Summary
Здесь мы приводим общие методы для анализа фагоцитарную функцию мышиных альвеолярных макрофагов и бактериальных Распродажа из легких. Эти методы исследования в пробирке фагоцитоз флуоресцеин Изотиоцианаты бусы и в естественных условиях фагоцитоз Pseudomonas aeruginosa зеленого флуоресцентного белка. Мы также описывают метод для очистки P. aeruginosa мышей.
Abstract
Альвеолярных макрофагов (AMs) гвардии пространство альвеолярных легких. Фагоцитоз, AMs играет решающую роль в обороне против вторгаясь патогенов, удаление омертвевших клеток или посторонних частиц и в резолюции воспалительных реакций и тканей ремоделирования, процессов, посредничестве различные поверхности рецепторы AMs. Здесь мы приводим методы для анализа фагоцитарной функции с помощью экспериментальных стратегий и в vitro и in vivo анализов различать шаблон признание рецептор-, рецептор комплемента- и гамма Fc рецептор опосредованный AMs фагоцитоз. Наконец мы рассмотрим метод, чтобы установить и характеризуют P. aeruginosa пневмонии модели мышей для оценки бактериальных Распродажа в естественных условиях. Эти анализы являются наиболее распространенными методами для оценки функции AM и может также использоваться для изучения функции макрофагов и бактериальных Распродажа в других органах.
Introduction
АПП являются крупные резидентов фагоцитов в альвеолах в стадии покоя и один из основных игроков врожденные иммунные реакции через признание и интернализации ингаляционных патогенов и инородных частиц1,2. Сообщалось, что AMs имеют важное значение для быстрого разминирования многих легочных патогены, например P. aeruginosa и клебсиеллы пневмонии3,4, так что дефицит в AM фагоцитоза часто приводит к респираторных инфекции, такие как острая пневмония, которые вызывают более высокие показатели смертности и заболеваемости.
АПП также инициировать врожденной воспалительные реакции в легких, производство цитокинов и chemokines например ФНО α, ИЛ 1β, какой уровень помех с другими клетками альвеолярного среды для производства chemokines и набирать воспалительных нейтрофилов, моноцитов, и Адаптивная иммунные клетки в легких5. Например ИЛ 1β, производимые AMs помогает премьер высвобождение нейтрофилов хемокиновых CXCL8 из эпителиальных клеток6. Кроме того АПП способствовать фагоцитоз apoptotic полиморфноядерных лейкоцитов (ПНЛ), отказ которых приводит к постоянной утечки внутриклеточных ферментов из ПНЛ окружающие ткани, что приводит к повреждению тканей и длительное воспаление 7 , 8 , 9.
Фагоцитоз, AMs опосредуется прямого признания патоген связанные молекулярные узоры на поверхности патогена шаблон признание рецепторов (ПРРС) АПП или привязки опсонизированными патогенов с рецепторами иммунной эффекторных АПП 10. для последнего, AMs может признать целей опсонизированными с иммуноглобулина (IgG) через их Fcγ рецепторы (FcγR) или патогенов с фрагментов комплемента, C3b и C3bi, через их дополнения рецепторов покрытием (CR)11. Среди дополнения рецепторов выборочно CR суперсемейства иммуноглобулинов (CRIg) выражается в ткани макрофагами12, и недавнее заключение подчеркнул роль CRIg в AM фагоцитоза в контексте P. aeruginosa пневмонии 13.
Многие оригинальные исследования использовать методы для оценки фагоцитоз макрофага описать молекулярных механизмов макрофагов функция14,15. Однако методы как в естественных условиях фагоцитоза требуют точную количественную оценку фагоцитоза. Здесь, мы суммируем подробная методология для фагоцитоза в vitro и in vivo, используя флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC)-стеклянные бусы и P. aeruginosa Зеленый флуоресцентный белок (КГВ), соответственно. Кроме того мы объяснить метод дифференциации среди PRR-, CR- и FcγR опосредованной фагоцитоза. Наконец мы сообщаем метод характеризовать бактериальных Распродажа в мыши отношении P. aeruginosa пневмонии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол следует принципам институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из Восточной Вирджинии медицинской школы.
1. флуоресцентные бусинки фагоцитоз
- Усыпить мыши (C57BL/6J, 6 недель, женщины) CO2 удушение согласно IACUC протоколы для этического эвтаназии животных.
