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Medicine

प्रफलन मधुमेह रेटिनोपैथी में Fibrovascular जटिलताओं के लिए एक पूर्व Vivo ऊतक संस्कृति मॉडल

Published: January 25, 2019 doi: 10.3791/59090
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,3
1Research Programs Unit, Genome-Scale Biology, Biomedicum Helsinki, University of Helsinki, 2Unit of Vitreoretinal Surgery, Ophthalmology, University of Helsinki and Helsinki University Hospital, 3Department of Microbiology, Tumor, and Cell Biology (MTC), Karolinska Institutet

Summary

यहां, हम तीन आयामी देशी ऊतक लक्षण वर्णन और पूर्व vivo संस्कृति के लिए रोगी-व्युत्पंन, शल्य चिकित्सा-उत्पाद, fibrovascular ऊतकों का उपयोग करके प्रफलन मधुमेह रेटिनोपैथी के pathophysiology का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । यह पूर्व vivo संस्कृति मॉडल भी परीक्षण या नए उपचार के विकास के लिए उत्तरदायी है ।

Abstract

डायबिटिक रेटिनोपैथी (DR) मधुमेह की सबसे आम microvascular जटिलता और कार्य-आयु वयस्कों में अंधापन के प्रमुख कारणों में से एक है । मधुमेह और ऑक्सीजन प्रेरित रेटिनोपैथी के कोई वर्तमान पशु मॉडल पूर्ण रेंज प्रगतिशील परिवर्तन मानव प्रफलन मधुमेह रेटिनोपैथी (पीडीआर) में प्रकट विकसित । इसलिए, रोग रोगजनन और pathophysiology की समझ काफी हद तक शामिल रोगजनक कारकों पर स्थिर राज्य की जानकारी प्रदान करते है कि दृष्टिकोण में ऊतकवैज्ञानिक वर्गों और अवलेह नमूनों के उपयोग पर भरोसा किया है । बढ़ते सबूत इंगित करता है कि गतिशील सेल-सेल और सेल-extracellular मैट्रिक्स (ECM) तीन आयामी (3 डी) microenvironments के संदर्भ में बातचीत नए के विकास के प्रति यंत्रवत और कार्यात्मक अध्ययन के लिए आवश्यक हैं उपचार रणनीतियों । इसलिए, हम कल्पना की है कि रोग fibrovascular ऊतक शल्य चिकित्सा पीडीआर के साथ आंखों से उत्पाद के लिए मज़बूती से सेलुलर और इस विनाशकारी बीमारी के आणविक तंत्र को जानने के लिए और उपंयास नैदानिक के लिए क्षमता का परीक्षण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है हस्तक्षेप. इस अंत की ओर, हम शल्य चिकित्सा-उत्पादेड रोगी-व्युत्पंन fibrovascular ऊतक (फुट), जो मानव पीडीआर pathophysiology के एक प्रासंगिक मॉडल के रूप में काम करेंगे के 3 डी पूर्व vivo संस्कृति के लिए एक उपंयास विधि विकसित की है । FTs explants में विच्छेदित कर रहे है और पूर्व vivo संस्कृति और 3 डी लक्षण वर्णन के लिए फाइब्रिन मैट्रिक्स में एंबेडेड । पूरे-देशी FTs और अंत बिंदु संस्कृतियों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस माउंट ऊतक संरचना और कोशिकीय प्रक्रियाओं की पूरी तरह से जांच की अनुमति देता है, के प्रासंगिक सुविधाओं को उजागर करने के लिए 3 डी ऊतक स्तर के लक्षण वर्णन के महत्व पर प्रकाश डाला पीडीआर pathophysiology. यह मॉडल पीडीआर टिशू आर्किटेक्चर और microenvironment के भीतर गतिशील जैव रासायनिक और शारीरिक बातचीत के जटिल संदर्भ में आणविक तंत्र, सेलुलर/ऊतक प्रक्रियाओं और उपचार प्रतिक्रियाओं के एक साथ मूल्यांकन की अनुमति देगा । इस मॉडल recapitulates पीडीआर pathophysiology के बाद से, यह भी परीक्षण या नए उपचार के विकास के लिए उत्तरदायी होगा.

Introduction

डॉ मधुमेह की एक गंभीर नेत्र जटिलता, एक रोग है कि पिछले तीन दशकों में भारी अनुपात तक पहुंच गया है1। निदान के बाद बीस साल, प्रकार के साथ लगभग हर रोगी 1 मधुमेह और प्रकार के साथ रोगियों के ६०% 2 मधुमेह रेटिनोपैथी के संकेत मौजूद, वयस्कों2काम कर रहे उम्र में अंधापन के प्रमुख कारणों में से एक से प्रति मधुमेह बना. microvascular अध कि और कोरोनरी क्षति के स्तर के अनुसार, डॉ गैर में वर्गीकृत है प्रफलन डॉ (गैर पीडीआर) और प्रफलन डॉ (पीडीआर) । अंत चरण रोग, पीडीआर, ischemia की विशेषता है-और सूजन प्रेरित neovascularization और vitreoretinal अंतरफलक पर fibrotic प्रतिक्रियाओं । अनुपचारित स्थितियों में, इन प्रक्रियाओं अवलेह नकसीर, रेटिना फाइब्रोसिस, कर्षण रेटिना टुकड़ी, और neovascular मोतियाबिंद3,4के कारण अंधापन को बढ़ावा मिलेगा । हाल के अग्रिमों के बावजूद, वर्तमान उपचार विकल्प लक्ष्य केवल डॉ चरणों, मधुमेह धब्बेदार शोफ और पीडीआर सहित, जब रेटिना क्षति पहले से ही लागू किया गया है. इसके अलावा, डॉ रोगियों का एक बड़ा अनुपात वर्तमान उपचार armamentarium से लाभ नहीं है, बेहतर चिकित्सा के लिए एक तत्काल जरूरत का संकेत4,5,6.

कई अंय in vivo रोग/विकास मॉडल और मधुमेह पशु मॉडल तिथि करने के लिए विकसित किया गया है, लेकिन उनमें से कोई भी मानव पीडीआर7,8में मनाया रोग सुविधाओं की पूरी श्रृंखला recapitulates । इसके अलावा, बढ़ती सबूत इंगित करता है कि उपचार प्रतिक्रियाओं कसकर ECM संरचना के साथ ही स्थानिक व्यवस्था और सेलुलर और acellular microenvironment9के बीच बातचीत से जुड़े हुए हैं । हम, इसलिए, बाहर सेट एफटी रोग सामग्री है कि सामांयतः पीडीआर10के शल्य चिकित्सा प्रबंधन के भाग के रूप में vitrectomy से गुजर रही आंखों से उत्पाद का उपयोग करके मानव पीडीआर के एक नैदानिक प्रासंगिक मॉडल विकसित करने के लिए ।

इस पांडुलिपि 3 डी पूर्व vivo संस्कृति और शल्य चिकित्सा-उत्पादत्मक, पीडीआर रोगी के लक्षण वर्णन-रोग फुट व्युत्पंन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है । विधि यहां वर्णित एक हाल ही में प्रकाशन है कि देशी 3 डी पीडीआर ऊतक परिदृश्य के सफल निर्माण का प्रदर्शन किया है, और angiogenic और fibrotic प्रतिक्रियाओं सहित पीडीआर pathophysiology की सुविधाओं के recapitulation में इस्तेमाल किया गया है असामांय संवहनी संरचनाओं11. इस मॉडल में भी उपंयास सुविधाओं है कि आसानी से पतले ऊतकवैज्ञानिक वर्गों, जैसे स्थानिक सीमित apoptosis और प्रसार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संवहनी टाप गठन11से सराहना नहीं किया जा सकता है पता चला । अवलेह द्रव सफलतापूर्वक 3 डी endothelial अंडाकार आकृति संस्कृतियों पर दूसरों के द्वारा प्रयोग किया गया है अपनी angiogenic क्षमता और angiostatic अणुओं की प्रभावकारिता का मूल्यांकन12। जब इन विट्रो 3 डी लसीका endothelial सेल (LEC) अंडाकार आकृति अंकुरण पीडीआर अवलेह उत्तेजक के रूप में प्रयोग परख के साथ संयुक्त, हमारे मॉडल के रूप में vitreal ऊतक के भीतर दोनों घुलनशील neovascular कारकों के रूप में अच्छी तरह से स्थानीय cues के योगदान से पता चला अभी तक खराब पीडीआर pathophysiology3,11में LEC भागीदारी समझ में आया । पीडीआर के प्रबंधन में, vitreoretinal सर्जरी एक नियमित रूप से अभी तक चुनौतीपूर्ण प्रक्रिया का प्रदर्शन किया है । शल्य चिकित्सा उपकरणों और तकनीक के रूप में सतत प्रगति और परिष्कार देख रहे हैं, fibrovascular प्रफलन नमूना के समय पर और रूढ़िवादी हटाने न केवल दृष्टि परिणाम में सुधार, लेकिन यह भी के लिए अमूल्य ऊतक सामग्री प्रदान करता है लाइव मानव ऊतक microenvironment के जटिल शोधों के पहलुओं में पीडीआर pathophysiology और उपचार प्रतिक्रियाओं की जांच ।

