Summary
Aquí, presentamos un protocolo de estudio de la fisiopatología de la retinopatía diabética proliferativa mediante el uso de los tejidos derivados del paciente quirúrgico suprimido, fibrovasculares de tejido nativo tridimensional caracterización y ex vivo la cultura. Esta ex modelo de cultura vivo también es favorable para probar o desarrollar nuevos tratamientos.
Abstract
Retinopatía diabética (RD) es la complicación microvascular más frecuente de la diabetes y una de las principales causas de ceguera en adultos en edad de trabajar. No actuales modelos animales de diabetes y la retinopatía inducida por el oxígeno convierten los cambios progresivos de gama completa que se manifiesta en humana retinopatía diabética proliferativa (PDR). Por lo tanto, comprensión de la patogénesis de la enfermedad y la patofisiología ha dependido en gran medida el uso de secciones histológicas y muestras de vítreas en planteamientos que sólo proporcionan información de estado de equilibrio en los factores patogénicos implicados. Creciente evidencia indica que célula dinámica e interacciones de la matriz extracelular de la célula (MEC) en el contexto de microambientes (3D) tridimensionales son esenciales para los estudios mecanicistas y funcionales para el desarrollo de nuevos estrategias de tratamiento. Por lo tanto, la hipótesis de que el tejido fibrovascular patológico suprimido quirúrgico de ojos con RDP podría utilizarse confiablemente desentrañar los mecanismos celulares y moleculares de esta enfermedad devastadora y poner a prueba el potencial clínico de la novela intervenciones. Hacia este fin, hemos desarrollado un novedoso método para 3D ex vivo cultura de suprimido quirúrgico derivados del paciente tejido fibrovascular (FT), que servirá como un modelo relevante de Fisiopatología humana de PDR. La FTs se diseca en explantes y embebida en matriz de fibrina para ex vivo cultura y 3D caracterización. Conjunto Monte inmunofluorescencia de la FTs nativos y culturas punto final permite investigación exhaustiva de la composición tisular y procesos multicelulares, destacando la importancia de la caracterización de nivel tejido 3D para descubrir características relevantes de Fisiopatología de la PDR. Este modelo permite la evaluación simultánea de los mecanismos moleculares, celulares y tejidos procesos y las respuestas al tratamiento en el contexto complejo de interacciones bioquímicas y físicas dinámicas dentro de la arquitectura del tejido PDR y el microambiente. Este modelo recoge Fisiopatología PDR, también será favorable para pruebas o desarrollo de nuevos tratamientos.
Introduction
DR es una grave complicación ocular de la diabetes, una enfermedad que ha alcanzado proporciones enormes en los últimos tres décadas1. Veinte años después de diagnosis, prácticamente todos los pacientes con diabetes tipo 1 y el 60% de los pacientes con tipo 2 diabetes presente las muestras de la retinopatía, que diabetes por sí uno de los principales causas de ceguera en adultos de edad2de trabajo. Según el nivel de degeneración microvascular y daño isquémico, DR se clasifica en RD no proliferativa (no democrática) y Rd proliferativa (RDP). La enfermedad, PDR, se caracteriza por la neovascularización inducida por la isquemia y la inflamación y respuesta fibrótica en la interfase vítreo-retina. En condiciones no tratadas, estos procesos conducirá a la ceguera debido a hemorragia vítrea, fibrosis retiniana, la separación retiniana del tractional y neovascular glaucoma3,4. A pesar de los avances recientes, las opciones actuales de tratamiento objetivo sólo DR etapas, incluso el edema macular diabético y PDR, daño retiniano ha ya se produjo. Por otra parte, una gran proporción de pacientes del Dr. no se beneficia del actual arsenal terapéutico de tratamiento, lo que indica una necesidad urgente de mejores terapias4,5,6.
Otros yovivo n modelos de enfermedad, del desarrollo y múltiples modelos animales diabéticos se han desarrollado hasta la fecha, pero ninguno de ellos recoge toda la gama de características patológicas observadas en humanos PDR7,8. Además, la creciente evidencia indica que las respuestas al tratamiento están conectadas firmemente a la composición del ECM, así como el arreglo espacial y la interacción entre el microambiente celular y acelular9. Nosotros, por lo tanto, para desarrollar un modelo clínico relevante de PDR humana utilizando el material patológico de FT que es suprimido comúnmente de ojos sometidos a vitrectomía como parte de la gerencia quirúrgica del PDR10.
Este manuscrito describe el protocolo para el 3D ex vivo cultura y caracterización de la quirúrgico-suprimido, PDR pies patológicos derivados del paciente. El método aquí descrito se ha utilizado en una publicación reciente que demostró éxito deconstrucción del nativo paisaje de tejido 3D de PDR y recapitulación de las características de la patofisiología PDR angiogénicos como respuesta fibrótica de la anormal estructuras vasculares11. Este modelo también reveló características novedosas que no pueden ser fácilmente apreciadas desde finas secciones histológicas, tales como espacialmente limitan apoptosis y proliferación, así como formación de islotes vasculares11. Líquido vítreo se ha utilizado con éxito por otras culturas esferoide endotelial 3D para evaluar su potencial angiogénico y la eficacia de angiostatic moléculas12. Cuando se combina con un esferoide de células endoteliales linfáticas 3D (LEC) en vitro brotación ensayo utilizando vítreo PDR como estimulante, nuestro modelo reveló que la contribución de ambos vitreal soluble factores claves así como locales en el tejido neovascular de la todavía mal entendida implicación de LEC en PDR Fisiopatología3,11. En la gestión de PDR, cirugía vitreorretiniana es un procedimiento rutinario realizado pero desafiante. Como instrumentación quirúrgica y técnicas están viendo continuo adelanto y sofisticación, eliminación oportuna y conservador de muestra proliferativo fibrovascular no sólo mejora el resultado de la visión sino que también proporciona material de tejido muy valiosa para la investigación de respuestas de la patofisiología y el tratamiento de la PDR en los aspectos complejos de la traslación del microambiente del tejido humano vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Esta investigación fue aprobada por la Junta de revisión institucional y Comité de ética del Hospital Universitario de Helsinki. Firmado el consentimiento informado se obtuvo de cada paciente.
1. preparación de soluciones, medios y equipos
- Preparar el siguiente equipo antes de la obtención del tejido fibrovascular (FT) para asegurar un procesamiento rápido.
