Summary
Hier presenteren we een protocol om te bestuderen van de pathofysiologie van proliferatieve diabetische retinopathie met behulp van patiënt-afgeleide, operatief verwijderd, fibrovascular weefsels voor driedimensionale inheemse karakterisering en ex vivo weefselkweek. Dit ex vivo cultuur model is ook vatbaar voor testen of ontwikkelen van nieuwe behandelingen.
Abstract
Diabetische retinopathie (DR) is de meest voorkomende microvasculaire complicaties van diabetes en een van de belangrijkste oorzaken van blindheid in de werkende leeftijd volwassenen. Geen huidige dierlijke modellen van diabetes en retinopathie zuurstof-geïnduceerde ontwikkelen de full-range progressieve wijzigingen manifesteert zich in menselijke proliferatieve diabetische retinopathie (PDR). Daarom heeft inzicht in de pathogenese van de ziekte en pathofysiologie vertrouwd grotendeels op het gebruik van histologische secties en glasvocht monsters in benaderingen die alleen steady-state informatie te over de betrokken pathogene factoren verstrekken. Een groeiende hoeveelheid bewijs geeft aan dat dynamische cel-cel en cel-extracellulaire matrix (ECM) interacties in het kader van driedimensionale (3D) microenvironments essentieel voor de mechanistische en functionele studies naar de ontwikkeling van nieuwe zijn behandelingsstrategieën. Dus veronderstelde we dat het pathologische fibrovascular weefsel chirurgisch verwijderd uit ogen met PDR betrouwbaar ontrafelen de cellulaire en moleculaire mechanismen van deze verwoestende ziekte en het potentieel voor roman klinische testen kan worden gebruikt interventies. Voor dit doel ontwikkeld wij een nieuwe methode voor 3D ex vivo cultuur van chirurgisch weggesneden patiënt afkomstige fibrovascular weefsel (FT), dat als een relevante model van menselijke PDR pathofysiologie dienen zal. De FTs worden ontleed in explantaten en ingebed in fibrine matrix voor ex vivo cultuur- en 3D-karakterisering. Geheel-mount immunofluorescentie van de inheemse FTs en eindpunt culturen kunt grondig onderzoek van weefsel samenstelling en meercellige processen, wijzen op het belang van 3D weefsel-niveau karakterisering blootleggen relevante kenmerken van PDR pathofysiologie. Dit model zal toelaten de gelijktijdige evaluatie van moleculaire mechanismen, mobiele/weefsel processen en reacties van de behandeling in de complexe context van dynamische biochemische en fysische interacties binnen de PDR weefsel architectuur en communicatie. Aangezien dit model PDR pathofysiologie recapituleert, zal het ook zijn vatbaar voor testen of ontwikkelen van nieuwe behandelingen.
Introduction
DR is een ernstige oogbeschadigingen en/of complicatie van diabetes, een ziekte die enorme proporties in de afgelopen drie decennia1heeft bereikt. Twintig jaar na de diagnose, vrijwel elke patiënt met type 1 diabetes en 60% van de patiënten met type 2 diabetes aanwezig tekenen van retinopathie, waardoor diabetes per se een van de belangrijkste oorzaken van blindheid in de leeftijd volwassenen2werken. Volgens het niveau van de microvasculaire degeneratie en ischemische schade, wordt DR ingedeeld in de niet-proliferatieve DR (niet-PDR) en proliferatieve DR (PDR). De einde-fase ziekte, PDR, wordt gekenmerkt door ischemie - en ontsteking-geïnduceerde neovascularization en fibrotische reacties op de vitreoretinal-interface. In onbehandelde voorwaarden, zullen deze processen leiden tot blindheid als gevolg van glasvocht bloeding, retinale fibrose, tractional retinale detachement en neovascular glaucoom3,4. Ondanks de recente vooruitgang target huidige behandelingsopties alleen DR stadia, met inbegrip van diabetische macula oedeem en PDR, wanneer retinale schade heeft reeds volgde. Bovendien is een groot deel van de patiënten van de DR is niet gebaat bij de huidige behandeling arsenaal, met vermelding van een dringende behoefte aan verbeterde therapieën4,5,6.
