Summary
Здесь мы представляем протокол для изучения патофизиологии пролиферативной диабетической ретинопатии, используя пациента производные, хирургического иссечена, сортопопуляциях тканей для трехмерных родной ткани характеристика и ex vivo культуры. Ex vivo культуры модель это также подходит для тестирования или разработки новых методов лечения.
Abstract
Диабетическая ретинопатия (DR) является наиболее распространенным осложнением микрососудистой диабета и одной из ведущих причин слепоты в взрослых трудоспособного возраста. Нет текущего животных моделей диабета и кислорода индуцированной ретинопатии разработать полный спектр прогрессивные изменения, проявляющиеся в человека пролиферативной диабетической ретинопатии (PDR). Таким образом понимание патогенеза заболевания и патофизиологии опиралась главным образом на использование Гистологические срезы и стекловидного тела образцов в подходах, которые только предоставляют установившегося информацию о связанных патогенных факторов. Все больше фактов указывает, что динамических клеток и клеток внеклеточного матрикса (ECM) взаимодействия в контексте трехмерной (3D) микросреды важны для механистическим и функциональных исследований по созданию новых стратегии лечения. Таким образом мы предположили, что патологические сортопопуляциях ткани, хирургического иссечена от глаз с НДР может использоваться надежно разгадать молекулярных и клеточных механизмов этой разрушительной болезни и проверить потенциал для Роман клинических вмешательства. С этой целью мы разработали новый метод для 3D ex vivo культуры хирургического иссечена пациента производные сортопопуляциях ткани (FT), который будет служить соответствующей модели человеческого PDR патофизиологии. ФНС расчлененный в эксплантов и встроенных в фибрин матрицы для ex vivo культуры и 3D характеристики. Целом гора иммунофлюоресценции родной ПТС и концевой культур позволяет тщательное расследование состав ткани и многоклеточных процессов, подчеркнув важность 3D ткани уровень квалификации для выявления соответствующих функций Патофизиология PDR. Эта модель позволит одновременно оценки молекулярных механизмов, процессов сотовых/ткани и лечения ответы в контексте сложных динамических биохимические и физические взаимодействия в рамках архитектуры ткани НДР и микроокружения. Поскольку эта модель резюмирует PDR патофизиологии, она будет также поддаются для тестирования или разработки новых методов лечения.
Introduction
Д-р является серьезным глазной осложнение диабета, болезни, которая достигла огромных масштабов в последние три десятилетия1. Спустя двадцать лет после диагноза, практически каждый пациент с сахарным диабетом типа 1 и 60% больных с типа 2 диабет настоящее признаки ретинопатии, делая диабет само по себе одной из ведущих причин слепоты в работе возраст взрослых2. По уровню микрососудистой дегенерация и ишемического повреждения DR подразделяется на не Пролиферативная DR (не Фунтовую) и пролиферативной DR (НДР). Терминальная стадия заболевания, НДР, характеризуется ишемии и воспаления индуцированной неоваскуляризации и фиброзных ответы на интерфейсе витреоретинальной. В необработанной условий эти процессы будут привести к слепоте вследствие кровоизлияния в стекловидное тело, сетчатки фиброза, тяговых отслойка и Неоваскулярная Глаукома3,4. Несмотря на недавние успехи текущие варианты лечения нацелены только DR этапов, включая диабетического макулярного отека и PDR, когда повреждения сетчатки уже последовало. Кроме того значительная доля пациентов доктора не воспользоваться текущей арсенале лечения, указывающее настоятельную необходимость улучшения лечения4,5,6.
Несколько других яn vivo болезни/развития и диабетической животных модели были разработаны на сегодняшний день, но никто из них не повторяет весь спектр патологических функций наблюдается в человека PDR7,,8. Кроме того все больше фактов указывает, что лечение ответы тесно связаны с состав ECM, а также пространственное расположение и взаимодействие между сотовой и ацеллюлярной микроокружения9. Мы, таким образом, изложенных разработать клинически значимых модель человека НДР, используя FT патологического материала, который обычно иссечена от глаз, претерпевает Витрэктомия частью хирургическое лечение PDR10.
Эта рукопись описывает протокол для 3D ex vivo культуры и характеристика хирургически подакцизным, НДР пациента производные патологических FT. Метод, описанный здесь был использован в недавней публикацией, которая продемонстрировала успешных деконструкции родной 3D пейзаж ткани НДР и резюме особенностей PDR патофизиологии, включая ангиогенных и фиброзных ответы ненормальное 11сосудистых структур. Эта модель также показал новые возможности, которые не могут быть оценены легко от гистологической шлифов, такие как пространственно ограничивается апоптоз и распространения, а также формирование сосудистой островок11. На 3D эндотелиальной сфероида культур для оценки его ангиогенных потенциал и эффективность ангиостатический молекул12стекловидного тела жидкость успешно использовался другими. В сочетании с в vitro 3D лимфатический эндотелиальных клеток (LEC) сфероида прорастания анализа с использованием PDR стекловидного тела как стимулятор, наша модель показало, что вклад обоих растворимых vitreal факторы, а также местные сигналы в пределах неоваскулярной ткани, как пока плохо понимали LEC участие в ЛНДР патофизиологии3,11. В управлении НДР витреоретинальная хирургия является регулярно осуществляется еще сложной процедурой. Как хирургические контрольно-измерительных приборов и методов наблюдаем непрерывное улучшение и изысканность, своевременной и консервативные удаления сортопопуляциях пролиферативной образца не только улучшает видение результатов, но также обеспечивает неоценимую ткани материал для расследование PDR патофизиологии и лечения ответов в сложных переводческих аспектах микроокружения живой ткани человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было одобрено институциональных Наблюдательный Совет и этического Комитета больницы университета Хельсинки. Подписанный информированное согласие было получено от каждого пациента.
1. Подготовка решений, средств массовой информации и оборудования
- Подготовьте следующее оборудование до сбора сортопопуляциях ткани (FT) для обеспечения быстрой обработки.
- Стерильными автоклав два microdissection пинцет.
