular a colônia única a 2 mL de caldo lisogenia (LB) e crescer a bactéria a 37° C durante a noite. Calcule o UFC, usando a seguinte fórmula.
UFC/mL = (número de colônias x fator de diluição) / volume da placa de cultura.
Dilua a cultura com PBS para obter o desejado UFC/mL. - No 1º julgamento, intratraquealmente injetar uma dose subletais de ~2.5 x 105 UFC/mL de p. aeruginosa anestesiado selvagem-tipo (WT) e TRIM72 ratosKO , tal como indicado no passo 4.2. Medir o peso corporal diariamente por 6 dias.
- No teste 2, injete uma segunda dose de p. aeruginosa (5 x 105 UFC/mL) os ratos que sobreviveram no 1º julgamento e medem o peso de corpo por 4 dias.
- No 3º julgamento, usando um conjunto diferente de ratos, injectar WT e TRIM72KO ratos com uma dose letal (3 x 107 UFC/mL) de p. aeruginosa e registar a mortalidade dentro de 2 dias de injeção. Animais apresentando sinais de estresse severo, como perda de peso significativa do corpo, costas encurvada, anorexia ou dispneia será avaliada por veterinários a atendente. Intratáveis animais serão sacrificados imediatamente.
- Morte ou após eutanásia no 2º dia após a injeção, colete tecido pulmonar-todo para a quantificação da carga bacteriana pulmonar na infecção de pico.
- Para testar a carga bacteriana do pulmão, adicionar 200 µ l de solução salina para os tecidos do pulmão e homogeneizar a eles, usando uma configuração previamente testada em um homogeneizador eletrônico que interrompe completamente o tecido pulmonar sem quebrar as bactérias. Ajuste o volume total do pulmão homogenate de 1ml e placa 100 µ l de pulmão lisado em placas de ágar de isolamento de Pseudomonas em 10 vezes diluições em série.
- Incubar as placas a 37 ° C por 24 h e contagem das colônias bacterianas para determinar o CFU por todo pulmão.
6. análise estatística
- Usar o Student t-teste para determinar a significância estatística da diferença entre os dois grupos. Considere uma diferença estatisticamente significante quando p < 0,05. Todos os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM).
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Representative Results
Primeiro realizamos o experimento para analisar a fagocitose por mouse AMs primários. Ao longo de todas as análises, comparamos AMs isolados de ratos deKO WT e TRIM72. Como mostrado na Figura 1A, microscopia de fluorescência revelou que fagocitose dos grânulos de vidro-FITC pelo mouse AMs primárias ocorre após 1 h de incubação. Figura 1 B mostra a análise da fagocitose por citometria de fluxo. A quantificação de fagocitose medidos por microscopia e citometria de fluxo é representada na Figura 1C e 1 FiguraD, respectivamente. Fagocitose FcγR e CR-mediada por células de MH-S é representado na Figura 2AeB , a Figura 2mostra a quantificação. Esses resultados mostram que a expressão de TRIM72 em células de MH-S resultou em uma diminuição de mais de cinco vezes na fagocitose de complemento. Imagens representativas de ingestão de partículas de ZnPPIX-A Alexa Fluor-488-conjugados por AMs primárias isolada do WT ou TRIM72KO ratos são mostradas na Figura 2,C, e a quantificação é apresentada na Figura 2D . Fagocitose in vivo resultados estão representados na Figura 3. Figura 3 A mostra diferencial manchando a identificar a presença de AMs, neutrófilos, linfócitos e células fagocíticas GFP+ . A percentagem de células LBA e a quantificação de fagocitose são representados na Figura 3B e Figura 3C, respectivamente. A porcentagem de perda de peso corporal em ratos após a administração intratraqueal de uma dose subletais de p. aeruginosa é mostrada na Figura 4A, e a porcentagem de sobrevivência dos ratos no dia 2, após uma dose letal de p. aeruginosa é indicado na Figura 4B. Figura 4 C mostra um gráfico de dispersão para a carga bacteriana total-pulmão na morte ou no 2º dia após a infecção p. aeruginosa em camundongos.