- Положите мыши животе на доске рассечение, покрытые бумажные полотенца. Придавить его лапы с spread-eagle конечностей и подключить строку под его передних зубов тянуть его голову назад, так что трахеи располагается прямо и уровня.
- Влажные мыши горло, грудь и живот с 70% этанол лечить и предотвращать мех от прилипания к инструментам.
- С помощью регулярных щипцы, подтянуть кожу на осевой линии тела и сократить с Ножницы хирургические до осевой линии в верхней части горла.
- Использование тупой конец стандартные хирургические ножницы, тщательно отойти на горло мышц и соединительной ткани и использовать весной ножницы (microscissors) для предоставления трахеи.
- Сжимая кольцо хряща с щипцами, тщательно сделать небольшой надрез (~1.5 мм), используя microscissors, на лице желудочка трахеи и Вставьте канюлю 18 G в трахею.
- Аккуратно промывание 3 мл фосфат амортизированное saline (PBS), 1 мл за один раз. Каждый раз мягко вывести жидкость в шприц и reinfuse его обратно в легких, 3 раза подряд. После сбора BALF, выполняют шейки матки дислокации для обеспечения эвтаназии. Передать трубку, центрифуги на 1000 x g за 10 мин, собранных PBS (~2.8 мл), которая является Бронхоальвеолярный лаваж жидкости (BALF), и собирать гранулы. Добавьте 1 mL свежих PBS в трубку и центрифуги на 1000 x g 10 мин мыть мусора и собирать гранулированных альвеолярные макрофаги.
- Ресуспензируйте гранулы в 2 мл среды (DMEM) Дульбекко изменение орла с 10% nonheat инактивированная плода бычьим сывороточным (ФБС) и культуры первичной альвеолярных макрофагов в тех же СМИ за 2 дня на блюде стекло дно при 37 ° C в атмосфере увлажненной.
- Аспирационная старых СМИ, промойте его с 1 мл раствора PBS и добавить 2 мл свежего средств массовой информации. Добавить FITC бусины (карбоксилатные латексные шарики, 2 мкм в диаметре, 50 бусы/клеток) и инкубировать 1 час при 37 ° C в атмосфере увлажненной.
- Мыть широко с PBS (1 мл в то время, в общей сложности пять смывки) для удаления внеклеточного бусины. Случайно изображение 100 клеток и подсчитать количество ячеек с внутриклеточной бусины (488 нм).
Примечание: фагоцитарный индексы являются количество попадает бусы, деленное на общее количество макрофагов; процент фагоцитирующих клеток — количество макрофаги, которые глотать по крайней мере один шарик, деленное на общее количество макрофаги16.- Кроме того после 1 ч инкубации с бисером, вымыть клетки с 3 мл PBS и обрабатывать их для проточной цитометрии для количественной оценки фагоцитоза. Аналогичным образом процесс AMs без бисера как безупречный ячейки или элемент управления. Рассчитать процент позитивность и означают интенсивности флуоресценции, использованием потока цитометрии программное обеспечение, выбрав эти варианты в программном обеспечении.
2. FcγR - и CR-опосредованной фагоцитоз
- Для опсонизацию проинкубируйте 2 x 108 овец красные кровяные клетки (SRBCs) с 50 мкл кролик анти SRBC-IgM или 50 мкл кролика, анти SRBC-IgG за 30 мин при комнатной температуре11.
- Инкубируйте IgM опсонизированными SRBCs с 50 мкл человеческой сыворотки C5-недостаточным (C5D) на 30 минут при 37 ° C для фиксации фрагментов дополнения C3b и C3bi на IgM покрытием SRBCs.
- Семя мышиных макрофагов (клетки MH-S) (10 000 клеток/а) в 96-луночных пластине и инкубировать на ночь, чтобы получить сочетанием ~ 70%. Добавить 100 мкл/мл 1 x 10-7опсонизированными SRBCs в каждой скважине MH-S клеток и инкубировать 1 час при температуре 37 ° C. Мыть несвязанные SRBCs очень быстро (~ 1 мин) с 100 мкл буфера lysis аммония хлорид калия (ACK).
- Лизировать клетки с 0.1% SDS и добавьте 50 мкл 2,7-diaminofluorene (DAF), содержащий 3% перекиси водорода и 6 М мочевины. Измерение оптической плотности формирования гемоглобина катализированное флуорена синий на 620 Нм.