Meerdere andere ikn vivo ziekte/ontwikkelingstoxiciteit en diabetische dierlijke modellen hebben ontwikkeld tot nu toe, maar geen van hen recapituleert de volledige reeks van pathologische functies waargenomen in menselijke PDR7,8. Bovendien geeft een groeiende hoeveelheid bewijs dat behandeling reacties strak met de ECM-samenstelling, alsmede de ruimtelijke rangschikking en de interactie tussen de cellulaire en Acellulair communicatie-9 verbonden bent. Daarom zetten we, uit een klinisch relevante model van menselijke PDR ontwikkelen door gebruik te maken van de FT pathologisch materiaal dat gewoonlijk uit ogen Vitrectomie ondergaan als onderdeel van het chirurgische beheer van PDR10is weggesneden.
Dit manuscript beschrijft het protocol voor de 3D ex vivo cultuur en karakterisering van de chirurgisch-weggesneden, PDR patiënt afkomstige pathologische FT. De hier beschreven methode is gebruikt in een recente publicatie die bewezen succesvolle deconstructie van de native 3D PDR weefsel landschap en recapitulatie van kenmerken van PDR pathofysiologie, met inbegrip van angiogenic en fibrotische reacties van de abnormale vasculaire structuren11. Dit model bleek ook nieuwe functies die niet kunnen gemakkelijk worden gewaardeerd uit dunne histologische secties, zoals ruimtelijk beperkt apoptosis, evenals proliferatie en vasculaire islet formatie11. Glasvocht vloeistof is met succes gebruikt door anderen op 3D endothelial sferoïde culturen om te evalueren van de potentiële angiogenic en de werkzaamheid van angiostatic moleculen12. Wanneer gecombineerd met een in vitro 3D lymfatische endothelial cel (LEC) sferoïde kiemen assay PDR glasvocht als stimulerende middelen gebruiken, bleek ons model dat de bijdrage van beide oplosbare vitreal factoren evenals als lokale signalen binnen het neovascular weefsel aan als nog slecht begrepen LEC deelname PDR pathofysiologie3,11. In het beheer van de PDR is vitreoretinal chirurgie een routinematig uitgevoerd maar uitdagende procedure. Zoals chirurgische Instrumentation en technieken continue verbetering en verfijning zien, tijdige en conservatieve verwijdering van fibrovascular proliferatieve specimen niet alleen verbetert visie uitkomst, maar biedt ook waardevolle weefsel materiaal voor de onderzoek naar de pathofysiologie en behandeling reacties PDR in de complexe translationeel aspecten van de communicatie van levende menselijke weefsels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit onderzoek werd goedgekeurd door de institutionele Review Board en ethisch comité van Helsinki University Hospital. Ondertekende geïnformeerde toestemming was verkregen bij elke patiënt.
1. bereiding van de oplossingen, Media en apparatuur
- De volgende apparatuur voor het verzamelen van het fibrovascular weefsel (FT) om ervoor te zorgen snelle verwerking voor te bereiden.
- Steriel-autoclaaf twee microdissection pincet.
- 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor te bereiden door de ontbinding van 1 vooraf gewogen PBS tablet (0,14 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0,010 M PO4-3) in 900 mL gedeïoniseerd water toe en roer te ontbinden. Regel het volume met water tot 1 L en steriele-autoclaaf de klaar oplossing. Winkel op RT.
- De hierboven genoemde oplossing en apparatuur in een mand, samen met een steriel scalpel van eenmalig gebruik, een steriele 6-cm cel cultuur schotel en vijf steriele 12-well cel cultuur platen te verzamelen.
- Bereid een 6 mg/mL fibrinogeen oplossing in Hanks evenwichtig zout oplossing (HBSS) door het oplossend plasminogen-verarmd menselijk fibrinogeen 30 mg in 5 mL HBSS, met behulp van een tube van 50 mL, ondergedompeld in een waterbad bij 37 ° C, gedurende ten minste 1 uur.
Opmerking: Deze oplossing kan worden gehouden in het waterbad (37 ° C) gedurende 7 uur (maximaal 10 h) vóór gebruik. - Voorbereiden van de ex vivo kweekmedium door toevoeging van 5% foetaal kalfsserum (FCS) of 5% menselijk serum, 0.4% endothelial cel groei supplement 10 ng/mL recombinante menselijke epidermale groeifactor, 1 μg/mL hydrocortison en 50 μg/mL gentamycine te commercieel beschikbaar groeimedium endothelial cel en houd in waterbad bij 37 ° C tot gebruik. Bewaren bij 4 ° C voor maximaal een maand.
