Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

En Ex Vivo vævskultur Model for Fibrovascular komplikationer i proliferativ diabetisk retinopati

Published: January 25, 2019 doi: 10.3791/59090

Summary

Vi præsenterer her, en protokol til at studere Patofysiologi af proliferativ diabetisk retinopati ved hjælp af patient-afledte, kirurgisk skåret ud, fibrovascular væv for tre-dimensionelle indfødte karakterisering og ex vivo vævskultur. Dette ex vivo kultur model er også modtagelig for afprøvning eller udvikle nye behandlinger.

Abstract

Diabetisk retinopati (DR) er den mest almindelige mikrovaskulære komplikationer af diabetes og en af førende årsager til blindhed i erhvervsaktive voksne. Ingen aktuelle dyremodeller for diabetes og ilt-induceret retinopati udvikle fuldtone progressive ændringer manifesteret i menneskelige proliferativ diabetisk retinopati (PDR). Derfor har forståelse af sygdom patogenesen og patofysiologien påberåbt sig i vid udstrækning brug af histologiske snit og glaslegeme prøver i metoder, der kun giver steady-state oplysninger om de involverede sygdomsfremkaldende faktorer. Stadig flere beviser indikerer at dynamisk celle-celle og celle-ekstracellulære matrix (ECM) interaktioner i forbindelse med tre-dimensionelle (3D) microenvironments er afgørende for de mekanistiske og funktionelle studier i retning af udvikling af nye behandling strategier. Derfor, vi hypotese at de patologiske fibrovascular væv kirurgisk skåret ud fra øjnene med PDR kunne udnyttes til at pålideligt optrævle de cellulære og molekylære mekanismer af denne ødelæggende sygdom og afprøve mulighederne for romanen kliniske interventioner. I denne retning udviklet vi en ny metode til 3D ex vivo kultur af kirurgisk skåret ud patient-afledte fibrovascular væv (FT), der vil tjene som en relevant model af menneskelige PDR patofysiologi. FTs er dissekeret i explants og indlejret i fibrin matrix for ex vivo kultur og 3D karakterisering. Hele-mount immunfluorescens af indfødte FTs og end-point kulturer giver mulighed for grundig undersøgelse af vævssammensætning og flercellede processer, fremhæver betydningen af 3D væv-niveau karakterisering for afdække relevante funktioner i PDR patofysiologi. Denne model vil tillade samtidige vurdering af molekylære mekanismer, cellulære/væv processer og behandling svar i den komplekse sammenhæng af dynamiske biokemiske og fysiske vekselvirkninger i PDR væv arkitektur og mikromiljø. Da denne model sammenfatter PDR Patofysiologi, vil det også være modtagelig for afprøvning eller udvikle nye behandlinger.

Introduction

DR er en alvorlig okulær komplikation til diabetes, en sygdom, der har nået enorme proportioner i de sidste tre årtier1. Tyve år efter diagnose, næsten alle patienter med type 1 diabetes og 60% af patienter med type 2 diabetes nuværende tegn på retinopati, gør diabetes i sig selv en af førende årsager til blindhed i arbejder alder voksne2. Ud fra mikrovaskulære degeneration og iskæmisk skade inddeles DR i følgende ikke-proliferativ DR (ikke-PDR) og proliferativ DR (PDR). Slutstadium sygdom, PDR, er karakteriseret ved iskæmi - og betændelse-induceret neovascularization og fibrotisk svar på grænsefladen vitreoretinal. I ubehandlet betingelser, vil disse processer føre til blindhed på grund af glaslegeme blødning, retinal fibrose, tractional nethindeløsning og neovaskulær glaukom3,4. Trods de seneste fremskridt målrette nuværende behandlingsmuligheder kun DR faser, herunder diabetisk makulaødem og PDR, når nethinde beskadige opstod allerede. Desuden en stor del af DR patienter ikke er omfattet af nuværende behandling angrebsformål, der angiver et presserende behov for forbedrede terapier4,5,6.

Flere andre jegn vivo sygdom/udviklingsmæssige modeller og diabetisk dyremodeller er blevet udviklet til dato, men ingen af dem indeholder hele spektret af patologiske funktioner observeret i menneskelige PDR7,8. Desuden angiver stadig flere beviser, behandlingsreaktioner er tæt forbundet med ECM sammensætning samt den rumlige arrangement og interaktion mellem cellulære og acellulær mikromiljø9. Vi er derfor, at udvikle en klinisk relevante model af menneskelige PDR ved at udnytte den FT patologisk materiale, der er almindeligt skåret ud fra øjne gennemgår vitrectomy som del af kirurgisk forvaltning af PDR10.

Dette manuskript beskriver protokollen for 3D ex vivo kultur og karakterisering af den kirurgisk-skåret ud, PDR patient-afledte patologiske FT. Metoden beskrevet her er blevet brugt i en nylig publikation, der demonstrerede vellykket dekonstruktion af den indfødte 3D PDR væv landskab og sammenfatning af funktioner af PDR Patofysiologi herunder angiogene og fibrotisk svar af den unormale vaskulære strukturer11. Denne model også afsløret nye funktioner, der ikke kan være let værdsat fra histologiske tyndslib, som rumligt begrænset apoptose og spredning samt vaskulære islet formation11. Glasagtige væske har held været anvendt af andre på 3D endotel klumpformet kulturer at evaluere dens potentielle angiogene og effekten af angiostatic molekyler12. Når det kombineres med en in vitro- 3D lymfe endotel celle (LEC) klumpformet spiring analyse ved hjælp af PDR glasagtige som stimulans, afslørede vores model både opløselige vitreal bidrag faktorer såvel som lokale stikord inden for neovaskulær væv til som endnu dårligt forstået LEC inddragelse i PDR Patofysiologi3,11. I forvaltningen af PDR er vitreoretinal kirurgi en rutinemæssigt udført endnu udfordrende procedure. Som kirurgiske Instrumentation og teknikker ser kontinuerlig fremgang og raffinement, rettidig og konservative fjernelse af fibrovascular proliferativ modellen ikke blot forbedrer vision resultatet men også giver uvurderlig væv materiale for den undersøgelse af PDR Patofysiologi og behandling svar i de komplekse translationel aspekter af levende menneskelige væv mikromiljø.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne forskning blev godkendt af det institutionelle Review Board og etiske udvalg i Helsinki University Hospital. Underskrevet informeret samtykke blev opnået fra hver patient.