- Подготовка 1 x фосфат амортизированное saline (PBS), растворяя 1 предварительно взвешенный PBS таблетка (0,14 М NaCl, 0,0027 M KCl, 0,010 M PO4-3) в 900 мл деионизированной воды и перемешайте, чтобы растворить. Отрегулируйте громкость водой до 1 Л и стерильные автоклав готовое решение. Магазин на RT.
- Соберите упомянутые выше решения и оборудование в корзине, вместе с одноразовые стерильные скальпель, стерильные 6-см клеток культуры блюдо и пять стерильные 12-ну клетки культуры пластин.
- Подготовьте раствор фибриногена в Хэнкс сбалансированный соли раствора (HBSS) 6 мг/мл, растворяясь в 5 мл HBSS, используя 50 мл трубки погружается в ванну с водой при 37 ° C, по крайней мере 1 h 30 мг человека фибриноген, плазминоген истощены.
Примечание: Это решение может храниться на водяной бане (37 ° C) для 7 h (максимум 10 h) перед использованием. - Подготовьте ex vivo питательной среды, добавив 5% плода телячьей сыворотки (FCS) или 5% сыворотки крови человека, 0,4% дополнение рост эндотелиальных клеток, 10 нг/мл рекомбинантного человеческого эпидермального фактора роста, гидрокортизон 1 мкг/мл и 50 мкг/мл гентамицина в коммерчески доступных Средний рост эндотелиальных клеток и держать на водяной бане при 37 ° C до использования. Хранить при 4 ° C до одного месяца.
2. сортопопуляциях ткани рассечение
- Соберите сортопопуляциях ткани (FT), которая была вырезана из человеческих субъектов, проходит транс конъюнктивы microincision витреоретинальная хирургия, на 23 или 20 колеи 3 портовый Парс plana Витрэктомия как часть витреоретинальная хирургическая управления НДР.
Примечание: FT является подакцизным с помощью сегментации и расслоению, сократить, если необходимо с microscissors и удаляется из полости стекловидного тела с интраокулярной конец сцепление microforceps опытных витреоретинальной хирургом. Крайне осторожно необходимо принимать для удаления целой, неповрежденной футов без повреждения глазной структур, включая зрительного нерва или временных сосудистых аркада, где ткани патологического неоваскулярной наиболее часто находится. Размер подакцизным ткани является переменной величиной, обычно колеблется от 3 до 50 мм2. - Держите FT в 6 см клетки культуры блюдо или 1,5 мл, содержащих 1 мл стерильного PBS на мокрый лед и передать его немедленно, чтобы исследовательская лаборатория для обработки.
Примечание: Важно, что исследовательское подразделение (лаборатории зал) близки к физически больнице операционной комнате (OR) для сведения к минимуму передачи раз небольшой подакцизным FT. В этом случае передача занимает менее 5 минут и эксплантов внедренные в фибрин обычно в 1-1,5 ч (максимум 2 h) после хирургического удаления. Влияние времени передачи на 3D культуры будет должна быть проверена. - FT в 6-см клетки культуры блюдо, содержащие 1 мл PBS при комнатной температуре (RT, 25 ° C) и получить изображения тканей с помощью Перевернутый эпифлуоресцентного микроскопа с задачей 5 x.
Примечание: Изображения приобретаются для качественной оценки и документации. Это будет возможность наблюдать за ткани размер, плотность и общей композиции (например, сосудистых структур). - Нарежьте FT ~ 1 мм2 штук под стереомикроскопом вертикально рассечение, используя стерильным скальпель и microdissection пинцет. Держите ткани, хорошо погруженной в PBS, в месте с помощью microdissection пинцет и выполнять четкие отрубы с использованием стерильным скальпель. Избегайте разрывая футов, как это изменит родной сортопопуляциях структур.
- Место каждого индивидуального кусок в колодец плиты культуры 12-ну ячейки, содержащие 1 мл стерильного PBS.
Примечание: При необходимости, слегка распространения FT на пластину с помощью пинцета microdissection, до выполнения сокращений.
3. приведение вертикально фибрина гель капельки для характеризации Ex Vivo культуры и родного FT
- Стерильными фильтр готов фибриноген раствор, приготовленный на шаге 1.2 с 0,22 мкм фильтром монтируется в шприц 10 мл.
- Подготовка аликвоты раствор фибриногена (25 мкл на 1,5 мл) и держать на RT. Prepare Алиготе для фибринового гель / каждый кусок FT, полученные после вскрытия, и пару дополнительных аликвоты для тестирования фибрина гель формирования.
- Подготовить раствор HBSS, содержащих 4 единиц/мл тромбина и 400 мкг/мл Апротинин, называемый далее TA решение и держать на RT. Prepare столько TA решения по мере необходимости, в зависимости от количество штук, полученные после вскрытия (25 мкл раствора TA используется для каждого FT/fibrin гель) и дополнительную сумму (например, 250 мкл) для тестирования гель образование фибрина и обеспечения того, чтобы достаточно решение всей территории литья капель геля фибрина.
Примечание: Тромбин является обязательным для полимеризации фибрина, хотя Апротинин добавляется предотвращения деградации фибрина геля сотовой протеаз, выраженные FTs13,14. - Проверить сроки формирования фибрина гель: добавить 25 мкл TA решения aliquoted 25 мкл фибриноген раствор, приготовленный на шаге 3.2 и, используя другой пипетки, равным 50 мкл, смешать в трубе, закупорить и обойтись в блюдо культуры клеток 6 см , образуя вертикальный капли.
Примечание: Образование фибрина гель должен проходить в ~ 1 мин. Если это занимает свыше 1,5 мин, концентрацию тромбина в TA раствор, приготовленный на шаге 3.3 можно увеличить, добавив больше Стоковый раствор тромбина. Десятая часть изначально использованный объем Стоковый раствор тромбина могут быть добавлены, неоднократно, пока гель образование фибрина происходит в течение 1,5 мин. Время формирования фибрина гель имеет решающее значение для трех размерности культуры, как гель быстрого формирования (в течение 1,5 минут) предотвращает FT кусок от тонуть к дну геля фибрина и таким образом контактирующих 2D пластиковые поверхности клетки Культура пластина, которая может привести к 2D клеточной адгезии и нарост. - Один FT заготовку в центре одной скважиной 24-ну пластины с помощью стерильный пинцет и удалите любые излишки PBS, дозирование с 0,5-10 мкл пипетки избежание всасывания силы на FT. В случае ткани прилипает к пинцет, использовать дополнительные пинцет для помощи размещение кусок ткани на плите.
