Summary
Nous présentons ici un protocole afin d’étudier la physiopathologie de la rétinopathie diabétique proliférante en utilisant les tissus dérivés de patient, excisées chirurgicalement, fibrovasculaire pour tridimensionnelle native caractérisation et ex vivo vitroplants. Cela ex vivo modèle de culture est également prête pour tester ou développer de nouveaux traitements.
Abstract
Rétinopathie diabétique (RD) est la complication la plus fréquente microvasculaire du diabète et une des principales causes de cécité chez les adultes en âge de travailler. Aucun cours modèles animaux de diabète et de la rétinopathie induite par l’oxygène ne développent les gamme complète des changements progressifs manifestées dans la rétinopathie diabétique proliférative humaine (PDR). Par conséquent, la compréhension de la pathogenèse de la maladie et la physiopathologie s’est appuyé en grande partie sur l’utilisation de coupes histologiques et vitreux échantillons dans les approches qui seulement stationnaire renseignent sur les facteurs pathogènes impliqués. Augmentant la preuve indique que les cellules dynamiques et interactions cellule-extracellulaire (ECM) dans le cadre des trois dimensions (3D) micro-environnements sont essentielles pour les études mécanistiques et fonctionnels vers le développement de nouveau stratégies de traitement. Par conséquent, nous avons supposé que le tissu fibrovasculaire pathologique excisé chirurgicalement des yeux avec les PDR pourrait servir à démêler avec fiabilité les mécanismes cellulaires et moléculaires de cette maladie dévastatrice et de tester le potentiel de roman clinique interventions. À cette fin, nous avons développé une nouvelle méthode pour la 3D ex vivo culture d’excisées chirurgicalement dérivé de patient fibrovasculaire tissulaire (FT), qui servira comme un modèle pertinent de physiopathologie humaine de PDR. Les FTs sont disséqués dans les explants et incorporées dans la matrice de fibrine pour ex vivo characterization de culture et de la 3D. Immunofluorescence entier-montent des FTs natives et des cultures de point final permet une enquête approfondie de la composition du tissu et des processus multicellulaires, soulignant l’importance de la caractérisation au niveau du tissu 3D pour découvrir les caractéristiques pertinentes des Physiopathologie de la RDP. Ce modèle permettra l’évaluation simultanée des mécanismes moléculaires, les processus cellulaire/tissulaire et les réactions aux traitements dans le cadre complex des interactions biochimiques et physiques dynamiques au sein de l’architecture de tissu PDR et le microenvironnement. Étant donné que ce modèle reprend la physiopathologie de la RDP, il sera également prête pour tester ou développer de nouveaux traitements.
Introduction
DR est une complication oculaire grave de diabète, une maladie qui a atteint des proportions énormes dans les dernières trois décennies1. Vingt ans après que le diagnostic, pratiquement tous les patients atteints de diabète de type 1 et 60 % des patients avec type 2 diabète présente des signes de rétinopathie, rendant le diabète en soi l’un des principaux causes de cécité dans le travail des adultes d’âge2. Selon le degré de dégénérescence microvasculaire et dommages ischémiques, DR est classé dans non-Proliférante (non-PDR) et DR proliférative (PDR). La maladie terminale, Lao, se caractérise par une néovascularisation induite par l’ischémie et l’inflammation et réponses fibreux à l’interface vitréo-rétinienne. Dans des conditions non traitées, ces processus conduira à la cécité due à l’hémorragie vitréenne, rétinienne fibrose, décollement de rétine Tractionnel et néovasculaire glaucome3,4. Malgré des progrès récents, les options thérapeutiques actuelles ciblent uniquement DR stades, y compris le œdème maculaire diabétique et PDR, lorsque les dommages rétiniens a déjà s’ensuivit. En outre, une grande proportion des patients du DR ne bénéficie pas actuel arsenal thérapeutique, ce qui indique un besoin urgent de traitements améliorés4,5,6.
Plusieurs autres jen vivo maladie/développement modèles et modèles animaux diabétiques ont été développés à ce jour, mais aucun d’eux ne récapitule l’ensemble des caractéristiques pathologiques observées dans humain RDP7,8. En outre, augmentant la preuve indique que les réactions aux traitements sont correctement raccordées à la composition de l’ECM ainsi que l’arrangement spatial et l’interaction entre le microenvironnement cellulaire et acellulaire9. Nous avons, par conséquent, entrepris d’élaborer un modèle cliniquement pertinent de RDP humain en utilisant le matériel pathologique FT qui est communément excisé d’yeux subissant la vitrectomie dans le cadre de la prise en charge chirurgicale des PDR10.
Ce manuscrit a décrit le protocole pour la 3D ex vivo culture et caractérisation de la chirurgicalement-excisés, PDR patient-dérivés FT pathologique. La méthode décrite ici a été utilisée dans une publication récente qui a démontré le succès déconstruction du paysage tissu PDR 3D native et récapitulation des éléments de physiopathologie PDR y compris angiogénique et réponses fibreuses de l’anormal 11de structures vasculaires. Ce modèle a également révélé caractéristiques nouvelles qui ne peuvent pas être facilement appréciés de fines coupes histologiques, tels que dans l’espace confiné l’apoptose et la prolifération comme îlot vasculaire formation11. Fluide vitreux a été utilisé avec succès par d’autres sur les cultures de sphéroïde endothéliales 3D pour évaluer son potentiel angiogénique et l’efficacité des molécules d’angiostatique12. Lorsqu’il est combiné avec un sphéroïde 3D cellules endothéliales lymphatiques (LEC) in vitro test à l’aide de corps vitré PDR comme stimulant la germination, notre modèle a révélé que la contribution de ces deux Vitréennes soluble des facteurs aussi bien en tant que locales repères dans le tissu néovasculaire à la comme encore mal compris ESL participation aux PDR physiopathologie3,11. Dans la gestion de RDP, chirurgie vitréo-rétinienne est une procédure régulièrement effectuée pourtant difficile. Comme techniques et instrumentations chirurgicales voient avancement continu et sophistication, opportune et prudente enlèvement de spécimen proliférative fibrovasculaire non seulement améliore l’issue de la vision, mais renferme aussi des documents de tissus précieux pour le enquête de PDR pathophysiologie et traitement réponses chez les aspects complexes et translationnelles du microenvironnement des tissus humains vivants.
