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Medicine

增殖性糖尿病视网膜病变纤维血管并发症的体外组织培养模型

Published: January 25, 2019 doi: 10.3791/59090

Summary

在这里, 我们提出了一个方案, 研究增殖性糖尿病视网膜病变的病理生理学使用患者衍生的, 手术切除, 纤维血管组织的三维本地组织表征和体外培养。这种体外培养模型也适合测试或开发新的治疗方法。

Abstract

糖尿病视网膜病变 (dr) 是糖尿病最常见的微血管并发症, 也是工作年龄成年人失明的主要原因之一。目前没有糖尿病和氧引起的视网膜病变的动物模型会出现人类增殖性糖尿病视网膜病变 (pdr) 所表现出的全系列渐进性变化。因此, 对疾病发病机制和病理生理学的了解在很大程度上依赖于使用组织学切片和玻璃体样本的方法, 这些方法只能提供有关致病因素的稳态信息。越来越多的证据表明, 在三维 (3d) 微环境中的动态细胞和细胞外基质 (ecm) 相互作用对于新的治疗策略。因此, 我们假设用 pdr 手术切除眼睛的病理性纤维血管组织可以可靠地揭示这种毁灭性疾病的细胞和分子机制, 并测试新的临床潜力干预。为此, 我们开发了一种新的方法, 用于手术切除患者衍生的纤维血管组织 (ft) 的三维体外培养, 该方法将作为人类 pdr 病理生理学的相关模型。将 ft 分解成外植体, 并嵌入纤维蛋白基质中, 用于体外培养和三维表征。通过对原生 fts 和终点培养物的全安装免疫荧光进行彻底的研究, 从而可以对组织组成和多细胞过程进行彻底的研究, 突出了3d 组织级表征对发现相关特征的重要性。pdr 病理生理学。该模型将允许在 pdr 组织结构和微环境中动态生化和物理相互作用的复杂背景下同时评估分子机制、纤维素组织过程和治疗反应。由于该模型重述了 pdr 病理生理学, 因此也可进行测试或开发新的治疗方法。

Introduction

dr 是糖尿病的一种严重的眼部并发症, 在过去30年中, 这种疾病已达到巨大的比例1。诊断20年后, 几乎每个1型糖尿病患者和60% 的2型糖尿病患者都有视网膜病变的迹象, 使糖尿病本身成为正常工作年龄失明的主要原因之一.根据微血管变性和缺血损伤的程度, dr 分为非增殖 dr (非 pdr) 和增殖 dr (pdr)。终末期疾病 pdr 的特点是缺血和炎症引起的新生血管和纤维化反应在玻璃体视网膜界面。在未经治疗的情况下, 这些过程将导致失明, 由于玻璃体出血, 视网膜纤维化, 视网膜三度脱离, 和新生血管性青光眼3,4。尽管最近的进展, 目前的治疗方案只针对 dr 阶段, 包括糖尿病黄斑水肿和 pdr, 当视网膜损伤已经接踵而至。此外, 很大一部分 dr 患者没有从目前的治疗水族馆中受益, 这表明迫切需要改进治疗 456.

到目前为止, 已经开发出多个其他体内疾病发展模型和糖尿病动物模型, 但没有一个模型可以概括人类 pdr7,8中观察到的全部病理特征。此外, 越来越多的证据表明, 治疗反应与 ecm 组合以及细胞和无细胞微环境之间的空间排列和相互作用密切相关。因此, 我们开始开发一个临床相关的模型的人 pdr 利用 ft 病理材料, 通常是从眼睛接受玻璃体切除术作为 pdr10的手术管理的一部分。

这份手稿描述了3d 体外培养和定性的手术切除, pdr 患者衍生病理 ft 的协议。这里描述的方法已被用于最近的一份出版物, 证明了成功解构本地 3d pdr 组织景观, 并重述了 pdr 病理生理学的特征, 包括血管生成和纤维化反应的异常血管结构11。该模型还揭示了从薄薄的组织学切片中不易被欣赏的新特征, 如空间限制的凋亡和增殖以及血管胰岛形成11。玻璃体液已被其他人成功地应用于三维内皮球体培养物, 以评估其血管生成潜力和血管静止分子12的有效性。当与体外三维淋巴细胞内皮细胞 (lec) 球体萌发试验结合使用 pdr 玻璃体作为刺激物时, 我们的模型揭示了可溶性玻璃体因子以及新生血管组织中的局部线索对作为刺激物的贡献。但对 lec 参与 pdr 病理生理学的情况了解甚少,3, 11。在 pdr 的管理中, 玻璃体视网膜手术是一个例行执行但具有挑战性的程序。由于外科器械和技术正在看到不断的进步和成熟, 及时和保守地去除纤维血管增生标本不仅提高视力, 而且还提供了宝贵的组织材料研究人类组织微环境复杂翻译方面的 pdr 病理生理学和治疗反应。