1. forberedelse af løsninger, medier og udstyr

  1. Forberede følgende udstyr inden indsamlingen af fibrovascular væv (FT) til at sikre en hurtig behandling.
    1. Sterilt-autoklave to microdissection pincet.
    2. Forberede 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) ved at opløse 1 pre vejes PBS tablet (0,14. M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.010 M PO4-3) i 900 mL deioniseret vand og rør til at opløse. Juster vandmængden op til 1 L og steril-autoklave klar løsning. Butik på RT.
    3. Indsamle de ovenfor nævnte løsning og udstyr i en kurv, sammen med en enkelt-bruger steril skalpel, en steril 6-cm celle kultur parabol og fem sterile 12-godt celle kultur plader.
  2. Forberede en 6 mg/mL fibrinogen løsning i Hanks Balanced Salt løsning (HBSS) ved at opløse 30 mg af plasminogen-forarmet humant fibrinogen til 5 mL af HBSS, ved hjælp af en 50 mL tube nedsænket i vandbad ved 37 ° C i mindst 1 time.
    Bemærk: Denne løsning kan holdes i vandbad (37 ° C) til 7 h (maksimum 10 h) før brug.
  3. Udarbejde ex vivo dyrkningsmediet ved at tilføje 5% føtalt kalveserum (FCS) eller 5% humant serum, 0,4% endotel celle vækst supplement, 10 ng/mL rekombinant human epidermal vækstfaktor, 1 μg/mL hydrocortison og 50 μg/mL phosphatbufferet til kommercielt tilgængelige endotel celle vækstmedium og holde i vandbad ved 37 ° C indtil brug. Opbevares ved 4 ° C i op til en måned.

2. fibrovascular væv dissektion

  1. Indsamle fibrovascular væv (FT), der har været skåret ud fra forsøgspersoner gennemgår trans-konjunktival microincision vitreoretinal kirurgi, af 23 eller 20 gauge tre-port pars plana vitrectomy som en del af vitreoretinal kirurgisk forvaltning af PDR.
    Bemærk: FT er afgift ved hjælp af segmentering og delaminering, skære hvis nødvendigt med microscissors, og fjernet fra Corpus vitreum-hulen med intraokulært ende-gribende microforceps af erfarne vitreoretinal kirurg. Stor forsigtighed skal træffes for at fjerne intakt, ubeskadiget FT uden at forårsage skader på okulær strukturer herunder synsnerven eller tidsmæssige vaskulære arkade hvor patologiske neovaskulær væv er oftest placeret. Størrelsen af den skåret væv er variabel, som regel spænder mellem 3 og 50 mm2.
  2. Holde FT i en 6 cm celle kultur parabol eller 1,5 mL rør indeholdende 1 mL steril PBS placeret på våde is, og overføre det straks til forskning laboratorium til forarbejdning.
    Bemærk: Det er væsentligt at forskningsenhed (Laboratoriefaciliteterne) er fysisk tæt på operationsstuen hospital (OR) at minimere overførselstider af den lille skåret FT. I dette tilfælde overførsel tager mindre end 5 minutter og explants er indlejret i fibrin som regel 1-1.5 h (højst 2 h) efter kirurgisk fjernelse. Virkningen af længere overførselstider på 3D kultur skulle afprøves.
  3. FT i en 6-cm celle kultur parabol indeholdende 1 mL PBS ved stuetemperatur (RT, 25 ° C) og erhverve billeder af væv ved hjælp af en omvendt epifluorescensmikroskop med en 5 x mål.
    Bemærk: Billederne er erhvervet for kvalitativ evaluering og dokumentation. Det vil være muligt at observere væv størrelse, tæthed og generelle sammensætning (f.eks. vaskulære strukturer).
  4. Skær FT i ~ 1 mm2 stykker under en opretstående dissektion stereomikroskopet, ved hjælp af en steril skalpel og microdissection pincet. Holde væv, godt neddykket i PBS, på plads ved hjælp af en microdissection pincet, og udføre klart udskæringer ved hjælp af en steril skalpel. Undgå rive FT, da dette ville ændre de indfødte fibrovascular strukturer.
  5. Placer hvert enkelt stykke i en brønd på en 12-godt celle kultur plade indeholdende 1 mL steril PBS.
    Bemærk: Hvis det er nødvendigt, forsigtigt sprede FT på pladen, ved hjælp af microdissection pincet, før du udfører nedskæringer.

3. støbning oprejst Fibrin Gel dråber til karakterisering af indfødte FT og Ex Vivo kultur