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Protocol
Cette recherche a été approuvée par l’Institutional Review Board et le Comité d’éthique de l’hôpital universitaire de Helsinki. Le consentement éclairé signé a été obtenu chez chaque patient.
1. préparation des Solutions, des médias et des équipements
- Préparer le matériel suivant avant le prélèvement du tissu fibrovasculaire (FT) pour assurer un traitement rapide.
- Pincettes de microdissection stérile-autoclave deux.
- Préparer 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dissoudre 1 comprimé de PBS pré-pesés (0,14 M NaCl, KCl, M 0,010 PO4-3de 0,0027 M) dans 900 mL d’eau désionisée et mélanger pour dissoudre. Ajuster le volume d’eau jusqu'à 1 L et stérile-autoclave la solution prêt. Magasin à température ambiante.
- Rassembler les solution mentionnée ci-dessus et les équipements dans un panier, avec un scalpel stérile à usage unique, une boîte de Petri stérile cellule de 6 cm et cinq plaques de culture de cellules de 12 puits stériles.
- Préparer un 6 mg/mL solution de fibrinogène dans Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) en dissolvant 30 mg de fibrinogène humain appauvris en plasminogène dans 5 mL de HBSS, à l’aide d’un tube de 50 mL, plongé dans un bain d’eau à 37 ° C, pendant au moins 1 h.
NOTE : Cette solution peut être conservée dans le bain d’eau (37 ° C) pendant 7 h (maximum 10 h) avant l’utilisation. - Préparer l’ex vivo milieu de culture en ajoutant 5 % de sérum de veau foetal (FCS) ou 5 % de sérum humain, supplément de croissance des cellules endothéliales 0,4 %, 10 ng/mL recombinant humain facteur de croissance épidermique, 1 hydrocortisone μg/mL et 50 μg/mL gentamicine à disponibles dans le commerce milieu de culture de cellules endothéliales et gardez au bain-marie à 37 ° C jusqu'à l’utilisation. Conserver à 4 ° C pendant jusqu'à un mois.
2. la Dissection des tissus fibrovasculaire
- Recueillir le tissu fibrovasculaire (FT) qui ont été retirée des sujets humains en cours de chirurgie vitréo-rétinienne de micro-incision trans-conjonctivale, par 23 20 jauge trois ports pars plana vitrectomie ou dans le cadre de la gestion de chirurgie vitréo-rétinienne de RDP.
Remarque : Le FT est excisé à l’aide de la segmentation et le délaminage, couper si nécessaire avec microciseaux et retirée de la cavité vitréenne avec intraoculaire micropinces fin-préhension par chirurgien expérimenté vitréo-rétinienne. Un soin extrême doit être pris pour retirer intact et non-endommagé FT sans endommager les structures oculaires y compris le nerf optique ou temporelle arcade vasculaire où se trouve plus souvent le tissu pathologique néovasculaire. La taille des tissus excisés est variable, généralement compris entre 3 et 50 mm2. - Garder le pieds dans une boîte de Petri de cellule 6 cm ou un tube de 1,5 mL contenant 1 mL de PBS stérile placée sur la glace humide et de le transférer immédiatement à la recherche de laboratoire pour le traitement.
Remarque : Il est essentiel que l’unité de recherche (laboratoires) est physiquement à proximité de la salle d’opération de l’hôpital (OR) pour minimiser les temps de transfert de la petite FT excisé. Dans ce cas, le transfert prend moins de 5 minutes et les explants sont incorporées dans la fibrine habituellement en 1 à 1,5 h (maximum 2 h) après l’ablation chirurgicale. L’impact du temps de transfert plus long sur la culture 3D devront être testés. - Placez le pieds dans une boîte de Petri de 6 cm cellule contenant 1 mL de PBS à température ambiante (RT, 25 ° C) et acquisition d’images du tissu à l’aide d’un microscope à épifluorescence inversé avec un objectif 5 x.
Remarque : Les Images sont acquises pour la documentation et l’évaluation qualitative. Il sera possible d’observer la taille des tissus, la densité et la composition générale (p. ex., les structures vasculaires). - Couper le FT en ~ 1 mm2 morceaux sous un stéréomicroscope de dissection verticale, à l’aide d’une pince à épiler bistouri et microdissection stérile. Maintenez le tissu, bien immergé dans du PBS, à l’aide d’une pince de microdissection et effectuer les coupes à blanc à l’aide d’un scalpel stérile. Éviter la déchirure FT, car cela altérerait les structures fibrovasculaire natives.
- Placer chaque pièce dans un puits d’une plaque de culture de cellules de 12 puits contenant 1 mL de PBS stérile.
Remarque : Si nécessaire, délicatement étalées le FT sur la plaque, à l’aide de pincettes microdissection, avant d’exécuter des coupes.
3. coulée verticale fibrine Gel gouttelettes pour la caractérisation des FT Native et de la Culture de l’Ex Vivo
- Stérile-filtrer la solution de fibrinogène prêt, préparée à l’étape 1.2 avec filtre 0,22 μm monté dans une seringue de 10 mL.
- Préparer des aliquotes de, solution de fibrinogène (25 μL / tube 1,5 mL) et à RT. Prepare une partie aliquote de fibrine gel / chaque pièce FT obtenue après la dissection, et un couple d’aliquotes supplémentaires pour tester la fibrine gel formation.
- Préparer une solution de HBSS contenant 4 unités/mL de thrombine et 400 μg/mL d’aprotinine, appelé ci-après TA solution et la garder au RT. Prepare autant solution TA selon les besoins, en fonction du nombre de pièces obtenues après dissection (25 μL de TA solution est utilisée pour chacun Gel de FT/fibrin) et un montant supplémentaire (par exemple, 250 μL) pour tester la formation de gel de fibrine et de veiller à ce que suffisamment de solution est disponible tout au long de la coulée des gouttelettes gel de fibrine.