2. fibrovascular weefsel dissectie
- Het fibrovascular weefsel (FT) dat heeft is weggesneden van menselijke proefpersonen ondergaan trans-conjunctivale microincision vitreoretinal operatie, door 23 of 20 gauge drie-poort pars plana Vitrectomie als onderdeel van het vitreoretinal chirurgische beheer van PDR verzamelen.
Opmerking: De FT is weggesneden met behulp van segmentatie en delaminatie, indien nodig met microscissors en verwijderd uit het glasvocht holte met intraoculaire einde aangrijpend microforceps gesneden door ervaren vitreoretinal chirurg. Uiterste zorg moet worden genomen om te intact, onbeschadigd FT verwijderen zonder schade aan oogbeschadigingen en/of structuren met inbegrip van de oogzenuw of tijdelijke vasculaire arcade waar de pathologische neovascular weefsel bevindt zich meestal. De grootte van het verwijderde weefsel is variabel, meestal variërend tussen de 3 en 50 mm2. - Houd de FT in een 6 cm cel cultuur schotel of 1,5 mL tube met 1 mL steriele PBS geplaatst op nat ijs, en breng dit onmiddellijk om te onderzoek laboratorium voor verwerking.
Opmerking: Het is essentieel dat de onderzoekseenheid (lab faciliteiten) fysiek dicht bij de operatiekamer ziekenhuis (OR zijn) om te minimaliseren van de overdrachtstijden van de kleine verwijderde FT. In dit geval de overdracht duurt minder dan 5 minuten en de explantaten zijn ingebed in fibrine meestal in 1-1,5 h (maximaal 2 uur) na chirurgische verwijdering. De impact van langere overdrachtstijden op de 3D cultuur zou moeten worden getest. - Plaats de FT in een 6-cm cel cultuur schotel met 1 mL PBS bij kamertemperatuur (RT, 25 ° C) en het verwerven van beelden van het weefsel een omgekeerde epifluorescence Microscoop met een 5 x doelstelling.
Opmerking: Afbeeldingen zijn verworven voor kwalitatieve evaluatie en documentatie. Het zal mogelijk zijn te observeren het weefsel omvang, de dichtheid en de algemene samenstelling (bijvoorbeeld vasculaire structuren). - Snijd de FT in ~ 1 mm2 stuks onder een rechtop dissectie stereomicroscoop, met een steriel scalpel en microdissection pincet. Houd het weefsel, goed ondergedompeld in PBS, in plaats met behulp van een microdissection-pincetten, en duidelijke bezuinigingen met een steriel scalpel uitvoeren. Vermijd scheuren FT, als dit de inheemse fibrovascular structuren veranderen zou.
- Plaats elk individueel stuk in een putje van een 12-well cel cultuur plaat met 1 mL steriele PBS.
Opmerking: Indien nodig, zachtjes verspreid de FT op het bord, met behulp van microdissection pincet, vóór het uitvoeren van bezuinigingen.
3. casting rechtop fibrine Gel druppels voor de karakterisatie van inheemse FT en Ex Vivo cultuur
- Steriel-filter de klaar fibrinogeen oplossing bereid in stap 1.2 met een 0,22 μm filter gemonteerd in een 10 mL spuit.
- Voorbereiden aliquots van de fibrinogeen oplossing (25 μL per tube 1,5 mL) en houd op RT. voorbereiden een aliquoot gedeelte voor fibrine gel / elk stuk FT verkregen na de dissectie, en een paar extra aliquots voor het testen van het fibrine gel vorming.
- Voorbereiden een oplossing van HBSS met 4 eenheden/mL van trombine en 400 μg/mL van aprotinin, genaamd hiernamaals TA oplossing en bewaar op RT. voorbereiden zoveel TA-oplossing, zo nodig, afhankelijk van het aantal stuks verkregen na dissectie (25 μL van TA oplossing wordt gebruikt voor elk FT/fibrin gel), en een extra bedrag (bijvoorbeeld 250 μL) voor het testen van de vorming van fibrine gel en ervoor te zorgen dat voldoende oplossing beschikbaar in het gehele gieten van de fibrine gel druppels is.
Opmerking: Trombine is vereist voor fibrine polymerisatie, terwijl aprotinin is toegevoegd om te voorkomen dat de aantasting van het fibrine gel door cellulaire proteasen uitgedrukt door de FTs13,14. - Testen van de timing van de vorming van fibrine gel: 25 μL van TA oplossing aan de aliquoted 25 μL fibrinogeen oplossing bereid in stap 3.2 toevoegt en, met behulp van een precisiepipet ingesteld op 50 μl, Meng in de buis door pipetteren en afzien in een 6 cm schotel voor de cultuur van de cel , vormen een rechtop druppel.