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Protocol

这项研究得到了赫尔辛基大学医院机构审查委员会和伦理委员会的批准。每个病人都得到了签字的知情同意。

1. 解决方案、介质和设备的准备

  1. 在收集纤维血管组织 (ft) 之前准备以下设备, 以确保快速处理。
    1. 灭菌高压灭菌器两个微解剖推子。
    2. 在900毫升去离子水中溶解1个预称的 pbs 片 (0.14 m ncl, 0.0027 m kcl, 0.010 m po 4-3), 制备 1x磷酸盐缓冲盐水 (pbs), 搅拌溶解。将水量调整到1升, 并对现成的溶液进行灭菌高压灭菌。存放在 rt。
    3. 将上述溶液和设备收集在一个篮子里, 再加上一次性无菌手术刀、6厘米的无菌细胞培养皿和五个无菌的12井细胞培养板。
  2. 在 hanks 平衡盐溶液 (hbss) 中制备 6 mgml 纤维蛋白原溶液, 将30毫克的血浆-贫化人类纤维蛋白原溶解成5ml 的 hbss, 使用 50 ml 管浸入37°c 的水浴中, 至少1小时。
    注: 使用前可将该溶液保存在水浴 (37°c) 中 7小时 (最长为 10小时)。
  3. 加入5% 的胎儿小牛血清 (fcs) 或5% 的人血清、0.4% 的内皮细胞生长补充剂、10 ngml 重组人表皮生长因子、1μgml 氢化可的松和50μgml 庆大霉素制备前活性内皮细胞生长介质, 并保持在37°c 的水浴中, 直到使用。在4°c 下存放长达一个月。

2. 纤维血管组织解剖

  1. 收集已从接受跨结膜微切口玻璃体视网膜手术的人的纤维血管组织 (ft), 由23或20规格的三端口骨平面玻璃体切除术作为 pdr 玻璃体视网膜手术治疗的一部分。
    注: ft 使用分割和分层切除, 必要时使用微剪刀切割, 并由经验丰富的玻璃体视网膜外科医生用眼内夹紧微钳从玻璃体腔中取出。需要采取极端的护理, 以消除完整的, 未损坏的 ft, 而不会造成损害的眼睛结构, 包括视神经或颞血管拱廊, 病理性血管组织最常见的位置。切除组织的大小是可变的, 通常在3到50毫米2之间.
  2. 将 ft 放在6厘米的细胞培养皿中, 或将含有1毫升无菌 pbs 的 1.5 ml 管放在湿冰上, 并立即将其转移到研究实验室进行处理。
    注: 研究单元 (实验室设施) 必须在物理上靠近医院手术室 (or), 以最大限度地减少小的切除 ft 的转移时间。在这种情况下, 转移需要不到 5分钟, 外植体被嵌入纤维蛋白通常在 1-1. 5小时 (最多 2小时) 手术切除后。需要测试较长的传输时间对3d 文化的影响。
  3. 将 ft 放置在一个6厘米的细胞培养盘中, 在室温 (rt, 25°c) 下含有1毫升的 pbs, 并使用具有5倍目标的倒置荧光显微镜获取组织图像。
    注: 图像是为定性评估和文档获取的。可以观察组织的大小、密度和一般成分 (例如,血管结构)。
  4. 使用无菌手术刀和微解剖推子, 在直立不连续的立体显微镜下将 ft 切割成 ~ 1 毫米2片。将组织, 很好地淹没在 pbs 中, 使用微解剖推拿器就位, 并使用无菌手术刀进行清晰的切割。避免撕裂 ft, 因为这会改变本地纤维血管结构。
  5. 将每个单独的一块放入一个12井细胞培养板的井, 其中含有1毫升无菌 pbs。
    注: 如有必要, 在进行切割之前, 使用微解剖推子将 ft 轻轻地铺到盘子上。

3. 铸造直立纤维蛋白凝胶液滴, 用于本土 ft 和 ex 活体培养的表征

  1. 消毒过滤在步骤1.2 中制备的现成纤维蛋白原溶液, 并将0.22μm 过滤器安装在10毫升注射器中。
  2. 制备纤维蛋白原溶液 (每 1.5 ml 管 25μl) 并保持在 rt 中. 为解剖后获得的纤维蛋白凝胶/每块 ft 制备一个等价物, 并制备一对额外的阿立剂, 用于测试纤维蛋白凝胶的形成。
  3. 准备 hbss 溶液, 其中含有 4 unitsml 和400μgl 的阿普利宁, 称为以下 ta 溶液, 并保持在 rt. 根据需要准备尽可能多的 ta 溶液, 根据解剖后获得的块的数量 (每一个使用25μl 的 ta 溶液ft/f蛋白凝胶), 以及额外的量 (例如, 250μl), 用于检测纤维蛋白凝胶的形成, 并确保在纤维蛋白凝滴的整个铸造过程中提供足够的溶液。
    注: 纤维蛋白聚合需要使用凝血酶, 同时添加前列腺素, 以防止 fts13, 14 所表达的细胞蛋白酶降解纤维蛋白凝胶。
  4. 测试纤维蛋白凝胶形成的时间: 在步骤3.2 中制备的脂肪含量的25μl 纤维蛋白原溶液中加入 25μl ta 溶液, 并使用另一台设置为50μl 的移液器, 通过移液在试管中混合, 并将其放入6厘米的细胞培养盘中, 形成一个直立的液滴。
    注: 纤维蛋白凝胶的形成应在 ~ 1分钟内发生。如果这需要超过 1.5分钟, 则通过添加更多凝血酶, 可以提高步骤3.3 中制备的 ta 溶液中凝血酶的浓度。最初使用的凝血酶的十分之一可以反复添加, 直到纤维蛋白凝胶形成在1.5 分钟内。纤维蛋白凝胶形成的时间对于培养的三维是至关重要的, 因为快速凝胶形成 (1.5 分钟内) 可以防止 ft 片沉入纤维蛋白凝胶底部, 从而与细胞的2d 塑料表面接触培养板, 可导致二维细胞粘附和生长。
  5. 使用无菌推拿器将一块 ft 片放置在24孔板的一个井的中心, 并使用 0.5-10l 移液器移液来去除任何多余的 pbs, 以避免在 ft 上产生吸力。在纸巾粘在推特上的情况下, 使用额外的推特, 以帮助将纸巾放在盘子上。
    注: ffin 凝胶也可以在48孔板上铸造, 以减少试剂的使用。然而, 这更具挑战性, 因为空间比较有限, 如果与井壁接触, 纤维蛋白就会扩散。
  6. 在步骤3.2 中所列的25μl 纤维蛋白原溶液中加入25μl 的 ta 溶液, 并通过移液在试管中使用另一台设定为50μl 的移液器。分配到 ft 件放置在板井, 移液器向上和向下2-3 倍, 以便包括 ft 件在直立的液滴内, 提供一个三维周围矩阵的 ft。
    注: 确保在移液过程中没有吸气 ft, 并且不会形成气泡。还确保混合、分配和移液快速进行, 因为纤维蛋白凝胶将在1.5 分钟内形成, 如步骤3.4 中测试的那样。如果将纤维蛋白凝胶浇注在48孔板上, 请改用20μl 的纤维蛋白原溶液和20μl 的 ta 溶液。
  7. 对所有 ft 件重复步骤3.5 和3.6。
  8. 允许纤维蛋白凝胶在加湿气氛中, 在37°c 的细胞培养孵化器中孵育板, 使其凝固.
  9. 0.5-1 h 后, 检查纤维蛋白凝胶是通过小心倾斜板完全形成的。当凝胶在板倾斜时不移动时, 继续走第3.10 步, 表明纤维蛋白凝胶的形成是完整的。
  10. 用体外培养基 (24μl·well) 或48米井板中 300μlwell) 覆盖 ft/f福林凝胶, 辅以100μgml 的阿普菌素。通过滴式分配轻轻将介质移注。
    注: 在这里, 前列腺素用于防止 f蛋白凝胶降解的细胞蛋白酶表达的 fts 13,14。体外培养基还可补充重组生长因子, 如 vegfa、vegfc、bfgf、tgfβ (见材料表)11
  11. 将 ft 体外培养板放回37°c、5% co2 细胞培养孵化器 , 并在所需时间段内进行培养 (例如, 2-18天, 需要测试更长的培养周期)。每三天用新鲜的体外培养基取代50% 的培养基。