Remarque : Thrombine est nécessaire pour la polymérisation de la fibrine tandis que l’aprotinine est ajouté pour prévenir la dégradation de la fibrine gel par des protéases cellulaires exprimées par la FTs13,14. - Tester le calendrier de formation de gel de fibrine : ajouter 25 μL de solution TA à la solution de fibrinogène 25 μL aliquotés préparée à l’étape 3.2 et, à l’aide d’une autre pipette la valeur 50 μL, mélanger dans le tube de pipetage et diluer dans une boîte de Petri de cellule de 6 cm , formant des gouttelettes d’un diamètre vertical.
Remarque : La formation de gel de fibrine interviendrait dans ~ 1 min. Si cela prend plus de 1,5 min, la concentration de la thrombine dans la solution de TA préparée à l’étape 3.3 peut être augmentée en ajoutant plus solution mère de thrombine. Un dixième du volume de solution mère de thrombine initialement utilisé peuvent être ajouté, à plusieurs reprises, jusqu'à ce que la formation de gel de fibrine se produit moins de 1,5 min. Le temps de formation de gel de fibrine est critique pour les trois dimensions de la culture, comme gel rapide empêche la pièce de FT de couler au fond du gel de fibrine et donc entrer en contact avec la surface en plastique 2D de la cellule de formation (à moins de 1,5 minutes) plaque de culture, qui peut conduire à l’adhésion cellulaire 2D et une excroissance. - Placez des FT un morceau au centre d’un puits d’une plaque de 24 puits à l’aide d’une pince stérile et enlever tout excès PBS en pipettant également, avec une pipette μL de 0,5 à 10 afin d’éviter la force d’aspiration sur le central de FT. Dans le cas que le tissu colle à la pince à épiler, utilisez une pince supplémentaire pour faciliter le placement de la pièce de tissu sur la plaque.
Remarque : Les gels de FT/fibrine peuvent également s’exprimer sur plaque 48 puits à réduire l’utilisation de réactifs. Cependant, c’est plus difficile car l’espace est plus restreint et fibrine se propage si elle entre en contact avec la paroi du puits. - Ajouter 25 μL de TA solution à la solution de fibrinogène 25 μL aliquotés à l’étape 3.2, et 50 μL de mélange dans le tube à l’aide de la pipette une autre valeur par pipetage. Répartir sur la pièce de pieds bien placée sur la plaque, et pipette de haut en bas de 2 - 3 fois afin d’y inclure la pièce FT dans la goutte verticale, en fournissant une matrice 3D environnante de la pi.
Remarque : Veiller à ce que la PI n’est pas aspiré pendant le pipetage et qu’aucune bulle d’air ne se forment. S’assurer également que le mélange, la dispensation et pipetage sont effectuées rapidement comme le gel de fibrine formeront dans 1,5 min, qu’il est testé à l’étape 3.4. Si le casting des gels de fibrine sur plaque 48 puits, utilisez plutôt 20 μL de solution de fibrinogène et 20 μL de TA solution. - Répétez les étapes 3.5 et 3.6 pour toutes les pièces FT.
- Laissez les gels de fibrine se solidifier en incubant les plaques dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C en atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2.
- Après 0,5 à 1 h, vérifier que le gel de fibrine est complètement formé par soigneusement l’inclinaison de la plaque. Passez à l’étape 3.10 quand le gel ne bouge pas lorsque la plaque est inclinée, ce qui indique que la formation de gel de fibrine est terminée.
- Superposer les gels FT/fibrine avec ex vivo milieu de culture (600 μL/puits en plaque 24 puits) ou 300 μL/puits en plaque 48 puits additionnés de 100 μg/mL aprotinine. Pipetter doucement le milieu par goutte-à-goutte dispensation.
NOTE : Ici, aprotinine sert à prévenir la dégradation de la fibrine gel par des protéases cellulaires exprimées par la FTs13,14. L’ex vivo, milieu de culture peut en outre être complété avec des facteurs de croissance recombinants, tels que VEGFA, VEGFC, bFGF, TGFβ (voir Table des matières)11. - Replacez le FT ex vivo plaque de culture dans les 37 ° C, 5 % CO incubateur de culture de2 cellules et de la culture pour la période souhaitée (par exemple, 2 - 18 jours, la culture plus longue périodes devront être testés). Remplacez 50 % de la moyenne avec frais ex vivo milieu de culture tous les trois jours.
4. « dans la matrice » imagerie
- Acquisition d’images de la FT ex vivo cultures sur le même jour (jour 0) et à intervalles réguliers (par exemple, tous les deux jours), en utilisant un microscope à épifluorescence inversé, pour suivre la croissance de 3D.
Remarque : Les images obtenues peuvent être utilisés pour la quantification de l’excroissance FT, comme la longueur totale des deux diamètres perpendiculaires à travers l' explant11.
5. native FT et Ex Vivo Culture point final
Remarque : Les gels FT/fibrine peuvent être cultivées ex vivo pour la période souhaitée (FT ex vivo cultures) ou fixés sur le même jour (native FT) pour native FT caractérisation11.
- Difficulté de la FT natif ou le FT ex vivo cultures en remplaçant le milieu de culture avec 1 mL/puits de paraformaldéhyde à 4 % dans une solution de PBS, pendant 1 h à température ambiante. Pour les gels natifs de FT/fibrine, difficulté à 0,5 ou 1 h après l’addition de l’ex vivo culture moyen (si les gels de fibrine n’ont pas été imbibés dans le milieu, fixation les endommagera).
Remarque : Exécutez cette étape sous hotte paraformaldéhyde étant corrosives, toxiques et cancérigènes. - Rincer les gels FT/fibrine avec trois lavages 5 min dans du PBS (2 mL/puits).
- Remplacer le PBS avec 2 mL/puits de PBS contenant 0,02 % d’azide de sodium et de stocker les gels de fibrine fixe à 4 ° C jusqu'à ce que la poursuite de la procédure. Sceller les plaques avec du film de paraffine pour s’assurer que les gels FT/fibrine ne séchez pas en stock.