Opmerking: De vorming van fibrine gel moet plaatsvinden in ~ 1 min. Als dit meer dan 1,5 min duurt, kan de concentratie van trombine in de TA-oplossing bereid in stap 3.3 worden verhoogd door het toevoegen van meer stockoplossing van trombine. Een tiende van de aanvankelijk gebruikte volume van de stockoplossing trombine kunnen worden toegevoegd, herhaaldelijk, totdat de vorming van fibrine gel binnen 1,5 min optreedt. De tijd van de vorming van fibrine gel is van cruciaal belang voor de drie dimensionaliteit van de cultuur, als snelle gel vorming (binnen 1,5 minuut) voorkomt dat de FT-stuk uit zinken naar de bodem van het fibrine-gel, en dus komen in contact met de 2D plastic oppervlak van de cel cultuur-plaat, die tot 2D cel adhesie en uitgroei leiden kan. - Plaats een FT stuk in het midden van een goed van een 24-well-plate met behulp van een steriel pincet en verwijder alle overtollige PBS door pipetteren met een 0.5-10 μL pipet te vermijden zuigkracht op de FT. In het geval dat het weefsel houdt zich aan de pincetten, een extra pincetten bedoeld als hulpmiddel van de plaatsing van het stuk weefsel op de plaat te maken.
Opmerking: FT/fibrine gels kunnen ook worden uitgebracht op 48-well plaat te verminderen van het gebruik van de reagentia. Dit is echter moeilijker als de ruimte beperkter is en fibrine verspreiden zich als het komt in contact met de goed muur. - 25 μL van TA-oplossing toevoegen aan de 25 μL fibrinogeen oplossing aliquoted in stap 3.2, en met behulp van een precisiepipet 50 μl mix in de buis door pipetteren instelt. Afzien op de FT-stuk geplaatst op de plaat goed en Pipetteer op en neer 2 - 3 keer op te nemen van het stuk van de FT binnen de rechtop druppel, bieden een 3D omliggende matrix tot de FT.
Opmerking: Zorg ervoor dat de FT is niet aanzuiging tijdens pipetteren en dat er geen luchtbellen worden gevormd. Zorg ook dat mengen, dispensatie en pipetteren worden uitgevoerd snel als de gel fibrine binnen 1,5 min vormen zullen, zoals getest in stap 3.4. Als gieten fibrine gels op 48-well plaat, gebruik in plaats daarvan 20 μL van fibrinogeen oplossing en 20 μL van TA oplossing. - Herhaal stap 3.5 en 3.6 voor alle stukken van de FT.
- De gels van fibrine te stollen door het broeden van de platen in een cel cultuur incubator bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer met 5% CO2toestaan.
- Na 0,5-1 kantelen h, Controleer de fibrine gel is volledig gevormd door zorgvuldig van de plaat. Ga naar stap 3.10 wanneer de gel niet wordt verplaatst als de plaat wordt bewogen, die aangeeft dat de vorming van fibrine gel voltooid is.
- Bedekken de FT/fibrine gels met ex vivo kweekmedium (600 μl per putje in 24-well plaat) of 300 μl per putje in 48-well plaat aangevuld met 100 μg/mL aprotinin. Pipetteer zachtjes het medium door drop-wise dispensatie.
Opmerking: Hier, aprotinin wordt gebruikt om te voorkomen dat de aantasting van het fibrine gel door cellulaire proteasen uitgedrukt door de FTs13,14. De ex vivo kweekmedium kan bovendien worden aangevuld met recombinant groeifactoren, zoals VEGFA, VEGFC, bFGF, TGFβ (Zie Tabel van materialen)11. - Plaats de FT ex vivo cultuur plaat terug in de 37 ° C, 5% CO2 cel cultuur incubator en cultuur voor de gewenste tijdsperiode (bijvoorbeeld2 - 18 dagen, langere cultuur periodes zal moeten worden getest). Vervangen door 50% van het medium vers ex vivo kweekmedium elke drie dagen.