- Определите количество SRBCs с помощью стандартной кривой в 620 Нм значения поглощения с известным количеством SRBCs. Аналогичным образом процесс MH-S клетки инкубировали с nonopsonized SRBCs для использования в качестве негативных элементов.
3. PRR-опосредованной фагоцитоз
- Выполните шаги 1,1-1,9 для изоляции и культивирования мышь первичной альвеолярных макрофагов.
- После 2 дней удалите средства массовой информации, вымыть клетки с 1 мл раствора PBS и 500 мкл свежих сред, содержащих Alexa Fluor-488-конъюгированных zymosan-A bioparticles (100 частиц/блюдо).
- Инкубировать 1 час при температуре 37 ° C. Остановите фагоцитоза, добавив 500 мкл ледяной PBS.
- Вымойте клетки активно с PBS (1 мл в то время, в общей сложности пять автомойки). Исправьте клетки с параформальдегида 4% за 10 мин при комнатной температуре.
- Вымыть клетки активно с PBS (1 мл в то время, в общей сложности пять смывки) и сохранить клетки в 500 мкл PBS.
- Изображение клетки под дифференциальной помехи контраст и флуоресцентные канала в 488 нм. AMs, содержащие zymosan-A bioparticles и определить процент фагоцитоза.
4. в естественных условиях фагоцитоза, альвеолярные макрофаги
Примечание: Прививок P. aeruginosa GFP на тарелку питательный агар и инкубировать пластины при 37 ° C на ночь. На следующий день прививок одной колонии по 2 мл бульона, питательных и расти бактерий при 37° C на ночь.
- Следующий день, анестезировать мышей с внутрибрюшинного отправления Ксилазина кетамина и 10 мг/кг 100 мг/кг. Подтверждение правильного анестезии через отсутствие реакции на мыс пинча.
- Положите мыши на плоской доски с резинкой через верхние резцы и поместите его в semirecumbent (45°) положении с вентральной поверхности и трибуны, вверх. С помощью Изогнутый пинцет, частично отозвать язык. Intratracheally управления microsprayer, 50 мкл (5 х 106 образуя колонии единиц [CFU])17 P. aeruginosa GFP в легкие наркотизированных мышей.
- После 1 h инфекции выполните шаги 1.1-1.7.
- Ресуспензируйте клетки в PBS и cytocentrifuge их (1000 x g, 1 мин при комнатной температуре) на стеклянное скольжение.
- Дифференциально пятно cytospin слайды для альвеолярные макрофаги и нейтрофилы, лимфоциты, согласно инструкциям производителя.
- Случайным образом выбрать 100 AMs, подсчета АПП, содержащие внутриклеточных бактерий и определить процент фагоцитоза.
5. в естественных условиях бактерии разминирования с помощью P. aeruginosa
- Прививок P. aeruginosa на тарелку агар P. aeruginosa изоляции и инкубировать пластины при 37 ° C на ночь. Прививок одной колонии до 2 мл бульона lysogeny (LB) и расти бактерий при 37° C на ночь. Вычислите CFU, с помощью следующей формулы.
КОЕ/мл = (количество колоний x коэффициент разрежения) / объем пластину культуры.
Разбавьте культуры с PBS для получения желаемого кое/мл. - В пробной 1, intratracheally придать сублетальных доз ~2.5 x 105 кое/мл P. aeruginosa наркотизированных одичал тип (WT) и TRIM72KO мышей, как указано в шаге 4.2. Измерьте вес тела ежедневно в течение 6 дней.
- В пробной 2 ввести вторую дозу P. aeruginosa (5 x 105 кое/мл) в мышей, которые выжили в пробной 1 и измерения массы тела в течение 4 дней.
- В пробной 3, используя другой набор мышей придать WT и TRIM72KO мышей с смертельной дозы (3 x 107 кое/мл) P. aeruginosa и запишите смертность в течение 2 дней после инъекции. Признаки тяжелой стресса, такие как потеря веса значительное тела животных, сгорбленная обратно, анорексия или одышка будут оцениваться путем посещения ветеринары. Неизлечимыми животных будет жертвовать немедленно.
- В момент смерти или после эвтаназии на 2 день после инъекции Соберите целое легочной ткани для количественной оценки легких бактериальной нагрузки на пик инфекции.
- Чтобы проверить легких бактериальной нагрузки, 200 мкл нормальное saline в тканях легких и гомогенизации их, используя параметр ранее протестированных на электронных гомогенизатор, который полностью разрушает легочную ткань не нарушая бактерий. Отрегулируйте общий объем легких огневки до 1 мл и пластины 100 мкл легких lysate на плиты агара Pseudomonas изоляции на десятикратного серийных разведений.