Remarque : Exécutez cette étape sous hotte comme l’azoture de sodium est toxique.
6. ensemble-Mont Immunofluorescence souillant
Remarque : Ce protocole dure 5 jours et peut être interrompu par des incubations durant la nuit lorsque indiqué. Ne laissez pas la fibrine gels sécher à tout moment. Toutes les mesures sont effectuées à la RT, sauf indication contraire.
- Préparer les solutions suivantes avant de commencer le protocole de coloration.
- Après fixation solution : préparer la solution de l’acétone : méthanol à 50/50 en mélangeant des quantités égales d’acétone et de méthanol (p. ex., 50 mL). Conserver à-20 ° C. Préparer cette solution plus tard le jour avant la coloration. Cette solution peut être stockée à-20 ° C et être utilisée pour les salissures.
NOTE : Préparer cette solution sous hotte comme l’acétone et le méthanol sont inflammables et dangereux pour la santé. - Bloquant la solution : préparer un 15 % foetale de sérum bovin (FBS), 0,3 % octyl phénol éthoxylate solution dans du PBS par premier ajout 15 % FBS à PBS. Ajouter octyl phénol éthoxylate et mélanger pour dissoudre. Conserver à 4 ° C.
NOTE : Cette solution peut être préparée en grande quantité à l’avance, stockés en aliquotes de 15 mL à-20 ° C et décongelés avant utilisation, le jour où le protocole de coloration est démarré. Utilisez un Intervento fraîchement préparé ou fraîchement décongelée pour chaque protocole de coloration. - Solution de lavage : préparer 1 L de PBS additionné de 0,45 % octyl phénol éthoxylate en ajoutant 4,5 mL d’octyle phénol éthoxylate à 995,5 mL de PBS. Mélanger pour dissoudre. Magasin à température ambiante.
- Après fixation solution : préparer la solution de l’acétone : méthanol à 50/50 en mélangeant des quantités égales d’acétone et de méthanol (p. ex., 50 mL). Conserver à-20 ° C. Préparer cette solution plus tard le jour avant la coloration. Cette solution peut être stockée à-20 ° C et être utilisée pour les salissures.
- Soulevez les gouttelettes délicatement de la plaque à l’aide d’une spatule de bout carré en acier inoxydable. Détacher la goutte tout d’abord les bords avant de soulever le centre et transférer dans un puits de la plaque de 12 puits contenant 1 mL de PBS.
Remarque : Effectuez après fixation, les lavages et les mesures de blocage dans ce format de plaque. - Fixer les gouttes avec 1 mL de solution d’acétone : méthanol glacée 50/50 ~ 1 min (la frontière des gouttelettes tournera blanche).
Remarque : Exécutez cette étape sous hotte comme l’acétone et le méthanol sont dangereux pour la santé. - Rincer avec 3 à 5 lavages dans 2 mL de PBS (les gouttelettes vont couler dans la solution de PBS lorsque la réhydratation est terminée).
Remarque : Ne pas toucher les gouttelettes avec l’embout de la pipette comme, après après fixation, elles sont collantes au plastique. Dans tout le protocole, éviter l’aspiration après correction, anticorps, blocage et solutions de lavage par aspiration, car cela peut endommager ou détruire complètement les gouttelettes. Au lieu de cela, inclinaison de la plaque et retirer délicatement à l’aide d’une pipette de 500-5 000 μL des solutions. - Centrifuger la solution de saturation à 21 000 x g et 4 ° C pendant 15 minutes afin d’enlever les débris.
Remarque : La solution peut être aliquotée dans des tubes de 1,5 mL pour la centrifugation. La solution inutilisée peut être conservée à 4 ° C et utilisée pour toutes les étapes ultérieures pertinentes. - Incuber les gouttelettes en suspension dans 500 μL bloquant la solution pendant 2 h à température ambiante.
Remarque : Pour réduire le volume de bloquant la solution utilisée, la plaque peut être inclinée sur un support et aussi peu que 300 μL de solution/gouttelettes peut être utilisé. - Préparer le mélange d’anticorps primaire (au moins 30 μL/goutte) à dilution appropriée en bloquant la solution et centrifuger pendant 15 minutes à 21 000 x g et 4 ° C.
- Transférer les gouttelettes en rond (U)-fond de plaque 96 puits à l’aide d’une spatule à bordure ronde et incuber au moins 30 μL/goutte du mélange anticorps primaire durant la nuit à 4 ° C.
- Le lendemain, transfert les gouttelettes dans 12-puit sur plaque contenant 2 mL de solution/puits, de lavage, rinçage avec trois 5 min lave premier puis avec neuf 30 min lavages. Laisser le dernier lavage (2 mL) une nuit à 4 ° C.
- Le lendemain, rincer trois fois avec du PBS et transférer les gouttelettes en rond (U)-fond de plaque à 96 puits.
- Pendant les lavages, préparer le mélange de l’anticorps secondaire conjugué à un fluorophore approprié (dilué 1/500, au moins 30 μL/goutte) en bloquant la solution et centrifuger pendant 15 minutes à 21 000 x g et 4 ° C.
- Transférer les gouttelettes dans un rond (U)-bas plaque 96 puits à l’aide d’une spatule à bordure ronde et incuber au moins 30 μL du mélange anticorps secondaire, de 4 h à RT, abri de la lumière.
Remarque : Effectuez toutes les incubations ultérieures et des étapes de lavage abri de la lumière. - Transférer les gouttelettes dans la plaque de 12 puits contenant 2 mL de lavage solution/puits avec une spatule à bordure ronde, rinçage avec trois lavages de 5 min tout d’abord, puis avec quatre lavages de 30 min. Laisser le dernier lavage (2 mL) une nuit à 4 ° C.
- Le lendemain, rincez les gels avec cinq lavages de 30 min et puis trois fois avec du PBS. Laisser le dernier lavage (2 mL) une nuit à 4 ° C.