4. "in Matrix" Imaging
- Verwerven van beelden van de FT ex vivo culturen op dezelfde dag (dag 0) en op vastgestelde tijden (bijvoorbeeld om de andere dag), met behulp van een omgekeerde epifluorescence microscope, om te volgen de 3D groei.
Nota: De beelden verkregen kunnen worden gebruikt voor de kwantificering van de FT uitgroei als de totale lengte van twee loodrecht diameters over de explant11.
5. inheemse FT en Ex Vivo cultuur eindpunt
Opmerking: De FT/fibrine gels kunnen worden gekweekt ex vivo voor de gewenste periode (FT ex vivo culturen) of vaste op dezelfde dag (native FT) voor inheemse FT karakterisering11.
- Moeilijke situatie van de inheemse FT of de FT ex vivo culturen door vervanging van het kweekmedium met 1 mL/goed voor 4% paraformaldehyde in PBS oplossing, voor 1 h op RT. Positiebepaling voor de inheemse FT/fibrine gels, 0,5-1 h na toevoeging van de ex vivo cultuur medium (als de gels van fibrine hebben niet was gedrenkt in medium, fixatie zal beschadigen).
Opmerking: Deze stap uitvoeren in de zuurkast betreft paraformaldehyde corrosieve, toxische en carcinogene. - Spoel de FT/fibrine gels met drie 5 min wast in PBS (2 mL/putje).
- Vervang de PBS met 2 mL/goed van PBS met 0,02% natriumazide en de vaste fibrine gels bij 4 ° C worden opgeslagen totdat zij worden verwerkt. Het zegel van de platen met paraffine film om ervoor te zorgen dat de FT/fibrine gels niet doen droog in opslag.
Opmerking: Deze stap uitvoeren in de zuurkast zoals natriumazide giftig is.
6. geheel-Mount immunofluorescentie kleuring
Opmerking: Dit protocol duurt 5 dagen en kan worden onderbroken met overnachting incubations indien aangegeven. Laat niet de fibrine gels droog op elk gewenst moment. Alle stappen worden uitgevoerd op RT, tenzij anders aangegeven.
- De volgende oplossingen voor te bereiden voordat het protocol van de kleuring.
- Na fixatie oplossing: bereid 50:50 aceton: methanolische oplossing door het mengen van gelijke hoeveelheden van aceton en methanol (bijvoorbeeld 50 mL). Winkel bij-20 ° C. Bereid deze oplossing laatste op de dag vóór de kleuring. Deze oplossing kan worden achtergelaten terug bij-20 ° C en voor latere technieken worden gebruikt.
Opmerking: Bereid deze oplossing in de zuurkast zoals aceton en methanol ontvlambaar en gevaarlijk voor de gezondheid zijn. - Blokkeren van de oplossing: een 15% foetale runderserum (FBS), 0,3% octyl fenol ethoxylaat oplossing in PBS met eerste toevoegen 15% bereiden FBS naar PBS. Voeg octyl fenol ethoxylaat en roer te ontbinden. Bewaren bij 4 ° C.
Opmerking: Deze oplossing kan worden bereid in grote bedrag van tevoren, opgeslagen in 15 mL aliquotes bij-20 ° C en ontdooid vóór gebruik, op de dag wanneer de kleuring protocol wordt gestart. Gebruik een vers bereide of vers ontdooide aliquote voor elk protocol dat kleuring. - Wassen van de oplossing: bereiden 1 L van PBS aangevuld met 0,45% octyl fenol ethoxylaat 4.5 mL van octyl fenol ethoxylaat aan 995.5 mL PBS toe te voegen. Roer te ontbinden. Winkel op RT.
- Na fixatie oplossing: bereid 50:50 aceton: methanolische oplossing door het mengen van gelijke hoeveelheden van aceton en methanol (bijvoorbeeld 50 mL). Winkel bij-20 ° C. Bereid deze oplossing laatste op de dag vóór de kleuring. Deze oplossing kan worden achtergelaten terug bij-20 ° C en voor latere technieken worden gebruikt.
- Til de druppels voorzichtig van de plaat met behulp van een spatel roestvrij staal bekantrecht. Ontkoppel de druppel eerst vanaf de randen vóór opheffing van het centrum, en overbrengen naar een putje van 12-well plaat met 1 mL PBS.
Opmerking: Na fixatie, wast en blokkerende stappen uitvoeren in deze plaat-indeling. - Na de druppels met 1 mL ijskoud 50:50 aceton: methanolische oplossing voor ~ 1 min (de rand van de druppels witte zal draaien) vast te stellen.