  1. Sterilt-filter klar fibrinogen løsning parat i trin 1.2 med 0,22 μm filter monteret i en 10 mL sprøjte.
  2. Forbered delprøver af fibrinogen løsning (25 μl pr. 1,5 mL tube) og holde på RT. Forbered en alikvot til fibrin gel / hver FT stykke fremstillet efter dissektion, og et par ekstra delprøver til afprøvning af fibrin gel dannelse.
  3. Forbered en løsning af HBSS indeholdende 4 enheder/mL af Trombin og 400 μg/mL af aprotinin, kaldet herefter TA løsning, og holde på RT. Forbered så meget TA løsning efter behov, afhængigt af antallet af stykker fremstillet efter dissektionen (25 μL af TA løsning er brugt for hvert FT/fibrin gel), og et ekstra beløb (f.eks. 250 μL) for test fibrin gel dannelse og sikre, at nok løsning er tilgængelige i hele støbning af fibrin gel dråber.
    Bemærk: Thrombin er nødvendig for fibrin polymerisering, mens aprotinin er tilføjet for at forhindre nedbrydning af fibrin gel af cellulær proteaser udtrykt af FTs13,14.
  4. Test timing af fibrin gel dannelse: tilsættes 25 μL TA løsning til den aliquoted 25 μL fibrinogen rengøringsopløsning taktfast 3.2 og bruger en anden pipette indstillet til 50 μL, bland i røret af pipettering og dispensere i en 6 cm celle kultur skål , danner en opretstående slipværktøj.
    Bemærk: Fibrin gel dannelse bør finde sted i ~ 1 min. Hvis det tager mere end 1,5 min, kan koncentrationen af thrombin i den TA rengøringsopløsning taktfast 3.3 øges ved at tilføje flere thrombin stamopløsning. En tiendedel af den oprindeligt anvendte mængde af thrombin stamopløsning kan tilføjes, gentagne gange, indtil fibrin gel dannelsen sker inden 1,5 min. Tidspunktet for fibrin gel dannelse er kritisk for de tre dimensioner af kulturen, som hurtig gel dannelse (indenfor 1,5 minutter) forhindrer FT stykke fra synker til bunden af fibrin gel, og dermed kommer i kontakt med 2D plast overfladen af cellen kultur plade, som kan føre til 2D celle vedhæftning og udvækst.
  5. Placer en FT stykke på midten af et godt af en 24-godt plade ved hjælp af en steril pincet og fjerner alle overskydende PBS når der afpipetteres med en 0,5-10 μL pipette til at undgå at suge kraft på FT. I tilfælde af væv klæber til pincet, bruge en ekstra pincet til at støtte placeringen af væv brik på pladen.
    Bemærk: FT/fibrin geler kan også være støbt på 48-godt plade til at reducere brugen af reagenser. Det er imidlertid mere udfordrende som rummet er mere begrænset og fibrin vil sprede sig, hvis det kommer i kontakt med godt væggen.
  6. Tilsættes 25 μL TA løsning til 25 μL fibrinogen løsningen aliquoted i trin 3.2, og ved hjælp af en anden pipette indstillet til 50 μL mix i røret af pipettering. Give afkald på FT stykke lægges på pladen godt, og pipetteres op og ned ad 2 - 3 gange for at medtage FT stykke inden for den opretstående slipværktøj, giver en 3D omkringliggende matrix til FT.
    Bemærk: Sikre at FT ikke er indsugning under pipettering og at ingen luftbobler er dannet. Sikre også at blande, dispensation og pipettering udføres hurtigt som fibrin gel vil danne inden 1,5 min, som testes i trin 3.4. Hvis støbning fibrin geler på 48-godt plade, brug i stedet 20 μL af fibrinogen løsning og 20 μL af TA løsning.
  7. Gentag trin 3.5 og 3.6 for alle FT stykker.
  8. Tillad fibrin geler størkne ved at inkubere plader i en celle kultur inkubator ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO2.
  9. Efter 0,5-1 vippe h, kontrollere, at fibrin gel er fuldstændigt dannet af omhyggeligt pladen. Fortsæt til trin 3.10 når gelen ikke bevæger sig når pladen vippes, der indikerer at fibrin gel dannelse er komplet.
  10. Overlay de FT/fibrin geler med ex vivo næringssubstratet (600 μl/brønd i 24-godt plade) eller 300 μL/brønd i 48-godt plade suppleret med 100 μg/mL aprotinin. Der afpipetteres medium forsigtigt af drop-wise dispensation.
    Bemærk: Her, aprotinin bruges til at forhindre nedbrydning af fibrin gel af cellulær proteaser udtrykt af FTs13,14. Den ex vivo dyrkningsmediet kan desuden suppleres med rekombinant vækst faktorer, såsom VEGFA, VEGFC, bFGF, TGFβ (Se Tabel af materialer)11.
  11. Placer FT ex vivo kultur plade tilbage til 37 ° C, 5% CO2 celle kultur inkubator og kultur for den ønskede tidsperiode (fx2 - 18 dage, længere kultur perioder bliver nødt til at blive testet). Erstatte 50% af mellemstore med friske ex vivo næringssubstratet hver tre dage.

4. "i Matrix" Imaging

  1. Erhverve billeder af FT ex vivo kulturer på samme dag (dag 0) og med bestemte intervaller (f.eks. hver anden dag), ved hjælp af en omvendt epifluorescensmikroskop, for at følge den 3D vækst.
    Bemærk: Billederne fremstillet kan bruges til kvantificering af FT udkommet som den samlede længde af to vinkelrette diametre på tværs af eksplantat11.

5. indfødte FT og Ex Vivo kultur End-Point

Bemærk: FT/fibrin geler kan kulturperler ex vivo til den ønskede tidsperiode (FT ex vivo kulturer) eller fast på den samme dag (native FT) for indfødte FT karakterisering11.

  1. Fastsætte de indfødte FT eller FT ex vivo kulturer ved at erstatte næringssubstratet med 1 mL/godt af 4% PARAFORMALDEHYD i PBS løsning, for 1 h på RT. For de indfødte FT/fibrin geler, fastsætte 0,5-1 h efter tilsætning af ex vivo kultur medium (hvis fibrin geler ikke har været dyppet i medium, fiksering vil skade dem).
    Bemærk: Udfør dette trin i stinkskab som PARAFORMALDEHYD er ætsende, giftige og kræftfremkaldende.
  2. Skyl FT/fibrin geler med tre 5 min vasker i PBS (2 mL/hul).
  3. Erstatte PBS med 2 mL/godt af PBS, som indeholder 0,02% natriumazid og gemme de faste fibrin geler ved 4 ° C indtil videre forarbejdning. Forsegle plader med paraffin film til at sikre, at FT/fibrin geler ikke tør i opbevaring.
    Bemærk: Udføre dette trin i stinkskab, da natriumazid er giftige.

6. hele-Mount immunofluorescens farvning

Bemærk: Denne protokol varer 5 dage og kan afbrydes med overnight inkubationer hvor angivet. Lad ikke fibrin geler tør på noget tidspunkt. Alle trin er udført på RT, medmindre andet er angivet.