Примечание: FT/фибрина гели также может быть приведен на 48-ну плита уменьшить использование реагентов. Однако это более сложным, как пространство является более ограниченным и фибрин будет распространяться, если он вступает в контакт с хорошо стены. - Добавить 25 мкл раствора TA 25 мкл фибриноген решение aliquoted в шаге 3.2, и с помощью другой пипеткой равным 50 мкл смеси в трубе, закупорить. Обойтись на FT кусок хорошо размещены на плите, и пипетки вверх и вниз 2 - 3 раза для того, чтобы включить кусок FT в вертикальном капелька, обеспечивая 3D матрицы окружающие FT.
Примечание: Убедитесь, что FT не придыханием во время закупорить и что без воздушных пузырей образуются. Убедитесь также, что смешивание, провидение и закупорить выполняются быстро как фибрин гель будет сформировать в течение 1,5 мин, как тестирование в шаге 3.4. Если приведение фибрина гели на табличке, 48-а, используйте вместо 20 мкл раствора фибриногена и 20 мкл раствора TA. - Повторите шаги 3.5 и 3.6 для всех частей FT.
- Разрешить фибрина гели закрепить путем инкубации пластины в инкубатор культуры клеток при 37 ° C в атмосфере увлажненный с 5% CO2.
- После 0,5-1 ч, проверьте, что фибрина гель полностью формируется тщательно наклона пластины. Перейдите к шагу 3.10 когда гель не двигаться наклоне пластину, указывающее, что гель образование фибрина является полным.
- Наложение FT/фибрина гели с ex vivo питательной среды (600 мкл/хорошо в 24-ну плиты) или 300 мкл/колодец в 48-ну пластины дополнена Апротинин 100 мкг/мл. Пипетка средство мягко, drop-wise провидение.
Примечание: Здесь, Апротинин используется для предотвращения деградации фибрина геля сотовой протеаз, выраженные FTs13,14. Ex vivo питательной среды дополнительно могут быть дополнены рекомбинантных факторов роста, такие как VEGFA, VEGFC, bFGF, TGFβ (см. Таблицу материалов)11. - Место FT ex vivo культуры пластины обратно в 37 ° C, 5% CO2 клетки инкубатор культуры и культуры за желаемый период (например, 2 - 18 дней, более культуры, которую периодов будет должна быть проверена). Замените 50% средних свежих ex vivo культуры среднего каждые три дня.
4. «в матрице» изображений
- Получение изображений FT ex vivo культур в тот же день (день 0) и в установленные интервалы времени (например, каждый день), используя Перевернутый эпифлуоресцентного микроскопа, чтобы начать следовать за 3D роста.
Примечание: Изображения, полученные может использоваться для количественной оценки FT нарост как общая длина двух перпендикулярных диаметров через экспланта11.
5. родной FT и Ex Vivo культуры концевой
Примечание: Гели FT/фибрин может быть культивировали ex vivo на желаемое время период (FT ex vivo культур) или фиксированной в тот же день (родной FT) для родной FT характеристика11.
- Исправить родной FT или FT ex vivo культур, заменив питательной среды с 1 мл/хорошо параформальдегида 4% в растворе PBS, за 1 ч на RT. Для родной гели FT/фибрина, исправить 0,5-1 ч после добавления ex vivo культуры среднего (если фибрина гели не имеют смоченной в среде, фиксация может повредить их).
Примечание: Выполните этот шаг в зонт как параформальдегида коррозионные, токсичными и канцерогенными. - Промойте FT/фибрина гели с тремя 5 мин моет в PBS (2 мл/хорошо).
- Заменить PBS с 2 мл/хорошо PBS, содержащие азид натрия 0,02% и хранить фиксированный фибрина гели на 4 ° C до дальнейшей обработки. Уплотнение пластины с парафином фильм для обеспечения что FT/фибрина гели не сушите в хранилище.
Примечание: Выполните этот шаг в зонт как азид натрия является токсичным.
6. всего гора иммунофлюоресценции пятнать
Примечание: Этот протокол длится 5 дней и может быть прерван с ночи инкубаций где указано. Не позволяйте фибрина, гели сухой в любой точке. Все действия выполняются на RT, если не указано иное.
- Подготовьте следующие решения перед началом окраски протокол.
- После фиксации решение: подготовка 50: 50 ацетон: метанол решение путем смешивания равных количеств ацетона и метанола (например, 50 мл). Хранить при температуре от-20 ° C. Готовить это решение последний на день до окрашивания. Это решение может храниться обратно при-20 ° C и использоваться для последующих stainings.
Примечание: Подготовьте это решение в Зонта как ацетон и метанола легковоспламеняющихся и опасных для здоровья. - Блокирование решение: подготовить 15% плода бычьим сывороточным (ФБС), 0,3% октиловый фенола ethoxylate раствора в PBS на первое добавление 15% FBS в PBS. Добавить октиловый фенол ethoxylate и перемешать, чтобы распустить. Хранить при 4 ° C.
Примечание: Это решение можно готовить в большом объеме заранее, хранящиеся в 15 мл аликвот при-20 ° C и разморожен перед использованием, в тот день, когда начинается окрашивание протокол. Используйте свежеприготовленный или свежей талой aliquote для каждого протокола, окрашивание. - Моющего раствора: подготовка 1 Л PBS, дополнена 0,45% фенола октиловый ethoxylate путем добавления 4,5 мл октиловый фенола ethoxylate 995.5 мл ФСБ. Движение, чтобы распустить. Магазин на RT.
- После фиксации решение: подготовка 50: 50 ацетон: метанол решение путем смешивания равных количеств ацетона и метанола (например, 50 мл). Хранить при температуре от-20 ° C. Готовить это решение последний на день до окрашивания. Это решение может храниться обратно при-20 ° C и использоваться для последующих stainings.