Figura 1 : Fagocitose nos macrófagos alveolares primário de rato. (A) de imagens representativas de baixo contra os altos índices de phagocytic mostrando AMs primárias contendo grânulos de fluorescent verde (à esquerda); imagens representativas, apresentando baixas e altas percentagens de AMs fagocíticas. Setas: baixo índice phagocytic AMs; setas: alto índice de phagocytic AMs. Barra de escala = 25 µm para as duas imagens à esquerda e 50 µm para as direita duas imagens. (B) representante flow cytometry deteção de fagocitando células no controle de não-grânulos, WT + grânulos e TRIM72KO + grânulos AMs. A população de célula define o grânulo contendo barras (em percentagem) e a intensidade média fluorescence (IFM). (C) as estatísticas de índice phagocytic médio e a porcentagem de AMs fagocíticas no WT e TRIM72KO AMs; n = 5 para ambos os grupos, *p < 0,05. (D) estatísticas de citometria flow IFM e a percentagem de células FITC+ WT e TRIM72KO AMs; n = 3 para ambos os grupos, *p < 0,05. Esta figura é reproduzida com permissão da American Thoracic Society13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : FcγR e CR-mediada por fagocitose. (A) de imagens representativas dos ovelhas opsonized células vermelhas do sangue (SRBCs) fagocitose pelas células de MH-S. As setas apontam para alguns SRBCs. Barra de escala = 25 µm. (B) Quantification de SRBCs fagocitose pelas células de MH-S superexpressão TRIM72 (TRIM72OE) na presença de IgG (fagocitose mediada por FcγR) ou IgM (fagocitose mediada por CR); n = 6 para cada grupo, *p < 0,05 e * *p < 0.005 comparado com controle WT. (C) imagens representativas de ingestão de partículas ZnPPIX Alexa Fluor-488-conjugados por AMs primários isolado de ratos deKO WT ou TRIM72. As setas no painel A e B indicam células + ZnPPIX. Barra de escala = 50 µm. (D) os resultados estatísticos da percentagem de ZnPPIX contendo AMs; n = 3 para cada grupo, p > 0,05. Esta figura é reproduzida com permissão da American Thoracic Society13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: fagocitose In vivo de p. aeruginosa GFP. (A) imagens representativas do lavado broncoalveolar lavagem fluido (LBA) célula cytospin slides de WT e TRIM72 ratosKO 1 h após a injeção de p. aeruginosa GFP. Kwik-Diff coloração identifica AMs (grandes, redondos células) e neutrófilos; GFP identifica células fagocíticas (setas brancas) e contraste de interferência diferencial de GFP+ (DIC) identifica bactérias interiorizadas de GFP (setas pretas) em AMs. As barras de escala = 50 µm. (B) quantificação da percentagem de AMs e neutrófilos em LBA de WT e TRIM72 camundongosKO 1 h após a injeção de p. aeruginosa . (C) quantificação da percentagem de AMs fagocíticas em camundongosKO WT e TRIM72; n = 3 para cada grupo, *p < 0,05. Os dados são apresentados como média (± SEM). Esta figura é reproduzida com permissão da American Thoracic Society13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Afastamento de bactérias In vivo usando p. aeruginosa (PA). (A), a porcentagem de perda de peso (BW) corpo de ratos para a ingênua WT e TRIM72KO após a primeira injeção intraperitoneal de 2.5 x 105 UFC/mL PAO1 (uma clínica isolada de p. aeruginosa); n = 13 para WT (quadrados pretos), n = 8 para TRIM72KO (círculos vermelhos), *p < 0.05, * *p < 0.005 comparado com peso (B) a porcentagem de sobrevivência no dia 2 depois o 3 x 107 UFC/mL P. aeruginosa injeção intraperitoneal; n = 10 para WT (círculos pretos sólidos) e TRIM72KO (quadrados vermelhos sólidos), *p < 0.05 para WT contra TRIM72KO grupos. (C) um gráfico de dispersão da carga bacteriana total-pulmão no dia 2 da injeção de p. aeruginosa em WT e TRIM72KO. A linha tracejada cinza designa a dose injetada e bacteriana; ^ designa os ratos que já morreram. Para WT contra TRIM72KO grupos, p < 0,05. Esta figura é reproduzida com permissão da American Thoracic Society13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Durante a execução de uma função de troca de gás, o pulmão persistentemente confronta alérgenos, patógenos e partículas estranhas. AMs fornecem a primeira linha de defesa em virtude da sua função principal, ou seja a fagocitose. AMs também coordenam com outras células do sistema imunológico em destruir os patógenos e na resolução da inflamação. Aqui, descrevemos os métodos para avaliar especificamente a fagocitose por AMs isolada do pulmão do rato. O protocolo apresentado neste manuscrito explica um estudo detalhado da fagocitose in vivo e in vitro, que também pode ser usado para estudar a função de macrófagos e liberação bacteriana em outros órgãos.
A fagocitose in vitro descrita baseia-se na simples ideia de incubação grânulos FITC tratadas ou opsonizada SRBCs com AMs cultivadas para iniciar a fagocitose. Este método inclui etapas de lavagem extensa e a lise de hemácias nonphagocytized para reduzir o plano de fundo. Deve ter cuidado para não separar o AMs aderido. A etapa de lavagem envolvendo solução de Lise ACK deve ser feita dentro de 1 min, como uma lavagem mais tempo leva para a lise dos macrófagos.