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Protocol

इस शोध को हेलसिंकी विश्वविद्यालय अस्पताल की संस्थागत समीक्षा बोर्ड और एथिकल कमेटी ने मंजूरी दी थी । हस्ताक्षरित सूचित सहमति प्रत्येक रोगी से प्राप्त की गई थी ।

1. समाधान, मीडिया और उपकरणों की तैयारी

  1. तेजी से प्रसंस्करण सुनिश्चित करने के लिए fibrovascular ऊतक (फुट) के संग्रह से पहले निम्नलिखित उपकरण तैयार करें ।
    1. बाँझो-आटोक्लेव दोन microdissection चिमटी.
    2. 1 पूर्व तौला पंजाबियों गोली (०.१४ मीटर NaCl, ०.००२७ मीटर KCl, ०.०१० एम पो4-3) भंग करके 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) तैयार करें और भंग करने के लिए हलचल... पानी की मात्रा को 1 L तक समायोजित करें और बाँझ-आटोक्लेव तैयार समाधान करें । RT पर स्टोर.
    3. एक टोकरी में उपर्युक्त समाधान और उपकरण इकट्ठा, एक साथ एक उपयोग बाँझ स्केलपेल, एक बाँझ 6 मुख्यमंत्री सेल संस्कृति पकवान और पांच बाँझ 12-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों.
  2. एक 6 मिलीग्राम/एमएल फाइब्रिनोजेन समाधान हैंक्स संतुलित नमक समाधान (HBSS) में plasminogen-घट मानव फाइब्रिनोजेन के 30 मिलीग्राम HBSS के 5 मिलीलीटर में भंग करके, एक ५० मिलीलीटर ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक जल स्नान में डूबे ट्यूब का उपयोग कर, के लिए कम से 1 ज ।
    नोट: इस समाधान का उपयोग करने से पहले पानी के स्नान (३७ डिग्री सेल्सियस) 7 घंटे (अधिकतम 10 घंटे) के लिए रखा जा सकता है ।
  3. 5% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) या 5% मानव सीरम, ०.४% endothelial सेल विकास अनुपूरक, 10 एनजी/एमएल रिकॉमबिनेंट मानव एपिडर्मल वृद्धि कारक, 1 μg/एमएल hydrocortisone, और ५० μg/एमएल गेन्तमयसीं से जोड़कर पूर्व vivo संस्कृति माध्यम तैयार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध endothelial सेल विकास मध्यम और ३७ डिग्री सेल्सियस पर पानी स्नान में रखने के लिए उपयोग जब तक । एक महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।

2. Fibrovascular ऊतक विच्छेदन

  1. fibrovascular ऊतक (फुट) है कि मानव ट्रांस नेत्रश्लेष्मला microincision vitreoretinal सर्जरी से गुजर रहा है, 23 या 20 गेज तीन पोर्ट pars प्लाना vitrectomy vitreoretinal के पीडीआर शल्य चिकित्सा प्रबंधन के भाग के रूप में से किया गया है उत्पाद ले लीजिए ।
    नोट: एफटी विभाजन और फाड़ना, कटौती का उपयोग कर अगर microscissors के साथ की जरूरत है, और अनुभवी vitreoretinal सर्जन द्वारा intraocular अंत मनोरंजक microforceps के साथ अवलेह गुहा से हटा दिया है । चरम देखभाल की जरूरत है, जहां रोग neovascular ऊतक सबसे अधिक स्थित है ऑप्टिक तंत्रिका या लौकिक संवहनी आर्केड सहित नेत्र संरचनाओं को नुकसान के कारण के बिना बरकरार, नुकसान फुट को दूर ले जाया जाएगा । उत्पाद के ऊतकों के आकार चर, आमतौर पर 3 और ५० mm2के बीच लेकर है ।
  2. एक 6 सेमी सेल संस्कृति पकवान या १.५ मिलीलीटर में गीला बर्फ पर रखा बाँझ पंजाबियों की 1 मिलीलीटर युक्त ट्यूब में फुट रखें, और यह प्रसंस्करण के लिए अनुसंधान प्रयोगशाला के लिए तुरंत स्थानांतरण.
    नोट: यह आवश्यक है कि अनुसंधान इकाई (लैब सुविधाएं) शारीरिक रूप से अस्पताल के ऑपरेटिंग कमरे के लिए बंद कर रहे है (या) छोटे उत्पादेड फुट के हस्तांतरण समय को कम करने के लिए । इस मामले में स्थानांतरण से कम 5 मिनट लगते है और explants फाइब्रिन के भीतर आमतौर पर 1-१.५ ज में (अधिकतम 2 ज) सर्जिकल हटाने के बाद एंबेडेड रहे हैं । 3d संस्कृति पर अब स्थानांतरण समय के प्रभाव का परीक्षण करने की आवश्यकता होगी ।
  3. कमरे के तापमान (आरटी, 25 डिग्री सेल्सियस) में पंजाब के 1 मिलीलीटर युक्त एक 6-मुख्यमंत्री सेल संस्कृति डिश में एफटी रखें और एक 5x उद्देश्य के साथ एक औंधा epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर ऊतक की छवियों को प्राप्त ।
    नोट: छवियां गुणात्मक मूल्यांकन और दस्तावेज़ीकरण के लिए अधिग्रहीत की जाती हैं । यह ऊतक के आकार, घनत्व और सामांय संरचना (जैसे, संवहनी संरचनाओं) का निरीक्षण करने के लिए संभव हो जाएगा ।
  4. एक ईमानदार विच्छेदन stereomicroscope के तहत ~ 1 मिमी2 टुकड़ों में फुट कट, एक बाँझ स्केलपेल और microdissection चिमटी का उपयोग कर । ऊतक पकड़ो, अच्छी तरह से पंजाब में जलमग्न, जगह में एक microdissection नोचना का उपयोग कर, और एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग कर स्पष्ट कटौती प्रदर्शन. फुट फाड़ से बचें, के रूप में यह मूल fibrovascular संरचनाओं को बदल जाएगा ।
  5. एक 12-अच्छी तरह से सेल संस्कृति बाँझ पंजाबियों की 1 मिलीलीटर युक्त थाली की एक अच्छी तरह से प्रत्येक टुकड़ा प्लेस ।
    नोट: यदि आवश्यक हो, धीरे प्लेट पर पैर फैला, microdissection चिमटी का उपयोग कर, कटौती प्रदर्शन करने से पहले.