- Поднимите капельки тщательно от пластины с помощью площади обрезная шпателем из нержавеющей стали. Вначале отсоединить капли от края до отмены в центр и передавать колодец 12-ну пластины, содержащие 1 мл ФСБ.
Примечание: Выполните после фиксации, моет и блокирование в этом формате пластины. - После исправьте капель с 1 мл раствора ацетона: метанол ледяной 50: 50 ~ 1 мин (границы капель станет белым).
Примечание: Выполните этот шаг в Зонта, как ацетон и метанола, опасны для здоровья. - Промойте с 3-5 стирок в 2 мл PBS (капельки утонет в решении PBS при завершении регидратации).
Примечание: Не прикасайтесь капельки кончиком пипетки как, после после фиксации, они закрепляемые на пластик. На протяжении всего протокола Избегайте аспирационных после исправления, антитела, блокирование и обмыв всасывания, решения, как это может повредить или полностью уничтожить капли. Вместо этого наклона пластины и тщательно удалить решения с помощью пипетки 500-5000 мкл. - Центрифуга блокировки решение для 15 мин на 21 000 x g и 4 ° C для того, чтобы удалить мусор.
Примечание: Решение может быть aliquoted в 1,5 мл пробирок для центрифугирования. Неиспользованный раствор можно хранить при 4 ° C и используется для всех соответствующих последующих шагов. - Инкубировать капельки в 500 мкл преграждая разрешение для 2 ч на RT.
Примечание: Чтобы уменьшить объем блокирования решение используется, плита может быть наклонена в на поддержке и может использоваться как 300 мкл раствора/капли. - Подготовьте смесь основное антитело (по крайней мере 30 мкл/капли) в соответствующие разрежения в блокировании решения и центрифуги для 15 мин на 21 000 x g и 4 ° C.
- Передача капельки в раунд (U)-снизу 96-луночных пластину с помощью шпателя раунд обрезная и проинкубируйте с по крайней мере 30 мкл/капли смеси основное антитело на ночь при 4 ° C.
- На следующий день, передачи, капельки в 12-ну пластины содержащий 2 мл моющего раствора/Ну, промыть с тремя 5 мин моет первой, а затем с 9 30 мин смывки. Оставьте последний мыть (2 мл) на ночь при 4 ° C.
- На следующий день, три раза промойте PBS и передачи капельки в раунд (U)-снизу 96-луночных пластины.
- Во время мойки Подготовьте соответствующий вторичное антитело проспряганное Флюорофор смесь (разбавленных 1: 500, по крайней мере 30 мкл/капли) в блокировании решения и центрифуги для 15 мин на 21 000 x g и 4 ° C.
- Перевести капли в раунд (U)-снизу 96-луночных пластину с помощью шпателя раунд обрезная и проинкубируйте с по крайней мере 30 мкл вторичное антитело смеси, для 4 h на RT, защищенном от света.
Примечание: Выполните все последующие инкубаций и стиральная защищены от света. - Перенесите капли в 12-ну пластины, содержащий 2 мл стирки решение/колодец с помощью шпателя раунд обрезная, полоскание с тремя 5 мин моет сначала и затем с четырьмя моет 30 мин. Оставьте последний мыть (2 мл) на ночь при 4 ° C.
- На следующий день промойте гели с пятью моет 30 мин и затем в три раза с PBS. Оставьте последний мыть (2 мл) на ночь при 4 ° C.
- На следующий день, передачи капли в раунд (U)-снизу 96-луночных пластину с помощью раунд кромкой шпателя и изображение ядер, инкубации с 10 мкг/мл Hoechst ядерной пятно (по крайней мере 30 мкл/капелька) за 30 минут на RT.
Примечание: Монтаж среднего дополнена 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) для counterstaining ядер в качестве альтернативы может быть использован. В этом случае этот шаг и шаг 6.16 пропускаются, перейти непосредственно к шагу 6.17. - Перевести капли в 12-ну пластины, содержащий 2 мл PBS/скважины с помощью шпателя раунд обрезная и промойте три раза с PBS.
- Смонтируйте капельки на микроскопа следующим образом:
- Применить узкий слой быстрой закалки монтажа средних по краям coverglass квадратная 22 x 22 мм и высушить на ~ 1 минуту. Выполните этот шаг для каждой капли индивидуально, чтобы избежать чрезмерного затвердения монтажной среды.
Примечание: Выполните этот шаг в зонт как средство быстрой закалки монтажа опасных для здоровья. - Промойте капли путем погружения в колодец 12-ну пластины, содержащий 2 мл деионизированной воды и перенести на микроскопа, с помощью шпателя раунд обрезная. Удалите лишнюю воду с помощью небольшой кусок фильтровальной бумаги.
- Отказаться от 15 мкл antifade монтажа не упрочнения среды на капли.
Примечание: в качестве альтернативы, если ядерной пятно "Хёхст" не был использован, монтаж среднего, содержащую 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) может использоваться. - Аккуратно положение крышка стекла, с быстрой закалки монтажа средой перед микроскопический слайд над капли и пусть урегулировать.
Примечание: Средство быстрого затвердевания будет придерживаться микроскопических слайдов и сохранить дроплет на месте.
- Применить узкий слой быстрой закалки монтажа средних по краям coverglass квадратная 22 x 22 мм и высушить на ~ 1 минуту. Выполните этот шаг для каждой капли индивидуально, чтобы избежать чрезмерного затвердения монтажной среды.
- Повторите шаг 6.17 для всех капельки. Смонтируйте две капельки на каждом микроскопа.
- Пусть слайды просушите на RT для ~ 2 h и хранить при 4 ° C на ночь. Убедитесь, что слайды располагаются горизонтально и защищены от света.