- Le lendemain, transvaser les gouttelettes dans un tour (U)-fond de plaque 96 puits à l’aide d’un noyaux de spatule et contre-colorant tranchant ronde en incubant 10 μg/ml Hoechst nucléaire tache (au moins 30 μL/goutte) pendant 30 minutes à température ambiante.
Remarque : Montage additionné de 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour les noyaux contre-coloration peut aussi être utilisé. Dans ce cas, cette étape et 6.16 sont ignorés, procéder directement à l’étape 6.17. - Transférer les gouttelettes dans la plaque de 12 puits contenant 2 mL de PBS/puits à l’aide d’une spatule ronde-tranchant et rincer trois fois avec du PBS.
- Monter les gouttes tombent sur lame de microscope comme suit :
- Appliquer une couche étroite du milieu de montage rapide-durcissement sur les bords d’une lamelle carrée 22 x 22 mm et laisser sécher pendant environ 1 minute. Effectuez cette étape pour chaque goutte individuellement, afin d’éviter un durcissement excessif de la milieu de montage.
Remarque : Exécutez cette étape sous hotte comme le support de montage rapide-durcissement est dangereux pour la santé. - Rincez la goutte par immersion dans un puits d’une plaque de 12 puits contenant 2 mL d’eau désionisée et transférer sur une lame de microscope, à l’aide d’une spatule ronde-tranchant. Enlevez l’eau excédentaire à l’aide d’un petit morceau de papier absorbant.
- Ajouter 15 μL de milieu non durcissante antifade montage sur la goutte.
NOTE : Sinon, si Hoechst tache nucléaire n’a pas été utilisé, montage milieu contenant 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) peut être utilisé. - Doucement, placez le couvercle en verre, avec le milieu de montage rapide-durcissement face à la lame microscopique, au cours de la goutte et laisser s’installer.
NOTE : Le milieu de durcissement rapide va coller à la lame microscopique et garder la goutte en place.
- Appliquer une couche étroite du milieu de montage rapide-durcissement sur les bords d’une lamelle carrée 22 x 22 mm et laisser sécher pendant environ 1 minute. Effectuez cette étape pour chaque goutte individuellement, afin d’éviter un durcissement excessif de la milieu de montage.
- Répétez l’étape 6.17 pour toutes les gouttelettes. Monter deux gouttes sur chaque lame de microscope.
- Laissez les lames sécher à l’air à ta pendant environ 2 h et conserver à 4 ° C durant la nuit. S’assurer que les diapositives sont positionnés horizontalement et abri de la lumière.
- Image le natif taché ou point final FT ex vivo de cultures à l’aide d’un microscope confocal ou un microscope à épifluorescence verticale équipé d’une fonction de sectionnement optique et 20 x ou 40 x, objectif. Fonction de tuile permet de capturer une plus grande surface du tissu à la fois.
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Representative Results
Meilleure compréhension des propriétés tissu fibrovasculaire PDR et expression de la protéine a compté principalement sur les échantillons vitreux et mince histologique FT sections3,15,16,17. Pour développer une méthode d’enquête approfondie sur l’organisation du tissu 3D et multicellulaires processus physiopathologiques de RDP, nous partîmes pour utiliser les excisées chirurgicalement, patient-FTs pathologiques pour la caractérisation 3D et ex vivo culture dérivée. Les FTs frais sont transférés au laboratoire de recherche et transformés comme l’illustre le flux de travail schématique à la Figure 1.
Les FTs peuvent être photographiées avant dissection d’évaluation qualitative et de documentation (Figure 2). Comme illustré à la Figure 2, les FTs affichent grande variation entre patients dans la taille, la densité et l’abondance des structures vasculaires. Dans certains tissus, cellules lâches, sans doute inflammatoire/immunitaire cellules ou globules rouges, ainsi que les structures vasculaires perméables de calibre différent peuvent également être facilement distinguées (Figure 2). Après dissection, une décision doit être faite sur l’utilisation en aval du nombre limite des explants obtenus. Une partie des explants est intégrée au sein de la matrice de fibrine et fixée après la formation de gel de fibrine, tandis que les explants restants peuvent être soumis aux ex vivo la culture sur une plaque séparée (Figure 1). Les FTs fraîches ont été utilisés avec succès pour ultrastructurale caractérisation par microscopie électronique. Les échantillons peuvent être que soit transformées en microscopie électronique à transmission conventionnelle (TEM) des coupes ultrafines ou bloc série visage-microscopie électronique (SBF-SEM)3,11.
Les gels de fibrine fixe peuvent être stockés pendant plusieurs semaines et colorées par immunofluorescence entiers18,19. Les échantillons colorés sont également stables à 4 ° C dans l’obscurité. Les gels FT/fibrine épaisses peuvent être photographiées en temps de façon efficace avec le microscope à épifluorescence équipé d’une fonction de sectionnement optique, utile pour atténuer la lumière diffusée d’out-of-focus. Imagerie avec cette méthode fournit une visualisation fine des structures. Par ailleurs, microscopie confocale, bien que plus exigeants temps, peut permettre la capture des détails plus fins. La caractérisation de la fraîchement incorporés fibrine et fixe, incultes, natifs de FTs par immunofluorescence entier-montent permet la caractérisation des structures vasculaires, plusieurs types de cellules et leur arrangement réciproque dans les tissus PDR 3D 11du paysage. Par exemple, CD31 anticorps peuvent être utilisées pour afficher l’endothélium et NG2 pour afficher des péricytes (Figure 3) tandis que les anticorps Lyve1 visualiser nouvellement découvert des structures en endothéliales lymphatiques (Figure 4)11. Multiples combinaisons d’anticorps peuvent être utilisés pour visualiser plusieurs structures et types de cellules (voir Table des matières) ; par exemple, ERG peut également visualiser l’endothélium, qui a un modèle d’expression discontinu dans la neovasculature PDR anormale. Les structures vasculaires colorés avec un marqueur de la membrane (par exemple, CD31 et Lyve1) peuvent être dosées pour la préservation et de la densité à l’aide de Angiotool, un logiciel libre-source développé par le National Cancer Institute des NIH11, 20. Volumes 3D peuvent également être rendues depuis le dataset obtenu (voir vidéo 1). Si un anticorps ne convient pas pour l’immunofluorescence entier-montent, les gouttelettes de fibrine peuvent alternativement être incorporés à la paraffine, coupés à lames minces et analysés par immunohistochimie. Dans ce cas les gouttelettes bénéficient de fixation durant la nuit à 4 ° C au lieu de 1 h à température ambiante.