- Инкубировать пластины при 37 ° C в течение 24 часов и рассчитывать бактериальных колоний для определения кое за весь легких.
6. Статистический анализ
- Используйте студента t-тест для определения статистической значимости различий между двумя группами. Рассмотреть статистически значимой разницы когда p < 0,05. Все данные представлены как средства ± Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы впервые провели эксперимент, чтобы анализировать фагоцитоза, мышь первичной AMs. На протяжении всех анализов мы сравнили AMs, изолированные от WT и TRIM72KO мышей. Как показано на рис. 1А, микроскопии флуоресцирования показал что фагоцитоза FITC-стеклянные бусины мышь первичной AMs происходит после 1 ч инкубации. Рисунок 1 B подачей cytometry показывает анализ фагоцитоза. Количественная оценка фагоцитоза измеряется микроскопии и проточной цитометрии представлена на рисунке 1C иD на рисунке 1, соответственно. FcγR - и CR-опосредованной фагоцитоза клетками MH-S представлена на рисунке 2AиB Рисунок 2показывает количественной оценки. Эти результаты показывают, что выражение TRIM72 в клетках MH-S привели к более чем пятикратное снижение дополнением фагоцитоза. Представитель изображения заглатывания Alexa Fluor-488-конъюгированных частиц zymosan-A по основным AMs, изолированные от WT или TRIM72KO мышей приведены в Рисунок 2Cи количественной оценки представлена в рисунке 2D . In vivo фагоцитоза результаты представлены на рисунке 3. Рисунок 3 A показывает дифференцированного окрашивания, выявления присутствия AMs, нейтрофилы, лимфоциты и фагоцитирующих клеток GFP+ . Процент от BALF клеток и количественная оценка фагоцитоза представлена в рисунке 3B и 3 на рисункеC, соответственно. Процент потери веса тела у мышей после отправления сублетальных доз P. aeruginosa трахею показан на рисунке 4A, и процент выживаемости мышей на 2 день после смертельной дозы P. aeruginosa указано в рисунке 4В. Рисунок 4 C показывает точечная для легких целом бактериальных бремя на смерть или на 2 день после заражения P. aeruginosa мышей.
Рисунок 1 : Фагоцитоз в мышь первичной альвеолярных макрофагах. (A) представитель образы низкой по сравнению с высокой фагоцитарный индексы показаны основная AMs, содержащие зеленый fluorescent бусы (слева); Представитель изображения показаны низкой и высокой доли фагоцитарной AMs. Стрелки: низкая фагоцитарный индекс АПП; стрелок: высокий фагоцитарный индекс AMs. В баре шкалы = 25 мкм для левой два изображения и 50 мкм для сразу два изображения. (B) представитель поток цитометрии обнаружение phagocytizing клетки в без бусы управления, Вт + бисер и TRIM72KO + бусы AMs. Бары определите шарик содержащих клеток населения (в процентах) и интенсивность средняя fluorescence (МРИ). (C) статистика средний фагоцитарный индекс и процент фагоцитоза AMs на WT и TRIM72KO АПП; n = 5 для обеих групп, *p < 0,05. (D) статистика поток цитометрии МФО и процент FITC+ клеток в WT и TRIM72KO АПП; n = 3 для обеих групп, *p < 0,05. Эта цифра перепечатана с разрешения Американского торакального общества13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : FcγR - и CR-опосредованной фагоцитоза. (A) представитель изображения опсонизированными овец красных кровяных клеток (SRBCs) фагоцитоза клетками MH-S. Стрелки указывают на некоторые SRBCs. Линейки шкалы = 25 µm. (B) ные SRBCs фагоцитоза клетками MH-S, экспрессирующих TRIM72 (TRIM72OE) в присутствии IgG (FcγR опосредованной фагоцитоза) или IgM (CR-опосредованной фагоцитоза); n = 6 для каждой группы, *p < 0,05 и **p < 0,005 по сравнению с контролем WT. (C) представитель образы Alexa Fluor-488-конъюгированных zymosan проглатывания частиц по первичной AMs, изолированные от WT или TRIM72KO мышей. Стрелки на панели A и B указывают zymosan + клеток. В баре шкалы = 50 µm. (D) статистические результаты доля zymosan содержащих АПП; n = 3 для каждой группы, p > 0.05. Эта цифра перепечатана с разрешения Американского торакального общества13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: В естественных условиях фагоцитоз P. aeruginosa GFP. (A) представитель образы Бронхоальвеолярный лаваж жидкости (BALF) клеток cytospin слайды от WT TRIM72KO мышей и 1 ч после инъекции