- Изображение окрашенных родной или концевой FT ex vivo культур с помощью Конфокальный микроскоп или вертикальном эпифлуоресцентного микроскопа, оборудованные оптической секущей функции и 20 x или 40 x цель. Используйте функцию плитки для захвата большей площади ткани сразу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Более глубокое понимание свойств сортопопуляциях ткани НДР и выражения протеина опиралась главным образом на стекловидном образцов и тонких гистологические FT секции3,15,16,17. Разработать метод для тщательного расследования Организации 3D ткани и многоклеточных выкидышей процессов НДР, мы отправились использовать хирургически подакцизным, пациент производные патологических ФНС для 3D характеристики и ex vivo культуры. Свежий ФНС переданы научно-исследовательская лаборатория и обрабатываются как показано в рабочем схема на рисунке 1.
FTs может быть imaged до вскрытия для качественной оценки и документации (рис. 2). Как показано на рисунке 2, ФНС отображать большие различия между пациентом в размер, плотность и обилием сосудистых структур. В некоторых тканях, свободные клетки, предположительно воспалительных/иммунной клетки или красных кровяных клеток а также предыдущим сосудистых структур различного калибра также может быть легко отличить (рис. 2). После вскрытия необходимо быть решение по течению использование ограничивающих количество полученных эксплантов. Часть эксплантов привнесенными матрицу фибрина и фиксированной после образования фибрина лари, в то время как остальные эксплантов может подвергаться ex vivo культуры на отдельной табличке (рис. 1). Свежий ФНС также успешно использовались для ультраструктурная характеристика по электронной микроскопии. Образцы могут быть либо обрабатываются для обычных просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) ультратонких секций или последовательного блока лицом сканирование электронной микроскопии (SBF-SEM)3,11.
Фиксированной фибрина гели можно хранить в течение нескольких недель и окрашенных в целом гора иммунофлюоресценции18,19. Окрашенные образцы также являются стабильными, при температуре 4 ° C в темноте. Толстые FT/фибрина гели можно отображаемого времени эффективно с эпифлуоресцентного микроскопа с оптической секущей функции, полезные для удаления рассеянного света вне фокуса. Обработка изображений с помощью этого метода обеспечивает прекрасный визуализации структур. Кроме того конфокальная микроскопия, хотя более требуют времени, может позволить захвата мелких деталей. Характеристика свежезаваренным встраиваемый фибрина и фиксированной, uncultured, родной ПТС в целом гора иммунофлюоресценции позволяет характеризация сосудистых структур, несколько типов клеток и их взаимной договоренности в рамках 3D ткани PDR пейзаж11. К примеру CD31 антитела могут использоваться для отображения эндотелия и NG2 для отображения pericytes (рис. 3), в то время как Lyve1 антитела визуализировать недавно обнаружил лимфатической как эндотелиальные структуры (рис. 4)11. Несколько комбинаций антител может использоваться для визуализации несколько конструкций и типов клеток (см. Таблицу материалы); например Эрг также можно визуализировать эндотелия, который имеет шаблон выражения discontinuos в это ненормальное НДР. Сосудистых структур, окрашенных с маркером мембраны (например, CD31 и Lyve1) можно количественно проанализированы для сохранения и плотности с помощью Angiotool, бесплатный источник программного обеспечения, разработанного национального института рака NIH11, 20. 3D тома может также оказываться из полученных данных (см. видео 1). Если антитела не подходит для всего гора иммунофлюоресценции, фибрина капель можно альтернативно заливали в парафин, вырезать шлифов и проанализированы иммуногистохимия. В этом случае капли выгоду от фиксации на ночь при 4 ° C вместо 1 ч на RT.
Ex vivo культуры поддерживает рост фибрин встроенный ФТП, развивающихся сотовых наросты уже после двух дней (рис. 5). В vitro фибрина гель используется как матрица для ex vivo культуры, поскольку его типичным в естественных условиях временного ECM, образуются после тромбина расщепления фибриногена сыворотки на участках сосудистые утечки, в непосредственном контакте с вытекающей PDR показаниями в воспаление фиброзных окружение15,21,22.
ЛНДР является микрососудистых осложнений, характеризуется ангиогенных и фиброзных ответ, и FT эксплантов сохранить этот сотовой репертуар в культуре, а также эффективно реагировать на внешние раздражители, добавлены в культуре средств массовой информации11. Репрезентативных данных на рисунке 6 показано, что ЛНДР культур ex vivo индуцированной прорастания CD31-позитивных эндотелия и сосудистую сохранения в ответ на VEGFA, в то время как TGFβ индуцированных фиброзных ответ, отражаемый нарост на Pericytes/SMCs NG2-положительных. Несколько внешних раздражителей могут быть проверены и, когда сообщил измерения их залегания в естественных условиях vitreal, здесь развитых PDR ex vivo культуры модель может выявить Роман микроокружения и контекст зависимых PDR патологические механизмы, которые не могут быть визуализируется в фиксированных тканей материал.