  1. Forberede følgende løsninger før du starter farvning protokollen.
    1. Efter fiksering løsning: forberede 50/50 acetone: methanol løsning ved at blande lige store mængder af acetone og methanol (f.eks. 50 mL). Opbevares ved-20 ° C. Forberede denne løsning senest på dagen før farvning. Denne opløsning kan opbevares ved-20 ° C og anvendes til efterfølgende stainings.
      Bemærk: Forberede denne løsning i stinkskab som acetone og methanol er letantændelige og sundhedsfarlige.
    2. Blokering løsning: forberede en 15% føtal bovint serum (FBS), 0,3% octyl phenol nonylphenolethoxylat løsning i PBS første tilføje 15% FBS til PBS. Tilføj octyl phenol nonylphenolethoxylat og rør til at opløse. Opbevares ved 4 ° C.
      Bemærk: Denne løsning kan tilberedes i stor mængde i forvejen, opbevares i 15 mL aliquotes ved-20 ° C og optøet før brug, på den dag, når farvning protokollen er startet. Bruge en frisklavet eller frisk optøede intramuskulaert for hver farvnings-protokol.
    3. Vask løsning: forberede 1 L PBS suppleret med 0,45% octyl phenol nonylphenolethoxylat ved at tilføje 4,5 mL octyl fenol nonylphenolethoxylat til 995.5 mL PBS. Rør til at opløse. Butik på RT.
  2. Løft dråber omhyggeligt fra pladen ved hjælp af en rustfri square-kantet spatel. Frigøre slipværktøjet først fra kanterne før løft centrum, og overføre til et godt af 12-godt plade indeholdende 1 mL PBS.
    Bemærk: Udføre efter fiksering, vask og blokerende trin i denne plade format.
  3. Efter lave dråber med 1 mL iskold 50/50 acetone: methanol løsning for ~ 1 min. (grænsen til dråber vil vende hvide).
    Bemærk: Udfør dette trin i stinkskab som acetone og methanol er sundhedsfarlige.
  4. Skyl med 3-5 vasker i 2 mL PBS (dråber vil synke i PBS løsning når rehydrering er fuldført).
    Bemærk: Undgå at røre dråber med pipette spids, som efter efter fiksering, de er klistret til plast. Hele protokollen, undgå sugning efter rettelse, antistof, blokering og vask løsninger af suge, da dette kan beskadige eller helt ødelægge dråber. I stedet, vippe pladen og fjern forsigtigt løsninger ved hjælp af en 500-5.000 μL pipette.
  5. Der centrifugeres den blokerende løsning for 15 min på 21.000 x g og 4 ° C for at fjerne snavs.
    Bemærk: Løsningen kan være aliquoted i 1,5 mL reagensglas til centrifugering. Den uudnyttede løsning kan opbevares ved 4 ° C og anvendes til alle relevante efterfølgende trin.
  6. Inkuber dråber i 500 μL blokerende løsning for 2 h på RT.
    Bemærk: For at reducere omfanget af blokering løsning bruges, pladen kan vippes med en støtte og så lidt som 300 μL af løsning/droplet kan bruges.
  7. Forbered primære antistof blanding (mindst 30 μL/dråbe) på passende fortynding i blokerende løsning og centrifugeres i 15 min. ved 21.000 x g og 4 ° C.
  8. Overføre dråber ind i runde (U)-96-brønd plade i bunden ved hjælp af en runde kantet spatel, og der inkuberes med mindst 30 μL/dråbe af primære antistof blandingen natten over ved 4 ° C.
  9. Den følgende dag, overførsel dråber i 12-brønd plade indeholdende 2 mL af vask løsning/nå, vasker skylles med tre 5 min første og derefter med ni 30 min vasker. Lad den sidste vask (2 mL) natten over ved 4 ° C.
  10. Den følgende dag, skylles tre gange med PBS og overføre dråber ind i runde (U)-96-brønd plade i bunden.
  11. Under vasker, forberede passende fluorophore-konjugeret sekundær antistof blandingen (fortyndet 1: 500, mindst 30 μL/droplet) i blokerende løsning, og der centrifugeres i 15 min. på 21.000 x g og 4 ° C.
  12. Overføre dråber i en runde (U)-96-brønd plade i bunden ved hjælp af en runde kantet spatel, og der inkuberes med mindst 30 μL af sekundær antistof-blandingen for 4 h i RT, beskyttet mod lys.
    Bemærk: Udfør alle efterfølgende inkubationer og vask trin beskyttet mod lys.
  13. Overføre dråber til 12-godt plade med 2 mL af vask løsning/brønd med en runde kantet spatel, skylles med tre 5 min vasker først og derefter med fire 30 min vasker. Lad den sidste vask (2 mL) natten over ved 4 ° C.
  14. Den følgende dag, skyl geler med fem 30 min vasker og derefter tre gange med PBS. Lad den sidste vask (2 mL) natten over ved 4 ° C.
  15. Den følgende dag, overføre dråber i en runde (U)-96-brønd plade i bunden ved hjælp af en runde kantet spatel og kontrastfarve kerner ved inkubering med 10 μg/mL Hoechst nukleare pletten (mindst 30 μL/droplet) i 30 minutter ved RT.
    Bemærk: Montering medium suppleret med 4', kan 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) for kerner counterstaining alternativt anvendes. I hvilket tilfælde, dette trin og trin 6.16 springes over, fortsætter direkte til trin 6.17.
  16. Overføre dråber til 12-godt plade med 2 mL af PBS/brønd med en runde kantet spatel og skylles tre gange med PBS.
  17. Montere dråber på objektglas som følger:
    1. Anvende en smal lag af quick-hærdning montering medium på kanten af en firkantet 22 mm x 22 mm daekglas og lad tørre i ~ 1 minut. Udføre dette trin for hver dråbe individuelt, for at undgå overdreven hærdning af montering medium.
      Bemærk: Udfør dette trin i stinkskab som hurtig-hærdning montering medium er sundhedsfarlige.
    2. Skyl slipværktøjet ved dypning i en brønd på en 12-godt plade med 2 mL deioniseret vand og overføre på et objektglas, ved hjælp af en runde kantet spatel. Fjern overskydende vand ved hjælp af et lille stykke af absorberende papir.
    3. Dispensere 15 μl af ikke-hærdende antifade montering medium på en droplet.
      Bemærk: Alternativt hvis Hoechst nukleare pletten ikke er blevet anvendt, montering medium indeholdende 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kan bruges.
    4. Forsigtigt Placer glas dækning med hurtig-hærdning montering medium står over for mikroskopiske diaset i slipværktøjet og lad nøjes.
      Bemærk: Quick-hærdning medium vil holde sig til den mikroskopiske dias og opbevar slipværktøjet.
  18. Gentag trin 6.17 for alle dråber. Montere to dråber på hvert objektglas.
  19. Lad dias lufttørre på RT for ~ 2 h og opbevares ved 4 ° C natten over. Sikre, at diasene er placeret vandret og beskyttet mod lys.
  20. Billede den farvede indfødte eller end-point FT ex vivo kulturer ved hjælp af en Konfokal mikroskop eller en opretstående epifluorescensmikroskop udstyret med en optisk kontinuerlig skæring funktion og 20 x eller 40 x mål. Bruge flisen funktion til at fange et større område af væv på én gang.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dybere forståelse af PDR fibrovascular væv egenskaber og protein udtryk har påberåbt sig hovedsageligt glasagtige prøver og tynde histologiske FT afsnit3,15,16,17. For at udvikle en metode til kulegravning af 3D væv organisation og flercellede physiopathological processer af PDR, vi satte sig for at udnytte den kirurgisk skåret, afledt patient-patologiske FTs for 3D karakterisering og ex vivo kultur. De friske FTs er overført til forskningslaboratorium og behandles som illustreret i arbejdsprocessen skematisk i figur 1.