Ex vivo la culture soutient la croissance des fibrine incorporé FTs, développement d’excroissances cellulaires déjà après deux jours (Figure 5). Le gel de fibrine in vitro est utilisé comme la matrice pour ex vivo la culture, car il est typique de l’ECM provisoire in vivo, formé après clivage de thrombine de fibrinogène de sérum sur les sites de la perméabilité vasculaire, en contact direct avec les néovaisseaux PDR qui fuit dans le enflammée fibrotique milieu15,21,22.
PDR est une complication microvasculaire caractérisée par une angiogénique et réaction fibreuse, et FT explants conservent ce répertoire cellulaire en culture, mais aussient répondent efficacement aux stimuli exogènes ajoutés à la culture media11. Les données représentatives sur la Figure 6 montrent que les cultures ex vivo PDR induisaient tandis que TGFβ induit une réponse fibrotique reflétée par l’excroissance la germination de la préservation de l’endothélium et système vasculaire CD31-positif en réponse à VEGFA, Péricytes séropositifs au NG2/CGS. Plusieurs stimuli exogènes peuvent être testées et, lorsque la part de mesures de leur abondance Vitréennes in vivo, la RDP ci-après développée ex vivo modèle de culture peut révéler roman microenvironnement et contexte dépendant PDR mécanismes pathologiques qui ne peuvent être visualisés en matériel tissulaire fixe.
La figure 1. Ex vivo Modèle de culture de tissu fibrovasculaire PDR. Représentation schématique du workflow de la chirurgie vitréo-rétinienne (pars plana vitrectomie) pour l’excision de la pi à sa dissection dans les explants et une incrustation dans la fibrine pour la culture en trois dimensions de caractérisation et ex vivo . S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Fraîchement excisées tissus fibrovasculaire PDR avant dissection. La phase contast micrographies de FTs fraîchement excisées prises avant la dissection. Les FTs sont très variables en taille, densité et l’abondance des structures vasculaires. Pointes de flèches indiquent les structures vasculaires de calibre différent. La ligne partiellement transparente rouge met en évidence deux navires individuels de calibre différent. Les images ont été prises à l’aide d’un microscope à épifluorescence inversé avec 0,15 ouverture numérique (NA), 5 x, objectif. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Entier-montez immunofluorescence d’un tissu fibrovasculaire natif de PDR. Épifluorescence micrographie d’un natif PDR FT colorée par immunofluorescence entier-montent. CD31 (A, vert) visualise l’endothélium tandis que NG2 (B, rouge) visualise les péricytes au sein des structures irrégulières néovasculaire. Images fusionnées sont indiqués en (C). Contre-colorant DAPI (bleu) visualise les noyaux. L’image a été prise à l’aide d’un microscope à épifluorescence verticale avec la fonction de sectionnement optique et combiné avec un contrôlé par ordinateur 1,3 mégapixels monochrome CCD caméra et image acquisition logiciel, en utilisant un x 40, 1,4 NA, objectif huile. Neuf sections optiques ont été combinées à l’aide de logiciels de traitement d’image ImageJ. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4. Entier-montez immunofluorescence d’un tissu fibrovasculaire natif de PDR. Épifluorescence micrographie d’un natif PDR FT colorée par immunofluorescence entier-montent. CD31 (A, vert) visualise l’endothélium tout en Lyve1 (B, rouge) visualise les structures endothéliales nouvellement découverts en lymphatique. Images fusionnées sont indiqués en (C). Hoechst 33342 contre-colorant (bleu) visualise les noyaux. L’image a été prise en utilisant un microscope à épifluorescence verticale avec la fonction de sectionnement optique et combiné avec un informatisé 1,3 mégapixels monochrome caméra CCD et logiciel d’acquisition image, en utilisant un objectif 20 x, NA 0,8. Quatre sections optiques ont été combinées à l’aide de logiciels de traitement d’image ImageJ. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5. Ex vivo la croissance des tissus fibrovasculaire PDR. Micrographies contraste de phase des deux FT ex vivo cultures aux moments indiqués (jour). Les FTs poussent ex vivo culture, développement d’excroissances cellulaires déjà après deux jours. Les images ont été prises à l’aide d’un microscope à épifluorescence inversé avec un objectif 5 x, NA 0,15. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6. Entier-montez immunofluorescence des tissus fibrovasculaire PDR cultivées ex vivo non traitées (CTRL), ou en présence de VEGFA ou de TGFβ. Épifluorescence micrographie de pieds cultivés ex vivo non traitées (CTRL) ou en présence de VEGFA ou de TGFβ pendant 9 jours et ensuite colorées par immunofluorescence entier-montent. CD31 (vert) visualise l’endothélium, tandis que le NG2 (rouge) visualise les péricytes. Contre-colorant DAPI (bleu) visualise les noyaux. VEGFA stabilisé le système vasculaire, tandis que TGFβ induit une réaction fibreuse. Les images ont été prises à l’aide d’un microscope à épifluorescence verticale avec la fonction de sectionnement optique et combinés avec un informatisé 1,3 mégapixels monochrome caméra CCD et logiciel d’acquisition image, en utilisant un objectif 20 x, NA 0,8. Neuf sections optiques ont été combinées à l’aide de logiciels de traitement d’image ImageJ. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Video 1. reconstruction du volume 3D d’un natif FT colorées par immunofluorescence entier-montent. CD31 (vert), Lyve1 (rouge). Hoechst 33342 contre-colorant (bleu) visualise les noyaux. L’image a été prise en utilisant un microscope à épifluorescence verticale avec la fonction de sectionnement optique et combiné avec un informatisé 1,3 mégapixels monochrome caméra CCD et logiciel d’acquisition image, en utilisant un objectif 20 x, NA 0,8. Reconstruction du volume 3D et le rendu vidéo a été réalisée à l’aide d’un logiciel commercial. Une partie de la vidéo est reproduite avec la permission de Gucciardo et al. 11. s’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
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Discussion
Compte tenu de l’importance du microenvironnement tissu pertinentes pour cellule fonctionnelle fiable et résultats de mécaniques moléculaires, il est impératif de trouver des modèles expérimentaux appropriés qui fournissent cet environnement tissulaire. Le modèle ci-après décrit ex vivo PDR culture pour les FTs fibrine incorporé permet l’investigation des mécanismes de la physiopathologie de la RDP dans le contexte autochtone, complex et multicellulaire des échantillons cliniques PDR.