Рисунок 1. Ex vivo PDR сортопопуляциях культуры ткани модель. Схематическое представление рабочего процесса от витреоретинальной хирургии (Парс plana Витрэктомия) для обрезания FT его рассечения в эксплантов и встраивания в фибрин для трехмерных характеристик и ex vivo культуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Свеже подакцизным PDR сортопопуляциях тканей до рассечение. Фаза контакты микроскопии свежезаваренным подакцизным ФНС, принятых до вскрытия. ФНС, крайне непостоянны в размер, плотность и обилием сосудистых структур. Стрелки указывают сосудистых структур различного калибра. Красная линия частично прозрачным выделяет два отдельных судов различного калибра. Изображения были взяты с помощью Перевернутый эпифлуоресцентного микроскопа с 5 x, 0,15 числовая апертура (NA), цель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Целом гора иммунофлюоресценции родной сортопопуляциях ткани PDR. Микрофотография эпифлуоресцентного уроженец PDR FT запятнана целом гора иммунофлюоресценции. CD31 (A, зеленый) визуализирует эндотелия при NG2 (B, красный) визуализирует pericytes в рамках нерегулярных неоваскулярной структур. (C) показаны слияния изображений. DAPI (синий) изображение визуализирует ядер. Изображение с помощью вертикально эпифлуоресцентного микроскопа с оптическим секущей функцией и в сочетании с компьютерным управлением 1.3 мегапиксельной монохромный CCD камеры и изображений приобретения программного обеспечения, используя 40 x 1.4 NA, цель нефти. Девять оптических разделы были объединены с помощью программного обеспечения для обработки изображений ImageJ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Целом гора иммунофлюоресценции родной сортопопуляциях ткани PDR. Микрофотография эпифлуоресцентного уроженец PDR FT запятнана целом гора иммунофлюоресценции. CD31 (A, зеленый) визуализирует эндотелия при Lyve1 (Б, красный) визуализирует недавно обнаруженных лимфатической как эндотелиальные структуры. (C) показаны слияния изображений. Hoechst 33342 (синий) изображение визуализирует ядер. Изображение с помощью вертикально эпифлуоресцентного микроскопа с оптическим секущей функцией и в сочетании с компьютерным управлением монохромный 1.3 мегапиксельной CCD камеры и изображений приобретения программного обеспечения, с помощью 20 x, 0.8 NA, цель. Четыре оптических секции были объединены с помощью программного обеспечения для обработки изображений ImageJ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Ex vivo рост тканей PDR сортопопуляциях. Фаза микроскопии контраст двух футов ex vivo культур в назначенное время точках (день). ФНС растут на ex vivo культуры, развитие сотовой наросты уже через два дня. Изображения были взяты с помощью Перевернутый эпифлуоресцентного микроскопа с 5 x, 0,15 NA, цель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6. Целом гора иммунофлюоресценции PDR сортопопуляциях тканей, искусственного ex vivo не лечить (CTRL), или в присутствии VEGFA или TGFβ. Микрофотография эпифлуоресцентного FT культивированный ex vivo не лечить (CTRL), или в присутствии VEGFA или TGFβ за 9 дней и впоследствии запятнана целом гора иммунофлюоресценции. CD31 (зеленый) визуализирует эндотелия, хотя NG2 (красный) визуализирует pericytes. DAPI (синий) изображение визуализирует ядер. VEGFA стабилизировать сосудистую, в то время как TGFβ индуцированных фиброзных ответ. Изображения были взяты с помощью вертикально эпифлуоресцентного микроскопа с оптическим секущей функцией и в сочетании с компьютерным управлением монохромный 1.3 мегапиксельной CCD камеры и изображений приобретения программного обеспечения, с помощью 20 x, 0.8 NA, цель. Девять оптических разделы были объединены с помощью программного обеспечения для обработки изображений ImageJ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Видео 1. 3D-объем реконструкции родной FT запятнана целом гора иммунофлюоресценции. CD31 (зеленый), Lyve1 (красный). Hoechst 33342 изображение (синий) визуализирует ядер. Изображение с помощью вертикально эпифлуоресцентного микроскопа с оптическим секущей функцией и в сочетании с компьютерным управлением монохромный 1.3 мегапиксельной CCD камеры и изображений приобретения программного обеспечения, с помощью 20 x, 0.8 NA, цель. 3D-объем реконструкции и видео рендеринга была выполнена с использованием коммерческого программного обеспечения. Часть видео перепечатана с разрешения от Gucciardo и др. 11. пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
С учетом важности соответствующих тканей микроокружение для надежных функциональных клеток и молекулярные механистический результаты необходимо найти соответствующие экспериментальные модели, которые предоставляют этот ткани окружающей среды. Здесь описаны ex vivo PDR культуры модель для фибрин встроенный ФТП позволяет исследование механизмов PDR патофизиологии в контексте родной, сложных и многоклеточных PDR клинических образцов.
Важнейшие шаги в рамках Протокола являются формирование гель надлежащего фибрина, позиционирование FT и надлежащего мытья во время окрашивания. Поскольку образование фибрина гель в основном зависит от активности тромбиновое, пострадавших от концентрации и температуры, количество тромбина необходимо скорректировать для каждого пакета Подготовка геля фибрина. Фибрин гель формирование должно быть достаточно быстро предотвратить 2D рост эксплантов футов, но также замедлить достаточно, чтобы позволить позиционирование FT в центр капель по вертикали и по горизонтали. В случае, если FT происходит, чтобы найти на краю капли дополнительное дозирование может помочь размещение FT в центр. Выразительно представляющую, которые по-прежнему остаются на краю капель или что растут в 2D должны быть исключены. Надлежащего мытья во время окрашивания и избегая высыхания капель в свою очередь критические для того чтобы оптимизировать окрашивание и минимизации фонового сигнала. Время передачи также может быть критическим. Мы внедряли ФНС до двух часов после витрэктомии и это не влияет на ex vivo роста. Влияние времени передачи на успех культуры будет должна быть проверена.
Этот протокол может быть изменен с помощью альтернативных матрицы для встраивания FT. В естественных условиях, НДР показаниями богатеть направлении стекловидного тела коры в коллагена23. Однако после сосудистые утечки компонентов сыворотки, включая фибриноген, растворяются в стекловидное тело в непосредственной близости от суда, согласно которой инициируется фиброзных ответ. Таким образом, был использован в пробирке фибринового сгустка здесь для ex vivo культуры с целью олицетворяют предварительную ECM сформирована в воспаленных фиброзных окружение PDR15,21,22. Кроме того, сгустков фибрина может быть дополнена Ламинин и фибронектин изменить стабильность прорастания капилляров, или эксплантов может быть встроен в пределах типа коллагена и других смешанных матрицы олицетворяют наиболее фиброзных микросреды в неоваскулярной тканей. Эти матрицы обычно подходят для 3D культуры и целом гора иммунофлюоресценции, но их влияние на НДР ФНС по-прежнему быть протестированы и соображения о сроках формирования 3D матрицы должны быть сделаны для того чтобы остаться в пределах для предотвращения 2D рост18,19. При физической близости исследовательское подразделение в больницу представляет собой ограничение, длиннее время передачи может компенсироваться с работы в команде; Приготовления раствора TA, стерильные фибриноген-фильтрации и фибрин гель формирования тестирования может выполняться во время передачи FT. Если фибрина гели не образуют даже после 1 часа, могли иметь место проблемы с фибриноген или TA приготовления раствора. В этом случае нельзя использовать гели FT/фибрина.