FTs kan være afbildet før dissektion for kvalitativ evaluering og dokumentation (figur 2). Som vist i figur 2, viser FTs stor inter patient variation i størrelse, tæthed og overflod af vaskulære strukturer. I nogle væv, løs celler, formentlig inflammatoriske/immun celler eller røde blodlegemer, såvel som pervious vaskulære strukturer af forskellige kaliber kan også være nemt skelnes (figur 2). Efter dissektion skal en beslutning foretages på downstream brugen af begrænser antallet af de opnåede explants. En del af explants er indlejret i fibrin matrix og fast efter fibrin gel dannelse, mens de resterende explants kan underkastes ex vivo kultur på en separat plade (figur 1). De friske FTs har også været med succes udnyttet for ultrastrukturelle karakteristika ved elektronmikroskopi. Prøverne kan være enten behandles for konventionelle transmissions Elektron Mikroskopi (TEM) af ultratynde sektioner eller seriel blok ansigt-scanning elektronmikroskopi (SBF-SEM)3,11.

De faste fibrin geler kan opbevares i flere uger og plettet af hele-mount immunofluorescens18,19. De farvede prøver er ligeledes stabil, når den opbevares ved 4 ° C i mørke. De tykke FT/fibrin geler kan være afbildet tid effektivt med epifluorescensmikroskop udstyret med en optisk kontinuerlig skæring funktion, nyttigt for at fjerne spredt ud af fokus lys. Billedbehandling med denne metode giver fine visualisering af strukturer. Alternativt, Konfokal mikroskopi, men mere tid-krævende, kan tillade fangst af finere detaljer. Karakterisering af frisk fibrin-indlejret og faste, ukultiveret, native FTs ved hele-mount immunfluorescens tillader karakterisering af vaskulære strukturer, flere celletyper og deres gensidige ordning inden for den 3D PDR væv landskab11. For eksempel, CD31 antistoffer kan bruges til at vise endotelet og NG2 til at vise pericytes (figur 3), mens Lyve1 antistoffer visualisere nyligt opdagede lymfe-lignende endotel strukturer (figur 4)11. Flere kombinationer af antistoffer kan bruges til at visualisere flere strukturer og celletyper (Se Tabel af materialer); for eksempel, kan ERG også visualisere endotel, som har et discontinuos udtryk mønster i den unormale PDR-neovasculature. De vaskulære strukturer farves med en membran markør (f.eks.CD31 og Lyve1) kan analyseres kvantitativt til bevarelse og tæthed ved hjælp af Angiotool, en gratis-source software udviklet af NIH National Cancer Institute11, 20. 3D diskenheder kan også gengives fra datasættet opnåede (Se Video 1). Hvis et antistof ikke er egnet til hele-mount immunofluorescens, kan fibrin dråber alternativt være indlejret i paraffin, skåret i tynde sektioner og analyseret af Immunhistokemi. I dette tilfælde dråber drage fordel af natten fiksering ved 4 ° C i stedet for 1t på RT.

Ex vivo opretholder kultur væksten af fibrin-embedded FTs, udvikle cellulære udvækster allerede efter to dage (figur 5). In vitro- fibrin gel anvendes som matrix for ex vivo kultur, da det typisk in vivo foreløbige ECM, dannet efter thrombin kløvningen af serum fibrinogen på lokaliteter af vaskulær lækage, i direkte kontakt med den utætte PDR neovessels i den betændt fibrotisk milieu15,21,22.

Laos er en mikrovaskulære komplikationer karakteriseret ved en angiogene og fibrotisk svar, og FT explants bevarer denne cellulære repertoire i kultur, samt reagere effektivt på udefrakommende stimuli tilføjes kultur medier11. De repræsentative data i figur 6 viser, at PDR ex vivo kulturer induceret spiring af CD31-positive endothelium og Vaskulaturen bevarelse som svar på VEGFA, mens TGFβ induceret fibrotisk svar afspejles af udkommet NG2-positive pericytes/SMCs. Flere udefrakommende stimuli kan afprøves, og når informeret af målinger af deres in vivo vitreal overflod, den heri udviklede PDR ex vivo kultur model kan afsløre roman mikromiljø og sammenhæng afhængige PDR patologiske mekanismer, der ikke kan være visualiseret i faste væv materiale.