P. aeruginosa GFP. Kwik-Diff пятнать идентифицирует AMs (большие, круглые клетки) и нейтрофилов; GFP определяет фагоцитирующих клеток (белые стрелки) и GFP+ дифференциальной помехи контраст (DIC) определяет внутреннюю GFP бактерий (черные стрелки) в AMs. Масштаб баров = 50 µm. (B) количественной оценки доли AMs и нейтрофилов в BALF WT TRIM72KO мышей и 1 ч после инъекции P. aeruginosa . (C) количественной оценки доли фагоцитарной AMs WT и TRIM72KO мышей; n = 3 для каждой группы, *p < 0,05. Данные представлены как означает (± SEM). Эта цифра перепечатана с разрешения Американского торакального общества13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Распродажа в естественных условиях бактерии с помощью P. aeruginosa (ПВД). (A) доля тела потеря веса (B.W.) наивные WT и TRIM72KO мышей после первого внутрибрюшинного введения 2,5 x 105 кое/мл PAO1 (клинического изолята P. aeruginosa); n = 13 WT (черные квадраты), n = 8 TRIM72KO (красные круги), *p < 0,05, **p < 0,005 по сравнению с веса (Б) процент выживания на 2 день после 3 x 107 кое/мл P. aeruginosa внутрибрюшинной инъекции; n = 10 на WT (твердые черные круги) и TRIM72KO (твердые красные квадраты), *p < 0.05 за WT против TRIM72KO групп. (C) A точечная целом легочными бактериальных бремени на день 2 P. aeruginosa инъекции в WT и TRIM72ко. Серая пунктирная линия обозначает вводят бактериальных дозы; ^ обозначает мышей, которые умерли. Для WT против TRIM72KO группы, p < 0,05. Эта цифра перепечатана с разрешения Американского торакального общества13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
При выполнении функции обмена газа, легких упорно противостоит посторонних частиц, патогенов и аллергенов. АПП обеспечивают первую линию обороны в силу их основная функция, а именно фагоцитоза. АПП также координировать с другими иммунные клетки в уничтожении патогенных микроорганизмов, а также в резолюции воспаления. Здесь мы описали методы специально оценки фагоцитоза, AMs, изолированных от легких мыши. Протокол, представленный в этой рукописи объясняет детальное изучение фагоцитоза in vivo и в пробирке, которые также могут быть использованы для изучения функции макрофагов и бактериальных Распродажа в других органах.
Описанные в пробирке фагоцитоза основывается на простой идее инкубации сыворотки лечение FITC бусы или опсонизированными SRBCs с культивированный AMs инициировать фагоцитоза. Этот метод включает в себя шаги обширные стирки и lysis nonphagocytized БС для уменьшения фона. Необходимо позаботиться не отсоединить придерживался AMs. Мыть шаг с участием ACK лизис решение должно быть сделано в течение 1 мин, как более стиральная время приводит к лизис макрофаги.
Кроме того в анализе изображений, мы характеризуется процент phagocytizing клеток и фагоцитарный индекс получить всеобъемлющее представление о функции AM фагоцитоза. Мы также объяснили метод различать среди PRR-, FcγR- и CR-опосредованной фагоцитоза в мышиных макрофага MH-S клеточной линии. В связи с генетическими модуляции этот шаг является полезным при попытке получить механистический идеи на конкретных фагоцитоза путь, который пострадал от целевой генные манипуляции.
Предыдущих докладах документально методы оценки бактериальных поглощение; метод наиболее заметным является гентамицина защиты пробирного14. В протоколе, представленные здесь мы также показали метод визуализации для измерения в естественных условиях фагоцитоза. Есть несколько ключевых факторов, которые делают этот метод лучше по сравнению с ранее опубликованные методы. Метод, описанный здесь включает инъекции трахею P. aeruginosa GFP следуют дифференцированного окрашивания BALF клеток. Этот метод выделяет использование флуоресцентных бактерий, который помогает определить попадает бактерий внутри фагоцитов. Кроме того дифференцированного окрашивания клеток BALF помогает различать специально фагоцитарной способности AMs из других иммунных клеток в в естественных условиях окружающей среды и оценить относительный вклад различных фагоцитов очистить бактериального грузы из легких. Незначительные ограничения данного метода является, что она требует тщательного трахею администрирования чтобы избежать изменчивость между мышей.