Ограничения этого подхода, как с каждой ex vivo подход, являются переменной качество первичных ткани образца через отдельных лиц, а также неоднородность ткани внутри пациента и между пациентами. В случае пациентов с сахарным диабетом часть этой изменчивости включает степень васкуляризации и фиброз, которая зависит от многочисленных факторов, таких как продолжительность заболевания, метаболические условия, генетические/эпигенетических факторов, типа сахарного диабета и системной терапии. Размер хирургического PDR FT восстановлены также является ограничивающим фактором, определяющим количество условий, которые могут быть исследованы для каждого образца. Обеспечивая взаимные пространственной информации, всего гора иммунофлюоресценции позволяет расследование лишь ограниченное количество функций/маркеров на капли. Как компромисс капельки фибрина можно в качестве альтернативы заливали в парафин, вырезать шлифов и проанализированы иммуногистохимия.
Существующие Диабетическая мыши модели разработки многие черты ранней стадии DR, но не всесторонне пилки прогрессивные изменения, происходящие в человека НДР, таким образом препятствуя исследования PDR болезни механизмы7,8. Кроме того мышиных глаз принципиально отличается от человеческого глаза, в том, что ей не хватает макулы, подчеркивая далее важность изучения болезней человека24. Хирургической FTs PDR либо ранее были отброшены, или использоваться для парафиновых срезах, просвечивающей электронной микроскопии, последовательный блок лицом сканирование электронной микроскопии, массовых РНК последовательности или 2D культуре диссоциированных клетки3,25 . Здесь описывается модель позволяет 3D характеристика этого драгоценного хирургического материала, а также расследование PDR патофизиологии в родной больные ткани микроокружения. В сочетании с использованием стекловидного тела жидкости, эта модель также позволяет расследование вклад сотовой и ацеллюлярной микроокружения НДР. Поскольку культура реагировать эффективно факторы роста, обнаруженные в стекловидном теле, такие как VEGFA, bFGF, VEGFC и TGFβ, таким образом, резюмируя особенности PDR патофизиологии, этот PDR ex vivo культуры модель поддается для тестирования или разработки новых РАП лечения 11. в этой модели, анти VEGFA предотвратить капиллярное прорастания и индуцированных признаки капиллярного регрессии, ответы, которые согласуются с Ожидаемые клинические исходы лечения анти VEGFA26,27. Таким образом эта модель может также использоваться для лучшего понимания воздействия текущих терапии, в том числе анти VEGFA и кортикостероидов лечение.
С живой клетки тепловизионных приборов, здесь описано ex vivo культуры модель может быть подвергнут покадровой микроскопии позволяет в реальном времени расследование таких процессов, как сосудистые регрессии, прорастания и клеточных пластичности. При сочетании с в vitro и in vivo моделей, а также клинических данных, это ex vivo PDR модель поможет в расследовании пациент ответы, основанные на конкретных наборов идентификации маркеров, на шаг ближе к проспекту для персонализированной медицины. Выявление пациента конкретных ответов и/или ответ специфических маркеров является особенно актуальным в случае НДР, который является многофакторных заболеваний с сложного взаимодействия микрососудистой, нейродегенеративные, метаболический, генетические/эпигеномные, иммунологические и воспаление, связанных факторов, таким образом требует все более междисциплинарный усилия для развития улучшение управления терапевтических ориентации и болезни. Помимо всего гора иммунофлюоресценции ex vivo культивированный FTs может также извлечь из фибрина с лечения наттокиназа плазмин/и подвергается транскриптомики и протеомных анализирует28. Пригодность здесь описывается модель ex vivo исследований сортопопуляциях тканей, разработанные в других глазных условий, таких, как в тяжелых случаях Серповидноклеточная ретинопатии, могли бы также изучить в будущем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы признательны коллег медицинских и хирургических сетчатки, медсестер и весь персонал диабетической группы и витреоретинальной хирургии группы на отделение офтальмологии больницы университета Хельсинки за активное участие в вербовке пациентов. Мы благодарим Biomedicum молекулярной визуализации подразделение для визуализации объектов. Мы благодарим Анастасия Черненко за отличную техническую помощь. Это исследование было поддержано грантов от Академии Финляндии (KL), Университет Хельсинки (KL), Сигрид Juselius Foundation (KL), Фонд Йоханссон K. Альбин (KL), Финский институт рака (KL), Karolinska Institutet (KL), Финский фонд глаз (SL), глаз и Фонд банка тканей (SL), Мэри и Георг C. Эрнруутов фонд (SL) и HUCH клинических исследовательских грантов (TYH2018127 после TYH2016230, SL), фонд исследования диабета (SL, KL, AK, например), а также докторскую программу в биомедицине (EG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Microforceps | Medicon | 07.60.03 | Used for handling the FTs |
| Disposable Scalpels - Sterile | Swann-Morton | 0513 | Used for FT dissection |
| Culture dish, vented, 28 ml (60mm) | Greiner Bio-One | 391-3210 | Used for dissection and for testing fibrin gel formation |
| Cell culture plates, 12-well | Greiner Bio-One | 392-0049 | Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL | Greiner Bio-One | 391-3477 | |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL | Greiner Bio-One | 525-0384 | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF | Millipore | SLGV033RS | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Syringe, 10 mL | Braun | 4606108V | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Fisher | FB74031 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well | Nunc | 142475 | Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture |
| Cell culture plates, 96-well, U-bottom | Greiner Bio-One | 392-0019 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Coverslips 22x22mm #1 | Menzel/Fisher | 15727582 | Used for mounting |
| Microscope slides | Fisher | Kindler K102 | Used for mounting |
| Absorbent paper | VWR | 115-0202 | Used for mounting |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | Used for preparing 1x PBS |
| Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Calbiochem | 341578 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H9394-500ML | Used for preparing the fibrinogen and TA solution |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | Used for preparing the blocking solution |
| Human Serum | Sigma-Aldrich | H4522 | Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media |
| Gentamicin Sulfate 10mg/ml | Biowest | L0011-100 | |
| Endothelial cell media MV Kit | Promocell | C-22120 | Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement, 500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-2.5L-M | Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | T9284 | Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. |