Figure 1
Figur 1. Ex vivo PDR fibrovascular vævskultur model. Skematisk gengivelse af arbejdsprocessen fra vitreoretinal kirurgi (pars plana vitrectomy) for excision af FT sin dissektion ind i explants og indkapslet i fibrin for tre-dimensionelle karakterisering og ex vivo kultur. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Frisk skåret ud PDR fibrovascular væv før dissektion. Fase contast micrographs af frisk skåret FTs taget før dissektion. FTs er meget varierende i størrelse, tæthed og overflod af vaskulære strukturer. Pilespidser angive vaskulære strukturer af forskellige kaliber. Den røde delvist gennemsigtig linje fremhæver to individuelle fartøjer af forskellige kaliber. Billederne blev taget ved hjælp af en omvendt epifluorescensmikroskop med 5 x, 0,15 numerisk blænde (NA), mål. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Hele-mount immunfluorescens af en indfødt PDR fibrovascular væv. Epifluorescensmikroskop Mikrograf af en indfødt PDR FT farves ved hele-mount immunfluorescens. CD31 (A, grønne) visualiserer endotelet mens NG2 (B, rød) visualiserer pericytes inden for de uregelmæssige neovaskulær strukturer. Flettede billeder vises i (C). DAPI (blå) kontrastfarve visualiserer kerner. Billedet blev taget med en opretstående epifluorescensmikroskop med optiske skære funktion og kombineret med en computer-styrede 1,3 megapixel monokrom CCD kamera og image erhvervelse software, ved hjælp af en 40 x, 1.4 NA, olieobjektiv. Ni optiske dele blev kombineret ved hjælp af billedbehandlingsprogram ImageJ. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Hele-mount immunfluorescens af en indfødt PDR fibrovascular væv. Epifluorescensmikroskop Mikrograf af en indfødt PDR FT farves ved hele-mount immunfluorescens. CD31 (A, grønne) visualiserer endotelet mens Lyve1 (B, rød) visualiserer de nyopdagede lymfe-lignende endotel strukturer. Flettede billeder vises i (C). Hoechst-33342 (blå) kontrastfarve visualiserer kerner. Billedet blev taget med en opretstående epifluorescensmikroskop med optiske skære funktion og kombineret med en computer-styrede 1,3 megapixel monokrom CCD kamera og image erhvervelse software, ved hjælp af en 20 x, 0,8 NA, mål. Fire optiske dele blev kombineret ved hjælp af billedbehandlingsprogram ImageJ. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5. Ex vivo vækst af PDR fibrovascular væv. Fase kontrast micrographs af to FT ex vivo kulturer på angivne tidspunkter (dag). FTs vokse ex vivo kultur, udvikling af cellulære udvækster allerede efter to dage. Billederne blev taget med en inverteret epifluorescensmikroskop med en 5 x, 0,15 NA, mål. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6. Hele-mount immunfluorescens af PDR fibrovascular væv kulturperler ex vivo ubehandlet (CTRL), eller i tilstedeværelse af VEGFA eller TGFβ. Epifluorescensmikroskop Mikrograf af FT kulturperler ex vivo ubehandlet (CTRL) eller i tilstedeværelse af VEGFA eller TGFβ i 9 dage og efterfølgende farves ved hele-mount immunfluorescens. CD31 (grøn) visualiserer endotelet, mens NG2 (rød) visualiserer pericytes. DAPI (blå) kontrastfarve visualiserer kerner. VEGFA stabiliseret Vaskulaturen mens TGFβ induceret en fibrotisk svar. Billederne blev taget med en opretstående epifluorescensmikroskop med optiske skære funktion og kombineret med en computer-styrede 1,3 megapixel monokrom CCD kamera og image erhvervelse software, ved hjælp af en 20 x, 0,8 NA, mål. Ni optiske dele blev kombineret ved hjælp af billedbehandlingsprogram ImageJ. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Video
Video 1. 3D volumen rekonstruktion af en indfødt FT farves ved hele-mount immunfluorescens. CD31 (grøn), Lyve1 (rød). Hoechst-33342 kontrastfarve (blå) visualiserer kerner. Billedet blev taget med en opretstående epifluorescensmikroskop med optiske skære funktion og kombineret med en computer-styrede 1,3 megapixel monokrom CCD kamera og image erhvervelse software, ved hjælp af en 20 x, 0,8 NA, mål. 3D volumen genopbygning og videogengivelse blev udført ved hjælp af en kommerciel software. En del af videoen er genoptrykt med tilladelse fra Gucciardo et al. 11. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I betragtning af betydningen af relevante væv mikromiljø for pålidelig funktionelle celle og molekylær mekanistiske resultater er det bydende nødvendigt at finde passende eksperimentelle modeller, der giver dette væv miljø. Den heri beskrevne ex vivo PDR kultur model til fibrin-embedded FTs giver mulighed for undersøgelse af mekanismerne af PDR Patofysiologi i native, komplekse og flercellede forbindelse med PDR kliniske prøver.

Kritiske trin i protokollen er ordentlig fibrin gel dannelse, positionering af FT og tilstrækkelig vask under farvning. Da fibrin gel dannelse for det meste afhænger af thrombin aktivitet, påvirket af koncentration og temperatur, skal mængden af thrombin justeres for hver batch af fibrin gel forberedelse. Fibrin gel dannelse bør være hurtig nok til at forhindre 2D vækst af FT explants men også langsomt nok til at tillade placering af FT til midten af dråberne vertikalt og horisontalt. I tilfældet FT tilfældigvis finde på kanten af en droplet, kunne yderligere pipettering støtte placeringen af FT til centrum. FTs der stadig er på kanten af dråber eller at vokse i 2D skal udelukkes. Passende vaske under farvning og undgå tørring af dråberne er igen kritisk for at optimere farvning og minimere baggrund signal. Overførselstider kan også være kritisk. Vi har indlejret FTs op til to timer efter vitrectomy og dette påvirkede ikke ex vivo vækst. Virkningen af længere overførselstider på kultur succes skulle afprøves.

Denne protokol kan ændres ved hjælp af alternative matricer for FT indlejring. In vivo, PDR neovessels vokse mod den glasagtige cortex rig på kollagen23. Dog ved vaskulær lækage serum komponenter, herunder fibrinogen, opløses i glaslegemet i umiddelbar nærhed af de fartøjer, hvorved den fibrotisk svar er indledt. Derfor, in vitro-fibrin blodprop blev udnyttet her for ex vivo kultur for at kendetegner den foreløbige ECM dannet i den betændte fibrotisk miljø af PDR15,21,22. Alternativt, fibrin blodpropper kunne suppleres med laminin og fibronektin at ændre dæmpningen af spiring kapillærer, eller explants kunne integreres inden for type I-kollagen og andre blandet matricer til kendetegner de mest fibrotisk microenvironments i neovaskulær væv. Disse matricer er generelt egnet til 3D kultur og hele-mount immunofluorescens men deres virkninger på PDR FTs fortsat skal testes og overvejelser om timingen af 3D matrix dannelsen skal gøres for at holde sig inden for grænserne for at forhindre 2D vækst18,19. Når den fysiske nærhed af Forskningsenheden til hospitalet udgør en begrænsning, kunne længere overførselstider kompenseres med team arbejde; TA løsning forberedelse, fibrinogen steril-filtrering og fibrin gel dannelse test kan udføres under FT overførsel. Hvis fibrin geler ikke danner selv efter 1 time, der kan være opstået et problem med fibrinogen eller TA løsning forberedelse. I dette tilfælde kan ikke FT/fibrin geler bruges.

Begrænsninger af denne tilgang, som med enhver ex vivo tilgang, er den varierende kvalitet af primære væv modellen på tværs af enkeltpersoner såvel som intra patient og indbyrdes patient væv heterogenitet. For diabetespatienter omfatter en del af denne variabilitet omfanget af vascularization og fibrose, der afhænger af mange faktorer som varighed af sygdom, metabolisk tilstand, genetiske/epigenetiske faktorer, type i diabetes og systemisk terapi. Størrelsen af den kirurgiske PDR FT inddrives er også en begrænsende faktor for antallet af forhold, der kan undersøges for hver prøve. Samtidig give gensidige geografisk information, tillader hele-mount immunofluorescens undersøgelse af kun en begrænset mængde af funktioner/markører pr. slipværktøj. Som et kompromis, kan fibrin dråber alternativt være indlejret i paraffin, skåret i tynde sektioner og analyseret af Immunhistokemi.