3. देशी फुट और पूर्व Vivo संस्कृति के लक्षण वर्णन के लिए कास्टिंग ईमानदार फाइब्रिन जेल बूंदों

  1. बाँझ-फ़िल्टर तैयार फाइब्रिनोजेन समाधान एक ०.२२ माइक्रोन फिल्टर के साथ कदम १.२ में तैयार एक 10 मिलीलीटर सिरिंज में घुड़सवार.
  2. फाइब्रिनोजेन समाधान (25 μL प्रति १.५ मिलीलीटर ट्यूब) के aliquots तैयार करें और RT पर रखें. फाइब्रिन जेल के लिए एक aliquot तैयार/हर फुट टुकड़ा विच्छेदन के बाद प्राप्त की, और aliquots जेल गठन के परीक्षण के लिए अतिरिक्त फाइब्रिन के एक जोड़े ।
  3. HBSS के 4 इकाइयों/thrombin और ४०० μg/एमएल के aprotinin, इसके बाद टा समाधान कहा जाता है की एक समाधान तैयार है, और आर टी पर रखने के रूप में बहुत टा समाधान की जरूरत के आधार पर, विच्छेदन के बाद प्राप्त टुकड़े की संख्या पर निरभर है (25 टा समाधान के μL प्रत्येक के लिए प्रयोग किया जाता है FT/फाइब्रिन जेल), और एक अतिरिक्त राशि (जैसे, २५० μL) फाइब्रिन जेल गठन के परीक्षण के लिए और यह सुनिश्चित करना है कि पर्याप्त समाधान फाइब्रिन जेल बूंदों के कास्टिंग के दौरान उपलब्ध है ।
    नोट: Thrombin फाइब्रिन बहुलकीकरण के लिए आवश्यक है, जबकि aprotinin फाइब्रिन13,14द्वारा व्यक्त सेलुलर छेड़ने से FTs जेल के क्षरण को रोकने के लिए जोड़ा गया है ।
  4. फाइब्रिन जेल गठन के समय का परीक्षण: aliquoted 25 μL फाइब्रिनोजेन चरण ३.२ में तैयार समाधान के लिए टा समाधान के 25 μL जोड़ें और, ५० पिपेट के लिए एक और μL सेट का उपयोग कर, pipetting द्वारा ट्यूब में मिश्रण और एक 6 सेमी सेल संस्कृति डिश में बांटना , एक ईमानदार छोटी बूंद बनाने ।
    नोट: फाइब्रिन जेल गठन ~ 1 मिनट में जगह ले जाना चाहिए । यदि यह १.५ मिनट से अधिक लेता है, तो चरण ३.३ में तैयार टा समाधान में thrombin की एकाग्रता अधिक thrombin स्टॉक समाधान जोड़कर बढ़ाया जा सकता है । फाइब्रिन जेल गठन १.५ मिनट के भीतर होता है जब तक thrombin स्टॉक समाधान की प्रारंभिक रूप से प्रयुक्त मात्रा में से एक दसवें, जोड़ा जा सकता है । फाइब्रिन जेल गठन के समय संस्कृति की तीन आयामीता के लिए महत्वपूर्ण है, त्वरित जेल गठन के रूप में (१.५ मिनट के भीतर) फाइब्रिन जेल के नीचे करने के लिए डूब से एफटी टुकड़ा रोकता है, और इस प्रकार सेल के 2d प्लास्टिक की सतह के साथ संपर्क में आ संस्कृति प्लेट, जो 2d सेल आसंजन और वृद्धि करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
  5. एक के केंद्र में एक फीट टुकड़ा प्लेस 24 अच्छी तरह से एक बाँझ नोचना का उपयोग कर प्लेट और एक 0.5-10 μL पिपेट के साथ pipetting द्वारा किसी भी अतिरिक्त पंजाबियों को हटाने के लिए फुट पर चूषण बल से बचने के लिए । मामले में ऊतक नोचना करने के लिए चिपक जाती है, एक अतिरिक्त नोचना का उपयोग करने के लिए थाली पर ऊतक टुकड़ा के स्थान सहायता ।
    नोट: FT/फाइब्रिन जैल भी ४८ पर डाली जा सकता है-अच्छी तरह से प्लेट रिएजेंट के उपयोग को कम करने के लिए । हालांकि, यह अधिक चुनौतीपूर्ण है के रूप में अंतरिक्ष और अधिक सीमित है और फाइब्रिन फैल जाएगा अगर यह अच्छी तरह से दीवार के साथ संपर्क में आता है ।
  6. 25 μL टा समाधान के 25 μL फाइब्रिनोजेन समाधान aliquoted चरण ३.२ में जोड़ें, और पिपेट द्वारा ट्यूब में ५० μL मिश्रण करने के लिए एक और pipetting सेट का उपयोग कर । थाली पर रखा फुट टुकड़ा पर वितरण अच्छी तरह से, और ऊपर और नीचे 2-3 बार पिपेट के लिए ईमानदार छोटी बूंद के भीतर फुट टुकड़ा शामिल करने के लिए, फुट के लिए एक 3 डी मैट्रिक्स आसपास उपलब्ध कराने के ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि एफटी pipetting के दौरान aspirated नहीं है और है कि कोई हवा बुलबुले का गठन कर रहे हैं । यह भी सुनिश्चित करें कि मिश्रण, औषधालय और pipetting जल्दी प्रदर्शन कर रहे है के रूप में फाइब्रिन जेल १.५ मिनट के भीतर फार्म जाएगा, के रूप में ३.४ कदम में परीक्षण किया । अगर ४८-well प्लेट पर फाइब्रिन जैल कास्टिंग, फाइब्रिनोजेन समाधान और टा समाधान के 20 μL के बजाय 20 μL का उपयोग करें ।
  7. चरण ३.५ और ३.६ सभी FT टुकड़ों के लिए दोहराएँ ।
  8. फाइब्रिन जैल 5% CO2के साथ एक humidified वातावरण में ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक सेल संस्कृति मशीन में प्लेटें मशीन द्वारा जमना के लिए अनुमति दें ।
  9. 0.5-1 एच के बाद, जांच करें कि फाइब्रिन जेल पूरी तरह से ध्यान से झुका प्लेट के द्वारा बनाई गई है । ३.१० कदम के लिए आगे बढ़ना जब जेल प्लेट झुका है के रूप में कदम नहीं है, यह दर्शाता है कि फाइब्रिन जेल गठन पूरा हो गया है ।
  10. पूर्व विवो संस्कृति माध्यम के साथ एफटी/फाइब्रिन जैल ओवरले (६०० μL/अच्छी तरह से 24-वेल प्लेट में या ३०० μL/अच्छी तरह से थाली में) १०० μg/एमएल aprotinin के साथ पूरक । पिपेट मध्यम धीरे से छोड़ वार औषधालय द्वारा ।
    नोट: यहां, aprotinin सेलुलर FTs13,14द्वारा व्यक्त की teases द्वारा फाइब्रिन जेल के क्षरण को रोकने के लिए प्रयोग किया जाता है । पूर्व vivo संस्कृति माध्यम इसके अतिरिक्त VEGFA, VEGFC, bFGF, TGFβ के रूप में रिकॉमबिनेंट वृद्धि कारकों, के साथ पूरक हो सकते हैं ( सामग्री की तालिकादेखें)11.
  11. ३७ ° c, 5% सह2 सेल संस्कृति मशीन और संस्कृति में वांछित समय अवधि के लिए (जैसे, 2-18 दिन, अब संस्कृति समय परीक्षण किया जाना चाहिए) के लिए एफटी पूर्व vivo संस्कृति थाली प्लेस । ताजा पूर्व vivo संस्कृति माध्यम के साथ मध्यम के ५०% हर तीन दिन बदलें ।

4. "मैट्रिक्स" इमेजिंग में

  1. एक ही दिन (दिन 0) और सेट अंतराल पर (उदाहरण के लिए, हर दूसरे दिन), एक औंधा epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, 3 डी विकास का पालन करने के लिए पर एफटी के पूर्व vivo संस्कृतियों की छवियों को प्राप्त करें ।
    नोट: प्राप्त छवियों explant11भर में दो सीधा व्यास की कुल लंबाई के रूप में एफटी के ठहराव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

5. देशी फुट और पूर्व Vivo कल्चर एंड-पॉइंट

नोट: एफटी/फाइब्रिन जैल के लिए वांछित समय अवधि के लिए पूर्व vivo किया जा सकता है (एफटी पूर्व vivo संस्कृतियों) या एक ही दिन पर फिक्स्ड देशी फुट लक्षण वर्णन11के लिए (मूल फुट) ।