| Hoechst 33342, 20mM | Life Technologies | 62249 | For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Eukitt Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 03989-100ml | TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | T9549-500UN | Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder | Sigma | A3428 | Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth factors | |||
| Recombinant human VEGFA | R&D Systems | 293-VE-010 | 50 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human VEGFC | R&D Systems | 752-VC-025 | 200 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human TGFβ | Millipore | GF346 | 1 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human bFGF | Millipore | 01-106 | 50 ng/ mL final concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary antibodies | |||
| CD31 (JC70A) | Dako | M0823 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD34 (QBEND10) | Dako | M716501-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD45 (2B11+PD7/26) | Dako | M070129-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD68 | ImmunoWay | RLM3161 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| Cleaved caspase-3 (5A1E) | Cell Signalling | 9664 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| ERG (EP111) | Dako | M731429-2 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| GFAP | Dako | Z0334 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Ki67 | Leica Microsystems | NCL-Ki67p | Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Lyve1 | R&D Systems | AF2089 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab |
| NG2 | Millipore | AB5320 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Prox1 | ReliaTech | 102-PA32 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab |
| Prox1 | R&D Systems | AF2727 | Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab |
| VEGFR3 (9D9F9) | Millipore | MAB3757 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| α-SMA (1A4) | Sigma | C6198 | Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG | Life Technologies | A-21202 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-11012 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG | Thermo Scientific | A-11057 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG | Thermo Scientific | A-11036 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG | Molecular Probes | A-21468 | Used at 1:500 dilution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope | Zeiss | For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT | |
| SZX9 upright dissection stereomicroscope | Olympus | For FT dissection | |
| LSM 780 confocal microscope | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT | |
| AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT |
References
- Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Liew, G., Wong, V. W., Ho, I. V. Mini Review: Changes in the Incidence of and Progression to Proliferative and Sight-Threatening Diabetic Retinopathy Over the Last 30 Years. Ophthalmic Epidemiology. 24 (2), 73-80 (2017).
- Loukovaara, S., et al. Indications of lymphatic endothelial differentiation and endothelial progenitor cell activation in the pathology of proliferative diabetic retinopathy. Acta Ophthalmologica. 93 (6), 512-523 (2015).
- Stitt, A. W., et al. The progress in understanding and treatment of diabetic retinopathy. Progress in Retinal and Eye Research. 51, 156-186 (2016).
- Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies. JCI Insight. 2 (14), (2017).
- Gross, J. G., et al. Five-Year Outcomes of Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial. JAMA Ophthalmology. 136 (10), 1138-1148 (2018).
- Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Disease Models, Mechanisms. 5 (4), 444-456 (2012).
- Villacampa, P., Haurigot, V., Bosch, F. Proliferative retinopathies: animal models and therapeutic opportunities. Current Neurovascular Research. 12 (2), 189-198 (2015).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models, Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
- Sharma, T., et al. Surgical treatment for diabetic vitreoretinal diseases: a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 44 (4), 340-354 (2016).
- Gucciardo, E., et al. The microenvironment of proliferative diabetic retinopathy supports lymphatic neovascularization. The Journal of Pathology. 245 (2), 172-185 (2018).
- Rezzola, S., et al. 3D endothelial cell spheroid/human vitreous humor assay for the characterization of anti-angiogenic inhibitors for the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Angiogenesis. 20 (4), 629-640 (2017).
- Pepper, M. S., Montesano, R., Mandriota, S. J., Orci, L., Vassalli, J. D. Angiogenesis: a paradigm for balanced extracellular proteolysis during cell migration and morphogenesis. Enzyme, Protein. 49 (1-3), 138-162 (1996).
- Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs). Journal of Cell Science. 115 (Pt 17), 3427-3438 (2002).
- Loukovaara, S., et al. Quantitative Proteomics Analysis of Vitreous Humor from Diabetic Retinopathy Patients. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5131-5143 (2015).
- Abu El-Asrar, A. M., Struyf, S., Opdenakker, G., Van Damme, J., Geboes, K. Expression of stem cell factor/c-kit signaling pathway components in diabetic fibrovascular epiretinal membranes. Molecular Vision. 16, 1098-1107 (2010).
- Loukovaara, S., et al. Ang-2 upregulation correlates with increased levels of MMP-9, VEGF, EPO and TGFbeta1 in diabetic eyes undergoing vitrectomy. Acta Ophthalmologica. 91 (6), 531-539 (2013).
- Sugiyama, N., et al. EphA2 cleavage by MT1-MMP triggers single cancer cell invasion via homotypic cell repulsion. Journal of Cell Biology. 201 (3), 467-484 (2013).
- Tatti, O., et al. MMP16 Mediates a Proteolytic Switch to Promote Cell-Cell Adhesion, Collagen Alignment, and Lymphatic Invasion in Melanoma. Cancer Research. 75 (10), 2083-2094 (2015).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
- Senger, D. R. Molecular framework for angiogenesis: a complex web of interactions between extravasated plasma proteins and endothelial cell proteins induced by angiogenic cytokines. American Journal of Pathology. 149 (1), 1-7 (1996).
- Senger, D. R., Davis, G. E. Angiogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (8), a005090 (2011).
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
- Marmorstein, A. D., Marmorstein, L. Y. The challenge of modeling macular degeneration in mice. Trends in Genetics. 23 (5), 225-231 (2007).
- Kim, L. A., et al. Characterization of cells from patient-derived fibrovascular membranes in proliferative diabetic retinopathy. Molecular Vision. 21, 673-687 (2015).
- Avery, R. L., et al. Intravitreal bevacizumab (Avastin) in the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Ophthalmology. 113 (10), e1691-e1615 (2006).
- Zhao, L. Q., Zhu, H., Zhao, P. Q., Hu, Y. Q. A systematic review and meta-analysis of clinical outcomes of vitrectomy with or without intravitreal bevacizumab pretreatment for severe diabetic retinopathy. The British Journal of Ophthalmology. 95 (9), 1216-1222 (2011).
- Carrion, B., Janson, I. A., Kong, Y. P., Putnam, A. J. A safe and efficient method to retrieve mesenchymal stem cells from three-dimensional fibrin gels. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (3), 252-263 (2014).