- Pinzas de microdisección estéril-autoclave dos.
- Preparar 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS) disolviendo 1 tableta de PBS previamente pesada (0.14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,010 M PO4-3) en 900 mL de agua desionizada y mezclar para disolver. Ajustar el volumen de agua hasta 1 L y estéril-autoclave la solución preparada. Tienda a TA.
- Recoger la solución mencionado y el equipo en una cesta, junto con un bisturí estéril de un solo uso, una placa de cultivo estéril de 6 cm de célula y cinco placas estériles celular 12-bien.
- Preparar un 6 mg/mL solución de fibrinógeno en Hanks equilibrada solución de sal (HBSS) disolver 30 mg de fibrinógeno humano plasminógeno-agotado en 5 mL de HBSS, usando un tubo de 50 mL sumergido en un baño de agua a 37 ° C, durante al menos 1 h.
Nota: Esta solución puede conservarse en el baño de agua (37 ° C) durante 7 horas (máximo 10 h) antes de su uso. - Preparar el ex vivo medio de cultivo mediante la adición de 5% de suero fetal de ternero (FCS) o 5% de suero humano, 0.4% suplemento para crecimiento celular endotelial, 10 ng/mL recombinante humana factor de crecimiento epidérmico, hidrocortisona μg/mL 1 y 50 μg/mL gentamicina a comercialmente disponibles medio de cultivo de células endoteliales y mantener en baño de agua a 37 ° C hasta su uso. Almacenar a 4 ° C por hasta un mes.
2. disección del tejido fibrovascular
- Recoger el tejido fibrovascular (FT) que ha sido suprimido de los sujetos humanos sometidos a la cirugía de vitreoretinal microincision trans conjuntival, por 23 o 20 calibre tres-puerto equipara el plana vitrectomy como parte de la gerencia quirúrgica del vitreoretinal del PDR.
Nota: El FT es suprimido mediante segmentación y delaminación, cortar si es necesario con microscissors y quitado de la cavidad vítrea con Micro-pinzas agarre extremo intraocular por cirujano experimentado. Extremo cuidado debe ser tomado para eliminar pies intactos y en perfecto estado sin dañar las estructuras oculares incluyendo el nervio óptico o la arcada vascular temporal donde se encuentra comúnmente el tejido patológico neovascular. El tamaño del tejido suprimido es variable, generalmente que van entre 3 y 50 mm2. - Mantener los pies en una placa de cultivo celular de 6 cm o en tubo de 1,5 mL que contiene 1 mL de PBS estéril colocada en hielo húmedo y transferirla inmediatamente a la investigación de laboratorio para el procesamiento.
Nota: Es imprescindible que la unidad de investigación (instalaciones de laboratorio) está físicamente cerca de la sala de operaciones del hospital (OR) para reducir al mínimo los tiempos de traslado de los pequeños pies suprimido. En este caso la transferencia toma menos de 5 minutos y los explantes se encajan dentro de fibrina generalmente en 1-1.5 h (máximo 2 h) después de la extirpación quirúrgica. El impacto del tiempo de transferencia en la cultura 3D tendría que ser probado. - Coloque los pies en una placa de cultivo celular de 6 cm que contiene 1 mL de PBS a temperatura ambiente (RT, 25 ° C) y adquirir imágenes del tejido mediante un microscopio de epifluorescencia invertida con un objetivo de 5 x.
Nota: Se adquieren imágenes de documentación y evaluación cualitativa. Será posible observar el tamaño del tejido, la densidad y la composición general (p. ej., estructuras vasculares). - Cortar los pies ~ 1 mm2 piezas bajo un estereomicroscopio de disección vertical, usando una pinza estéril de bisturí y microdisección. Mantener el tejido, bien sumergido en PBS, utilizando una pinza de microdisección y realizar cortes claros con un bisturí estéril. Evite rasgado FT, ya que esto alteraría las estructuras nativas fibrovasculares.
- Coloque cada pieza en un pozo de una placa de cultivo celular 12-bien que contiene 1 mL de PBS estéril.
Nota: Si es necesario, extender suavemente el FT en la placa, usando pinzas de microdisección, antes de realizar cortes.
3. gotas de Gel de fibrina vertical del bastidor para la caracterización de FT nativa y cultivo Ex Vivo
- Filtro estéril la solución de fibrinógeno listo preparado en el paso 1.2 con filtro de 0.22 micras montada en una jeringa de 10 mL.
- Preparar alícuotas de la solución de fibrinógeno (25 μL por tubo de 1.5 mL) y mantener en RT. Prepare una alícuota para fibrina gel cada pieza FT obtenidos después de la disección, y un par de alícuotas adicionales para probar la fibrina formación del gel.
- Prepare una solución de HBSS conteniendo 4 unidades/mL de trombina y 400 μg/mL de aprotinina, llamada en adelante TA solución y mantener en RT. preparar solución como mucho TA según sea necesario, dependiendo del número de piezas obtenidas después de la disección (25 μL de solución de TA se utiliza para cada uno Gel de FT/fibrin) y una cantidad adicional (por ejemplo, 250 μL) para probar la formación del gel de fibrina y asegurar que suficiente solución está disponible a través de la fundición de las gotas de gel de fibrina.
Nota: La trombina es necesaria para la polimerización de la fibrina mientras que la aprotinina se añade para prevenir la degradación del gel de fibrina por proteasas celulares expresadas por los FTs13,14. - Probar el tiempo de formación de gel de fibrina: Añadir 25 μL de solución de TA para la solución de fibrinógeno alícuotas de 25 μL preparada en el paso 3.2, con otra pipeta a 50 μL, se mezclan y en el tubo mediante pipeteo dispensar en una placa de cultivo celular de 6 cm , formando una gota vertical.
Nota: La formación del gel de fibrina debe ocurrir en ~ 1 min. Si esto toma más 1,5 min, la concentración de trombina en la solución de TA preparada en el paso 3.3 puede incrementarse mediante la adición de solución stock de más trombina. Una décima parte del volumen inicialmente utilizado de solución stock de trombina se puede Agregar, repetidas veces, hasta la formación del gel de fibrina se produce dentro de 1,5 minutos. El tiempo de formación de gel de fibrina es crítico para las tres dimensión de la cultura, como gel de rápida formación (en 1,5 minutos) impide que la pieza de pies de hundimiento en la parte inferior del gel de fibrina y así entre en contacto con la superficie de plástico 2D de la célula placa de cultivo, que puede conducir a la adhesión celular 2D y consecuencia. - Colocar pies una pieza en el centro de un pozo de una placa de 24 pocillos usando una pinza estéril y retire cualquier exceso PBS mediante pipeteo con una pipeta de 0.5-10 μL para evitar la fuerza de succión en los pies. En el caso que el tejido se pega a la pinza, utilice una pinza adicional para facilitar la colocación de la pieza de tejido en la placa.
Nota: Geles FT/fibrina también pueden lanzarse en placa de 48 pozos para reducir el uso de reactivos. Sin embargo, esto es más difícil ya que el espacio es más limitado y fibrina se extenderá si entra en contacto con la pared bien. - Añadir 25 μL de solución de TA a la solución de fibrinógeno μL 25 alícuotas en el paso 3.2, y con otra pipeta establece en 50 μL mezcla en el tubo de pipeteo. Dispensar en el pedazo de pies colocado en la placa bien y pipeta arriba y abajo 2 - 3 veces para incluir el pedazo de pies dentro de la gota vertical, proporcionando una 3D matriz circundante hasta los pies.
Nota: Asegúrese de que el FT no es aspirado durante el pipeteo y que no se forman burbujas de aire. Asegúrese también de que mezcla, dispensación y uso se realizan rápidamente como se forma el gel de fibrina dentro de 1,5 min, ya probado en el paso 3.4. Si casting geles de fibrina en la placa de 48 pozos, utilice 20 μL de solución de fibrinógeno y 20 μL de solución de TA. - Repita los pasos del 3.5 y 3.6 para todas las piezas de los pies.
- Permita que los geles de fibrina solidificar por incubar las placas en una incubadora de cultivo celular a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% CO2.
- Después de 0.5-1 h, compruebe que el gel de fibrina está formado totalmente por cuidadosamente inclinando la placa. Proceda al paso 3.10 cuando el gel no se mueve como se inclina la placa, lo que indica que la formación del gel de fibrina es completa.
- Sobreponer los geles FT/fibrina con ex vivo de medio de cultivo (600 μL/pocillo en placa de 24 pocillos) o 300 μL/pocillo en placa de 48 pozos con 100 μg/mL aprotinina. Pipetee suavemente el medio de dispensación drop-wise.
Nota: Aquí, la aprotinina se utiliza para prevenir la degradación del gel de fibrina por proteasas celulares expresadas por los FTs13,14. El ex vivo medio de cultivo Además pueden complementarse con factores de crecimiento recombinantes, como la VEGFA, VEGFC, bFGF, TGFβ (véase Tabla de materiales)11. - Coloque FT ex vivo placa de cultivo a 37 ° C, 5% CO2 célula cultura la incubadora y la cultura para el período de tiempo deseado (por ejemplo, 2 - 18 días, más cultura períodos tendrá que ser probado). Reemplazar el 50% de la media con la dulce ex vivo medio de cultivo cada tres días.
4. "en matriz" proyección de imagen de
- Adquirir imágenes del FT ex vivo de culturas en el mismo día (día 0) y en intervalos fijos (por ejemplo, cada dos días), utilizando un microscopio de epifluorescencia invertida, para seguir el crecimiento del 3D.
Nota: Las imágenes obtenidas pueden utilizarse para la cuantificación de la consecuencia FT como la longitud total de dos diámetros perpendiculares en el explante11.
5. FT nativo y punto final de cultivo Ex Vivo
Nota: Los geles de fibrina/FT pueden ser cultivados ex vivo para el período de tiempo deseado (FT ex vivo culturas) o fijo en el mismo día (nativo FT) nativo de caracterización FT11.
- Fijar el FT nativo o el FT ex vivo culturas mediante la sustitución del medio de cultivo con 1 mL/pozo de paraformaldehído al 4% en solución de PBS, por 1 h a TA. Para los geles nativos de FT/fibrina, fijar 0.5-1 h después de la adición del ex de vivo la cultura medio (si los geles de fibrina no han estado en remojo en medio, la fijación dañarlas).
Nota: Realice este paso en campana como paraformaldehido es corrosivo, tóxico y cancerígeno. - Enjuague los geles de fibrina/FT con tres lavados de 5 minutos en PBS (2 mL/pocillo).
- Vuelva a colocar el PBS con 2 mL/de PBS con azida sódica al 0.02% y guardar los geles de fibrina fija a 4 ° C hasta el procesamiento posterior. Sellar las placas con la película de parafina para asegurarse de que los geles de fibrina/FT no sequen en almacenamiento de información.
Nota: Realice este paso en campana como la azida sódica es tóxica.
6. tinción de inmunofluorescencia whole-Mount
Nota: Este protocolo dura 5 días y puede ser interrumpido con incubaciones de noche donde se indica. No deje que la fibrina geles secos en cualquier momento. Todos los pasos se realizan a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.
- Preparar las siguientes soluciones antes de iniciar el protocolo de tinción.
- Posteriores a la fijación solución: preparar 50: 50 acetona: metanol solución mezclando cantidades iguales de acetona y metanol (p. ej., 50 mL). Almacenar a-20 ° C. Preparar esta solución última en el día antes de la tinción. Esta solución puede conservarse a-20 ° C y utilizarse para stainings posterior.
Nota: Preparar esta solución en campana como acetona y metanol son inflamables y peligrosos para la salud. - Solución de bloqueo: preparar un 15% suero bovino fetal (FBS), 0.3% octil fenol etoxilado solución en PBS por primera agregar 15% FBS a PBS. Agregar octil fenol etoxilado y revolver hasta para disolver. Almacenar a 4 ° C.
Nota: Esta solución puede prepararse en gran cantidad por adelantado, almacenados en aliquotes de 15 mL a-20 ° C y descongelar antes de su uso, en el día cuando se inicia el protocolo de tinción. Utilice un recién preparado o recién descongelado alícuotas para cada protocolo de tinción. - Solución de lavado: preparar 1 L de PBS suplementado con 0.45% octil fenol etoxilado al agregar 4,5 mL de octil fenol etoxilado a 995,5 mL de PBS. Remover para disolver. Tienda a TA.
- Posteriores a la fijación solución: preparar 50: 50 acetona: metanol solución mezclando cantidades iguales de acetona y metanol (p. ej., 50 mL). Almacenar a-20 ° C. Preparar esta solución última en el día antes de la tinción. Esta solución puede conservarse a-20 ° C y utilizarse para stainings posterior.
- Levante las gotitas cuidadosamente de la placa con una espátula de acero inoxidable con bordes cuadrados. Separar primero la gota de los bordes antes de levantar el centro y transferir a un pozo de placa de 12 pozos que contienen 1 mL de PBS.
Nota: Realizar la fijación, lavados y pasos bloqueo en este formato de placa. - -Fijar las gotitas con 1 mL de solución de helado de 50: 50 acetona: metanol para ~ 1 min (la frontera de las gotitas se convertirá blanco).
Nota: Realice este paso en campana como acetona y metanol son peligrosas para la salud. - Enjuague con lavado de 3-5 en 2 mL de PBS (las gotas se hundirán en la solución de PBS cuando la rehidratación es completa).
Nota: Evite tocar las gotas con la punta de la pipeta como, después de la fijación, son pegajosos al plástico. A lo largo del Protocolo, evitar aspiración post fix, anticuerpo, bloqueo y soluciones de lavado por succión, como esto puede dañar o destruir completamente las gotas. En cambio, la inclinación de la placa y retire cuidadosamente con una pipeta de 500-5.000 μL de soluciones. - Centrifugue la solución de bloqueo durante 15 min a 21.000 x g y 4 ° C para eliminar la suciedad.
Nota: La solución puede ser alícuotas en tubos de 1,5 mL para centrifugación. La solución no utilizada puede ser almacenada a 4 ° C y utilizada para todos los pasos posteriores pertinentes. - Incubar las gotas de 500 μL bloqueando la solución por 2 h a TA.
Nota: Para reducir el volumen de solución de bloqueo, la placa puede inclinarse sobre un soporte y puede ser utilizado lo menos 300 μL de solución/gotas. - Preparar la mezcla de anticuerpo primario (menos de 30 μL/gota) en dilución en el bloqueo de solución y centrifugar durante 15 min a 21.000 x g a 4 ° C.
- Transferencia de las gotas en redonda (U)-placa de 96 pocillos de fondo usando una espátula de borde redondo e incubar con al menos 30 μL/gota de la mezcla del anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C.
- Transferencia de las gotas en 12-bien la placa que contiene 2 mL de solución/bien, se lava, al día siguiente enjuague con tres 5 min lava primero y después con nueve 30 min lavados. Deje el último lavado (2 mL) durante la noche a 4 ° C.
- Al día siguiente, enjuague tres veces con PBS y transferencia de las gotas en redonda (U)-placa de 96 pocillos de fondo.
- Durante los lavados, preparar la mezcla de anticuerpos secundarios conjugados fluoróforo apropiado (diluido 1: 500, por lo menos 30 μL/gota) en el bloqueo de solución y centrifugar durante 15 min a 21.000 x g a 4 ° C.
- Transferencia de las gotas en una ronda (U)-placa de 96 pocillos de fondo usando una espátula de borde redondo e incubar con al menos 30 μL de la mezcla del anticuerpo secundario, durante 4 h a temperatura ambiente, protegido de la luz.
Nota: Realice todas las incubaciones posteriores y pasos de lavado protegidos de la luz. - Transferencia de las gotas en la placa de 12 pozos que contienen 2 mL de lavado solución/pozo usando una espátula de borde redondo, enjuague con tres lavados de 5 minutos primero y luego con cuatro lavados de 30 minutos. Deje el último lavado (2 mL) durante la noche a 4 ° C.
- Al día siguiente, enjuague los geles con cinco lavados de 30 min y luego tres veces con PBS. Deje el último lavado (2 mL) durante la noche a 4 ° C.
- Al día siguiente, transferir las gotitas en una ronda (U)-placa de 96 pocillos de fondo mediante el uso de un núcleos de espátula y contratinción redondo-afilado por incubar con 10 μg/mL Hoechst tinción nuclear (al menos 30 μL/gota) durante 30 minutos a TA.
Nota: Montaje suplementado con 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para núcleos contratinción puede alternativamente utilizarse. En cuyo caso, se saltan este paso y paso 6.16, proceder directamente al paso 6.17. - Transferencia de las gotas en la placa de 12 pozos que contienen 2 mL de PBS/bien con una espátula con borde redondo y enjuagar tres veces con PBS.
- Monte las gotitas sobre portaobjetos como sigue:
- Aplicar una capa estrecha de medio de montaje rápido endurecimiento en los bordes de un cubreobjetos cuadrado 22 x 22 mm y deje secar por ~ 1 minuto. Realizar este paso para cada gota individualmente, para evitar el excesivo endurecimiento del medio de montaje.
Nota: Realice este paso en campana como el endurecimiento rápido montaje medio es peligroso para la salud. - Enjuague la gota sumergiendo en un pozo de una placa de 12 pozos que contiene 2 mL de agua desionizada y transferir a un portaobjetos de microscopio, utilizando una espátula de borde redondo. Usando un pequeño pedazo de papel absorbente para quitar exceso de agua.
- Dispensar 15 μL de medio de montaje antifade no se endurezca en la gota.
Nota: Alternativamente, si no ha utilizado tinción nuclear de Hoechst, que contiene 4', medio de montaje 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) puede utilizarse. - Suavemente Coloque el vidrio de cubierta, con el medio de montaje rápido-endureciendo frente a la diapositiva microscópica, sobre la gota y deje instalarse.
Nota: El medio de endurecimiento rápido del palillo a la diapositiva microscópica y mantenga la gota en su lugar.
- Aplicar una capa estrecha de medio de montaje rápido endurecimiento en los bordes de un cubreobjetos cuadrado 22 x 22 mm y deje secar por ~ 1 minuto. Realizar este paso para cada gota individualmente, para evitar el excesivo endurecimiento del medio de montaje.
- Repita el paso 6.17 gotitas todas. Monte dos gotitas en cada portaobjetos.
- Deje que los portaobjetos secar al aire a temperatura ambiente durante 2 h y almacenar a 4 ° C durante la noche. Asegúrese de que las diapositivas son en posición horizontal y protegidas de la luz.
- Imagen natural teñido o punto final FT ex vivo culturas utilizando un microscopio confocal o un microscopio de epifluorescencia vertical equipado con una función seccionamiento óptica 20 x y objetivo 40 x. Utilice la función de azulejo para capturar un área del tejido a la vez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Comprensión más profunda de las propiedades del tejido fibrovascular de PDR y expresión de la proteína se ha basado principalmente en muestras de vítreas y finas histológicas FT secciones3,15,16,17. Para desarrollar un método para la investigación exhaustiva de la organización de tejido 3D y pluricelulares procesos fisiopatológicos de la RDP, nos propusimos utilizar la excisión quirúrgica, paciente derivados patológicos FTs para caracterización 3D y ex vivo de la cultura. La FTs fresca al laboratorio de investigación y procesada como se muestra en el flujo de trabajo esquemático en la figura 1.
La FTs puede ser reflejada antes de la disección para la evaluación cualitativa y documentación (figura 2). Como se muestra en la figura 2, el FTs muestran gran variación entre paciente en tamaño, densidad y abundancia de estructuras vasculares. En algunos tejidos, células sueltas, probablemente inflamatoria inmune las células o glóbulos rojos, así como permeable estructuras vasculares de calibre diferente también pueden ser fácilmente distinguido (figura 2). Después de la disección, una decisión es necesario el uso aguas abajo del número límite de los explantes obtenidos. Una porción de los explantes es embebida en matriz de fibrina y se fija después de la formación del gel de fibrina, mientras que los explantes restantes pueden someterse a ex vivo de cultura en un plato separado (figura 1). La FTs fresca también se han utilizado con éxito para la caracterización ultraestructural por microscopia electrónica Las muestras pueden ser que bien procesados convencionales microscopía electrónica de transmisión (TEM) de secciones ultrafinas o de bloque serie cara-microscopía electrónica (SBF-SEM)3,11.
Los geles de fibrina fijo pueden almacenarse durante varias semanas y tinción por inmunofluorescencia de montaje en conjunto18,19. Las muestras teñidas son además estables cuando se almacena a 4 ° C en la oscuridad. Los geles FT/fibrina gruesos pueden ser reflejados tiempo eficientemente con microscopio de epifluorescencia equipado con la función seccionamiento óptica, útil para eliminar la luz dispersada fuera de enfoque. Con este método la proyección de imagen proporciona excelente visualización de las estructuras. Por otra parte, la microscopia confocal, aunque más exigente de tiempo, puede permitir la captura de detalles. La caracterización del recién integrado por fibrina y fijo, FTs no cultivadas, nativas por inmunofluorescencia de montaje en conjunto permite la caracterización de estructuras vasculares, múltiples tipos de células y su disposición recíproca dentro del tejido del PDR 3D paisaje11. Por ejemplo, CD31 anticuerpos pueden utilizarse para mostrar el endotelio y NG2 para mostrar pericitos (figura 3) mientras que los anticuerpos Lyve1 visualizar recientemente descubierto estructuras endoteliales linfático (figura 4)11. Múltiples combinaciones de anticuerpos se pueden utilizar para visualizar varias estructuras y tipos de la célula (véase Tabla de materiales); por ejemplo, el ERG puede visualizar también el endotelio, que tiene un patrón de expresión discontinuos en la occidentalización PDR anormal. Las estructuras vasculares teñidas con un marcador de membrana (p. ej., CD31 y Lyve1) pueden ser analizadas cuantitativamente para conservación y densidad mediante el uso de Angiotool, un software de código libre desarrollado por el Instituto Nacional del cáncer de NIH11, 20. Volúmenes en 3D pueden hacerse también desde el conjunto de datos obtenidos (ver Video 1). Si un anticuerpo no es conveniente para el conjunto de montaje de la inmunofluorescencia, las gotitas de fibrina pueden alternativamente ser embebidas en parafina, corte secciones delgadas y analizadas por immunohistochemistry. En este caso las gotas se benefician de fijación durante la noche a 4 ° C en lugar de 1 h a TA.
Ex vivo cultura sustenta el crecimiento de la FTs de fibrina incrustado, desarrollo de crecimientos celulares ya después de dos días (figura 5). El gel de fibrina en vitro se utiliza la matriz para ex vivo de la cultura, puesto que tipifica el ECM provisional en vivo, formado después de escote de trombina de fibrinógeno sérico en los sitios de fuga vascular, en contacto directo con los neovessels PDR con fugas en el inflamado medio fibrótica15,21,22.
La RDP es una complicación microvascular caracterizada por una respuesta fibrótica y angiogénicos y los explantes FT retienen este repertorio celular en cultivo, así como responden eficazmente a los estímulos exógenos a los medios de cultivo11. Los datos representativos en la figura 6 muestran que los cultivos ex vivo PDR induce brotación de la preservación del endotelio y vasculatura de CD31-positiva en respuesta a VEGFA, si bien TGFβ indujo una respuesta fibrótica reflejada por el fruto NG2-positivo pericitos/PYME. Varios estímulos exógenos pueden ser probados y, cuando se informó de las medidas de su abundancia vitreal en vivo, el PDR aquí desarrollado ex vivo modelo de cultura puede revelar nuevo microambiente y contexto dependiente PDR mecanismos patológicos que no pueden ser visualizado en el material tejido fijo.
Figura 1. Ex vivo Modelo de cultura de tejido fibrovascular PDR. Representación esquemática del flujo de trabajo de la cirugía vitreoretinal (vitrectomía por pars plana) para la supresión de los pies a su disección en explantes e incrustación en fibrina tridimensional cultura caracterización y ex vivo . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Recién suprimido tejidos fibrovasculares PDR antes disección. Fase contast micrografías de FTs recién suprimidos tomadas antes de la disección. La FTs son muy variable en tamaño, densidad y abundancia de estructuras vasculares. Puntas de flecha indican estructuras vasculares de calibre diferente. La línea parcialmente transparente Roja destaca dos vasos individuales de diverso calibre. Las imágenes fueron tomadas usando un microscopio invertido de epifluorescencia con un x 5, 0.15 apertura numérica (NA), objetivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Conjunto montaje inmunofluorescencia de un tejido fibrovascular nativo de PDR. Epifluorescencia micrografía de un nativo PDR pies manchados por inmunofluorescencia de montaje en conjunto. CD31 (A, verde) visualiza el endotelio mientras NG2 (B, rojo) visualiza del pericitos dentro de las estructuras irregulares neovascular. Imágenes combinadas aparecen en (C). Contratinción DAPI (azul) visualiza núcleos. La imagen fue tomada usando un microscopio de epifluorescencia vertical con la función seccionamiento óptica y combinada con un controlado por ordenador 1.3 megapíxeles monocromática CCD cámara e imagen software de adquisición, utilizando un 40 x, NA 1.4, objetivo de aceite. Nueve secciones ópticas se combinaron mediante el uso de software de procesamiento de imágenes ImageJ. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Conjunto montaje inmunofluorescencia de un tejido fibrovascular nativo de PDR. Epifluorescencia micrografía de un nativo PDR pies manchados por inmunofluorescencia de montaje en conjunto. CD31 (A, verde) visualiza el endotelio mientras Lyve1 (B, rojo) visualiza el recién descubiertas estructuras endoteliales linfático. Imágenes combinadas aparecen en (C). Contraste (azul) Hoechst 33342 visualiza núcleos. La imagen fue tomada usando un microscopio de epifluorescencia vertical con la función seccionamiento óptica y combinada con un controlado por ordenador 1.3 megapíxeles monocromo CCD cámara y software de adquisición de imagen, usando un objetivo de 20 x, 0.8 NA. Cuatro secciones ópticas se combinaron mediante el uso de software de procesamiento de imágenes ImageJ. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Ex vivo de crecimiento de los tejidos fibrovasculares PDR. Imágenes de contraste de fase de culturas de x vivo ede dos pies en los puntos de tiempo indicado (día). La FTs crecen sobre ex vivo cultura, desarrollo de crecimientos celulares ya después de dos días. Las imágenes fueron tomadas usando un microscopio invertido de epifluorescencia con un objetivo de 5 x, NA 0.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Conjunto de montaje de inmunofluorescencia de tejido fibrovascular PDR cultivadas ex vivo no tratada (CTRL), o en presencia de VEGFA o TGFβ. Micrografía de epifluorescencia de pies cultivados ex vivo no tratada (CTRL) o en presencia de VEGFA o TGFβ durante 9 días y posteriormente manchadas por inmunofluorescencia montaje en conjunto. CD31 (verde) se visualiza el endotelio mientras NG2 (rojo) visualiza del pericitos. Contratinción DAPI (azul) visualiza núcleos. VEGFA estabilizaron la vasculatura mientras que TGFβ indujo una respuesta fibrótica. Las imágenes fueron tomadas usando un microscopio de epifluorescencia vertical con la función seccionamiento óptica y combinadas con un controlado por ordenador 1.3 megapíxeles monocromo CCD cámara y software de adquisición de imagen, usando un objetivo de 20 x, 0.8 NA. Nueve secciones ópticas se combinaron mediante el uso de software de procesamiento de imágenes ImageJ. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video 1. reconstrucción 3D del volumen de un nativo FT manchado por inmunofluorescencia de montaje en toda. CD31 (verde), Lyve1 (rojo). Hoechst 33342 contratinción (azul) visualiza núcleos. La imagen fue tomada usando un microscopio de epifluorescencia vertical con la función seccionamiento óptica y combinada con un controlado por ordenador 1.3 megapíxeles monocromo CCD cámara y software de adquisición de imagen, usando un objetivo de 20 x, 0.8 NA. Reconstrucción de volumen 3D y representación video fue realizado usando un software comercial. Una parte del video es reimpreso con permiso de Gucciardo et al. 11. por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Considerando la importancia del microambiente del tejido relevante para celular funcional confiable y resultados mecanismos moleculares, es imperativo encontrar modelos experimentales apropiados que proporcionan el ambiente de este tejido. El PDR aquí descrito ex vivo cultura modelo de la FTs de fibrina incrustado permite la investigación de los mecanismos de la patofisiología PDR en el contexto nativo, complejo y pluricelular de las muestras clínicas del PDR.
Pasos críticos en el protocolo son la formación de gel de fibrina adecuada, la colocación de los pies y lavado adecuado durante la tinción. Puesto que la formación de gel de fibrina depende principalmente de la actividad de la trombina, afectada por la concentración y la temperatura, la cantidad de trombina debe ajustarse para cada lote de preparación del gel de fibrina. Formación de gel de fibrina debe ser lo suficientemente rápida como evitar el crecimiento de 2D de los explantes de pies pero también lento lo suficiente para permitir la colocación de los pies hasta el centro de las gotas verticalmente y horizontalmente. En el caso de que los pies pasa a ubicar en el borde de la gota, pipeteo adicional podría ayudar a la colocación de los pies al centro. FTs que quedan en el borde de las gotitas o que crecen en 2D tendrá que ser excluida. Adecuado lavado durante la coloración y evitar secar las gotitas son a su vez crítico para optimizar la coloración y minimizar la señal de fondo. Tiempos de transferencia también pueden ser críticas. Hemos incorporado la FTs hasta dos horas después de vitrectomy y esto no afectó el ex vivo crecimiento. El impacto del tiempo de transferencia en el éxito de la cultura tendría que ser probado.
Este protocolo podría modificarse mediante el uso de matrices alternativas para incrustar FT. In vivo, el PDR neovessels crecen hacia la corteza vítrea ricas en colágeno23. Sin embargo, sobre componentes de suero de fuga vascular, incluyendo fibrinógeno, disolverse en el vítreo en proximidad cercana a los vasos por el que se inicia la respuesta fibrótica. Por lo tanto, el coágulo de fibrina in vitro se utilizó aquí para el ex vivo de cultura con el fin de tipificar el ECM provisional formado en el medio fibroso inflamado de PDR15,21,22. Alternativamente, los coágulos de fibrina podrían complementarse con la laminina y la fibronectina a alterar la estabilidad de brotes capilares o los explantes podrían incluirse dentro del tipo I colágeno y otras matrices mixtas que caracterizan los microambientes más fibróticos en neovascular tejidos. Estas matrices son generalmente adecuadas para la cultura 3D e inmunofluorescencia todo montaje pero sus efectos sobre el PDR FTs permanecen a probarse y consideraciones en el momento de la formación de matriz 3D tendrá que ser hecho para mantenerse dentro de los límites para la prevención de 2D crecimiento18,19. Cuando la proximidad física de la unidad de investigación en el hospital representa una limitación, tiempo de transferencia podría compensarse con trabajo en equipo; TA solución preparación, filtración estéril de fibrinógeno y fibrina gel de formación se pueden realizar durante la transferencia FT. Si los geles de fibrina forma incluso después de 1 hora, podría haber ocurrido un problema con el fibrinógeno o la preparación de solución de TA. En este caso, no se puede utilizar los geles de fibrina/FT.
Limitaciones de este enfoque, como con cada ex vivo enfoque, son la calidad variable de la muestra de tejido primario a través de individuos así como la heterogeneidad del tejido de la paciente y entre pacientes. En el caso de pacientes diabéticos, parte de esta variabilidad incluye el grado de vascularización y fibrosis que dependen de numerosos factores como la duración de la enfermedad, afección metabólica, factores epigenéticos/genética, tipo de diabetes y la terapia sistémica. El tamaño del FT PDR quirúrgico recuperados es también un factor limitante para determinar el número de condiciones que pueden ser investigadas para cada muestra. Proporcionando información espacial recíproca, todo Monte inmunofluorescencia permite la investigación de solamente una cantidad limitada de características/marcadores por gota. Como un compromiso, las gotitas de fibrina pueden alternativamente ser incrustadas en parafina, corte secciones delgadas y analizadas por immunohistochemistry.
Cuales el ratón diabético modelos desarrollan muchas características de la etapa temprana Dr. pero no recapitular exhaustivamente los cambios progresivos que ocurren en la humana República Democrática, por lo tanto, lo que dificulta los estudios de los PDR enfermedad mecanismos7,8. Por otra parte, el ojo murino es fundamentalmente diferente de la del ojo humano, en que carece de la mácula, más énfasis en la importancia de estudiar la enfermedad humana24. La FTs PDR quirúrgica ya sea previamente sido descartada o utilizado para secciones de parafina, microscopía electrónica de transmisión, bloque serie cara-microscopía electrónica, a granel 2D cultivo de células disociadas3,25 o secuenciación del RNA . El modelo aquí descrito permite la caracterización 3D de este precioso material quirúrgico, así como la investigación de la patofisiología PDR en el microambiente del tejido enfermo nativo. Cuando se combina con el uso de líquido vítreo, este modelo también permite la investigación de la contribución del microambiente PDR celular y acelular. Puesto que las culturas responden eficientemente a factores de crecimiento detectado en el vítreo, como VEGFA, bFGF, VEGFC y TGFβ, recapitulando así características de la patofisiología de la PDR, este PDR ex vivo modelo de cultura es favorable para pruebas o desarrollo de nuevos tratamientos de PDR 11. en este modelo, anti-VEGFA prevenir brotes capilares e inducida por señales de regresión capilar, respuestas que son consistentes con los resultados clínicos esperados de anti-VEGFA tratamiento26,27. Por lo tanto, este modelo también puede utilizarse para comprender mejor los efectos de las terapias actuales, incluyendo tratamientos anti-VEGFA y corticosteroides.
Con la instrumentación imágenes de células vivas, lo aquí descrito ex vivo modelo de la cultura puede ser sujetos a la microscopía Time-lapse para permitir la investigación en tiempo real de procesos como la regresión vascular, despunte y celular de la plasticidad. Cuando se combinan con modelos in vitro e in vivo, así como datos clínicos, esta ex modelo PDR vivo ayudará en la investigación de pacientes respuestas basadas en conjuntos particulares de identificación de marcadores, un paso más cerca a la avenida para medicina personalizada. Identificación de las respuestas específicas del paciente o marcadores específicos de respuesta es especialmente relevante en el caso de República Democrática, que es una enfermedad multifactorial con una interacción compleja de microvascular, neurodegenerativas, metabólica, genética/epigenéticos, factores inmunológicos y relacionado con la inflamación, así que requieren esfuerzos cada vez más multidisciplinares para el desarrollo del mejor manejo terapéutico de orientación y la enfermedad. Además de conjunto de montaje de la inmunofluorescencia, el ex vivo cultivado FTs también podrían ser obtenidos de la fibrina por el tratamiento de nattokinase plasmina/y sometidos a transcriptómico y proteómica analiza28. La idoneidad del modelo aquí descrito para ex vivo estudios de tejidos fibrovasculares desarrollados en otras afecciones oculares, como en los casos graves de la retinopatía de células falciformes, también podría explorarse en el futuro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores están muy agradecidos a los colegas de retina médica y quirúrgica, enfermeras y todo personal de la unidad de diabéticos y la unidad de cirugía del Vitreoretinal en el Departamento de Oftalmología, Hospital Universitario de Helsinki para participar activamente en el reclutamiento de los pacientes. Agradecemos a Biomedicum unidad de imagen Molecular para las instalaciones de proyección de imagen. Agradecemos a Anastasiya Chernenko excelente asistencia técnica. Este estudio fue apoyado por becas de la Academia de Finlandia (KL), Universidad de Helsinki (KL), Sigrid Juselius Fundación (KL), K. Albin Johansson Fundación (KL), Instituto Finlandés del cáncer (KL), Karolinska Institutet (KL), Fundación de ojo finlandés (SL), ojo y Fundación de banco de tejidos (SL), María y Georg C. Ehrnrooth Fundación (SL) y becas de investigación clínica en HUCH (TYH2018127 después de TYH2016230, SL), Diabetes Research Foundation (SL, KL, AK, EG), así como el programa de doctorado en biomedicina (EG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Microforceps | Medicon | 07.60.03 | Used for handling the FTs |
| Disposable Scalpels - Sterile | Swann-Morton | 0513 | Used for FT dissection |
| Culture dish, vented, 28 ml (60mm) | Greiner Bio-One | 391-3210 | Used for dissection and for testing fibrin gel formation |
| Cell culture plates, 12-well | Greiner Bio-One | 392-0049 | Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL | Greiner Bio-One | 391-3477 | |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL | Greiner Bio-One | 525-0384 | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF | Millipore | SLGV033RS | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Syringe, 10 mL | Braun | 4606108V | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Fisher | FB74031 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well | Nunc | 142475 | Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture |
| Cell culture plates, 96-well, U-bottom | Greiner Bio-One | 392-0019 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Coverslips 22x22mm #1 | Menzel/Fisher | 15727582 | Used for mounting |
| Microscope slides | Fisher | Kindler K102 | Used for mounting |
| Absorbent paper | VWR | 115-0202 | Used for mounting |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | Used for preparing 1x PBS |
| Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Calbiochem | 341578 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H9394-500ML | Used for preparing the fibrinogen and TA solution |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | Used for preparing the blocking solution |
| Human Serum | Sigma-Aldrich | H4522 | Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media |
| Gentamicin Sulfate 10mg/ml | Biowest | L0011-100 | |
| Endothelial cell media MV Kit | Promocell | C-22120 | Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement, 500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-2.5L-M | Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | T9284 | Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. |
| Hoechst 33342, 20mM | Life Technologies | 62249 | For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Eukitt Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 03989-100ml | TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | T9549-500UN | Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder | Sigma | A3428 | Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth factors | |||
| Recombinant human VEGFA | R&D Systems | 293-VE-010 | 50 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human VEGFC | R&D Systems | 752-VC-025 | 200 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human TGFβ | Millipore | GF346 | 1 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human bFGF | Millipore | 01-106 | 50 ng/ mL final concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary antibodies | |||
| CD31 (JC70A) | Dako | M0823 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD34 (QBEND10) | Dako | M716501-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD45 (2B11+PD7/26) | Dako | M070129-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD68 | ImmunoWay | RLM3161 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| Cleaved caspase-3 (5A1E) | Cell Signalling | 9664 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| ERG (EP111) | Dako | M731429-2 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| GFAP | Dako | Z0334 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Ki67 | Leica Microsystems | NCL-Ki67p | Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Lyve1 | R&D Systems | AF2089 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab |
| NG2 | Millipore | AB5320 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Prox1 | ReliaTech | 102-PA32 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab |
| Prox1 | R&D Systems | AF2727 | Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab |
| VEGFR3 (9D9F9) | Millipore | MAB3757 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| α-SMA (1A4) | Sigma | C6198 | Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG | Life Technologies | A-21202 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-11012 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG | Thermo Scientific | A-11057 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG | Thermo Scientific | A-11036 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG | Molecular Probes | A-21468 | Used at 1:500 dilution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope | Zeiss | For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT | |
| SZX9 upright dissection stereomicroscope | Olympus | For FT dissection | |
| LSM 780 confocal microscope | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT | |
| AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT |
References
- Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Liew, G., Wong, V. W., Ho, I. V. Mini Review: Changes in the Incidence of and Progression to Proliferative and Sight-Threatening Diabetic Retinopathy Over the Last 30 Years. Ophthalmic Epidemiology. 24 (2), 73-80 (2017).
- Loukovaara, S., et al. Indications of lymphatic endothelial differentiation and endothelial progenitor cell activation in the pathology of proliferative diabetic retinopathy. Acta Ophthalmologica. 93 (6), 512-523 (2015).
- Stitt, A. W., et al. The progress in understanding and treatment of diabetic retinopathy. Progress in Retinal and Eye Research. 51, 156-186 (2016).
- Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies. JCI Insight. 2 (14), (2017).
- Gross, J. G., et al. Five-Year Outcomes of Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial. JAMA Ophthalmology. 136 (10), 1138-1148 (2018).
- Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Disease Models, Mechanisms. 5 (4), 444-456 (2012).
- Villacampa, P., Haurigot, V., Bosch, F. Proliferative retinopathies: animal models and therapeutic opportunities. Current Neurovascular Research. 12 (2), 189-198 (2015).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models, Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
- Sharma, T., et al. Surgical treatment for diabetic vitreoretinal diseases: a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 44 (4), 340-354 (2016).
- Gucciardo, E., et al. The microenvironment of proliferative diabetic retinopathy supports lymphatic neovascularization. The Journal of Pathology. 245 (2), 172-185 (2018).
- Rezzola, S., et al. 3D endothelial cell spheroid/human vitreous humor assay for the characterization of anti-angiogenic inhibitors for the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Angiogenesis. 20 (4), 629-640 (2017).
- Pepper, M. S., Montesano, R., Mandriota, S. J., Orci, L., Vassalli, J. D. Angiogenesis: a paradigm for balanced extracellular proteolysis during cell migration and morphogenesis. Enzyme, Protein. 49 (1-3), 138-162 (1996).
- Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs). Journal of Cell Science. 115 (Pt 17), 3427-3438 (2002).
- Loukovaara, S., et al. Quantitative Proteomics Analysis of Vitreous Humor from Diabetic Retinopathy Patients. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5131-5143 (2015).
- Abu El-Asrar, A. M., Struyf, S., Opdenakker, G., Van Damme, J., Geboes, K. Expression of stem cell factor/c-kit signaling pathway components in diabetic fibrovascular epiretinal membranes. Molecular Vision. 16, 1098-1107 (2010).
- Loukovaara, S., et al. Ang-2 upregulation correlates with increased levels of MMP-9, VEGF, EPO and TGFbeta1 in diabetic eyes undergoing vitrectomy. Acta Ophthalmologica. 91 (6), 531-539 (2013).
- Sugiyama, N., et al. EphA2 cleavage by MT1-MMP triggers single cancer cell invasion via homotypic cell repulsion. Journal of Cell Biology. 201 (3), 467-484 (2013).
- Tatti, O., et al. MMP16 Mediates a Proteolytic Switch to Promote Cell-Cell Adhesion, Collagen Alignment, and Lymphatic Invasion in Melanoma. Cancer Research. 75 (10), 2083-2094 (2015).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
- Senger, D. R. Molecular framework for angiogenesis: a complex web of interactions between extravasated plasma proteins and endothelial cell proteins induced by angiogenic cytokines. American Journal of Pathology. 149 (1), 1-7 (1996).
- Senger, D. R., Davis, G. E. Angiogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (8), a005090 (2011).
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
- Marmorstein, A. D., Marmorstein, L. Y. The challenge of modeling macular degeneration in mice. Trends in Genetics. 23 (5), 225-231 (2007).
- Kim, L. A., et al. Characterization of cells from patient-derived fibrovascular membranes in proliferative diabetic retinopathy. Molecular Vision. 21, 673-687 (2015).
- Avery, R. L., et al. Intravitreal bevacizumab (Avastin) in the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Ophthalmology. 113 (10), e1691-e1615 (2006).
- Zhao, L. Q., Zhu, H., Zhao, P. Q., Hu, Y. Q. A systematic review and meta-analysis of clinical outcomes of vitrectomy with or without intravitreal bevacizumab pretreatment for severe diabetic retinopathy. The British Journal of Ophthalmology. 95 (9), 1216-1222 (2011).
- Carrion, B., Janson, I. A., Kong, Y. P., Putnam, A. J. A safe and efficient method to retrieve mesenchymal stem cells from three-dimensional fibrin gels. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (3), 252-263 (2014).