  1. के साथ संस्कृति माध्यम की जगह से मूल फुट या एफटी ex vivo संस्कृतियों फिक्स 4% paraformaldehyde के पंजाबियों समाधान में 1 ज के लिए, आर टी देशी FT/फाइब्रिन जैल के लिए, पूर्व vivo संस्कृति माध्यम के अलावा 0.5-1 ज फिक्स (यदि फाइब्रिन जैल मध्यम में भिगोया नहीं गया है, तो निर्धारण उंहें नुकसान होगा) ।
    नोट: paraformaldehyde संक्षारक, विषाक्त और यलो है के रूप में धुएं डाकू में इस कदम का प्रदर्शन ।
  2. पंजाब में तीन 5 मिनट धोने के साथ एफटी/फाइब्रिन जैल कुल्ला (2 मिलीलीटर/
  3. ०.०२% सोडियम azide युक्त पंजाबियों के 2 मिलीलीटर/के साथ पंजाबियों की जगह और आगे प्रसंस्करण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर फिक्स्ड फाइब्रिन जैल की दुकान । तेल फिल्म के साथ प्लेटें सील सुनिश्चित करने के लिए कि एफटी/फाइब्रिन जैल भंडारण में सूखी नहीं है ।
    नोट: सोडियम azide विषाक्त है के रूप में धुएं डाकू में इस कदम का प्रदर्शन ।

6. पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

नोट: इस प्रोटोकॉल 5 दिनों तक रहता है और रात भर की गर्मी जहां संकेत के साथ बाधित किया जा सकता है । फाइब्रिन जैल को किसी भी बिंदु पर सूखने न दें । सभी कदम आरटी पर प्रदर्शन किया जब तक अंयथा संकेत दिया जाता है ।

  1. धुंधला प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले निंन समाधान तैयार करें ।
    1. पद निर्धारण समाधान: तैयार करें 50:50 एसीटोन: एसीटोन और मेथनॉल (जैसे, ५० मिलीलीटर) के बराबर मात्रा में मिलाकर मेथनॉल समाधान । -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । इस समाधान को धुंधला होने से पहले दिन पर नवीनतम तैयार करें । यह समाधान-20 डिग्री सेल्सियस पर वापस संग्रहीत किया जा सकता है और बाद में दाग के लिए इस्तेमाल किया जा ।
      नोट: एसीटोन और मेथनॉल के रूप में धुएं डाकू में इस समाधान तैयार ज्वलनशील और स्वास्थ्य के लिए खतरनाक हैं ।
    2. समाधान अवरुद्ध: एक 15% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), ०.३% octyl phenol ethoxylate पहले पंजाबियों को 15% FBS जोड़ने के द्वारा पंजाब में समाधान तैयार करते हैं । octyl phenol ethoxylate और हलचल को भंग करने के लिए जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
      नोट: यह समाधान अग्रिम में बड़ी राशि में तैयार किया जा सकता है, 15 मिलीलीटर aliquotes में संग्रहित-20 डिग्री सेल्सियस और उपयोग से पहले गल, दिन पर जब धुंधला प्रोटोकॉल शुरू कर दिया है । प्रत्येक दाग प्रोटोकॉल के लिए एक नए सिरे से तैयार या हौसले से गल aliquote का प्रयोग करें ।
    3. धुलाई समाधान: ०.४५% के साथ अनुपूरक के 1 एल के पूरक तैयार करें octyl phenol ethoxylate ने octyl phenol ethoxylate के ४.५ मिलीलीटर को जोड़कर पंजाब के ९९५.५ मिलीलीटर. हलचल भंग करने के लिए । RT पर स्टोर.
  2. एक स्टेनलेस स्टील वर्ग का उपयोग कर प्लेट से ध्यान से बूंदों लिफ्ट-धार रंग । केंद्र उठाने से पहले किनारों से पहले छोटी बूंद को अलग करें, और 12-पंजाब के 1 मिलीलीटर की अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से स्थानांतरण ।
    नोट: इस प्लेट प्रारूप में पोस्ट-निर्धारण, बहाकर और अवरुद्ध कदम प्रदर्शन करते हैं ।
  3. पोस्ट-फिक्स के साथ बूंदों बर्फ की 1 मिलीलीटर-ठंड 50:50 एसीटोन: मेथनॉल समाधान के लिए ~ 1 मिनट (बूंदों की सीमा सफेद हो जाएगा) ।
    नोट: एसीटोन और मेथनॉल के रूप में धुएं डाकू में इस कदम प्रदर्शन स्वास्थ्य के लिए खतरनाक हैं ।
  4. पंजाब के 2 मिलीलीटर में 3-5 बहाकर (बूंदों के साथ कुल्ला जब निर्जलीकरण पूरा हो गया है पंजाब के समाधान में डूब जाएगा) ।
    नोट: के रूप में पिपेट टिप के साथ बूंदों को छूने से बचें, पद-निर्धारण के बाद, वे प्लास्टिक के लिए चिपचिपा रहे हैं । प्रोटोकॉल के दौरान, aspirating पोस्ट-फिक्स, एंटीबॉडी, अवरुद्ध और चूषण द्वारा समाधान धोने से बचने के लिए, के रूप में यह नुकसान या पूरी तरह से बूंदों को नष्ट कर सकते हैं । इसके बजाय, प्लेट झुकाएं और ध्यान से एक 500-5000 μL पिपेट का उपयोग करके समाधान निकालें ।
  5. मलबे को हटाने के लिए २१,००० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए अवरुद्ध समाधान केंद्रापसारक ।
    नोट: समाधान १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में aliquoted जा सकता है केंद्रापसारक के लिए । अप्रयुक्त समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है और सभी प्रासंगिक बाद के चरणों के लिए इस्तेमाल किया ।
  6. ५०० μL में बूंदें आर टी 2 के लिए समाधान अवरुद्ध में मशीन ।
    नोट: उपयोग अवरुद्ध समाधान की मात्रा को कम करने के लिए, थाली एक समर्थन पर झुका जा सकता है और समाधान के रूप में कम के रूप में ३०० μL/
  7. समाधान को अवरुद्ध करने में उचित कमजोर पड़ने पर प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण (ंयूनतम 30 μL/छोटी बूंद) तैयार करें और २१,००० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
  8. एक दौर धार रंग का उपयोग करके गोल (यू)-नीचे ९६-अच्छी तरह से थाली में बूंदों स्थानांतरण, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण की कम से कम 30 μL/
  9. अगले दिन पर, 12-अच्छी तरह से धोने के समाधान के 2 मिलीलीटर की थाली में बूंदों हस्तांतरण/ठीक है, तीन 5 मिनट के साथ कुल्ला पहले और फिर ९ ३० मिनट बहाकर के साथ । पिछले धो (2 मिलीलीटर) 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात छोड़ दें ।
  10. अगले दिन, पंजाबियों के साथ तीन बार कुल्ला और गोल (यू)-नीचे ९६-अच्छी तरह से थाली में बूंदों हस्तांतरण ।
  11. धोने के दौरान, उपयुक्त fluorophore-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण तैयार (पतला 1:500, कम से कम 30 μL/छोटी बूंद) समाधान अवरुद्ध में और 15 मिनट के लिए २१,००० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक ।
  12. एक दौर में बूंदों स्थानांतरण (यू)-नीचे ९६-अच्छी तरह से प्लेट एक दौर का उपयोग करके रंग धार और माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण के कम से 30 μL के साथ गर्मी, आरटी पर 4 एच के लिए, प्रकाश से रक्षा की ।
    नोट: सभी बाद की मशीन और धुलाई प्रकाश से सुरक्षित कदम प्रदर्शन करते हैं ।
  13. 12-अच्छी तरह से धोने समाधान के 2 मिलीलीटर युक्त प्लेट में बूंदों स्थानांतरण/अच्छी तरह से एक दौर धार रंग का उपयोग कर, तीन 5 मिनट के साथ कुल्ला पहले और फिर ४ ३० मिनट बहाकर साथ धो । पिछले धो (2 मिलीलीटर) 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात छोड़ दें ।
  14. अगले दिन, ५ ३० मिनट धोने के साथ जैल कुल्ला और फिर तीन बार पंजाबियों के साथ । पिछले धो (2 मिलीलीटर) 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात छोड़ दें ।
  15. अगले दिन पर, एक दौर (यू)-नीचे ९६-अच्छी प्लेट में एक गोल धार रंग और counterstain नाभिक के साथ 10 μg/एमएल Hoechst परमाणु दाग के साथ मशीन द्वारा और 30 मिनट के लिए RT पर (कम से कम 30 μL/
    नोट: बढ़ते मध्यम नाभिक counterstaining के लिए 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के साथ पूरक वैकल्पिक रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है । जिस स्थिति में, यह चरण और चरण ६.१६ छोड़ दिया है, सीधे चरण ६.१७ पर आगे बढ़ने ।
  16. 12-पंजाब के 2 मिलीलीटर युक्त प्लेट में बूंदों हस्तांतरण/अच्छी तरह से एक गोल धार रंग का उपयोग कर और तीन बार पंजाबियों के साथ कुल्ला ।
  17. इस प्रकार के रूप में माइक्रोस्कोप स्लाइड पर बूंदों माउंट:
    1. एक वर्ग के आकार का 22 मिमी x 22 मिमी coverglass के किनारों पर त्वरित सख्त बढ़ते माध्यम की एक संकीर्ण परत लागू करें और ~ 1 मिनट के लिए सूखी चलो । प्रत्येक ड्रॉप के लिए यह कदम व्यक्तिगत रूप से, बढ़ते माध्यम के अत्यधिक कठोर से बचने के लिए करते हैं ।
      नोट: जल्दी सख्त बढ़ते मध्यम स्वास्थ्य के लिए खतरनाक है के रूप में धुएं हुड में इस कदम का प्रदर्शन ।
    2. एक 12-अच्छी तरह से एक खुर्दबीन स्लाइड पर पानी और हस्तांतरण के 2 मिलीलीटर युक्त थाली के एक कुआं में सूई से छोटी बूंद कुल्ला, एक गोल धार रंग का उपयोग कर । शोषक कागज का एक छोटा सा टुकड़ा का उपयोग करके अतिरिक्त पानी निकालें ।
    3. 15 μL गैर-सख्त antifade के माध्यम से छोटी बूंद पर बढ़ते मध्यम वितरण ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, यदि Hoechst नाभिकीय दाग का उपयोग नहीं किया गया है, बढ़ते मध्यम जिसमें 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) का उपयोग किया जा सकता है ।
    4. धीरे से कवर कांच की स्थिति, जल्दी से सख्त बढ़ते सूक्ष्म स्लाइड का सामना करना पड़ मध्यम, छोटी बूंद पर और चलो बसा के साथ ।
      नोट: त्वरित सख्त माध्यम सूक्ष्म स्लाइड करने के लिए छड़ी और जगह में छोटी बूंद रखना होगा ।
  18. सभी बूंदों के लिए ६.१७ चरण को दोहराएं । प्रत्येक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर दो बूंदें माउंट ।
  19. स्लाइडो को हवा-सूखे के लिए आर टी में ~ 2 एच और स्टोर 4 ° c रात भर में चलो । सुनिश्चित करें कि स्लाइड्स क्षैतिज रूप से और प्रकाश से सुरक्षित हैं ।
  20. छवि सना हुआ देशी या अंत बिंदु फुट पूर्व vivo एक फोकल माइक्रोस्कोप या एक ईमानदार epifluorescence माइक्रोस्कोप एक ऑप्टिकल अनुभाग समारोह और 20x या 40x उद्देश्य से सुसज्जित का उपयोग कर संस्कृतियों । एक बार में ऊतक के एक अधिक क्षेत्र पर कब्जा करने के लिए टाइल समारोह का प्रयोग करें ।

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Representative Results

पीडीआर fibrovascular ऊतक गुणों और प्रोटीन अभिव्यक्ति की गहरी समझ अवलेह नमूनों और पतली ऊतकवैज्ञानिक फुट वर्गों3,15,16,17पर मुख्य रूप से भरोसा किया है । 3 डी ऊतक संगठन और पीडीआर के कोशिकीय physiopathological प्रक्रियाओं की पूरी तरह से जांच के लिए एक विधि विकसित करने के लिए, हम 3 डी लक्षण और पूर्व vivo संस्कृति के लिए शल्य चिकित्सा उत्पादत्मक, रोगी-व्युत्पन्न रोग FTs का उपयोग करने के लिए बाहर सेट. ताजा FTs अनुसंधान प्रयोगशाला में स्थानांतरित कर रहे है और चित्र 1में योजनाबद्ध कार्यप्रवाह में सचित्र के रूप में संसाधित ।

FTs गुणात्मक मूल्यांकन और प्रलेखन (चित्रा 2) के लिए विच्छेदन से पहले छवि हो सकता है । चित्रा 2में दिखाया गया है, FTs आकार, घनत्व और संवहनी संरचनाओं की बहुतायत में महान अंतर रोगी भिन्नता प्रदर्शित करते हैं । कुछ ऊतकों में, ढीली कोशिकाओं, संभवतः भड़काऊ/प्रतिरक्षा कोशिकाओं या लाल रक्त कोशिकाओं, साथ ही साथ अलग कैलिबर की प्रवेशक संवहनी संरचनाओं को भी आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है (चित्रा 2) । विच्छेदन के बाद, एक निर्णय प्राप्त explants की सीमित संख्या के बहाव के उपयोग पर किए जाने की जरूरत है । explants का एक हिस्सा फाइब्रिन मैट्रिक्स के भीतर एंबेडेड और फाइब्रिन जेल गठन के बाद तय है, जबकि शेष explants एक अलग थाली (चित्रा 1) पर पूर्व vivo संस्कृति के अधीन किया जा सकता है । ताजा FTs भी सफलतापूर्वक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा ultrastructural लक्षण वर्णन के लिए उपयोग किया गया है । नमूनों या तो ultrathin वर्गों के पारंपरिक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) के लिए या सीरियल ब्लॉक चेहरा स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SBF-SEM)3,11के लिए संसाधित किया जा सकता है ।

फिक्स्ड फाइब्रिन जैल कई हफ्तों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है और पूरे से सना हुआ-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस18,19। सना हुआ नमूने इसी तरह स्थिर जब अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत कर रहे हैं । मोटी एफटी/फाइब्रिन जैल समय कुशलतापूर्वक epifluorescence माइक्रोस्कोप के साथ एक ऑप्टिकल अनुभाग समारोह से सुसज्जित किया जा सकता है, बिखरे हुए आउट-ऑफ-फोकस प्रकाश को हटाने के लिए उपयोगी है । इस विधि के साथ इमेजिंग संरचनाओं के ठीक दृश्य प्रदान करता है । वैकल्पिक रूप से, फोकल माइक्रोस्कोपी, हालांकि अधिक समय की मांग, बेहतर विवरण के कब्जा की अनुमति दे सकते हैं । ताजा फाइब्रिन के लक्षण वर्णन-एंबेडेड और तय, uncultureed, पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा देशी FTs संवहनी संरचनाओं के लक्षण वर्णन की अनुमति देता है, एकाधिक सेल प्रकार और 3 डी पीडीआर ऊतक के भीतर उनके पारस्परिक व्यवस्था लैंडस्केप11। उदाहरण के लिए, CD31 एंटीबॉडी को प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता endothelium और NG2 प्रदर्शित करने के लिए pericytes (चित्रा 3) जबकि Lyve1 एंटीबॉडी कल्पना नए लसीका की खोज की तरह endothelial संरचनाओं (चित्रा 4)11. एंटीबॉडी के एकाधिक संयोजन कई संरचनाओं और कोशिका प्रकार की कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ( सामग्री की तालिकादेखें); उदाहरण के लिए, एर्ग भी endothelium, जो असामांय पीडीआर neovasculature में एक discontinuos अभिव्यक्ति पैटर्न है कल्पना कर सकते हैं । संवहनी एक झिल्ली मार्कर के साथ दाग संरचनाओं (जैसे, CD31 और Lyve1) Angiotool, एक मुक्त स्रोत NIH राष्ट्रीय कैंसर संस्थान11द्वारा विकसित सॉफ्टवेयर का उपयोग करके संरक्षण और घनत्व के लिए मात्रात्मक विश्लेषण किया जा सकता है, 20। 3d वॉल्यूम को प्राप्त डेटासेट से भी रेंडर किया जा सकता है ( वीडियो 1देखें). यदि एक एंटीबॉडी पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए उपयुक्त नहीं है, फाइब्रिन बूंदों वैकल्पिक रूप से तेल में एंबेड किया जा सकता है, पतले वर्गों में कटौती और immunohistochemistry द्वारा विश्लेषण । इस मामले में बूंदें रात के निर्धारण से 4 डिग्री सेल्सियस पर के बजाय आर 1 के स्तर पर लाभ ।