Eksisterende diabetisk mus modeller udvikler mange funktioner i tidligt stadium DR men undlader at omfattende sammenfatte de gradvise forandringer i menneskelige PDR, dermed hindre undersøgelser af PDR sygdom mekanismer7,8. Derudover er murine øjet fundamentalt forskellige fra det menneskelige øje, idet det mangler den gule plet, yderligere understreger vigtigheden af at studere menneskers sygdom24. Den kirurgiske PDR FTs enten tidligere blevet kasseret eller anvendes til paraffinsnit, transmissions elektronmikroskopi, seriel blok ansigt-scanning elektronmikroskopi, bulk RNA sekvensering eller 2D kultur af dissocierede celler3,25 . Den heri beskrevne model giver 3D karakterisering af denne dyrebare kirurgisk materiale, samt undersøgelse af PDR Patofysiologi i native sygt væv mikromiljø. Når det kombineres med brug af glasagtige væske, kan denne model også undersøgelse af bidrag på både den cellulære og acellulær PDR mikromiljø. Da kulturer reagere effektivt på vækstfaktorer opdaget i glaslegemet, såsom VEGFA, bFGF, er VEGFC og TGFβ, dermed recapitulating funktioner af PDR Patofysiologi, denne PDR ex vivo kultur model modtagelig for afprøvning eller udvikle nye PDR behandlinger 11. i denne model, anti-VEGFA forhindret kapillær spiring og induceret tegn på kapillær regression, reaktioner, der er i overensstemmelse med de forventede kliniske resultater af anti-VEGFA behandling26,27. Denne model kan derfor også bruges til bedre forståelse af virkningerne af aktuelle behandlinger, herunder anti-VEGFA og kortikosteroid behandlinger.