4. "在矩阵中" 成像

  1. 使用倒置的荧光显微镜, 在同一天 (第0天) 和设定的时间间隔 (例如,每隔一天) 获取 ft 外培养物的图像, 以跟踪3d 生长。
    注: 所获得的图像可用于对 ft 的外露量进行量化, 使其在外植体11上的两个垂直直径的总长度。

5. 本土 ft 和 ex vivo 文化的终点

注: ft/f蛋白凝胶可以在所需的时间段内进行体内培养 (ft 前体内培养物), 也可以固定在同一天 (原生 ft),用于原生 ft 表征11。

  1. 用 pbs 溶液中4% 的甲醛培养基取代培养基, 在 rt 中选择1% 的甲醛, 修复原生 ft 或 ft 的体外培养物。对于原生 ft/fbin 凝胶, 在添加体外培养基后固定 0.5-1 h (如果纤维蛋白凝胶未被浸泡在培养基中, 固定会对其造成伤害)。
    注: 在烟罩中执行此步骤, 因为多聚甲醛具有腐蚀性、毒性和致癌性。
  2. 在 pbs (2mlwell) 中三次5分钟清洗 ffin 凝胶。
  3. 将 pbs 替换为含有0.02% 氮化钠的 2 mll 井, 并将固定纤维蛋白凝胶存放在 4°c, 直至进一步加工。用石蜡膜密封板, 确保 ft/f福林凝胶在储存中不干燥。
    注: 在烟罩中执行此步骤, 因为氮化钠有毒。