पूर्व vivo संस्कृति फाइब्रिन-एंबेडेड FTs के विकास को बनाए रखने, पहले से ही दो दिनों के बाद सेलुलर वृद्धि विकासशील (चित्रा 5) । इन इन विट्रो फाइब्रिन जेल मैट्रिक्स के रूप में प्रयोग किया जाता है के लिए पूर्व विवो संस्कृति, के बाद से यह typifies में vivo अनंतिम ECM, संवहनी रिसाव की साइटों पर सीरम फाइब्रिनोजेन के thrombin दरार के बाद गठित, में नलों पीडीआर neovessels के साथ सीधे संपर्क में सूजन fibrotic वातावरण15,21,22.

पीडीआर एक microvascular एक angiogenic और fibrotic प्रतिक्रिया द्वारा विशेषता जटिलता है, और एफटी explants संस्कृति में इस सेलुलर प्रदर्शनों की एक प्रकार की, साथ ही कुशलता से जवाब exogenous उत्तेजनाओं संस्कृति मीडिया11में जोड़ा । आंकड़ा 6 में प्रतिनिधि डेटा से पता चलता है कि पीडीआर पूर्व vivo संस्कृतियों CD31 के अंकुरण प्रेरित-सकारात्मक endothelium और vasculature संरक्षण VEGFA के जवाब में है, जबकि TGFβ एक fibrotic प्रतिक्रिया प्रेरित पर वृद्धि से परिलक्षित NG2-positive pericytes/SMCs. कई exogenous उत्तेजनाओं का परीक्षण किया जा सकता है और, जब vivo vitreal बहुतायत में उनके माप द्वारा सूचित, करवायी विकसित पीडीआर पूर्व vivo संस्कृति मॉडल उपंयास microenvironment और संदर्भ निर्भर पीडीआर रोग तंत्र है कि नहीं किया जा सकता है प्रकट कर सकते है निश्चित ऊतक सामग्री में visualized ।

Figure 1
चित्र 1. पूर्व वीवो पीडीआर fibrovascular टिशू कल्चर मॉडल । vitreoretinal सर्जरी से कार्यप्रवाह का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व (pars प्लाना vitrectomy) explants में अपने विच्छेदन के लिए और फाइब्रिन में embedding तीन आयामी लक्षण वर्णन और पूर्व vivo संस्कृति के लिए उत्पाद शुल्क के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. ताजा उत्पाद विच्छेदन से पहले पीडीआर fibrovascular ऊतकों । चरन contast माइक्रोग्राफ के नए सिरे से आबकारी FTs विच्छेदन से पहले ले लिया । FTs आकार, घनत्व और संवहनी संरचनाओं की बहुतायत में अत्यधिक चर रहे हैं । ऐरोहेड अलग कैलिबर के संवहनी संरचनाओं संकेत मिलता है । लाल आंशिक रूप से पारदर्शी लाइन अलग कैलिबर की दो व्यक्तिगत जहाजों पर प्रकाश डाला गया । छवियों एक 5x, ०.१५ संख्यात्मक एपर्चर (एनए), उद्देश्य के साथ एक औंधा epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर लिया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. एक देशी पीडीआर fibrovascular ऊतक के पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस । Epifluorescence micrograph एक देशी पीडीआर फुट के दाग पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस । CD31 (ए, ग्रीन) endothelium visualizes जबकि NG2 (बी, लाल) अनियमित neovascular संरचनाओं के भीतर pericytes visualizes । मर्ज की गई छवियां (C) में दिखाई जाती हैं । DAPI (नीला) counterstain visualizes नाभिक. छवि ऑप्टिकल अनुभाग समारोह के साथ एक ईमानदार epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर लिया गया था और एक कंप्यूटर के साथ संयुक्त १.३ मेगापिक्सेल मोनोक्रोम सीसीडी कैमरा और छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर, एक 40x, १.४ एनए, तेल उद्देश्य का उपयोग कर नियंत्रित । नौ ऑप्टिकल वर्गों छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर ImageJ का उपयोग करके संयुक्त थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. एक देशी पीडीआर fibrovascular ऊतक के पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस । Epifluorescence micrograph एक देशी पीडीआर फुट के दाग पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस । CD31 (एक, हरा) endothelium visualizes जबकि Lyve1 (बी, लाल) नई खोज की लसीका endothelial संरचनाओं की तरह visualizes । मर्ज की गई छवियां (C) में दिखाई जाती हैं । Hoechst-३३३४२ (नीला) counterstain visualizes नाभिक. छवि ऑप्टिकल अनुभाग समारोह के साथ एक ईमानदार epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर लिया गया था और एक कंप्यूटर के साथ संयुक्त १.३ मेगापिक्सेल मोनोक्रोम सीसीडी कैमरा और छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर, एक 20x, ०.८ एनए, उद्देश्य का उपयोग कर नियंत्रित । चार ऑप्टिकल वर्गों छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर ImageJ का उपयोग करके संयुक्त थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5. पीडीआर fibrovascular ऊतकों के पूर्व vivo वृद्धि । चरण कंट्रास्ट दो फुट ईएक्स vivo संस्कृतियों के संकेत समय बिंदुओं (दिन) में माइक्रोग्राफ । FTs पूर्व vivo संस्कृति पर बढ़ती है, पहले से ही दो दिनों के बाद सेलुलर वृद्धि विकासशील । छवियों एक 5x, ०.१५ एनए, उद्देश्य के साथ एक औंधा epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर लिया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6. पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस पीडीआर fibrovascular ऊतकों के प्रसंस्कृत पूर्व vivo अनुपचारित (CTRL), या VEGFA या TGFβ की उपस्थिति में । Epifluorescence micrograph के एफटी पूर्व का इलाज किया vivo (CTRL) या VEGFA या TGFβ की उपस्थिति में 9 दिनों के लिए और बाद में पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा दाग । CD31 (हरा) endothelium visualizes जबकि NG2 (लाल) pericytes visualizes । DAPI (नीला) counterstain visualizes नाभिक. VEGFA स्थिर vasculature जबकि TGFβ एक fibrotic प्रतिक्रिया प्रेरित । छवियों ऑप्टिकल अनुभाग समारोह के साथ एक ईमानदार epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर लिया गया था और एक कंप्यूटर के साथ संयुक्त १.३ मेगापिक्सेल मोनोक्रोम सीसीडी कैमरा और छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर, एक 20x, ०.८ एनए, उद्देश्य का उपयोग कर नियंत्रित । नौ ऑप्टिकल वर्गों छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर ImageJ का उपयोग करके संयुक्त थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Video
वीडियो 1.3 डी पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस से सना हुआ एक देशी फुट के पुनर्निर्माण की मात्रा । CD31 (हरा), Lyve1 (लाल) । Hoechst-३३३४२ counterstain (नीला) visualizes नाभिक. छवि ऑप्टिकल अनुभाग समारोह के साथ एक ईमानदार epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर लिया गया था और एक कंप्यूटर के साथ संयुक्त १.३ मेगापिक्सेल मोनोक्रोम सीसीडी कैमरा और छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर, एक 20x, ०.८ एनए, उद्देश्य का उपयोग कर नियंत्रित । 3d वॉल्यूम पुनर्निर्माण और वीडियो प्रतिपादन एक वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग किया गया था । वीडियो के एक हिस्से Gucciardo एट अल से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित है । 11. इस वीडियो को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

विश्वसनीय कार्यात्मक कोशिका और आणविक यंत्रवत परिणामों के लिए प्रासंगिक ऊतक microenvironment के महत्व को ध्यान में रखते हुए, यह उपयुक्त प्रयोगात्मक मॉडल है कि इस ऊतक पर्यावरण प्रदान खोजने के लिए आवश्यक है । इस स्पेसिफिकेशंस फाइब्रिन-एंबेडेड FTs के लिए पूर्व vivo पीडीआर संस्कृति मॉडल वर्णित pathophysiology नैदानिक नमूनों की देशी, जटिल और कोशिकीय संदर्भ में पीडीआर पीडीआर के तंत्र की जांच की अनुमति देता है ।

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम उचित फाइब्रिन जेल गठन, फुट की स्थिति और दाग के दौरान पर्याप्त धुलाई कर रहे हैं । चूंकि फाइब्रिन जेल गठन thrombin गतिविधि पर ज्यादातर निर्भर करता है, एकाग्रता और तापमान से प्रभावित, thrombin की राशि फाइब्रिन जेल तैयारी के हर बैच के लिए समायोजित करने की जरूरत है । फाइब्रिन जेल गठन एफटी explants के 2d विकास को रोकने के लिए पर्याप्त जल्दी होना चाहिए, लेकिन यह भी पर्याप्त धीमी बूंदों के केंद्र के लिए पैर की स्थिति खड़ी करने के लिए अनुमति देने के लिए और क्षैतिज । मामले में फुट छोटी बूंद के किनारे पर पता लगाने के लिए होता है, अतिरिक्त pipetting केंद्र के लिए फुट के स्थान पर सहायता कर सकता है । FTs कि अभी भी बूंदों के किनारे पर रहते है या कि 2 डी में बढ़ने के लिए बाहर की आवश्यकता होगी । दाग और बूंदों के सूखने से बचने के दौरान पर्याप्त धुलाई में आदेश धुंधला अनुकूलन और पृष्ठभूमि संकेत को कम करने के लिए महत्वपूर्ण मोड़ में हैं । स्थानांतरण बार भी महत्वपूर्ण हो सकता है । हम vitrectomy के बाद दो घंटे तक FTs एंबेडेड है और यह पूर्व vivo वृद्धि को प्रभावित नहीं किया । संस्कृति की सफलता पर अब स्थानांतरण समय के प्रभाव का परीक्षण किया जाना चाहिए ।

FT एंबेडिंग के लिए वैकल्पिक मैट्रिक्स का उपयोग करके इस प्रोटोकॉल को संशोधित किया जा सका । vivo में, पीडीआर neovessels कोलेजन23में अमीर अवलेह प्रांतस्था की ओर बढे । हालांकि, संवहनी रिसाव सीरम घटकों पर, फाइब्रिनोजेन सहित, जहाजों को बंद निकटता में अवलेह में भंग जिससे fibrotic प्रतिक्रिया शुरू की है. इसलिए, में इन विट्रो फाइब्रिन थक्का के लिए यहां का उपयोग किया गया था पूर्व vivo संस्कृति के लिए typify वातावरण15,21,22के सूजन fibrotic पीडीआर में गठित अनंतिम ECM. वैकल्पिक रूप से, फाइब्रिन थक्के laminin और fibronectin के साथ पूरक हो सकता है अंकुरण केशिकाओं की स्थिरता को बदलने के लिए, या explants प्रकार के भीतर एंबेड किया जा सकता है मैं कोलेजन और अंय मिश्रित मैट्रिक्स typify में सबसे fibrotic microenvironments करने के लिए neovascular ऊतकों । ये मैट्रिक्स आम तौर पर 3 डी संस्कृति और पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए उपयुक्त हैं, लेकिन पीडीआर FTs पर उनके प्रभाव का परीक्षण किया जा रहने के लिए और 3 डी मैट्रिक्स गठन के समय पर विचार करने के लिए आदेश में 2 डी को रोकने के लिए सीमा के भीतर रहने के लिए किए जाने की आवश्यकता होगी विकास18,19. जब अस्पताल के लिए अनुसंधान इकाई की शारीरिक निकटता एक सीमा का प्रतिनिधित्व करता है, अब स्थानांतरण बार टीम के काम के साथ मुआवजा किया जा सकता है; टा समाधान तैयारी, फाइब्रिनोजेन बाँझ-निस्पंदन और फाइब्रिन जेल गठन परीक्षण एफटी स्थानांतरण के दौरान किया जा सकता है । फाइब्रिन जैल 1 घंटे के बाद भी फार्म नहीं है, तो फाइब्रिनोजेन या टा समाधान तैयारी के साथ एक समस्या उत्पन्न हो सकती है । इस मामले में, एफटी/फाइब्रिन जैल इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है ।

इस दृष्टिकोण की सीमाएं, हर पूर्व vivo दृष्टिकोण के साथ के रूप में, व्यक्तियों के रूप में अच्छी तरह से अंतर रोगी और अंतर रोगी ऊतक विविधता में प्राथमिक ऊतक नमूने के चर गुणवत्ता के हैं । मधुमेह रोगियों के मामले में, इस परिवर्तनशीलता का हिस्सा vascularization और फाइब्रोसिस जो रोग की अवधि, चयापचय हालत, आनुवंशिक/epigenetic कारकों, मधुमेह और प्रणालीगत चिकित्सा के प्रकार की तरह कई कारकों पर निर्भर करता है की हद तक शामिल है । शल्य चिकित्सा पीडीआर फुट बरामद का आकार भी स्थितियों है कि प्रत्येक नमूने के लिए जांच की जा सकती है की संख्या निर्धारित करने में एक सीमित कारक है । जबकि पारस्परिक स्थानिक जानकारी प्रदान करने, पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस केवल एक सीमित मात्रा में सुविधाओं की जांच की अनुमति देता है/ एक समझौते के रूप में, फाइब्रिन बूंदों वैकल्पिक रूप से तेल में एंबेड किया जा सकता है, पतले वर्गों में कटौती और immunohistochemistry द्वारा विश्लेषण ।

मौजूदा मधुमेह माउस मॉडल प्रारंभिक चरण के कई सुविधाओं का विकास डॉ लेकिन व्यापक मानव पीडीआर में होने वाले प्रगतिशील परिवर्तन दोहराऊंगा करने में विफल, इस प्रकार पीडीआर रोग तंत्र7,8के अध्ययन में बाधा. इसके अलावा, murine आंख मानव आंख से मौलिक रूप से अलग है, कि यह मैक्युला का अभाव है, और मानव रोग24के अध्ययन के महत्व पर बल दिया । सर्जिकल पीडीआर FTs पहले या तो छोड़ दिया गया है, या आयल वर्गों के लिए इस्तेमाल किया, संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, सीरियल ब्लॉक चेहरा स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, थोक आरएनए अनुक्रमण या 2 डी संस्कृति असंबद्ध कोशिकाओं के3,25 . इस स्पेसिफिकेशंस वर्णित मॉडल इस बहुमूल्य शल्य चिकित्सा सामग्री के 3d लक्षण वर्णन, साथ ही साथ देशी रोगग्रस्त ऊतक microenvironment में पीडीआर pathophysiology की जांच की अनुमति देता है । जब अवलेह द्रव के उपयोग के साथ संयुक्त, यह मॉडल भी सेलुलर और acellular पीडीआर microenvironment दोनों के योगदान की जांच की अनुमति देता है । के बाद से संस्कृतियों के विकास कारकों को कुशलतापूर्वक प्रतिक्रिया अवलेह में पाया, जैसे VEGFA, bFGF, VEGFC और TGFβ, इस प्रकार recapitulating पीडीआर की विशेषताएं pathophysiology, इस पीडीआर पूर्व vivo संस्कृति मॉडल परीक्षण या नए पीडीआर उपचार के विकास के लिए उत्तरदायी है 11. इस मॉडल में, विरोधी VEGFA रोका केशिका अंकुरण और केशिका हीनता के संकेत प्रेरित, प्रतिक्रियाओं कि विरोधी VEGFA उपचार26,27की उंमीद नैदानिक परिणामों के अनुरूप हैं । इसलिए, इस मॉडल भी विरोधी VEGFA और corticosteroid उपचार सहित वर्तमान उपचारों के प्रभाव को बेहतर समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

लाइव सेल इमेजिंग इंस्ट्रूमेंटेशन के साथ, इस के साथ साथ पूर्व vivo संस्कृति मॉडल का वर्णन किया जा सकता है समय चूक माइक्रोस्कोपी के लिए इस तरह के संवहनी प्रतिगमन के रूप में प्रक्रियाओं की वास्तविक समय की जांच की अनुमति, अंकुरण और सेलुलर प्लास्टिक । जब इन विट्रो में और vivo मॉडल में, साथ ही नैदानिक डेटा के साथ संयुक्त, इस पूर्व vivo पीडीआर मॉडल की पहचान मार्करों की विशेष सेट के आधार पर रोगी प्रतिक्रियाओं की जांच में मदद मिलेगी, एक कदम के लिए करीब व्यक्तिगत चिकित्सा के लिए एवेंयू. रोगी की पहचान-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं और/या उत्तर-विशिष्ट मार्करों पीडीआर के मामले में विशेष रूप से प्रासंगिक है, जो microvascular, neurodegenerative, चयापचय, आनुवंशिक/epigenetic के एक परिसर में खेलने के साथ एक multifactorial रोग है, प्रतिरक्षा, और सूजन से संबंधित कारकों, इस प्रकार बेहतर चिकित्सीय लक्ष्यीकरण और रोग प्रबंधन के विकास के लिए तेजी से multidisciplinary प्रयासों की आवश्यकता होती है । इसके अलावा पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस, पूर्व vivo कल्चरल FTs भी plasmin/nattokinase उपचार द्वारा फाइब्रिन से प्राप्त किया जा सकता है और transcriptomic और proteomic विश्लेषण28के अधीन । अंय नेत्र स्थितियों में विकसित fibrovascular ऊतकों के पूर्व vivo अध्ययनों के लिए इस प्रकार की उपयुक्तता का वर्णन किया गया है, जैसे सिकल सेल रेटिनोपैथी के गंभीर मामलों में, भविष्य में भी पता लगाया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक सबसे चिकित्सा और सर्जिकल रेटिना सहयोगियों, नर्सों और नेत्र विज्ञान के विभाग में मधुमेह इकाई और Vitreoretinal सर्जरी यूनिट के पूरे स्टाफ के लिए आभारी हैं, हेलसिंकी भर्ती में सक्रिय रूप से भाग लेने के लिए विश्वविद्यालय अस्पताल रोगियों की । हम इमेजिंग सुविधाओं के लिए Biomedicum आणविक इमेजिंग इकाई का शुक्र है । हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए Anastasiya Chernenko धंयवाद । इस अध्ययन में फिनलैंड की अकादमी (केरल), हेलसिंकी विश्वविद्यालय (केरल), Sigrid Juselius फाउंडेशन (केरल), के Albin जोहानसन फाउंडेशन (केरल), फिनिश कैंसर संस्थान (केरल), कारोलिंस्का Institutet (केरल), फिनिश आई फाउंडेशन (SL), नेत्र और ऊतक बैंक फाउंडेशन (sl), मरियम और Georg सी Ehrnrooth फाउंडेशन (sl), और हछ नैदानिक अनुसंधान अनुदान (TYH2018127 के बाद TYH2016230, sl), मधुमेह अनुसंधान फाउंडेशन (sl, केरल, एके, जैसे) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से के रूप में डॉक्टरी कार्यक्रम में चिकित्सा (eg) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Microforceps Medicon 07.60.03 Used for handling the FTs
Disposable Scalpels - Sterile Swann-Morton 0513 Used for FT dissection
Culture dish, vented, 28 ml (60mm) Greiner Bio-One 391-3210 Used for dissection and for testing fibrin gel formation
Cell culture plates, 12-well Greiner Bio-One 392-0049 Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL Greiner Bio-One 391-3477
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL Greiner Bio-One 525-0384
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF Millipore SLGV033RS Used to sterile-filter the fibrinogen solution
Syringe, 10 mL Braun 4606108V Used to sterile-filter the fibrinogen solution
Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL Fisher FB74031
Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well Nunc 142475 Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture
Cell culture plates, 96-well, U-bottom Greiner Bio-One 392-0019 Used for whole-mount immunofluorescence
Round/Flat Spatulas, Stainless Steel VWR 82027-528 Used for whole-mount immunofluorescence
Coverslips 22x22mm #1 Menzel/Fisher 15727582 Used for mounting
Microscope slides Fisher Kindler K102 Used for mounting
Absorbent paper VWR 115-0202 Used for mounting
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
PBS tablets Medicago 09-9400-100 Used for preparing 1x PBS
Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma Calbiochem 341578
Hanks Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich H9394-500ML Used for preparing the fibrinogen and TA solution
Fetal bovine serum Gibco 10270106 Used for preparing the blocking solution
Human Serum Sigma-Aldrich H4522 Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media
Gentamicin Sulfate 10mg/ml Biowest L0011-100
Endothelial cell media MV Kit Promocell C-22120 Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement,  500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL)
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood.
Acetone Sigma-Aldrich 32201-2.5L-M Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.
Methanol Sigma-Aldrich 32213 Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.
Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate) Sigma-Aldrich T9284 Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing.
Hoechst 33342, 20mM Life Technologies 62249 For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Laboratories H-1000 Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200 Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
Eukitt Quick-hardening mounting medium Sigma-Aldrich 03989-100ml TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder Sigma-Aldrich T9549-500UN  Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw
Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder Sigma A3428 Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw
Name Company Catalog Number Comments
Growth factors
Recombinant human VEGFA R&D Systems 293-VE-010 50 ng/ mL final concentration
Recombinant human VEGFC R&D Systems 752-VC-025 200 ng/ mL final concentration
Recombinant human TGFβ Millipore GF346 1 ng/ mL final concentration
Recombinant human bFGF Millipore 01-106 50 ng/ mL final concentration
Name Company Catalog Number Comments
Primary antibodies
CD31 (JC70A) Dako M0823 Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD34 (QBEND10) Dako M716501-2 Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD45 (2B11+PD7/26) Dako M070129-2 Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD68 ImmunoWay RLM3161 Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
Cleaved caspase-3 (5A1E) Cell Signalling 9664 Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
ERG (EP111) Dako M731429-2 Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
GFAP Dako Z0334 Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Ki67 Leica Microsystems NCL-Ki67p Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Lyve1 R&D Systems AF2089 Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab
NG2 Millipore AB5320 Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Prox1 ReliaTech 102-PA32 Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab
Prox1 R&D Systems AF2727 Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab
VEGFR3 (9D9F9) Millipore MAB3757 Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
α-SMA (1A4) Sigma C6198 Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated
Name Company Catalog Number Comments
Secondary antibodies
Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG Life Technologies A-21202 Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG Invitrogen A-11012 Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG Thermo Scientific A-11057 Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG Thermo Scientific A-11036 Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG Molecular Probes A-21468 Used at 1:500 dilution
Name Company Catalog Number Comments
Microscopes
Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope Zeiss For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT
SZX9 upright dissection stereomicroscope Olympus For FT dissection
LSM 780 confocal microscope Zeiss For imaging of whole-mount immunostained FT
AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome Zeiss For imaging of whole-mount immunostained FT

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References

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कर्षण अंक १४३ पूर्व vivo संस्कृति fibrovascular ऊतक प्रफलन मधुमेह रेटिनोपैथी रोगी-प्राप्त नैदानिक नमूने vasculature रोग pathophysiology तीन आयामी पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस vitrectomy neovessel ।
प्रफलन मधुमेह रेटिनोपैथी में Fibrovascular जटिलताओं के लिए एक पूर्व Vivo ऊतक संस्कृति मॉडल
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Gucciardo, E., Loukovaara, S., Korhonen, A., Lehti, K. An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy. J. Vis. Exp. (143), e59090, doi:10.3791/59090 (2019).

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