Кроме того мы объяснили метод, чтобы установить специальные акции бактерий P. aeruginosa мышей в контексте пневмонии. Охарактеризовать этот метод, мы определили потеря веса тела и смертности после отправления P. aeruginosa трахею и используется количественного анализа для определения бремя бактерий легких. Смертности является важным параметром для оценки всеобъемлющего иммунный ответ организма. Мы использовали легких образцов из этого эксперимента для оценки бактериальной нагрузки. Однако бактериальной нагрузки также могут определяться из образцов легких, собирают в течение 48 ч после не летальная доза бактериального инъекции. Успех assay будет определяться путем стандартизации времени впрыска, качество возбудителя и дозы инъекций и оптимизации методом гомогенизации, который полностью разрушает легких не нарушая бактериального клеточной мембраны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается Грант R01HL116826 X. Zhao.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-G Needle | Nipro Medical | CI+1832-2C | Molecular Biology grade |
| 2,7-diaminofluorene (DAF) | Sigma-Aldrich | D17106 | Molecular Biology grade |
| 70% Ethanol | Decon Labs Inc. | 18C27B | Analytical grade |
| 96-well plate | Corning | 3603 | Cell Biology grade |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492 | Molecular Biology grade |
| Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle | Thermofisher Scientific | Z23373 | Molecular Biology grade |
| C5 deficient serum | Sigma-Aldrich | C1163 | Biochemical reagent |
| Centrifuge | Labnet International | C0160-R | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher Scientific | A78300101 Issue 11 | |
| DMEM Cell Culture Media | Gibco | 11995-065 | Cell Biology grade |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | Cell Biology grade |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Jo Software | FlowJo, LLC | ||
| Forceps | Dumont | 0508-SS/45-PS-1 | Suitable for laboratory animal dissection |
| FITC-carboxylated latex beads | Sigma-Aldrich | L4530 | Cell Biology grade |
| GFP-P. aeruginosa | ATCC | 101045GFP | Suitable for cell infection assays |
| Glass bottom dish | MatTek Corp. | P35G-0.170-14-C | Cell Biology grade |
| High-Pressure Syringe | Penn-Century | FMJ-250 | Suitable for laboratory animal use |
| Homogenizer | Omni International | TH-01 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | Analytical grade |
| Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX73 | |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira | CA-2904 | Pharmaceutical grade |
| Shandon Kwik-Diff Stains | Thermofisher Scientific | 9990700 | Cell Biology grade |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425 | Molecular Biology grade |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1427 | Molecular Biology grade |
| MicroSprayer Aerosolizer | Penn-Century | IA-1C | Suitable for laboratory animal use |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagent grade |
| PBS | Gibco | 20012-027 | Cell Biology grade |
| rabbit anti-SRBC-IgG | MP Biomedicals | 55806 | Suitable for immuno-assays |
| rabbit anti-SRBC-IgM | Cedarline Laboratories | CL9000-M | Suitable for immuno-assays |
| Scissors | Miltex | 5-2 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century | LS-2 | Suitable for laboratory animal use |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | BioRad | 1610301 | Analytical grade |
| Spring Scissors (Med) | Fine Science Tools | 15012-12 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Spring Scissors (Small) | Fine Science Tools | 91500-09 | Suitable for laboratory animal dissection |
| sheep red blood cells (SRBCs) | MP Biomedicals | 55876 | Washed, preserved SRBCs |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | Molecular Biology grade |
| Xylazine | Akorn Animal Health | 59399-110-20 | Pharmaceutical grade |
References
- Hussell, T., Bell, T. J. Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context. Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).
- Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease. Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).
- Broug-Holub, E., et al. Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival. Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).
- Knapp, S., et al. Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).
- Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).
- Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).
- Greenlee-Wacker, M. C. Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation. Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).
- Haslett, C. Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).
- Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).
- Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).
- Mosser, D. M., Zhang, X. Measuring Opsonic Phagocytosis via Fcγ Receptors and complement receptors on macrophages. Current Protocols in Immunology. , CHAPTER: Unit-14.27 (2011).
- He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation. Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).
- Nagre, N., et al. Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Su, H., Chen, H., Jen, C. J. Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).
- Amiel, E., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression. Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).
- Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).