6. 全山免疫荧光染色

注: 此协议持续 5天, 可以中断与夜间孵育, 在指定的地方。不要让纤维蛋白凝胶在任何时候干燥。除非另有说明, 所有步骤均在 rt 执行。

  1. 在启动染色协议之前, 请准备以下解决方案。
    1. 固定后溶液: 准备50:50 丙酮: 甲醇溶液, 混合等量丙酮和甲醇 (例如, 50 毫升)。储存在-20°c。请在染色前一天准备此解决方案。此解决方案可存储在-20°c, 并可用于后续的污渍。
      注: 在烟罩中准备此溶液, 因为丙酮和甲醇是易燃且对健康有害的。
    2. 阻止溶液: 在 pbs 中制备15% 的胎儿牛血清 (fbs), 0.3% 的辛醇聚氧乙烯醚溶液, 首先在 pbs 中加入15% 的 fbs。加入辛酚聚氧乙烯醚, 搅拌溶解。存放在4°c。
      注: 此解决方案可以提前大量准备, 在-20°c 时存储在15毫升的报价中, 并在使用前在染色协议启动当天解冻。对于每个染色协议, 请使用新准备的或新解冻的算法。
    3. 洗涤溶液: 加入 4.5 ml 的辛醇聚氧乙烯醚至 995.5 ml 的 pbs, 辅以0.45 的辛酚聚氧乙烯基。搅拌溶解。存放在 rt。
  2. 使用不锈钢方形边缘铲子小心地从盘子里提起液滴。先将液滴从边缘分离, 然后抬起中心, 转移到含有1毫升 pbs 的12孔板井。
    注: 在此钢板格式下执行固定后、清洗和阻塞步骤。
  3. 用1毫升冰凉50丙酮固定液滴: 甲醇溶液约 1分钟 (液滴的边界会变白)。
    注: 在烟罩中执行此步骤, 因为丙酮和甲醇对健康有害。
  4. 用3-5 洗的 pbs 冲洗 (补液完成后, 液滴将沉入 pbs 溶液中)。
    注: 避免接触液滴与移液器尖端, 因为, 固定后, 他们是粘的塑料。在整个协议过程中, 避免通过吸气来吸气后修复、抗体、堵塞和清洗溶液, 因为这可能会损坏或完全摧毁液滴。相反, 倾斜板, 并使用500-5000μl 移液器小心去除溶液。
  5. 在 21, 000 x g 和4°c 下离心堵塞溶液 15分钟, 以去除碎屑。
    注: 该溶液可在 1.5 ml 管中进行离心。未使用的解决方案可存储在 4°c, 并用于所有相关的后续步骤。
  6. 在 rt 将液滴在500μl 阻滞溶液中培养2小时。
    注: 为了减少所使用的封堵液的体积, 板材可以在支架上倾斜, 只需使用300μl 的溶液液滴。
  7. 在适当稀释的阻断溶液中制备原生抗体混合物 (至少 30μl/droplet), 离心剂在 21, 000 x g 和4°c 时进行15分钟。
  8. 使用圆刃铲子将液滴转移到圆形 (u) 底部96井板中, 并在4°c 下与原发抗体混合物的至少30μl/液滴孵育。
  9. 第二天, 将液滴转移到含有2毫升洗涤液的12孔板中, 先用 3次5分钟的洗涤, 然后用9分钟的洗涤。在4°c 下留下最后一次清洗 (2 毫升) 过夜。
  10. 第二天, 用 pbs 冲洗三次, 并将液滴转移到圆形 (u) 底部96孔板中。
  11. 在清洗过程中, 在堵塞溶液中制备适当的氟结合二级抗体混合物 (稀释 1:500, 至少30μl/液滴), 离心剂在 21, 000 x g 和4°c 下进行15分钟。
  12. 通过使用圆刃铲子将液滴转移到一个圆形 (u) 底部96井板, 并以至少30μl 的二级抗体混合物孵育, 在 rt 中保持4小时的光保护。
    注: 执行所有后续的孵育和防光清洗步骤。
  13. 将液滴转移到12井板中, 其中含有2毫升的洗涤液, 用圆刃铲子冲洗, 先用3分钟的洗净, 然后用四次30分钟的洗涤。在4°c 下留下最后一次清洗 (2 毫升) 过夜。
  14. 第二天, 用 5 0分钟的清洗, 然后用 p b s 冲洗凝胶3次。在4°c 下留下最后一次清洗 (2 毫升) 过夜。
  15. 第二天, 用圆刃铲子和反污渍核, 在 rt 孵育 10μgl hoechst 核染色 (至少30μl/液滴) 30分钟, 将液滴转移到圆形 (u) 底部96孔板中。
    注: 可使用 4 ', 6-二胺-2-苯二酚 (dapi) 作为替代材料的安装介质, 用于核子反染色。在这种情况下, 将跳过此步骤和步骤 6.16, 直接进入步骤6.16。
  16. 用圆刃铲子将液滴转移到含有2毫升 pbs井的12井板中, 并用 pbs 冲洗三次。
  17. 将液滴安装在显微镜幻灯片上, 如下所示:
    1. 在方形 22 mm x22 mm 的覆盖玻璃边缘涂上一层狭窄的快速硬化安装介质, 并使其干燥约1分钟。对每个掉落单独执行此步骤, 以避免安装介质过度硬化。
      注: 在烟罩中执行此步骤, 因为快速硬化安装介质对健康有害。
    2. 用圆刃铲子将含有2毫升去离子水的12孔板的井中冲洗液滴, 转移到显微镜滑块上。用一小块吸水纸去除多余的水。
    3. 将15μl 的非硬化防褪色安装介质涂在液滴上。
      注: 或者, 如果未使用 hoechst 核染色, 则可使用含有 4 '、6-二胺-2-苯丙二醇 (dapi) 的安装介质。
    4. 轻轻地将盖板玻璃放置, 快速硬化安装介质面向微观滑块, 在液滴上放置。
      注: 快速硬化介质将粘附在微观滑块上, 并保持液滴就位。
  18. 对所有液滴重复步骤6.17。在每张显微镜幻灯片上安装两个液滴。
  19. 让幻灯片在 rt 干燥约 2小时, 并在4°c 过夜存放。确保幻灯片水平放置, 并免受光线影响。
  20. 使用共聚焦显微镜或配备光学切片功能和20x 或40x 目标的直立皮荧光显微镜成像染色的原生或终点 ft 体外培养物。使用瓷砖功能一次捕捉组织的更大面积。

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Representative Results

对 pdr 纤维血管组织特性和蛋白表达的深入了解主要依靠玻璃体样品和薄组织学 ft部分 3,15,16,17。为了建立一种方法, 彻底研究三维组织组织和多细胞生理病理过程的 pdr, 我们提出了利用手术切除, 患者衍生的病理 ft 进行三维表征和体外培养。新鲜的 ft 被转移到研究实验室并进行处理, 如图 1中的示意图工作流程所示。

可以在解剖之前对 ft 进行成像, 以便进行定性评估和记录 (图 2)。如图 2所示, ft 显示了患者间血管结构的大小、密度和丰度的巨大差异。在某些组织中, 松散的细胞, 大概是炎症免疫细胞或红血球, 以及不同口径的通透血管结构也很容易区分 (图 2)。解剖后, 需要对所获得的外植体的限制数的下游使用情况作出决定。部分外植体嵌入纤维蛋白基质中, 并在纤维蛋白凝胶形成后固定, 而其余外植体可在单独的板上接受体外培养 (图 1)。新鲜的 ft 也被成功地应用于电子显微镜的超微结构表征。样品可以用于常规透射电子显微镜 (tem) 超薄切片, 也可以用于串行块面扫描电子显微镜 (sbf-sem)3,11

固定纤维蛋白凝胶可以储存数周, 并通过全安装免疫荧光 18,19染色。染色样品在黑暗中储存在4°c 时也同样稳定。厚 ft/ff 凝胶可以通过具有光学切片功能的荧光显微镜进行实时成像, 可用于去除分散的焦距外光。利用这种方法进行成像, 可提供结构的精细可视化。另外, 共聚焦显微镜虽然要求更长, 但可以捕获更精细的细节。通过全安装免疫荧光对新鲜纤维蛋白嵌入和固定、未培养的原生 ft 进行表征, 可以对三维 pdr 组织中的血管结构、多种细胞类型及其相互排列进行表征景观11。例如, cd31 抗体可用于显示内皮和 ng2 以显示外周细胞 (图 3), 而 lyve1 抗体可将新发现的类似淋巴的内皮结构 (图 4)11。抗体的多种组合可用于可视化几种结构和细胞类型 (见材料表);例如, erg 还可以可视化内皮细胞, 它在异常的 pdr 新生培养中具有不连续性的表达模式。使用国家卫生研究院第11年开发的自由来源软件 angiotool, 可以用血管结构 (cd31 和 lyve1) 定量分析血管结构, 以保存和密度. 20岁。还可以从获得的数据集中呈现3d 卷 (请参阅视频 1)。如果抗体不适合全身性免疫荧光, 纤维蛋白液滴也可以嵌入石蜡中, 切割成薄片, 并通过免疫组织化学进行分析。在这种情况下, 液滴受益于在4°c 下的隔夜固定, 而不是在 rt 的1小时。

体外培养维持纤维蛋白嵌入 ft 的生长, 两天后就已经发育出细胞外生长 (图 5)。体外纤维蛋白凝胶被用作体外培养的基质, 因为它是在血管渗漏部位血清纤维蛋白原裂解后形成的体内临时 ecm, 直接与血管渗漏的 pdr 新丝。发炎的纤维化环境15,21,22

pdr 是一种微血管并发症, 其特征是血管生成和纤维化反应, ft 外植体保留了这种细胞在培养中的曲目, 并对添加到培养基11中的外源刺激做出了有效的反应。图 6中的代表性数据显示, pdr体外培养诱导 cd31 阳性内皮细胞萌发和血管保存对 vegfa 的反应, 而 tgfβ诱导纤维化反应, 反映出的外生长ng2 阳性果皮。几种外源刺激可以进行测试, 当通过对其体内玻璃体丰度的测量, 本文开发的 pdr 体培养模型可以揭示新的微环境和上下文相关的 pdr 病理机制, 而这些机制是不可能的在固定的组织材料中可视化。

Figure 1
图1。体外pdr 纤维血管组织培养模型.从玻璃体视网膜手术 (玻璃体切除术) 切除 ft 到外植体并嵌入纤维蛋白的工作流程的示意图表示, 用于三维表征和体外培养。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图2。在解剖前新鲜切除的 pdr 纤维血管组织.解剖前拍摄的新切除 ft 的相示台镜。ft 在血管结构的大小、密度和丰度方面差异很大。箭头表示不同口径的血管结构。红色的部分透明线突出了两个不同口径的单独船只。图像是用倒置的荧光显微镜拍摄的, 具有5倍、0.15 数值孔径 (na) 的目标。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图3。原生 pdr 纤维血管组织的全安装免疫荧光.全安装免疫荧光染色的原生 pdr ft 的荧光显微镜。cd31 (a, 绿色) 可视化内皮细胞, 而 ng2 (b, 红色) 可视化不规则的新生血管结构中的周细胞。合并的图像显示在 (c) 中。dapi (蓝色) 反色显示核子。图像是使用具有光学切片功能的直立荧光显微镜拍摄的, 并与计算机控制的130万像素单色 ccd 摄像机和图像采集软件结合使用 40x, 1.4 na, 油目标。利用图像处理软件 imagej 将九个光学部分组合在一起。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图4。原生 pdr 纤维血管组织的全安装免疫荧光.全安装免疫荧光染色的原生 pdr ft 的荧光显微镜。cd31 (a, 绿色) 可视化内皮细胞, 而 lyve1 (b, 红色) 可视化新发现的淋巴样内皮结构。合并的图像显示在 (c) 中。hoechst-33342 (蓝色) 反污渍显示核子。图像是使用垂直的荧光显微镜与光学切片功能, 并结合计算机控制的130万像素单色 ccd 相机和图像采集软件, 使用 20x, 0.8 na, 目标。利用图像处理软件 imagej 将四个光学部分组合在一起。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图5。pdr 纤维血管组织的体内生长.在指示时间点 (日) 的两个 ft e x 体内培养物的相位对比显微图像。ft 是在体外培养后生长的, 两天后就已经发育出细胞外生长。图像是用倒置的荧光显微镜拍摄的, 具有 5倍, 0.15 na, 目标。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 6
图6。pdr 纤维血管组织的全安装免疫荧光在体内培养未经治疗 (ctrl), 或存在 vegfa 或 tgfβ.未经体内或 vegfa 或 tgfβ存在, 经体内培养的 ft 荧光显微图, 经过9天的染色, 随后经全身免疫荧光染色。cd31 (绿色) 显示内皮细胞, 而 ng2 (红色) 可视化的周周。dapi (蓝色) 反色显示核子。vegfa 稳定血管, tgfβ诱导纤维化反应。这些图像是使用具有光学切片功能的直立荧光显微镜拍摄的, 并与计算机控制的130万像素单色 ccd 摄像机和图像采集软件相结合, 使用 20x, 0.8 na, 目标。利用图像处理软件 imagej 将九个光学部分组合在一起。请点击这里查看此图的较大版本.

Video
视频 1. 全安装免疫荧光染色的原生 ft 的3d 体积重建.cd31 (绿色)、lyve1 (红色)。hoechst-33342 反污渍 (蓝色) 显示细胞核。图像是使用垂直的荧光显微镜与光学切片功能, 并结合计算机控制的130万像素单色 ccd 相机和图像采集软件, 使用 20x, 0.8 na, 目标。使用商业软件进行3d 卷重建和视频渲染。视频的一部分在 gucciardo等人的许可下重新打印。11.请点击此处查看此视频。(右键单击下载.

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Discussion

考虑到相关组织微环境对可靠的功能细胞和分子力学结果的重要性, 有必要找到适当的实验模型, 提供这种组织环境。本文介绍了纤维蛋白嵌入 ft 的体外pdr 培养模型, 可以研究 pdr 病理生理学在 pdr 临床样本的本机、复杂和多细胞环境中的机制。

协议中的关键步骤是适当的纤维蛋白凝胶形成、ft 的定位和染色过程中的适当清洗。由于纤维蛋白凝胶的形成主要取决于凝血酶的活性, 受浓度和温度的影响, 每批纤维蛋白凝胶制剂的凝血酶量都需要调整。纤维蛋白凝胶的形成应该足够快, 以防止 ft 外植体的2d 生长, 但也足够缓慢, 允许 ft 定位到中心的液滴垂直和水平。在 ft 恰好位于液滴边缘的情况下, 额外的移液可能有助于 ft 放置在中心。仍然处于液滴边缘或在2d 中生长的 ft 将需要被排除在外。在染色过程中进行足够的清洗和避免液滴干燥也是至关重要的, 以便优化染色并最大限度地减少背景信号。传输时间也可能很关键。我们在玻璃体切除术后最多两个小时内嵌入了 ft, 这并不影响体外生长。更长的转移时间对文化成功的影响需要检验。

该协议可以通过使用可选矩阵进行 fft 嵌入来修改。在体内, pdr 新的外合物生长向富含胶原蛋白23的玻璃体皮层.然而, 血管渗漏后, 血清成分, 包括纤维蛋白原, 溶解成玻璃体, 靠近血管, 从而引发纤维化反应。因此, 在 pdr 15、21、22的炎症纤维蛋白环境中, 利用体外纤维蛋白凝块进行体外培养, 以典型出在 fdr152122 的炎症纤维化环境中形成的临时 ecm。或者, 纤维蛋白凝块可以补充层压蛋白和纤维连接蛋白, 以改变萌发毛细血管的稳定性, 或者外植体可以嵌入 i 型胶原蛋白和其他混合基质, 以典型的大多数纤维化微环境新生血管组织。这些基质一般适用于3d 培养和整体安装免疫荧光, 但其对 pdr ftd 的影响仍有待测试, 需要考虑3d 矩阵形成的时间, 以便保持在预防2d 的范围内增长18,19。当研究单位与医院的物理距离存在限制时, 更长的转移时间可以通过团队工作得到补偿;在 ft 传输过程中, 可进行 ta 溶液制备、纤维蛋白原消毒过滤和纤维蛋白凝胶形成试验。如果纤维蛋白凝胶即使在1小时后仍未形成, 则可能会出现纤维蛋白原或 ta 溶液制备的问题。在这种情况下, 不能使用 ffin 凝胶。

与每一种体外方法一样, 这种方法的局限性在于个体初级组织标本的质量参差不齐, 以及患者内部和患者间组织的异质性。就糖尿病患者而言, 这种变异性的一部分包括血管化和纤维化的程度, 这取决于多种因素, 如疾病的持续时间, 代谢条件, 遗传/表观遗传因素, 糖尿病类型和系统治疗。恢复的外科 pdr ft 的大小也是决定每个标本可研究的条件数量的一个限制因素。在提供对等空间信息的同时, 整个安装免疫荧光允许只研究每个液滴的有限数量的特征标记。作为妥协, 纤维蛋白液滴可以嵌入石蜡, 切割成薄片, 并通过免疫组织化学进行分析。

现有的糖尿病小鼠模型发展了早期 dr 的许多特征, 但未能全面概括人类 pdr 中发生的渐进变化, 从而阻碍了 pdr 疾病机制 7,8的研究。此外, 小鼠的眼睛与人眼有着根本的不同, 因为它缺乏黄斑, 进一步强调了研究人类疾病的重要性.外科 pdr fts 以前曾被丢弃, 或用于石蜡切片、透射电子显微镜、串行块面扫描电子显微镜、批量 rna 测序或离解细胞的2d 培养3,25.本文所描述的模型允许这种珍贵的外科材料的三维表征, 以及 pdr 病理生理学在本地病变组织微环境中的研究。当与玻璃体液体的使用相结合时, 该模型还允许研究细胞和无细胞 pdr 微环境的贡献。由于培养物对玻璃体中检测到的生长因子 (如 vegfa、bfgf、vegfc 和 tgfβ) 有有效的反应, 从而概括了 pdr 病理生理特征, 因此这种 pdr 前体培养模型适合于测试或开发新的 pdr 处理方法。11. 在这一模型中, 抗 vegfa 防止了毛细血管萌发和毛细血管回归的诱发迹象, 其反应与抗 vegfa 治疗的预期临床结果一致26,27。因此, 该模型还可用于更好地了解目前治疗方法的效果, 包括抗 vegfa 和皮质类固醇治疗。