Étapes critiques au sein du protocole sont la formation de gel de fibrine appropriée, le positionnement des FT et lavage adéquat pendant la coloration. Étant donné que la formation de gel de fibrine dépend principalement de l’activité de la thrombine, influencée par la concentration et la température, la quantité de thrombine doit être ajustée pour chaque lot de préparation de gel de fibrine. Formation de gel de fibrine devrait être assez rapide pour empêcher la croissance des explants FT 2D mais aussi ralentir suffisamment pour permettre le positionnement de la PI au centre des gouttelettes verticalement et horizontalement. Dans le cas que du FT arrive à localiser au bord de la goutte, le pipetage supplémentaire pourrait aider le placement de la PI au centre. FTs qui demeurent toujours à la pointe des gouttelettes ou qui croissent en 2D devra être exclue. Adéquate de lavage au cours de coloration et d’éviter de séchage des gouttelettes sont tour à tour critique afin d’optimiser la coloration et de minimiser le signal de fond. Temps de transfert peuvent aussi être critiques. Nous avons incorporé les FTs jusqu'à deux heures après vitrectomie et cela n’affectait pas l’ex vivo croissance. L’impact du temps de transfert plus long sur le succès de la culture devrait être testé.
Ce protocole peut être modifié à l’aide de matrices de rechange pour l’incorporation de FT. In vivo, le PDR néovaisseaux se développent vers le cortex vitreux riches en collagène23. Toutefois, sur les composants de sérum de perméabilité vasculaire, y compris le fibrinogène, dissoudre dans vitré à proximité de navires par lequel la réaction fibreuse est engagée. Par conséquent, le caillot de fibrine in vitro a été utilisé ici pour l’ex vivo culture afin caractérisent l’ECM provisoire formé dans le milieu fibreux enflammé du PDR15,21,22. Par ailleurs, les caillots de fibrine pourraient être additionnés de laminine et la fibronectine d’altérer la stabilité des capillaires de la germination, ou les explants peuvent être intégrées dans les limites de type I collagène et autres matrices mixtes à typifier les micro-environnements plus fibreuses dans tissus de la DMLA néovasculaire. Ces matrices sont généralement adaptés pour la culture 3D et immunofluorescence entier-montent, mais leurs effets sur la FTs PDR restent à tester et considérations sur le calendrier de formation de la matrice 3D devra être fait afin de rester dans les limites de prévention 2D croissance18,19. Lorsque la proximité physique de l’unité de recherche à l’hôpital représente une limitation, les temps de transfert plus long pourraient être compensées au travail d’équipe ; TA solution préparation, de fibrinogène-filtration stérilisante et de fibrine gel formation analyse peuvent être effectuées pendant le transfert FT. Si les gels de fibrine ne font pas même après 1 heure, un problème avec le fibrinogène ou de la préparation de TA solution seraient intervenues. Dans ce cas, les gels FT/fibrine ne peut pas être utilisés.
Limites de cette approche, comme avec chaque ex vivo approche, sont la qualité variable de l’échantillon de tissu primaire à travers des individus ainsi que l’hétérogénéité tissulaire intra-patients et les patients. Dans le cas de patients diabétiques, une partie de cette variabilité comprend l’étendue de la vascularisation et la fibrose qui dépendent de nombreux facteurs comme la durée de la maladie, des facteurs génétiques/épigénétique, état métabolique, type de diabète et un traitement systémique. La taille de la FT PDR chirurgicale récupéré est aussi un facteur limitant pour déterminer le nombre de conditions qui peuvent être l’objet d’une enquête pour chaque échantillon. Tout en fournissant l’information spatiale réciproque, entier-montez immunofluorescence permet à l’enquête de seulement une quantité limitée de caractéristiques/marqueurs par goutte. En guise de compromis, les gouttelettes de fibrine peuvent alternativement être incorporés à la paraffine, coupés à sections minces et analysées par immunohistochimie.
Les souris diabétique modèles développent de nombreuses fonctionnalités de stade précoce DR mais ne parviennent pas à récapituler globalement progressives changements survenant dans les PDR humaine, entravant ainsi les études du PDR maladie mécanismes7,8. En outre, l’oeil murin est fondamentalement différente de le œil humain, en ce qu’il manque la macula, soulignant également l’importance d’étudier les maladies humaines24. Le FTs PDR chirurgicales n’ont précédemment soit mis au rebut, ou utilisé pour les sections de paraffine, microscopie électronique à transmission, bloc série visage-microscopie électronique, en masse le séquençage RNA ou 2D culture de cellules dissociées3,25 . Le modèle ci-après décrit permet la caractérisation 3D de ce précieux matériel chirurgical, ainsi que l’étude de la physiopathologie de la RDP dans le micro-environnement des tissus malades native. Lorsqu’il est combiné avec l’utilisation du fluide vitreux, ce modèle permet également l’étude de la contribution du micromilieu PDR cellulaire et acellulaire. Étant donné que les cultures répondent efficacement aux facteurs de croissance détectée dans le vitré, tels que VEGFA, bFGF, VEGFC et TGFβ, récapitulant ainsi les caractéristiques de la physiopathologie de la PDR, ce PDR ex vivo modèle de culture se prête pour tester ou développer de nouveaux traitements PDR 11. dans ce modèle, anti-VEGFA empêche la repousse capillaire et induit des signes de régression capillaire, réponses qui concordent avec les résultats cliniques attendus du traitement d’anti-VEGFA,26,27. Par conséquent, ce modèle peut également servir pour mieux comprendre les effets des thérapies actuelles, y compris les traitements anti-VEGFA et de corticostéroïdes.
Avec instrumentation d’imagerie de cellules vivantes, le décrit dans les présentes ex vivo, modèle de culture pourrait être soumis à la microscopie time-lapse pour permettre une enquête en temps réel des processus comme la régression vasculaire, plasticité cellulaire et repousse. Lorsqu’il est combiné avec des modèles in vitro et in vivo, ainsi que des données cliniques, cela ex vivo modèle PDR aidera en enquêtant sur les réponses des patientes issus des ensembles particuliers de l’identification de marqueurs, une étape plus près de l’avenue de médecine personnalisée. Identification des réponses spécifiques au patient et/ou marqueurs de réponse spécifique est particulièrement pertinente dans le cas de la RDP, qui est une maladie multifactorielle avec une interaction complexe de microvasculaire, neurodégénératives, métaboliques, génétiques/épigénétiques, facteurs immunologiques et liées à l’inflammation, ce qui nécessite des efforts de plus en plus multidisciplinaires pour le développement de la prise en charge thérapeutique ciblant et maladie améliorée. En plus de l’immunofluorescence entier-montent, l’ex vivo cultivée FTs puissent également être récupérées de la fibrine par traitement nattokinase plasmine/et soumis à la transcriptomique et protéomique analyse28. La pertinence du modèle décrit dans les présentes pour ex vivo études de tissus fibrovasculaire développés dans d’autres affections oculaires, tels que dans les cas graves de drépanocytose rétinopathie, pourraient également être explorées dans l’avenir.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs sont reconnaissants aux collègues de rétine médicale et chirurgicale, infirmières et tout le personnel de l’unité diabétique et l’unité de chirurgie vitréo-rétinienne dans le département d’ophtalmologie, hôpital universitaire de Helsinki pour participer activement au recrutement des patients. Nous remercions Biomedicum unité d’imagerie moléculaire pour les installations d’imagerie. Nous remercions Anastasiya Chernenko excellente assistance technique. Cette étude a été financée par des subventions de l’Académie de Finlande (KL), Université d’Helsinki (KL), Sigrid Juselius Foundation (KL), K. Albin Johansson Foundation (KL), Institut finlandais de Cancer (KL), Karolinska Institutet (KL), finlandais Eye Foundation (SL), œil et Banque de tissus Foundation (SL), Mary et Georg C. Ehrnrooth Foundation (SL) et subventions de recherche clinique HUCH (TYH2018127 après TYH2016230, SL), Diabetes Research Foundation (SL, KL, AK, EG) ainsi que le Programme Doctoral en biomédecine (EG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Microforceps | Medicon | 07.60.03 | Used for handling the FTs |
| Disposable Scalpels - Sterile | Swann-Morton | 0513 | Used for FT dissection |
| Culture dish, vented, 28 ml (60mm) | Greiner Bio-One | 391-3210 | Used for dissection and for testing fibrin gel formation |
| Cell culture plates, 12-well | Greiner Bio-One | 392-0049 | Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL | Greiner Bio-One | 391-3477 | |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL | Greiner Bio-One | 525-0384 | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF | Millipore | SLGV033RS | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Syringe, 10 mL | Braun | 4606108V | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Fisher | FB74031 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well | Nunc | 142475 | Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture |
| Cell culture plates, 96-well, U-bottom | Greiner Bio-One | 392-0019 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Coverslips 22x22mm #1 | Menzel/Fisher | 15727582 | Used for mounting |
| Microscope slides | Fisher | Kindler K102 | Used for mounting |
| Absorbent paper | VWR | 115-0202 | Used for mounting |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | Used for preparing 1x PBS |
| Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Calbiochem | 341578 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H9394-500ML | Used for preparing the fibrinogen and TA solution |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | Used for preparing the blocking solution |
| Human Serum | Sigma-Aldrich | H4522 | Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media |
| Gentamicin Sulfate 10mg/ml | Biowest | L0011-100 | |
| Endothelial cell media MV Kit | Promocell | C-22120 | Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement, 500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-2.5L-M | Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | T9284 | Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. |
| Hoechst 33342, 20mM | Life Technologies | 62249 | For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Eukitt Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 03989-100ml | TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | T9549-500UN | Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder | Sigma | A3428 | Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth factors | |||
| Recombinant human VEGFA | R&D Systems | 293-VE-010 | 50 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human VEGFC | R&D Systems | 752-VC-025 | 200 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human TGFβ | Millipore | GF346 | 1 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human bFGF | Millipore | 01-106 | 50 ng/ mL final concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary antibodies | |||
| CD31 (JC70A) | Dako | M0823 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD34 (QBEND10) | Dako | M716501-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD45 (2B11+PD7/26) | Dako | M070129-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD68 | ImmunoWay | RLM3161 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| Cleaved caspase-3 (5A1E) | Cell Signalling | 9664 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| ERG (EP111) | Dako | M731429-2 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| GFAP | Dako | Z0334 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Ki67 | Leica Microsystems | NCL-Ki67p | Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Lyve1 | R&D Systems | AF2089 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab |
| NG2 | Millipore | AB5320 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Prox1 | ReliaTech | 102-PA32 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab |
| Prox1 | R&D Systems | AF2727 | Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab |
| VEGFR3 (9D9F9) | Millipore | MAB3757 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| α-SMA (1A4) | Sigma | C6198 | Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG | Life Technologies | A-21202 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-11012 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG | Thermo Scientific | A-11057 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG | Thermo Scientific | A-11036 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG | Molecular Probes | A-21468 | Used at 1:500 dilution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope | Zeiss | For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT | |
| SZX9 upright dissection stereomicroscope | Olympus | For FT dissection | |
| LSM 780 confocal microscope | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT | |
| AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT |
References
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