Além disso, na análise de imagens, nós caracteriza-se tanto a percentagem de células fagocitando e índice phagocytic a ganhar uma visão abrangente da função de fagocitose de AM. Temos também explicado o método para diferenciar entre PRR, FcγR e fagocitose mediada por CR em macrófago murino linha celular de MH-S. Em conjunto com modulação genética, este passo é útil ao tentar obter insights mecanicistas a caminho da fagocitose específico que foi afectado pela manipulação gene alvo.
Relatórios anteriores documentados métodos para avaliar a absorção bacteriana; o método mais notável é a proteção de gentamicina ensaio14. O protocolo apresentado aqui, mostramos também um método de imagem para medir a fagocitose in vivo. Existem alguns fatores-chave que fazem com que esse método melhor em comparação com os métodos publicados anteriormente. O método descrito aqui envolve uma injeção intratraqueal de GFP de p. aeruginosa , seguido de coloração diferencial de células BALF. Este método realça a utilização de bactérias fluorescentes, que ajuda a identificar bactérias ingeridas dentro os fagócitos. Além disso, a coloração diferencial de células BALF ajuda a diferenciar especificamente a capacidade fagocitária de AMs de outras células imunes no ambiente em que vivo e para avaliar a contribuição relativa dos diferentes fagócitos para limpar as bactérias cargas do pulmão. Uma menor limitação desse método é que ele requer uma administração intratraqueal de cuidado para evitar a variabilidade entre ratos.
Além disso, explicamos o método para estabelecer um afastamento de bactérias de p. aeruginosa em camundongos no contexto de pneumonia. Para caracterizar este método, nós determinado a perda de peso corporal e a mortalidade após administração intratraqueal de p. aeruginosa e usado um ensaio quantitativo para determinar a carga de bactérias do pulmão. A mortalidade é um parâmetro importante para avaliar a resposta imune abrangente do corpo. Usamos amostras de pulmão deste experimento para avaliar a carga bacteriana. No entanto, carga bacteriana também pode ser determinada de pulmão amostras colhidas em 48h após a dose letal de injeção bacteriana. O sucesso do ensaio será determinado por uma padronização do tempo de injeção, a qualidade do agente patogénico e a dose da injeção e a otimização de um método de homogeneização que interrompe completamente o pulmão sem quebrar a bacteriana membrana celular.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pela concessão de R01HL116826 para X. Zhao.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-G Needle | Nipro Medical | CI+1832-2C | Molecular Biology grade |
| 2,7-diaminofluorene (DAF) | Sigma-Aldrich | D17106 | Molecular Biology grade |
| 70% Ethanol | Decon Labs Inc. | 18C27B | Analytical grade |
| 96-well plate | Corning | 3603 | Cell Biology grade |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492 | Molecular Biology grade |
| Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle | Thermofisher Scientific | Z23373 | Molecular Biology grade |
| C5 deficient serum | Sigma-Aldrich | C1163 | Biochemical reagent |
| Centrifuge | Labnet International | C0160-R | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher Scientific | A78300101 Issue 11 | |
| DMEM Cell Culture Media | Gibco | 11995-065 | Cell Biology grade |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | Cell Biology grade |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Jo Software | FlowJo, LLC | ||
| Forceps | Dumont | 0508-SS/45-PS-1 | Suitable for laboratory animal dissection |
| FITC-carboxylated latex beads | Sigma-Aldrich | L4530 | Cell Biology grade |
| GFP-P. aeruginosa | ATCC | 101045GFP | Suitable for cell infection assays |
| Glass bottom dish | MatTek Corp. | P35G-0.170-14-C | Cell Biology grade |
| High-Pressure Syringe | Penn-Century | FMJ-250 | Suitable for laboratory animal use |
| Homogenizer | Omni International | TH-01 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | Analytical grade |
| Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX73 | |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira | CA-2904 | Pharmaceutical grade |
| Shandon Kwik-Diff Stains | Thermofisher Scientific | 9990700 | Cell Biology grade |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425 | Molecular Biology grade |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1427 | Molecular Biology grade |
| MicroSprayer Aerosolizer | Penn-Century | IA-1C | Suitable for laboratory animal use |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagent grade |
| PBS | Gibco | 20012-027 | Cell Biology grade |
| rabbit anti-SRBC-IgG | MP Biomedicals | 55806 | Suitable for immuno-assays |
| rabbit anti-SRBC-IgM | Cedarline Laboratories | CL9000-M | Suitable for immuno-assays |
| Scissors | Miltex | 5-2 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century | LS-2 | Suitable for laboratory animal use |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | BioRad | 1610301 | Analytical grade |
| Spring Scissors (Med) | Fine Science Tools | 15012-12 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Spring Scissors (Small) | Fine Science Tools | 91500-09 | Suitable for laboratory animal dissection |
| sheep red blood cells (SRBCs) | MP Biomedicals | 55876 | Washed, preserved SRBCs |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | Molecular Biology grade |
| Xylazine | Akorn Animal Health | 59399-110-20 | Pharmaceutical grade |
References
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