通过活细胞成像仪器, 本文所描述的体外培养模型可以进行延时显微镜检查, 以便实时调查血管回归、萌发和细胞可塑性等过程。当与体外和体内模型以及临床数据相结合时, 这种体外 pdr 模型将有助于根据特定的识别标记集调查患者的反应, 这距离个性化医学的途径又近了一步。识别患者特异性的反应和/或反应特异性标记在 pdr 的情况下尤其重要, pdr 是一种多因素疾病, 具有复杂的微血管、神经退行性、代谢、遗传性/表观遗传等相互作用,免疫和炎症相关因素, 因此需要越来越多的多学科努力, 以发展更好的治疗靶向和疾病管理。除全贴免疫荧光外, 体外培养的 ft 还可通过纤溶酶/纳豆激酶治疗从纤维蛋白提取, 并进行转录和蛋白质组学分析28。本文所描述的模型的适用性, 在其他眼科条件下, 如在严重的镰状细胞视网膜病变的情况下, 纤维血管组织的体外研究的适用性, 也可以在未来进行探讨。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者非常感谢赫尔辛基大学医院眼科糖尿病科和玻璃体视网膜外科的医疗和外科医生、护士和全体工作人员积极参与招聘工作。的病人。我们感谢生物素分子成像设备的成像设施。我们感谢阿纳斯塔西亚·切尔年科提供的出色技术援助。这项研究得到了芬兰科学院 (kl) 赠款的支持, 赫尔辛基大学 (kl)、sigrid juselius 基金会 (kl)、k. albin johansson 基金会 (kl)、芬兰癌症研究所 (kl)、karolinska 学院 (kl)、芬兰眼科基金会 (sl)、眼睛和组织银行基金会 (sl)、mary 和 georg c. ehrnrooth 基金会 (sl) 和 huch 临床研究赠款 (tyh2018127 (tyh2018127), TYH2018127, sl), 糖尿病研究基金会 (sl, kl, ak, eg) 以及生物医学博士方案 (eg)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Microforceps Medicon 07.60.03 Used for handling the FTs
Disposable Scalpels - Sterile Swann-Morton 0513 Used for FT dissection
Culture dish, vented, 28 ml (60mm) Greiner Bio-One 391-3210 Used for dissection and for testing fibrin gel formation
Cell culture plates, 12-well Greiner Bio-One 392-0049 Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL Greiner Bio-One 391-3477
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL Greiner Bio-One 525-0384
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF Millipore SLGV033RS Used to sterile-filter the fibrinogen solution
Syringe, 10 mL Braun 4606108V Used to sterile-filter the fibrinogen solution
Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL Fisher FB74031
Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well Nunc 142475 Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture
Cell culture plates, 96-well, U-bottom Greiner Bio-One 392-0019 Used for whole-mount immunofluorescence
Round/Flat Spatulas, Stainless Steel VWR 82027-528 Used for whole-mount immunofluorescence
Coverslips 22x22mm #1 Menzel/Fisher 15727582 Used for mounting
Microscope slides Fisher Kindler K102 Used for mounting
Absorbent paper VWR 115-0202 Used for mounting
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
PBS tablets Medicago 09-9400-100 Used for preparing 1x PBS
Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma Calbiochem 341578
Hanks Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich H9394-500ML Used for preparing the fibrinogen and TA solution
Fetal bovine serum Gibco 10270106 Used for preparing the blocking solution
Human Serum Sigma-Aldrich H4522 Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media
Gentamicin Sulfate 10mg/ml Biowest L0011-100
Endothelial cell media MV Kit Promocell C-22120 Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement,  500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL)
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood.
Acetone Sigma-Aldrich 32201-2.5L-M Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.
Methanol Sigma-Aldrich 32213 Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.
Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate) Sigma-Aldrich T9284 Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing.
Hoechst 33342, 20mM Life Technologies 62249 For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Laboratories H-1000 Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200 Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
Eukitt Quick-hardening mounting medium Sigma-Aldrich 03989-100ml TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder Sigma-Aldrich T9549-500UN  Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw
Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder Sigma A3428 Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw
Name Company Catalog Number Comments
Growth factors
Recombinant human VEGFA R&D Systems 293-VE-010 50 ng/ mL final concentration
Recombinant human VEGFC R&D Systems 752-VC-025 200 ng/ mL final concentration
Recombinant human TGFβ Millipore GF346 1 ng/ mL final concentration
Recombinant human bFGF Millipore 01-106 50 ng/ mL final concentration
Name Company Catalog Number Comments
Primary antibodies
CD31 (JC70A) Dako M0823 Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD34 (QBEND10) Dako M716501-2 Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD45 (2B11+PD7/26) Dako M070129-2 Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD68 ImmunoWay RLM3161 Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
Cleaved caspase-3 (5A1E) Cell Signalling 9664 Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
ERG (EP111) Dako M731429-2 Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
GFAP Dako Z0334 Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Ki67 Leica Microsystems NCL-Ki67p Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Lyve1 R&D Systems AF2089 Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab
NG2 Millipore AB5320 Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Prox1 ReliaTech 102-PA32 Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab
Prox1 R&D Systems AF2727 Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab
VEGFR3 (9D9F9) Millipore MAB3757 Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
α-SMA (1A4) Sigma C6198 Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated
Name Company Catalog Number Comments
Secondary antibodies
Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG Life Technologies A-21202 Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG Invitrogen A-11012 Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG Thermo Scientific A-11057 Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG Thermo Scientific A-11036 Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG Molecular Probes A-21468 Used at 1:500 dilution
Name Company Catalog Number Comments
Microscopes
Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope Zeiss For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT
SZX9 upright dissection stereomicroscope Olympus For FT dissection
LSM 780 confocal microscope Zeiss For imaging of whole-mount immunostained FT
AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome Zeiss For imaging of whole-mount immunostained FT

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References

  1. Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
  2. Liew, G., Wong, V. W., Ho, I. V. Mini Review: Changes in the Incidence of and Progression to Proliferative and Sight-Threatening Diabetic Retinopathy Over the Last 30 Years. Ophthalmic Epidemiology. 24 (2), 73-80 (2017).
  3. Loukovaara, S., et al. Indications of lymphatic endothelial differentiation and endothelial progenitor cell activation in the pathology of proliferative diabetic retinopathy. Acta Ophthalmologica. 93 (6), 512-523 (2015).
  4. Stitt, A. W., et al. The progress in understanding and treatment of diabetic retinopathy. Progress in Retinal and Eye Research. 51, 156-186 (2016).
  5. Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies. JCI Insight. 2 (14), (2017).
  6. Gross, J. G., et al. Five-Year Outcomes of Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial. JAMA Ophthalmology. 136 (10), 1138-1148 (2018).
  7. Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Disease Models, Mechanisms. 5 (4), 444-456 (2012).
  8. Villacampa, P., Haurigot, V., Bosch, F. Proliferative retinopathies: animal models and therapeutic opportunities. Current Neurovascular Research. 12 (2), 189-198 (2015).
  9. Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models, Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
  10. Sharma, T., et al. Surgical treatment for diabetic vitreoretinal diseases: a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 44 (4), 340-354 (2016).
  11. Gucciardo, E., et al. The microenvironment of proliferative diabetic retinopathy supports lymphatic neovascularization. The Journal of Pathology. 245 (2), 172-185 (2018).
  12. Rezzola, S., et al. 3D endothelial cell spheroid/human vitreous humor assay for the characterization of anti-angiogenic inhibitors for the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Angiogenesis. 20 (4), 629-640 (2017).
  13. Pepper, M. S., Montesano, R., Mandriota, S. J., Orci, L., Vassalli, J. D. Angiogenesis: a paradigm for balanced extracellular proteolysis during cell migration and morphogenesis. Enzyme, Protein. 49 (1-3), 138-162 (1996).
  14. Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs). Journal of Cell Science. 115 (Pt 17), 3427-3438 (2002).
  15. Loukovaara, S., et al. Quantitative Proteomics Analysis of Vitreous Humor from Diabetic Retinopathy Patients. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5131-5143 (2015).
  16. Abu El-Asrar, A. M., Struyf, S., Opdenakker, G., Van Damme, J., Geboes, K. Expression of stem cell factor/c-kit signaling pathway components in diabetic fibrovascular epiretinal membranes. Molecular Vision. 16, 1098-1107 (2010).
  17. Loukovaara, S., et al. Ang-2 upregulation correlates with increased levels of MMP-9, VEGF, EPO and TGFbeta1 in diabetic eyes undergoing vitrectomy. Acta Ophthalmologica. 91 (6), 531-539 (2013).
  18. Sugiyama, N., et al. EphA2 cleavage by MT1-MMP triggers single cancer cell invasion via homotypic cell repulsion. Journal of Cell Biology. 201 (3), 467-484 (2013).
  19. Tatti, O., et al. MMP16 Mediates a Proteolytic Switch to Promote Cell-Cell Adhesion, Collagen Alignment, and Lymphatic Invasion in Melanoma. Cancer Research. 75 (10), 2083-2094 (2015).
  20. Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
  21. Senger, D. R. Molecular framework for angiogenesis: a complex web of interactions between extravasated plasma proteins and endothelial cell proteins induced by angiogenic cytokines. American Journal of Pathology. 149 (1), 1-7 (1996).
  22. Senger, D. R., Davis, G. E. Angiogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (8), a005090 (2011).
  23. Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
  24. Marmorstein, A. D., Marmorstein, L. Y. The challenge of modeling macular degeneration in mice. Trends in Genetics. 23 (5), 225-231 (2007).
  25. Kim, L. A., et al. Characterization of cells from patient-derived fibrovascular membranes in proliferative diabetic retinopathy. Molecular Vision. 21, 673-687 (2015).
  26. Avery, R. L., et al. Intravitreal bevacizumab (Avastin) in the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Ophthalmology. 113 (10), e1691-e1615 (2006).
  27. Zhao, L. Q., Zhu, H., Zhao, P. Q., Hu, Y. Q. A systematic review and meta-analysis of clinical outcomes of vitrectomy with or without intravitreal bevacizumab pretreatment for severe diabetic retinopathy. The British Journal of Ophthalmology. 95 (9), 1216-1222 (2011).
  28. Carrion, B., Janson, I. A., Kong, Y. P., Putnam, A. J. A safe and efficient method to retrieve mesenchymal stem cells from three-dimensional fibrin gels. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (3), 252-263 (2014).

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撤回 第143期,体外培养 纤维血管组织 增殖性糖尿病视网膜病变 患者衍生的临床样本 血管 疾病病理生理学 三维 三维 全身免疫荧光 玻璃体切除术,新奥韦塞尔。
增殖性糖尿病视网膜病变纤维血管并发症的体外组织培养模型
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Gucciardo, E., Loukovaara, S., Korhonen, A., Lehti, K. An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy. J. Vis. Exp. (143), e59090, doi:10.3791/59090 (2019).

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