Med live-celle imaging instrumentation, den heri beskrevne ex vivo kultur model kunne blive udsat for time-lapse mikroskopi at tillade real-time undersøgelse af processer såsom vaskulære regression, spirende og cellulære plasticitet. Når det kombineres med in vitro- og in vivo modeller samt kliniske data, dette ex vivo PDR model vil hjælpe i efterforskningen af patienternes svar baseret på særlige sæt af identificering af markører, et skridt nærmere til avenue for personlig medicin. At identificere patienten-specifikke svar og/eller svar-specifikke markører er især relevant for PDR, som er en multifaktoriel sygdom med et komplekst samspil af mikrovaskulære, neurodegenerative, metabolisk, genetiske/epigenetiske, immunologiske og betændelse-relaterede faktorer, og det kræver mere og mere tværfaglig indsats for udvikling af forbedret terapeutiske målretning og sygdom management. Udover hele-mount immunofluorescens analyserer ex vivo kulturperler FTs kan også hentes fra fibrin af plasmin/nattokinase behandling og udsat for transkriptom og proteom28. Egnetheden af de heri beskrevne model for ex vivo studier af fibrovascular væv udvikles i andre okulære betingelser, som i svære tilfælde af seglcelleanæmi retinopati, kunne også undersøges i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne er meget taknemmelig for medicinsk og kirurgisk nethinden kolleger, sygeplejersker og hele personalet i diabetisk enhed og Vitreoretinal kirurgi enhed på Institut for oftalmologi, Helsinki University Hospital for aktivt at deltage i rekruttering af patienter. Vi takker Biomedicum Molekylær Imaging enhed for billedbehandling faciliteter. Vi takker Anastasiya Chernenko for fremragende teknisk bistand. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Academy i Finland (KL), Helsinki Universitet (KL), Sigrid Juselius Foundation (KL), K. Albin Johansson Foundation (KL), finsk Cancer Institute (KL), Karolinska Institutet (KL), finsk øjet Foundation (SL), øjet og Tissue Bank Foundation (SL), Mary og Georg C. Ehrnrooth Foundation (SL) og HUCH klinisk forskningstilskud (TYH2018127 efter TYH2016230, SL), Diabetes Research Foundation (SL, KL, AK, EG) samt af ph.d.-programmet i biomedicin (EG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Microforceps Medicon 07.60.03 Used for handling the FTs
Disposable Scalpels - Sterile Swann-Morton 0513 Used for FT dissection
Culture dish, vented, 28 ml (60mm) Greiner Bio-One 391-3210 Used for dissection and for testing fibrin gel formation
Cell culture plates, 12-well Greiner Bio-One 392-0049 Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL Greiner Bio-One 391-3477
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL Greiner Bio-One 525-0384
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF Millipore SLGV033RS Used to sterile-filter the fibrinogen solution
Syringe, 10 mL Braun 4606108V Used to sterile-filter the fibrinogen solution
Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL Fisher FB74031
Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well Nunc 142475 Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture
Cell culture plates, 96-well, U-bottom Greiner Bio-One 392-0019 Used for whole-mount immunofluorescence
Round/Flat Spatulas, Stainless Steel VWR 82027-528 Used for whole-mount immunofluorescence
Coverslips 22x22mm #1 Menzel/Fisher 15727582 Used for mounting
Microscope slides Fisher Kindler K102 Used for mounting
Absorbent paper VWR 115-0202 Used for mounting
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
PBS tablets Medicago 09-9400-100 Used for preparing 1x PBS
Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma Calbiochem 341578
Hanks Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich H9394-500ML Used for preparing the fibrinogen and TA solution
Fetal bovine serum Gibco 10270106 Used for preparing the blocking solution
Human Serum Sigma-Aldrich H4522 Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media
Gentamicin Sulfate 10mg/ml Biowest L0011-100
Endothelial cell media MV Kit Promocell C-22120 Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement,  500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL)
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood.
Acetone Sigma-Aldrich 32201-2.5L-M Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.
Methanol Sigma-Aldrich 32213 Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.
Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate) Sigma-Aldrich T9284 Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing.
Hoechst 33342, 20mM Life Technologies 62249 For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Laboratories H-1000 Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200 Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
Eukitt Quick-hardening mounting medium Sigma-Aldrich 03989-100ml TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder Sigma-Aldrich T9549-500UN  Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw
Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder Sigma A3428 Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw
Name Company Catalog Number Comments
Growth factors
Recombinant human VEGFA R&D Systems 293-VE-010 50 ng/ mL final concentration
Recombinant human VEGFC R&D Systems 752-VC-025 200 ng/ mL final concentration
Recombinant human TGFβ Millipore GF346 1 ng/ mL final concentration
Recombinant human bFGF Millipore 01-106 50 ng/ mL final concentration
Name Company Catalog Number Comments
Primary antibodies
CD31 (JC70A) Dako M0823 Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD34 (QBEND10) Dako M716501-2 Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD45 (2B11+PD7/26) Dako M070129-2 Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD68 ImmunoWay RLM3161 Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
Cleaved caspase-3 (5A1E) Cell Signalling 9664 Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
ERG (EP111) Dako M731429-2 Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
GFAP Dako Z0334 Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Ki67 Leica Microsystems NCL-Ki67p Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Lyve1 R&D Systems AF2089 Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab
NG2 Millipore AB5320 Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Prox1 ReliaTech 102-PA32 Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab
Prox1 R&D Systems AF2727 Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab
VEGFR3 (9D9F9) Millipore MAB3757 Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
α-SMA (1A4) Sigma C6198 Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated
Name Company Catalog Number Comments
Secondary antibodies
Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG Life Technologies A-21202 Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG Invitrogen A-11012 Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG Thermo Scientific A-11057 Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG Thermo Scientific A-11036 Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG Molecular Probes A-21468 Used at 1:500 dilution
Name Company Catalog Number Comments
Microscopes
Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope Zeiss For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT
SZX9 upright dissection stereomicroscope Olympus For FT dissection
LSM 780 confocal microscope Zeiss For imaging of whole-mount immunostained FT
AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome Zeiss For imaging of whole-mount immunostained FT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
  2. Liew, G., Wong, V. W., Ho, I. V. Mini Review: Changes in the Incidence of and Progression to Proliferative and Sight-Threatening Diabetic Retinopathy Over the Last 30 Years. Ophthalmic Epidemiology. 24 (2), 73-80 (2017).
  3. Loukovaara, S., et al. Indications of lymphatic endothelial differentiation and endothelial progenitor cell activation in the pathology of proliferative diabetic retinopathy. Acta Ophthalmologica. 93 (6), 512-523 (2015).
  4. Stitt, A. W., et al. The progress in understanding and treatment of diabetic retinopathy. Progress in Retinal and Eye Research. 51, 156-186 (2016).
  5. Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies. JCI Insight. 2 (14), (2017).
  6. Gross, J. G., et al. Five-Year Outcomes of Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial. JAMA Ophthalmology. 136 (10), 1138-1148 (2018).
  7. Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Disease Models, Mechanisms. 5 (4), 444-456 (2012).
  8. Villacampa, P., Haurigot, V., Bosch, F. Proliferative retinopathies: animal models and therapeutic opportunities. Current Neurovascular Research. 12 (2), 189-198 (2015).
  9. Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models, Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
  10. Sharma, T., et al. Surgical treatment for diabetic vitreoretinal diseases: a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 44 (4), 340-354 (2016).
  11. Gucciardo, E., et al. The microenvironment of proliferative diabetic retinopathy supports lymphatic neovascularization. The Journal of Pathology. 245 (2), 172-185 (2018).
  12. Rezzola, S., et al. 3D endothelial cell spheroid/human vitreous humor assay for the characterization of anti-angiogenic inhibitors for the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Angiogenesis. 20 (4), 629-640 (2017).
  13. Pepper, M. S., Montesano, R., Mandriota, S. J., Orci, L., Vassalli, J. D. Angiogenesis: a paradigm for balanced extracellular proteolysis during cell migration and morphogenesis. Enzyme, Protein. 49 (1-3), 138-162 (1996).
  14. Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs). Journal of Cell Science. 115 (Pt 17), 3427-3438 (2002).
  15. Loukovaara, S., et al. Quantitative Proteomics Analysis of Vitreous Humor from Diabetic Retinopathy Patients. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5131-5143 (2015).
  16. Abu El-Asrar, A. M., Struyf, S., Opdenakker, G., Van Damme, J., Geboes, K. Expression of stem cell factor/c-kit signaling pathway components in diabetic fibrovascular epiretinal membranes. Molecular Vision. 16, 1098-1107 (2010).
  17. Loukovaara, S., et al. Ang-2 upregulation correlates with increased levels of MMP-9, VEGF, EPO and TGFbeta1 in diabetic eyes undergoing vitrectomy. Acta Ophthalmologica. 91 (6), 531-539 (2013).
  18. Sugiyama, N., et al. EphA2 cleavage by MT1-MMP triggers single cancer cell invasion via homotypic cell repulsion. Journal of Cell Biology. 201 (3), 467-484 (2013).
  19. Tatti, O., et al. MMP16 Mediates a Proteolytic Switch to Promote Cell-Cell Adhesion, Collagen Alignment, and Lymphatic Invasion in Melanoma. Cancer Research. 75 (10), 2083-2094 (2015).
  20. Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
  21. Senger, D. R. Molecular framework for angiogenesis: a complex web of interactions between extravasated plasma proteins and endothelial cell proteins induced by angiogenic cytokines. American Journal of Pathology. 149 (1), 1-7 (1996).
  22. Senger, D. R., Davis, G. E. Angiogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (8), a005090 (2011).
  23. Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
  24. Marmorstein, A. D., Marmorstein, L. Y. The challenge of modeling macular degeneration in mice. Trends in Genetics. 23 (5), 225-231 (2007).
  25. Kim, L. A., et al. Characterization of cells from patient-derived fibrovascular membranes in proliferative diabetic retinopathy. Molecular Vision. 21, 673-687 (2015).
  26. Avery, R. L., et al. Intravitreal bevacizumab (Avastin) in the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Ophthalmology. 113 (10), e1691-e1615 (2006).
  27. Zhao, L. Q., Zhu, H., Zhao, P. Q., Hu, Y. Q. A systematic review and meta-analysis of clinical outcomes of vitrectomy with or without intravitreal bevacizumab pretreatment for severe diabetic retinopathy. The British Journal of Ophthalmology. 95 (9), 1216-1222 (2011).
  28. Carrion, B., Janson, I. A., Kong, Y. P., Putnam, A. J. A safe and efficient method to retrieve mesenchymal stem cells from three-dimensional fibrin gels. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (3), 252-263 (2014).

Tags

Retraktion spørgsmålet 143 Ex vivo kultur fibrovascular væv proliferativ diabetisk retinopati patient-afledte kliniske prøver Vaskulaturen sygdom Patofysiologi tre-dimensionelle hele-mount immunofluorescens vitrectomy neovessel.
En Ex Vivo vævskultur Model for Fibrovascular komplikationer i proliferativ diabetisk retinopati
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gucciardo, E., Loukovaara, S.,More

Gucciardo, E., Loukovaara, S., Korhonen, A., Lehti, K. An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy. J. Vis. Exp. (143), e59090, doi:10.3791/59090 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter