Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لدراسة الفسيولوجيا المرضية لاعتلال الشبكية السكري التكاثري باستخدام الأنسجة المستمدة من المريض، واقتطعت جراحيا، فيبروفاسكولار للنسيج الأصلي ثلاثية الأبعاد توصيف والسابقين فيفو ثقافة. هذا السابقين فيفو ثقافة النموذجي أيضا قابلة للاختبار أو تطوير علاجات جديدة.
Abstract
اعتلال الشبكية السكري (DR) مضاعفات microvascular الأكثر شيوعاً من داء السكري وواحدة من أبرز أسباب العمى في البالغين سن العمل. لا توجد نماذج حيوانية الحالية من مرض السكري واعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين وضع التغييرات التدريجية الكاملة تتجلى في اعتلال الشبكية السكري التكاثري البشري (PDR). ولذلك، اعتمدت فهم منشأ المرض والفيزيولوجيا المرضية إلى حد كبير على استخدام مقاطع نسيجية وعينات الزجاجي في النهج التي لا تقدم سوى معلومات الحالة المستقرة على العوامل المسببة للأمراض المشتركة. تزايد الأدلة يشير إلى أن دينامية خلية-خلية وتفاعلات المصفوفة خارج الخلية الخلية (ECM) في السياق ميكرونفيرونمينتس ثلاثية الأبعاد (3D) ضرورية للدراسات الميكانيكية والفنية نحو تطوير جديدة استراتيجيات العلاج. ولذلك، افترضنا أنه يمكن الاستفادة من الأنسجة فيبروفاسكولار المرضية جراحيا اقتطعت من العيون مع الديمقراطية الشعبية موثوق كشف الآليات الخلوية والجزيئية لهذا المرض المدمر واختبار إمكانات الرواية السريرية التدخلات. تحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير طريقة جديدة ل 3D السابقين فيفو ثقافة اقتطعت جراحيا المستمدة من المريض فيبروفاسكولار الأنسجة (قدم)، التي ستكون بمثابة نموذج ذات صلة البشرية الديمقراطية الشعبية الفيزيولوجيا المرضية. FTs تشريح في اكسبلانتس وجزءاً لا يتجزأ من مصفوفة فيبرينوجين للسابقين فيفو توصيف الثقافة و 3D. يسمح الفلورة الجامع-جبل FTs الأصلية والثقافات نقطة النهاية تحقيقا دقيقا في تكوين الأنسجة وعمليات متعددة الخلايا، وتسليط الضوء على أهمية توصيف مستوى الأنسجة ثلاثية الأبعاد للكشف عن ميزات ذات الصلة الديمقراطية الشعبية الفيزيولوجيا المرضية. سيسمح هذا النموذج المتزامن تقييم الآليات الجزيئية والخلوية/الأنسجة العمليات وعلاج الاستجابات في سياق معقدة من التفاعلات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية داخل هندسة الأنسجة الديمقراطية الشعبية والمكرويه. حيث يلخص هذا النموذج الديمقراطية الشعبية الفيزيولوجيا المرضية، سيكون أيضا قابلة للاختبار أو تطوير علاجات جديدة.
Introduction
الدكتور هو مضاعفات مرض السكري، مرض الذي وصل إلى أبعاد هائلة في العقود الثلاثة الماضية1العين خطيرة. بعد عشرين عاماً على التشخيص، وتقريبا كل مريض بداء السكري من النوع 1 و 60% من المرضى بالنوع 2 من داء السكري علامات هذا اعتلال الشبكية، مما يجعل مرض السكري في حد ذاته واحداً من أبرز الأسباب للعمى في العمل البالغين سن2. وفقا لمستوى انحطاط ميكروفاسكولار والأضرار الدماغية، يصنف الدكتور إلى الدكتور غير التكاثري (غير الديمقراطية)، والدكتور التكاثري (PDR). نهاية مرحلة المرض، الديمقراطية، يتسم بالناجم عن الاسكيمية، والتهاب نيوفاسكولاريزيشن والردود تليفية في واجهة زجاجي شبكي. في ظروف غير المعالجة، وسوف تؤدي هذه العمليات إلى العمى بسبب نزف الزجاجي وتليف الشبكية وانفصال الشبكية تراكشونال ونيوفاسكولار الزرق3،4. وعلى الرغم من التقدم الذي أحرز مؤخرا، تستهدف خيارات العلاج الحالي سوى الدكتور المراحل، بما في ذلك السكري وذمة بقعيه والديمقراطية الشعبية، عند تلف الشبكية وقد تبع ذلك الفعل. وعلاوة على ذلك، أن نسبة كبيرة من مرضى الدكتور لا تستفيد من عتاد العلاج الحالي، تشير إلى حاجة ملحة لتحسين العلاجات4،،من56.
متعددة أخرى أنافيفو ن المرض/الإنمائية نماذج ونماذج حيوانية السكري قد وضعت حتى الآن، ولكن أيا منها لا يجمل النطاق الكامل لميزات باثولوجي في7،الديمقراطية الشعبية البشرية8. وعلاوة على ذلك، أدلة متزايدة تشير إلى أن الاستجابات العلاج ترتبط محكم لتشكيل إدارة المحتوى في المؤسسة، وكذلك الترتيب المكاني والتفاعل بين المكروية الخلوية واللاخلوي9. ونحن لذلك وضعت لتطوير نموذج ذات صلة سريرياً للديمقراطية الشعبية البشرية عن طريق استخدام المواد المرضية FT التي هي عادة اقتطعت من عيون تمر الاستئصال الكلي الزجاجية كجزء من إدارة العمليات الجراحية للديمقراطية الشعبية10.
يصف هذه المخطوطة البروتوكول ل 3D السابقين فيفو ثقافة وتوصيف جراحيا-اقتطعت، الديمقراطية الشعبية المريض-المستمدة FT المرضية. وقد استخدمت الأسلوب الموصوفة هنا في منشور صدر مؤخرا أثبتت نجاح تفكيك الديمقراطية الشعبية 3D الأصلية الأنسجة المناظر الطبيعية، وخلاصة من سمات الديمقراطية الشعبية الفيزيولوجيا المرضية بما في ذلك الأوعية وردود تليفية غير طبيعي 11من هياكل الأوعية الدموية. وكشف هذا النموذج أيضا تقتصر رواية من الميزات التي لا يمكن بسهولة تقدير من أقسام نسيجية رقيقة، مثل مكانياً المبرمج والانتشار، فضلا عن تشكيل الأوعية الدموية جزيرة11. السائل الزجاجي وقد استخدمت بنجاح من قبل الآخرين على الثقافات كروي غشائي ثلاثية الأبعاد لتقييم به الأوعية المحتملة ونجاعة أنجيوستاتيك جزيئات12. عندما يتم دمجها مع في المختبر 3D غشائي اللمفاوية خلية (LEC) كروي تنتشر المقايسة تستخدم الديمقراطية الشعبية زجاجي كمنشط، نموذجنا كشف عوامل مساهمة كلا فيتريل القابلة للذوبان العظة كذلك المحلية داخل الأنسجة نيوفاسكولار إلى حتى الآن غير مفهومة LEC المشاركة في الديمقراطية الشعبية الفيزيولوجيا المرضية3،11. جراحة زجاجي شبكي في إدارة الديمقراطية الشعبية، إجراء المؤداة بعد التحدي بشكل روتيني. كما هي رؤية الأدوات الجراحية وأساليب النهوض المستمر والتطور، إزالة عينة التكاثري فيبروفاسكولار في الوقت المناسب والمحافظة ليس فقط بتحسين نتائج الرؤية ولكن أيضا يوفر مواد النسيج لا تقدر بثمن تحقيق الديمقراطية الشعبية استجابات الفيزيولوجيا المرضية والعلاج في الجوانب المعقدة متعدية الجنسيات المكروية أنسجة بشرية حية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأقر هذا البحث "المؤسسي استعراض المجلس" واللجنة الأخلاقية في مستشفى جامعة هلسنكي. تم الحصول على الموافقة المستنيرة الموقعة من كل مريض.
1-إعداد الحلول ووسائل الإعلام والمعدات
- إعداد المعدات التالية قبل جمع الأنسجة فيبروفاسكولار (قدم) لضمان المعالجة السريعة.
- ملاقط ميكروديسيكشن معقم اﻷوتوكﻻف اثنين.
- تحضير 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) بإذابة قرص برنامج تلفزيوني 1 وزنه قبل (0.14 م NaCl، 0.0027 م بوكل، 0.010 م ص. ب4-3) في 900 مل من المياه وآثاره حل. ضبط حجم المياه يصل إلى 1 لتر ومعقم اﻷوتوكﻻف حل جاهز. مخزن في الرايت
- جمع الحل المذكور أعلاه والمعدات في سلة، جنبا إلى جنب مع مشرط معقمة تستخدم مرة واحدة وطبق ثقافة عقيمة 6-سم خلية وخمس لوحات الثقافة العقيمة جيدا 12 خلية.
- إعداد 6 مغ/مل الحل الفيبرينوجين في هانكس متوازن الملح الحل (حبس) بإذابة 30 ملغ الفيبرينوجين البشري المستنفد البلاسمينوجين إلى 5 مل حبس، استخدام أنبوب 50 مل منغمسين في حمام مائي عند 37 درجة مئوية، على الأقل ح 1.
ملاحظة: هذا الحل يمكن أن يوضع في حمام الماء (37 درجة مئوية) ح 7 (بحد أقصى 10 ح) قبل الاستخدام. - إعداد السابقين فيفو الثقافة المتوسطة بإضافة 5% مصل العجل الجنين (FCS) أو مصل الدم البشري 5% والملحق نمو الخلايا البطانية 0.4 في المائة، 10 نانوغرام/مل الماشوب البشري البشرة عامل النمو، 1 ميكروغرام/مل الهيدروكورتيزون ومع الجنتامايسين ميكروغرام/مل 50 إلى المتاحة تجارياً متوسط نمو الخلايا البطانية وتبقى في حوض ماء في 37 درجة مئوية حتى الاستخدام. تخزين في 4 درجات مئوية لتصل إلى شهر.
2-تشريح الأنسجة فيبروفاسكولار
- جمع الأنسجة فيبروفاسكولار (قدم) التي كانت قد اقتطعت من البشر عملية جراحية ميكروينسيسيون ترانس مايوجد زجاجي شبكي، قبل 23 أو 20 قياس ثلاثة-ميناء بارس بلانا الاستئصال الكلي الزجاجية كجزء من إدارة العمليات الجراحية زجاجي شبكي للديمقراطية الشعبية.
ملاحظة: قدم اقتطعت استخدام تجزئة وتنسل الأطراف، قص إذا لزم الأمر مع ميكروسسيسورس، وإزالتها من تجويف الزجاجي بالعين ميكروفورسيبس تجتاح نهاية بالجراح زجاجي شبكي ذوي الخبرة. يحتاج العناية القصوى التي يجب اتخاذها لإزالة FT سليمة، سليمة دون إلحاق أضرار بالعين الهياكل بما فيها العصب البصري أو ممر الأوعية الزمانية حيث الأنسجة نيوفاسكولار المرضية يقع الأكثر شيوعاً. حجم الأنسجة قصت متغير، وعادة ما تتراوح ما بين 3 و 50 مم2. - الإبقاء قدم في صحن ثقافة الخلية 6 سم أو 1.5 مل أنبوب يحتوي على 1 مل PBS العقيمة على الجليد الرطب، ونقله فورا البحوث المختبرية للمعالجة.
ملاحظة: من الضروري أن وحدة البحوث (مختبر مرافق) فعلياً قريبة من غرفة العمليات في المستشفى (أو) لتقليل أوقات نقل FT قصت الصغيرة. وفي هذه الحالة النقل يستغرق أقل من 5 دقائق و explants المضمنة داخل فيبرينوجين عادة في ح 1-1.5 (بحد أقصى 2 ح) بعد الاستئصال الجراحي. أثر أوقات أطول في نقل ثقافة 3D سوف تحتاج إلى اختبار. - المكان قدم في صحن ثقافة 6-سم خلية التي تحتوي على 1 مل من برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة (RT، 25 درجة مئوية) والحصول على صور الأنسجة باستخدام مجهر مقلوب ابيفلوريسسينسي هدف 5 x.
ملاحظة: يتم الحصول على الصور للتقييم النوعي والوثائق. وسوف يكون من الممكن لمراقبة حجم الأنسجة والكثافة والتركيب العام (مثلاً، هياكل الأوعية الدموية). - قطع قدم إلى ~ 1 مم2 قطعة تحت ستيريوميكروسكوبي تشريح تستقيم، استخدام الملقط مشرط وميكروديسيكشن عقيمة. اضغط الأنسجة، وكذلك غارقة في برنامج تلفزيوني، في مكان استخدام الملاقط ميكروديسيكتيون، وإجراء التخفيضات واضحا باستخدام مشرط معقم. تجنب تمزق متر، كما أن هذا سيؤدي إلى تغيير هياكل فيبروفاسكولار الأصلية.
- ضع كل قطعة فردية في بئر لوحة الثقافة 12-جيدا خلية تحتوي على 1 مل PBS العقيمة.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، بلطف انتشار متر على لوح، استخدام الملقط ميكروديسيكشن، قبل إجراء تخفيضات.
3-صب قطرات جل فيبرينوجين تستقيم لتوصيف FT الأصلية والثقافة السابقين فيفو
- معقمة-تصفية الحل الفيبرينوجين استعداد إعدادها في الخطوة 1.2 مع عامل تصفية 0.22 ميكرومتر شنت في محقن 10 مل.
- تحضير مختبرين الحل الفيبرينوجين (25 ميكروليتر كل أنبوب 1.5 مل) وأن يبقى في تحضير الرايت قاسمة فيبرينوجين هلام/كل قطعة متر تم الحصول عليها بعد التشريح، وزوجين من مختبرين إضافي للاختبار في فيبرينوجين هلام تشكيل.
- تحضير حلاً لحبس تحتوي على 4 وحدات/مل من ثرومبين و 400 ميكروغرام/مل من أبروتينين، يسمى الآخرة تا الحل، وتبقى في تحضير الرايت قدر الحل تا حسب الحاجة، اعتماداً على عدد القطع التي تم الحصول عليها بعد تشريح (25 ميكروليتر تا الحل هو استخدام لكل هلام FT/fibrin)، ومبلغ إضافي (مثلاً 250 ميكروليتر) لاختبار تكوين هلام فيبرينوجين وضمان أن تكفي الحل متاح في جميع أنحاء صب قطرات جل فيبرينوجين.
ملاحظة: ثرومبين مطلوب من أجل بلمرة فيبرينوجين حين يضاف إلى منع تدهور جل فيبرينوجين aprotinin البروتياز الخلوية التي أعرب عنها13،FTs14. - اختبار توقيت فيبرينوجين هلام تشكيل: إضافة 25 ميكروليتر تا الحل إلى الحل الفيبرينوجين 25 ميكروليتر الكوتيد إعدادها في الخطوة 3، 2، واستخدام ماصة آخر تعيين إلى 50 ميكروليتر، خلط في الأنبوب بيبيتينج والاستغناء عن إلى طبق ثقافة خلية 6 سم ، تشكل الحبرية تستقيم.
ملاحظة: تكوين هلام فيبرينوجين ينبغي أن يجري في ~ 1 دقيقة. إذا كان هذا يأخذ أكثر من 1.5 دقيقة، يمكن زيادة تركيز ثرومبين في الحل تا إعدادها في الخطوة 3، 3 بإضافة أكثر من حل الأسهم ثرومبين. يمكن إضافة عشر حجم المستخدمة في البداية من حل الأسهم ثرومبين، مرارا وتكرارا، حتى تشكيل جل فيبرينوجين يحدث داخل 1.5 دقيقة. وقت تكوين هلام فيبرينوجين أمر حاسم لثلاثة أبعاد للثقافة، كجل سريع تشكيل (في غضون دقائق 1.5) يمنع متر قطعة من غرق إلى الجزء السفلي من جل فيبرينوجين، وهكذا تأتي على اتصال بسطح البلاستيك 2D الخلية لوحة الثقافة، والتي يمكن أن تؤدي إلى التصاق الخلايا 2D وثمرة. - جيدا من صفيحة 24-جيدا باستخدام ملقط معقم مكان قطعة متر واحد في المركز واحد وإزالة أي برنامج تلفزيوني الزائدة عن طريق بيبيتينج مع 0.5-10 ميكروليتر ماصة لتجنب قوة الشفط على قدم. في حالة الأنسجة تتمسك الملاقط، استخدم الملاقط إضافية للمساعدة في وضع قطعة النسيج في اللوحة.
ملاحظة: يمكن أن يلقي الجل FT/فيبرينوجين أيضا على لوحة 48-جيدا للحد من استخدام المواد الكاشفة. ومع ذلك، هذا أكثر صعوبة كما أن الفضاء أكثر محدودية وسوف تنتشر فيبرينوجين إذا أنه يأتي في اتصال مع الجدار جيدا. - إضافة 25 ميكروليتر تا الحل إلى الحل الفيبرينوجين ميكروليتر 25 اليكووتيد في الخطوة 3، 2، واستخدام ماصة آخر تعيين 50 ميكروليتر ميكس في الأنبوب بواسطة بيبيتينج. الاستغناء عن على قطعة متر توضع على اللوحة جيدا، وماصة صعودا وهبوطاً 2-3 مرات كي تشمل قطعة متر داخل الحبرية تستقيم، توفير مصفوفة ثلاثية الأبعاد المحيطة بها إلى قدم.
ملاحظة: تأكد من أن قدم لا يستنشق خلال بيبيتينج وأن يتم تشكيل لا فقاعات الهواء. تكفل أيضا خلط، إعفاء وبيبيتينج أداء بسرعة كما سوف تشكل جل فيبرينوجين داخل 1.5 دقيقة، كما تم اختبارها في الخطوة 3.4. إذا صب المواد الهلامية فيبرينوجين على لوحة 48، حسنا، استخدم بدلاً من ذلك 20 ميكروليتر من حل الفيبرينوجين و 20 ميكروليتر من حل تا. - كرر الخطوات من 3.5 و 3.6 لكل قطعة متر.
- تسمح المواد الهلامية فيبرينوجين ترسيخ التي تفرخ اللوحات في حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد مع شركة 5%2.
- بعد 0.5-1 ح، تحقق من أن جل فيبرينوجين يتكون تماما من عناية إمالة اللوحة. انتقل إلى الخطوة 3، 10 عند الجل لا تتحرك عند تحريك اللوحة، مشيراً إلى أن تشكيل جل فيبرينوجين كاملة.
- تراكب الجل FT/فيبرينوجين مع السابقين فيفو الثقافة المتوسطة (600 ميكروليتر/أيضا في لوحة 24-جيدا) أو 300 ميكروليتر/بئر في لوحة 48-جيدا وتستكمل مع 100 ميكروغرام/مل أبروتينين. "الماصة؛" المتوسطة بلطف بإعفاء دروبويسي.
ملاحظة: هنا، aprotinin تستخدمها لمنع تدهور جل فيبرينوجين البروتياز الخلوية التي أعرب عنها13،FTs14. السابقين فيفو المتوسطة الثقافة يمكن بالإضافة إلى ذلك أن تستكمل بعوامل النمو المؤتلف، مثل فيجفا، فيجفك، بفجف، TGFβ (انظر الجدول للمواد)11. - مكان قدم السابقين فيفو ثقافة اللوحة مرة أخرى إلى 37 درجة مئوية ونسبة 5% CO2 خلية ثقافة حاضنة والثقافة للفترة الزمنية المطلوبة (مثلاً، 2-18 يوما، ثقافة أطول فترات سوف تحتاج إلى اختبار). يستعاض عن 50 في المائة المتوسط مع الطازجة السابقين فيفو الثقافة المتوسطة كل ثلاثة أيام.
4-"في مادة خلالية التصوير
- الحصول على صور قدم السابقين فيفو الثقافات في نفس اليوم (يوم 0) وفي فترات زمنية معينة (مثلاً كل يوم)، باستخدام مجهر مقلوب ابيفلوريسسينسي، من أجل متابعة نمو 3D.
ملاحظة: يمكن استخدام الصور التي تم الحصول عليها للتحديد الكمي لثمرة متر كالطول الإجمالي لاثنين من أقطار متعامدة عبر ال explant11.
5. قدم الأصلية ونقطة النهاية الثقافة السابقين فيفو
ملاحظة: يمكن مثقف السابقين فيفو للفترة الزمنية المطلوبة (قدم السابقين فيفو الثقافات) المواد الهلامية FT/فيبرينوجين أو ثابتة في نفس اليوم (قدم الأصلي) ل توصيف FT الأصلية11.
- إصلاح قدم الأصلي أو قدم السابقين فيفو الثقافات بالاستعاضة عن المتوسط الثقافة مع 1 مل/جيدا من بارافورمالدهيد 4 ٪ في حل برنامج تلفزيوني، ح 1 في الرايت للهلام FT/فيبرينوجين الأصلية، إصلاح 0.5-1 ح بعد إضافة السابقين فيفو الثقافة المتوسطة (إذا كان قد تم غارقة الجل فيبرينوجين ليس في المتوسط، التثبيت سوف تلحق الضرر لهم).
ملاحظة: إجراء هذه الخطوة في غطاء الدخان كما بارافورمالدهيد أكالة والسامة والمسببة للسرطان. - شطف الجل FT/فيبرينوجين مع ثلاثة 5 دقائق يغسل في برنامج تلفزيوني (2 مل في البئر).
- استبدال برنامج تلفزيوني مع 2 مل/جيدا لبرنامج تلفزيوني يتضمن أزيد الصوديوم 0.02 في المائة، وتخزين المواد الهلامية فيبرينوجين ثابتة عند 4 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة. ختم اللوحات مع الفيلم البارافين التأكد من أن المواد الهلامية FT/فيبرينوجين الجاف لا في التخزين.
ملاحظة: إجراء هذه الخطوة في غطاء الدخان كما أزيد الصوديوم السامة.
6-تلوين الفلورة كل-جبل
ملاحظة: هذا البروتوكول تستمر 5 أيام، ويمكن أن توقف مع إينكوبيشنز بين عشية وضحاها حيث المشار إليها. لا تدع فيبرينوجين الجل الجاف عند أي نقطة. يتم تنفيذ كافة الخطوات في الرايت ما لم يشر إلى خلاف ذلك.
- إعداد الحلول التالية قبل بدء تشغيل البروتوكول المصبوغة.
- الحل بعد انتهاء التثبيت: إعداد 50: 50 الأسيتون: الميثانول الحل عن طريق خلط كميات متساوية من الأسيتون والميثانول (مثلاً 50 مل). مخزن في-20 درجة مئوية. إعداد هذا الحل أحدث في اليوم السابق لتلطيخ. هذا الحل يمكن تخزينها مرة أخرى في-20 درجة مئوية، وستستخدم ستينينجس اللاحقة.
ملاحظة: يعد هذا الحل في غطاء الدخان كذلك الأسيتون والميثانول القابلة للاشتعال وخطرة على الصحة. - عرقلة الحل: إعداد 15% الجنيني بقرى مصل (FBS)، 0.3% octyl الفينول الحل اثوكسيلاتي في برنامج تلفزيوني بأول إضافة 15% FBS لبرنامج تلفزيوني. إضافة الفينول أوكتيل اثوكسيلاتي وآثاره إلى حل. مخزن في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: هذا الحل يمكن إعداد كمية كبيرة مقدما، المخزنة في اليكووتيس 15 مل في-20 درجة مئوية وإذابة قبل الاستعمال، في اليوم عند بدء تشغيل البروتوكول المصبوغة. استخدام الكوت طازجة أو المذابة طازجة لكل بروتوكول المصبوغة. - الغسيل الحل: تحضير 1 لتر من برنامج تلفزيوني مع 0.45 في المائة octyl الفينول اثوكسيلاتي تكملها إضافة 4.5 مل فينول أوكتيل اثوكسيلاتي لمل 995.5 من برنامج تلفزيوني. إثارة إلى حل. مخزن في الرايت
- الحل بعد انتهاء التثبيت: إعداد 50: 50 الأسيتون: الميثانول الحل عن طريق خلط كميات متساوية من الأسيتون والميثانول (مثلاً 50 مل). مخزن في-20 درجة مئوية. إعداد هذا الحل أحدث في اليوم السابق لتلطيخ. هذا الحل يمكن تخزينها مرة أخرى في-20 درجة مئوية، وستستخدم ستينينجس اللاحقة.
- رفع قطرات بعناية من اللوحة باستخدام ملعقة ذات حواف مربع فولاذ المقاوم للصدأ. فصل الحبرية أولاً من الحواف قبل رفع المركز، ونقل إلى بئر 12-جيدا صفيحة تحتوي على 1 مل من برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: إجراء التثبيت بعد ويغسل وعرقلة الخطوات في هذا الشكل لوحة. - بعد إصلاح القطرات مع 1 مل من المثلج 50: 50 الأسيتون: الميثانول الحل لدقيقة ~ 1 (سوف تتحول حدود القطرات بيضاء).
ملاحظة: إجراء هذه الخطوة في غطاء الدخان كما الأسيتون والميثانول تشكل خطرا على الصحة. - شطف مع يغسل 3-5 في 2 مل من برنامج تلفزيوني (سوف تنزل القطرات في برنامج تلفزيوني الحل عند اكتمال الإماهة).
ملاحظة: تجنب لمس القطرات مع طرف ماصة، كما بعد التثبيت فيما بعد، لاصقة للبلاستيك. في جميع أنحاء البروتوكول، تجنب يسفط ما بعد الإصلاح، جسم، حجب وغسل الحلول بالشفط، كما أن هذا قد تضر أو تدمر تماما القطرات. بدلاً من ذلك، إمالة اللوحة وإزالة حلول باستخدام ماصة ميكروليتر 500-5,000 بعناية. - الطرد المركزي حل حظر لمدة 15 دقيقة في 21,000 س ز و 4 درجة مئوية من أجل إزالة الحطام.
ملاحظة: يمكن أن يكون الحل الكوتيد في أنابيب 1.5 مل للطرد المركزي. يمكن تخزين في 4 درجات مئوية الحل غير المستخدمة والمستخدمة لجميع الخطوات اللاحقة ذات الصلة. - احتضان القطرات في 500 ميكروليتر عرقلة الحل ح 2 في الرايت
ملاحظة: لتقليص حجم عرقلة الحل المستخدم، اللوحة يمكن يميل على دعم ويمكن استخدام أقل قدر من 300 ميكروليتر من الحل/الحبرية. - إعداد الخليط جسم الأولية (على الأقل 30 ميكروليتر/الحبرية) في تمييع المناسبة في عرقلة الحل والطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في س 21,000 ز و 4 درجة مئوية.
- نقل القطرات في جولة (U)-أسفل لوحة 96-جيدا باستخدام ملعقة ذات الحواف المستديرة، واحتضان مع ميكروليتر/الحبرية مالا يقل عن 30 من خليط جسم الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- اليوم التالي، نقل القطرات في بئر 12 لوحة تحتوي على 2 مل من الغسيل الحل/حسنا، شطف مع 5 ثلاث دقائق يغسل أولاً ثم مع تسع 30 دقيقة يغسل. إجازة تغسل الماضي (2 مل) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- اليوم التالي، شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني ونقل القطرات في جولة (U)-96-جيدا لوحة أسفل.
- خلال يغسل، إعداد المخلوط مناسبة جسم الثانوي مترافق fluorophore (المخفف 1: 500، على الأقل 30 ميكروليتر/الحبرية) في عرقلة الحل والطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 21,000 س ز و 4 درجة مئوية.
- نقل القطرات إلى جولة (U)-أسفل لوحة 96-جيدا باستخدام ملعقة ذات الحواف المستديرة واحتضان مع ميكروليتر على الأقل 30 الخليط الجسم المضاد الثانوي، عن ح 4 في الرايت، محمية من الضوء.
ملاحظة: تنفيذ جميع إينكوبيشنز اللاحقة وخطوات الغسيل محمية من الضوء. - نقل القطرات في لوحة 12-البئر الذي يحتوي على 2 مل من الغسيل الحل/جيدا باستخدام ملعقة ذات الحواف المستديرة، شطف مع ثلاثة 5 دقائق يغسل أولاً ومن ثم مع أربعة 30 دقيقة يغسل. إجازة تغسل الماضي (2 مل) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- اليوم التالي، شطف الجل مع خمسة 30 دقيقة يغسل وثم ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. إجازة تغسل الماضي (2 مل) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- اليوم التالي، نقل القطرات إلى جولة (U)-لوحة 96-جيدا أسفل باستخدام نوى البسط وكونتيرستاين ذات الحواف المستديرة التي تفرخ مع 10 ميكروغرام/مل هويشت النووية وصمة عار (على الأقل 30 ميكروليتر/الحبرية) لمدة 30 دقيقة في الرايت
ويمكن بدلاً من ذلك استخدام ملاحظة: تصاعد المتوسطة وتستكمل مع 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) لنواة كونتيرستينينج. في هذه الحالة، تخطي هذه الخطوة والخطوة 6.16، الانتقال مباشرة إلى الخطوة 6.17. - نقل القطرات في لوحة 12-البئر الذي يحتوي على 2 مل من برنامج تلفزيوني/جيدا باستخدام ملعقة ذات الحواف المستديرة وشطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
- جبل قطرات على شريحة المجهر على النحو التالي:
- تطبيق طبقة ضيقة من تصلب سريعة التركيب المتوسطة على حواف كوفيرجلاس على شكل مربع 22 مم × 22 مم واسمحوا جافة ~ 1 دقيقة. تنفيذ هذه الخطوة لكل قطره على حدة، لتجنب تصلب المفرط في المتوسط المتصاعدة.
ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة في غطاء الدخان كما المتوسط التركيب السريع-تصلب خطرة على الصحة. - شطف الحبرية بالغمس في بئر صفيحة 12-جيدا يحتوي على 2 مل مياه ونقلها إلى شريحة مجهر، استخدام ملعقة ذات الحواف المستديرة. إزالة المياه الزائدة باستخدام قطعة صغيرة من ورقة ماصة.
- الاستغناء عن 15 ميكروليتر من تصاعد عدم تصلب أنتيفادي المتوسطة على الحبرية.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، إذا لم يتم استخدامه هويشت النووية وصمة عار، تصاعد المتوسطة التي تحتوي على 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) يمكن استخدامها. - بلطف ضع زجاج الغطاء، مع المتوسطة تصاعد تصلب السريعة التي تواجه شريحة مجهرية، عبر الحبرية والسماح لتسوية.
ملاحظة: وسيلة سريعة-تصلب ستلتزم الشرائح المجهرية وإبقاء الحبرية في المكان.
- تطبيق طبقة ضيقة من تصلب سريعة التركيب المتوسطة على حواف كوفيرجلاس على شكل مربع 22 مم × 22 مم واسمحوا جافة ~ 1 دقيقة. تنفيذ هذه الخطوة لكل قطره على حدة، لتجنب تصلب المفرط في المتوسط المتصاعدة.
- كرر الخطوة 6.17 قطرات كافة. جبل قطرات اثنين على كل شريحة المجهر.
- واسمحوا الشرائح أيردري على RT ح ~ 2 وتخزينها في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. تأكد من أن الشرائح يتم وضعه أفقياً ومحمية من الضوء.
- الصورة الأصلية الملون أو نقطة النهاية قدم السابقين فيفو الثقافات باستخدام مجهر [كنفوكل] أو مجهر ابيفلوريسسينسي تستقيم مزودة بوظيفة تقطيع ضوئية و 20 x أو 40 س الهدف. استخدم الدالة بلاط لالتقاط مساحة أكبر من الأنسجة في وقت واحد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
فهم أعمق لخصائص الأنسجة فيبروفاسكولار الديمقراطية الشعبية والتعبير البروتين تعتمد أساسا على عينات الزجاجي ورقيقة النسيجي قدم أقسام3،15،،من1617. بتطوير طريقة لإجراء تحقيق شامل في المنظمة أنسجة ثلاثية الأبعاد وعمليات متعددة الخلايا فيسيوباثولوجيكال الديمقراطية الشعبية، فإننا نحدد للاستفادة من قصت جراحيا، المريض المستمدة من FTs المرضية لتوصيف 3D والسابقين فيفو ثقافة. FTs جديدة نقلت إلى مختبر البحوث ومعالجتها كما هو موضح في سير العمل التخطيطي في الشكل 1.
يمكن تصويرها في FTs قبل تشريح للتقييم النوعي والوثائق (الشكل 2). كما هو مبين في الشكل 2، عرض FTs التباين الكبير بين المرضى في الحجم والكثافة ووفرة من هياكل الأوعية الدموية. في بعض الأنسجة، والخلايا فضفاضة، يفترض التحريضية/المناعي خلايا أو خلايا الدم الحمراء، فضلا عن هياكل الأوعية الدموية السابق من العيار مختلفة كما يمكن بسهولة تمييز (الشكل 2). بعد التشريح، يحتاج اتخاذ قرار فيما يتعلق باستخدام المتلقين للمعلومات لتحديد عدد اكسبلانتس التي تم الحصول عليها. جزء من explants مضمنة داخل مصفوفة فيبرينوجين وثابتة بعد تكوين هلام فيبرينوجين بينما explants المتبقية يمكن أن تخضع لحكم فيفو ثقافة على لوح منفصل (الشكل 1). FTs جديدة أيضا بنجاح استخدمت لوصف ultrastructural بالمجهر الإلكتروني. العينات التي يمكن أن تكون أما المعالجة التقليدية مجهر إلكتروني (TEM) من أقسام سامسونج أو كتلة المسلسل مسح الوجه الميكروسكوب الإلكتروني (SBF-وزارة شؤون المرأة)3،11.
يمكن تخزين لعدة أسابيع المواد الهلامية فيبرينوجين الثابتة والملون بالجامعة-جبل الفلورة18،19. عينات ملطخة بالمثل مستقرة عند تخزينها في 4 درجات مئوية في الظلام. يمكن تصويرها الجل FT/فيبرينوجين سميك الوقت كفاءة مع مجهر ابيفلوريسسينسي مزودة بوظيفة تقطيع ضوئية، مفيدة لإزالة متفرقة خارج نطاق التركيز الضوء. التصوير مع هذا الأسلوب يوفر التصور غرامة الهياكل. وبدلاً من ذلك، الفحص المجهري [كنفوكل]، على الرغم من أن أكثر تطلبا الوقت، يمكن السماح بالقبض على التفاصيل الدقيقة. التوصيف الطازجة جزءا لا يتجزأ من فيبرينوجين والثابتة، يسمح FTs الأصلية وجاهل بالجامعة-جبل الفلورة توصيف هياكل الأوعية الدموية والعديد من أنواع الخلايا وعلى ترتيب متبادل داخل الأنسجة الديمقراطية الشعبية 3D 11والمناظر الطبيعية. على سبيل المثال، يمكن استخدام الأجسام المضادة CD31 لعرض البطانة و NG2 عرض بيريسيتيس (الشكل 3)، بينما تصور الأجسام المضادة Lyve1 حديثا اكتشفت هياكل اللمفاوي تشبه غشائي (الشكل 4)11. يمكن استخدام مجموعات متعددة من الأجسام المضادة لتصور العديد من الهياكل وأنواع الخلايا (انظر الجدول للمواد)؛ على سبيل المثال، يمكن أيضا تصور أرج البطانة، الذي لديه نمط تعبير ديسكونتينوس في نيوفاسكولاتوري الديمقراطية الشعبية غير طبيعي. ويمكن تحليل هياكل الأوعية الدموية الملون مع علامة غشاء (مثلاً، CD31 و Lyve1) كمياً للحفاظ عليها والكثافة باستخدام أنجيوتول، برمجيات الحرة المصدر وضعته المعاهد معهد السرطان الوطني11، 20. كما يمكن أن تصبح أحجام ثلاثية الأبعاد من مجموعة البيانات التي تم الحصول عليها (انظر 1 فيديو). إذا كان جسم غير مناسبة للجامعة-جبل الفلورة، قطرات فيبرينوجين يمكن بدلاً من ذلك جزءا لا يتجزأ من البارافين، وقطع إلى أجزاء رقيقة وتحليلها من قبل إيمونوهيستوتشيميستري. وفي هذه الحالة تستفيد القطرات من التثبيت بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية بدلاً من ح 1 في الرايت
السابقين فيفو ثقافة تغذي نمو FTs جزءا لا يتجزأ من فيبرينوجين، تطوير أووتجرووثس الخلوية الفعل بعد يومين (الشكل 5). يتم استخدام هلام فيبرينوجين في المختبر المصفوفة للسابقين فيفو الثقافة، منذ ذلك الحين فإنه يجسد ECM المؤقت في المجراة، تشكلت بعد انشقاق ثرومبين لمصل الفيبرينوجين في مواقع التسرب والأوعية الدموية، وفي اتصال مباشر مع نيوفيسيلس الديمقراطية الشعبية راشح في التهاب الوسط تليفية15،،من2122.
الديمقراطية الشعبية مضاعفات microvascular تتميز بالأوعية واستجابة تليفية، و explants متر تحتفظ بهذا المرجع الخلوية في الثقافة، فضلا عن الاستجابة بفعالية للمنبهات الخارجية إضافة إلى وسائل الإعلام ثقافة11. وتوضح البيانات الممثل في الشكل 6 أن ثقافات السابقين فيفو الديمقراطية الشعبية التي يسببها تنتشر حفظ البطانة والمفرج CD31 إيجابية ردا على فيجفا، بينما TGFβ الناجمين عن استجابة تليفية تعكسه ثمرة بيريسيتيس/سمكس NG2-إيجابية. يمكن اختبار عدة مؤثرات خارجية، وعندما علم بقياسات لما وفرة المجراة في فيتريل، الديمقراطية المتقدمة هنا السابقين فيفو ثقافة نموذجية يمكن أن تكشف عن رواية المكروية والسياق تعتمد الديمقراطية الشعبية المرضية الآليات التي لا يمكن تصور في مواد الأنسجة الثابتة.
الشكل 1. السابقين فيفو نموذج زراعة الأنسجة فيبروفاسكولار الديمقراطية الشعبية- التمثيل التخطيطي لسير العمل من جراحة زجاجي شبكي (بارس بلانا الاستئصال الكلي الزجاجية) للختان قدم التشريح في اكسبلانتس وتضمينها في فيبرينوجين لثقافة توصيف و السابقين فيفو ثلاثي الأبعاد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. حديثا اقتطعت الأنسجة فيبروفاسكولار الديمقراطية الشعبية قبل التشريح. المرحلة كونتاست ميكروجرافس من FTs طازجة قصت اتخاذها قبل التشريح. FTs اختلافاً كبيرا في الحجم والكثافة ووفرة من هياكل الأوعية الدموية. تشير رؤوس الأسهم إلى هياكل الأوعية الدموية من العيار مختلفة. ويبرز خط أحمر شفاف جزئيا سفينتين الفردية من العيار مختلفة. وأخذت الصور اتباع مجهر مقلوب ابيفلوريسسينسي مع 5 س، 0.15 الفتحة العددية (نا)، والهدف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. الجامعة-جبل الفلورة أنسجة فيبروفاسكولار الديمقراطية الشعبية الأصلية- صورة مجهرية ابيفلوريسسينسي من مواطن "قدم الديمقراطية الشعبية" الملون بالجامعة-جبل الفلورة. CD31 (الأخضر) يتصور البطانة حين NG2 (ب، أحمر) يتصور بيريسيتيس داخل هياكل نيوفاسكولار غير النظامية. وتظهر الصور المدمجة في (ج). كونتيرستين DAPI (أزرق) يتصور الأنوية. الصورة اتخذت باستخدام مجهر ابيفلوريسسينسي تستقيم وظيفة تقطيع الضوئية وجنبا إلى جنب مع الكمبيوتر التي تسيطر 1.3 ميجا بكسل أحادية اللون CCD الكاميرا والصورة اقتناء برمجيات، استخدام علامة x 40، 1.4 نا، الهدف النفط. تم ضم تسعة أقسام الضوئية باستخدام برنامج معالجة الصور إيماجيج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. الجامعة-جبل الفلورة أنسجة فيبروفاسكولار الديمقراطية الشعبية الأصلية- صورة مجهرية ابيفلوريسسينسي من مواطن "قدم الديمقراطية الشعبية" الملون بالجامعة-جبل الفلورة. CD31 (الأخضر) يتصور البطانة حين Lyve1 (ب، أحمر) يتصور هياكل اللمفاوي مثل بطانية المكتشفة حديثا. وتظهر الصور المدمجة في (ج). كونتيرستين (أزرق) 33342 هويشت يتصور الأنوية. الصورة اتخذت باستخدام مجهر ابيفلوريسسينسي تستقيم وظيفة تقطيع الضوئية وجنبا إلى جنب مع الكمبيوتر التي تسيطر عليها 1.3 ميجا بكسل أحادية اللون CCD كاميرا وصورة اقتناء البرمجيات، استخدام 20 x، 0.8 غ، وهدف. تم ضم أربعة أقسام الضوئية باستخدام برنامج معالجة الصور إيماجيج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5. السابقين فيفو نمو الأنسجة فيبروفاسكولار الديمقراطية الشعبية- المرحلة ميكروجرافس تباين الثقافات x vivo هقدم اثنان في النقاط الزمنية المشار إليها (اليوم). تنمو FTs السابقين فيفو الثقافة، تطوير أووتجرووثس الخلوية الفعل بعد يومين. أخذت الصور باستخدام مجهر مقلوب ابيفلوريسسينسي ذات هدف 5 س، 0.15 غ،. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6. الجامعة-جبل الفلورة الأنسجة فيبروفاسكولار الديمقراطية الشعبية مثقف السابقين فيفو دون علاج (CTRL)، أو في وجود فيجفا أو TGFβ- صورة مجهرية ابيفلوريسسينسي متر مثقف السابقين فيفو دون علاج (CTRL) أو في وجود فيجفا أو TGFβ لمدة 9 أيام، وبعد ذلك الملون بالجامعة-جبل الفلورة. CD31 (الأخضر) يتصور البطانة حين يتصور (أحمر) في NG2 بيريسيتيس. كونتيرستين DAPI (أزرق) يتصور الأنوية. فيجفا استقرت المفرج بينما TGFβ الناجمين عن استجابة تليفية. الصور أخذت في استخدام مجهر ابيفلوريسسينسي تستقيم مع وظيفة تقطيع الضوئية وجنبا إلى جنب مع الكمبيوتر التي تسيطر عليها 1.3 ميجا بكسل أحادية اللون CCD كاميرا وصورة اقتناء البرمجيات، استخدام 20 x، 0.8 غ، وهدف. تم ضم تسعة أقسام الضوئية باستخدام برنامج معالجة الصور إيماجيج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الفيديو 1-التعمير حجم ثلاثي الأبعاد قدم الأصلي الملون بالجامعة-جبل الفلورة. Lyve1 CD31 (الأخضر)، (أحمر). 33342 هويشت كونتيرستين (الأزرق) يتصور الأنوية. الصورة اتخذت باستخدام مجهر ابيفلوريسسينسي تستقيم وظيفة تقطيع الضوئية وجنبا إلى جنب مع الكمبيوتر التي تسيطر عليها 1.3 ميجا بكسل أحادية اللون CCD كاميرا وصورة اقتناء البرمجيات، استخدام 20 x، 0.8 غ، وهدف. تم إجراء التعمير حجم ثلاثي الأبعاد وعرض الفيديو باستخدام برمجيات تجارية. جزء من شريط الفيديو هو طبع بإذن من جوكياردو et al. 11- من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وبالنظر إلى أهمية المكروية الأنسجة ذات الصلة للخلية الفنية موثوق بها والنتائج الميكانيكية الجزيئية، يتحتم إيجاد النماذج التجريبية المناسبة التي توفر هذه البيئة الأنسجة. هذه الوثيقة وصف السابقين فيفو الديمقراطية الشعبية ثقافة نموذج FTs جزءا لا يتجزأ من فيبرينوجين يسمح التحقيق في آليات الديمقراطية الشعبية الفيزيولوجيا المرضية في سياق الأصلي ومعقدة ومتعددة الخلايا من العينات السريرية الديمقراطية الشعبية.
الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول هي تشكيل جل فيبرينوجين السليم، موضع قدم والغسيل الكافي أثناء تلطيخ. منذ تشكيل جل فيبرينوجين يعتمد معظمها على النشاط ثرومبين، وتتأثر بالتركيز ودرجة الحرارة، مقدار ثرومبين يحتاج إلى تعديل لكل دفعة من فيبرينوجين جل إعداد. ينبغي أن يكون تكوين هلام فيبرينوجين سريعة بما يكفي منع نمو 2D explants متر ولكن أيضا بطء ما يكفي للسماح بتحديد المواقع قدم إلى مركز القطرات عمودياً وأفقيا. بيبيتينج إضافية يمكن أن تساعد في القضية قدم يحدث لتحديد موقع على حافة الحبرية، موضع قدم إلى المركز. FTs التي لا تزال على حافة القطرات أو التي تنمو في 2D ستحتاج إلى استبعادها. تجفيف القطرات كافية الغسيل خلال تلطيخ وتجنب بدورها الحاسم بغية تحسين تلطيخ وتقليل الإشارات الخلفية. كما يمكن نقل مرات الحرجة. نحن المضمنة في FTs يصل إلى ساعتين بعد الاستئصال الكلي الزجاجية، وهذا لا يؤثر على السابقين فيفو النمو. أثر أطول أوقات النقل بنجاح الثقافة سوف تحتاج إلى اختبار.
ويمكن تعديل هذا البروتوكول باستخدام مصفوفات بديلة لتضمين متر. الحية، نيوفيسيلس الديمقراطية الشعبية تنمو نحو القشرة الزجاجي غنية بالكولاجين23. ومع ذلك، عند مكونات المصل تسرب الأوعية الدموية، بما في ذلك الفيبرينوجين، يذوب في زجاجي بالقرب من السفن حيث يتم البدء استجابة تليفية. ولذلك، استخدم تجلط فيبرينوجين في المختبر هنا شكلت ثقافة فيفو بغية تحبيذ ECM المؤقت للسابقين في الوسط تليفية ملتهبة الديمقراطية الشعبية15،،من21إلى22. وبدلاً من ذلك، يمكن استكمال جلطات فيبرينوجين مع laminin وفيبرونيكتين لتغيير استقرار تنتشر الشعيرات الدموية، أو يمكن ترسيخها في explants داخل النوع الأول من الكولاجين والمصفوفات الأخرى المختلطة تحبيذ ميكرونفيرونمينتس تليفية آخر في نيوفاسكولار الأنسجة. هذه المصفوفات عموما مناسبة للثقافة 3D والجامع-جبل الفلورة ولكن آثارها على FTs الديمقراطية الشعبية تظل تختبر واعتبارات بشأن التوقيت تكوين مصفوفة ثلاثية الأبعاد سوف تحتاج إلى بذل من أجل البقاء في الحدود لمنع 2D النمو18،19. عند القرب المادي وحدة البحوث إلى المستشفى يمثل قيداً، يمكن تعويضه بوقت أطول لنقل مع فريق العمل؛ يمكن إجراء إعداد الحل تا والعقيمة الفيبرينوجين-الترشيح واختبار تكوين هلام فيبرينوجين أثناء نقل متر. إذا كانت لا تشكل المواد الهلامية فيبرينوجين حتى بعد ساعة واحدة، قد حدثت مشكلة مع الفيبرينوجين أو إعداد الحل تا. وفي هذه الحالة، لا يمكن استخدام المواد الهلامية FT/فيبرينوجين.
القيود المفروضة على هذا النهج، كما هو الحال مع كل السابقين فيفو نهج، وهي نوعية متغيرة من عينات الأنسجة الأولية عبر الأفراد، فضلا عن عدم التجانس بين المريض والمريض داخل الأنسجة. ويشمل جزء من هذا التغير في حالة مرضى السكري، مدى الأوعية الدموية والتليف الذي يعتمد على العديد من العوامل مثل مدة المرض، شرط التمثيل الغذائي، والعوامل الوراثية/جينية، ونوع من مرض السكري والعلاج المنهجي. حجم "قدم الديمقراطية الشعبية" الجراحية استردادها هو أيضا عاملاً مقيداً في تحديد عدد الشروط التي يمكن أن تحقق لكل عينة. مع توفير المعلومات المكانية المتبادلة، يسمح الفلورة الجامع-جبل التحقيق سوى كمية محدودة من ميزات/علامات كل قطره. كحل وسط، قطرات فيبرينوجين يمكن بدلاً من ذلك جزءا لا يتجزأ من البارافين، وقطع إلى أجزاء رقيقة وتحليلها قبل إيمونوهيستوتشيميستري.
القائمة الماوس السكري نماذج تطوير العديد من الميزات من مرحلة مبكرة الدكتور لكنها تفشل في صورة شاملة الخص التدريجي التغيرات الحاصلة في الديمقراطية الشعبية البشرية، مما أعاق الدراسات الديمقراطية الشعبية المرض آليات7،8. وعلاوة على ذلك، العين مورين يختلف اختلافاً جوهريا عن العين البشرية، حيث أنها تفتقر إلى البقعة، إذ يشدد كذلك على أهمية دراسة الأمراض البشرية24. FTs الديمقراطية الشعبية الجراحية سابقا أما تجاهل، أو تستخدم لمقاطع البارافين، ومجهر إلكتروني، وكتلة المسلسل مسح الوجه الميكروسكوب الإلكتروني، الجزء الأكبر من تسلسل الحمض النووي الريبي أو الثقافة 2D من الخلايا ينتابها3،25 . يسمح النموذج هنا وصف 3D توصيف هذه المواد الجراحية الثمينة، وكذلك التحقيق في الديمقراطية الشعبية الفيزيولوجيا المرضية في المكروية الأصلية الأنسجة المريضة. عندما يتم دمجها مع استخدام السائل الزجاجي، يسمح هذا الطراز أيضا التحقيق في مساهمة المكروية الديمقراطية الشعبية الخلوية واللاخلوي. منذ الثقافات التصدي بكفاءة للكشف عن عوامل النمو في الجسم الزجاجي، مثل فيجفا، بفجف، فيجفك و TGFβ، هكذا لخص ملامح الديمقراطية الشعبية الفيزيولوجيا المرضية، هذه الديمقراطية الشعبية السابقين فيفو ثقافة النموذجي قابلة للاختبار أو تطوير علاجات جديدة من الديمقراطية الشعبية 11. في هذا النموذج، مكافحة فيجفا منعت تنتشر الشعرية والناجم عن علامات الانحدار الشعرية، الاستجابات التي تتفق مع النتائج السريرية المتوقعة لمكافحة فيجفا العلاج26،27. ولذلك، يمكن أيضا استخدام هذا النموذج لتحسين فهم الآثار للعلاجات الحالية، بما في ذلك العلاجات المضادة فيجفا والقشرية.
مع أجهزة التصوير خلية يعيش هنا وصف السابقين فيفو نموذج الثقافة يمكن أن تخضع للفحص المجهري الوقت الفاصل بين السماح بتحقيق في الوقت الحقيقي لعمليات مثل الأوعية الدموية الانحدار، اللدونة تبرعم والهاتف الخلوي. عندما يتم دمجها مع نماذج في المختبر وفي الحية، فضلا عن البيانات السريرية، هذا السابقين فيفو نموذج الديمقراطية الشعبية سوف يساعد في التحقيق في استجابات المريض استناداً إلى مجموعات خاصة لتحديد علامات، خطوة أقرب إلى الجادة لشخصية الطب. تحديد الاستجابات الخاصة بالمريض و/أو علامات استجابة محددة ذات أهمية خاصة في حالة الديمقراطية الشعبية، وأمراض المتعددة العوامل مع تفاعلات معقدة من microvascular، الأعصاب، الأيض، الوراثية/جينية، العوامل المناعية، والمتصلة بالتهاب، مما يتطلب بذل جهود متزايدة متعددة التخصصات للتنمية لتحسين إدارة استهداف والمرض العلاجية. وإلى جانب الجامع-جبل الفلورة، يحلل السابقين يمكن أيضا استرداد من فيبرينوجين بواسطة العلاج لازمين/ناتوكيناسي FTs فيفو مثقف وتعرض ترانسكريبتوميك والبروتين28. ويمكن أيضا استكشاف مدى ملاءمة النموذج هنا وصف للسابقين فيفو دراسات الأنسجة فيبروفاسكولار وضعت في شروط العين الأخرى، كما هو الحال في الحالات الشديدة من فقر الدم المنجلي اعتلال الشبكية، في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب نشعر بامتنان بالغ للزملاء الشبكية الطبية والجراحية والممرضات والموظفين كله "وحدة السكري" و "وحدة جراحة زجاجي شبكي" في قسم لطب العيون، مستشفى جامعة هلسنكي للمشاركة بنشاط في تجنيد من المرضى. ونشكر "بيوميديكوم وحدة التصوير الجزيئي" لمرافق التصوير. ونحن نشكر تشيرنينكو أناستاسيا للمساعدة التقنية الممتازة. كان يؤيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من أكاديمية فنلندا (كوالا لمبور)، جامعة هلسنكي (كوالا لمبور)، سيغريد جوسيليوس مؤسسة (كوالا لمبور)، ك ألبين يوهانسون مؤسسة (كوالا لمبور)، ومعهد السرطان الفنلندية (كوالا لمبور)، ومعهد كارولينسكا (كوالا لمبور)، الفنلندية العين مؤسسة (SL)، العين و مؤسسة مصرف الأنسجة (SL)، وماري وجورج جيم اهرنروت مؤسسة (SL)، ومنح البحوث السريرية هوك (TYH2018127 بعد TYH2016230، م)، مؤسسة أبحاث مرض السكري (SL، كوالا لمبور، حزب العدالة والتنمية، مثلاً)، فضلا عن برنامج الدكتوراه في "الطب الحيوي" (مثلاً).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Microforceps | Medicon | 07.60.03 | Used for handling the FTs |
| Disposable Scalpels - Sterile | Swann-Morton | 0513 | Used for FT dissection |
| Culture dish, vented, 28 ml (60mm) | Greiner Bio-One | 391-3210 | Used for dissection and for testing fibrin gel formation |
| Cell culture plates, 12-well | Greiner Bio-One | 392-0049 | Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL | Greiner Bio-One | 391-3477 | |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL | Greiner Bio-One | 525-0384 | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF | Millipore | SLGV033RS | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Syringe, 10 mL | Braun | 4606108V | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Fisher | FB74031 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well | Nunc | 142475 | Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture |
| Cell culture plates, 96-well, U-bottom | Greiner Bio-One | 392-0019 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Coverslips 22x22mm #1 | Menzel/Fisher | 15727582 | Used for mounting |
| Microscope slides | Fisher | Kindler K102 | Used for mounting |
| Absorbent paper | VWR | 115-0202 | Used for mounting |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | Used for preparing 1x PBS |
| Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Calbiochem | 341578 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H9394-500ML | Used for preparing the fibrinogen and TA solution |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | Used for preparing the blocking solution |
| Human Serum | Sigma-Aldrich | H4522 | Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media |
| Gentamicin Sulfate 10mg/ml | Biowest | L0011-100 | |
| Endothelial cell media MV Kit | Promocell | C-22120 | Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement, 500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-2.5L-M | Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | T9284 | Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. |
| Hoechst 33342, 20mM | Life Technologies | 62249 | For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Eukitt Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 03989-100ml | TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | T9549-500UN | Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder | Sigma | A3428 | Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth factors | |||
| Recombinant human VEGFA | R&D Systems | 293-VE-010 | 50 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human VEGFC | R&D Systems | 752-VC-025 | 200 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human TGFβ | Millipore | GF346 | 1 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human bFGF | Millipore | 01-106 | 50 ng/ mL final concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary antibodies | |||
| CD31 (JC70A) | Dako | M0823 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD34 (QBEND10) | Dako | M716501-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD45 (2B11+PD7/26) | Dako | M070129-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD68 | ImmunoWay | RLM3161 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| Cleaved caspase-3 (5A1E) | Cell Signalling | 9664 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| ERG (EP111) | Dako | M731429-2 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| GFAP | Dako | Z0334 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Ki67 | Leica Microsystems | NCL-Ki67p | Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Lyve1 | R&D Systems | AF2089 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab |
| NG2 | Millipore | AB5320 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Prox1 | ReliaTech | 102-PA32 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab |
| Prox1 | R&D Systems | AF2727 | Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab |
| VEGFR3 (9D9F9) | Millipore | MAB3757 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| α-SMA (1A4) | Sigma | C6198 | Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG | Life Technologies | A-21202 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-11012 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG | Thermo Scientific | A-11057 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG | Thermo Scientific | A-11036 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG | Molecular Probes | A-21468 | Used at 1:500 dilution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope | Zeiss | For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT | |
| SZX9 upright dissection stereomicroscope | Olympus | For FT dissection | |
| LSM 780 confocal microscope | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT | |
| AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT |
References
- Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Liew, G., Wong, V. W., Ho, I. V. Mini Review: Changes in the Incidence of and Progression to Proliferative and Sight-Threatening Diabetic Retinopathy Over the Last 30 Years. Ophthalmic Epidemiology. 24 (2), 73-80 (2017).
- Loukovaara, S., et al. Indications of lymphatic endothelial differentiation and endothelial progenitor cell activation in the pathology of proliferative diabetic retinopathy. Acta Ophthalmologica. 93 (6), 512-523 (2015).
- Stitt, A. W., et al. The progress in understanding and treatment of diabetic retinopathy. Progress in Retinal and Eye Research. 51, 156-186 (2016).
- Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies. JCI Insight. 2 (14), (2017).
- Gross, J. G., et al. Five-Year Outcomes of Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial. JAMA Ophthalmology. 136 (10), 1138-1148 (2018).
- Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Disease Models, Mechanisms. 5 (4), 444-456 (2012).
- Villacampa, P., Haurigot, V., Bosch, F. Proliferative retinopathies: animal models and therapeutic opportunities. Current Neurovascular Research. 12 (2), 189-198 (2015).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models, Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
- Sharma, T., et al. Surgical treatment for diabetic vitreoretinal diseases: a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 44 (4), 340-354 (2016).
- Gucciardo, E., et al. The microenvironment of proliferative diabetic retinopathy supports lymphatic neovascularization. The Journal of Pathology. 245 (2), 172-185 (2018).
- Rezzola, S., et al. 3D endothelial cell spheroid/human vitreous humor assay for the characterization of anti-angiogenic inhibitors for the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Angiogenesis. 20 (4), 629-640 (2017).
- Pepper, M. S., Montesano, R., Mandriota, S. J., Orci, L., Vassalli, J. D. Angiogenesis: a paradigm for balanced extracellular proteolysis during cell migration and morphogenesis. Enzyme, Protein. 49 (1-3), 138-162 (1996).
- Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs). Journal of Cell Science. 115 (Pt 17), 3427-3438 (2002).
- Loukovaara, S., et al. Quantitative Proteomics Analysis of Vitreous Humor from Diabetic Retinopathy Patients. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5131-5143 (2015).
- Abu El-Asrar, A. M., Struyf, S., Opdenakker, G., Van Damme, J., Geboes, K. Expression of stem cell factor/c-kit signaling pathway components in diabetic fibrovascular epiretinal membranes. Molecular Vision. 16, 1098-1107 (2010).
- Loukovaara, S., et al. Ang-2 upregulation correlates with increased levels of MMP-9, VEGF, EPO and TGFbeta1 in diabetic eyes undergoing vitrectomy. Acta Ophthalmologica. 91 (6), 531-539 (2013).
- Sugiyama, N., et al. EphA2 cleavage by MT1-MMP triggers single cancer cell invasion via homotypic cell repulsion. Journal of Cell Biology. 201 (3), 467-484 (2013).
- Tatti, O., et al. MMP16 Mediates a Proteolytic Switch to Promote Cell-Cell Adhesion, Collagen Alignment, and Lymphatic Invasion in Melanoma. Cancer Research. 75 (10), 2083-2094 (2015).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
- Senger, D. R. Molecular framework for angiogenesis: a complex web of interactions between extravasated plasma proteins and endothelial cell proteins induced by angiogenic cytokines. American Journal of Pathology. 149 (1), 1-7 (1996).
- Senger, D. R., Davis, G. E. Angiogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (8), a005090 (2011).
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
- Marmorstein, A. D., Marmorstein, L. Y. The challenge of modeling macular degeneration in mice. Trends in Genetics. 23 (5), 225-231 (2007).
- Kim, L. A., et al. Characterization of cells from patient-derived fibrovascular membranes in proliferative diabetic retinopathy. Molecular Vision. 21, 673-687 (2015).
- Avery, R. L., et al. Intravitreal bevacizumab (Avastin) in the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Ophthalmology. 113 (10), e1691-e1615 (2006).
- Zhao, L. Q., Zhu, H., Zhao, P. Q., Hu, Y. Q. A systematic review and meta-analysis of clinical outcomes of vitrectomy with or without intravitreal bevacizumab pretreatment for severe diabetic retinopathy. The British Journal of Ophthalmology. 95 (9), 1216-1222 (2011).
- Carrion, B., Janson, I. A., Kong, Y. P., Putnam, A. J. A safe and efficient method to retrieve mesenchymal stem cells from three-dimensional fibrin gels. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (3), 252-263 (2014).