Opmerking: Deze stap uitvoeren in de zuurkast zoals aceton en methanol gevaarlijk voor de gezondheid zijn. - Spoel met 3-5 wasbeurten in 2 mL PBS (de druppels zal zinken in de PBS-oplossing wanneer rehydratie voltooid is).
Opmerking: Raak de druppels met de pipet tip omdat ze na na fixatie, kleverige tot plastic. In het gehele protocol, Vermijd zuigen na correctie, antilichaam, blokkeren en wassen van oplossingen door afzuigen, zoals dit kan beschadigen of volledig de druppels vernietigen. In plaats daarvan, kantelen van de plaat en verwijder voorzichtig oplossingen met een 500-5.000 μL pipet. - Centrifugeer de blokkerende oplossing voor 15 min op 21.000 x g- en 4 ° C om puin te ruimen.
Opmerking: De oplossing kan worden aliquoted in 1,5 mL tubes voor het centrifugeren. De ongebruikte oplossing kan worden opgeslagen bij 4 ° C en gebruikt voor alle relevante latere stappen. - Incubeer de druppels in 500 μL blokkeren oplossing voor 2 h op RT.
Opmerking: Verklein de hoeveelheid oplossing gebruikt blokkeren en de plaat kan worden gekanteld op een drager en zo weinig als 300 μL van oplossing/druppel kan worden gebruikt. - Voorbereiden van het primaire antilichaam mengsel (ten minste 30 μL/druppel) bij juiste verdunning in het blokkeren van de oplossing en Centrifugeer gedurende 15 min bij 21.000 x g- en 4 ° C.
- Overdracht van de druppels in eerste ronde (U)-96-Wells bodemplaat met behulp van een spatel ronde-edged, en broeden met ten minste 30 μL/druppel van het mengsel primair antilichaam 's nachts bij 4 ° C.
- De volgende dag, overdracht de druppels in 12-well met 2 mL plaat van de oplossing per putje, wassen wast spoelen met drie 5 min eerste en vervolgens met negen 30 min wast. Laat de laatste wasbeurt (2 mL) 's nachts bij 4 ° C.
- Op de volgende dag, Spoel driemaal met PBS en overdracht van de druppels in eerste ronde (U)-96-Wells bodemplaat.
- Tijdens de wast, bereiden de passende fluorophore-geconjugeerde secundair antilichaam-mengsel (verdunde 1:500, ten minste 30 μL/druppel) in het blokkeren van de oplossing en Centrifugeer gedurende 15 min op 21.000 x g- en 4 ° C.
- Breng de druppels in een ronde (U)-96-Wells bodemplaat met behulp van een spatel ronde randen en incubeer met ten minste 30 μl van het mengsel secundair antilichaam voor 4 uur op RT, beschermd tegen licht.
Opmerking: Alle daaropvolgende incubations en wassen stappen beschermd tegen licht uitvoeren. - Breng de druppels in 12-well plaat met 2 mL van oplossing/putje met behulp van een ronde-edged spatel, spoelen met drie 5 min wast eerst wassen en vervolgens met vier 30 min wast. Laat de laatste wasbeurt (2 mL) 's nachts bij 4 ° C.
- De volgende dag, spoel de gels met vijf 30 min wast en vervolgens driemaal met PBS. Laat de laatste wasbeurt (2 mL) 's nachts bij 4 ° C.
- De volgende dag, breng de druppels in een ronde (U)-96-Wells bodemplaat met behulp van een ronde-edged spatel en counterstain kernen door het broeden met 10 μg/mL Hoechst nucleaire vlek (ten minste 30 μL/druppel) gedurende 30 minuten bij RT.
Opmerking: Montage medium aangevuld met 4', kan 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) voor kernen counterstaining als alternatief gebruikt worden. In dat geval deze stap en stap 6.16 worden overgeslagen, gaan rechtstreeks naar stap 6.17. - Breng de druppels in 12-well plaat met 2 mL PBS per putje met behulp van een ronde-edged spatel en spoel driemaal met PBS.
- Mount de druppels op microscoopglaasje als volgt:
- Het toepassen van een smalle laag van snel uithardend montage medium op de randen van een dekglaasje vierkant-vormige 22 x 22 mm en laten drogen voor ~ 1 minuut. Voer deze stap voor elke daling individueel, om te voorkomen dat buitensporige verharding van het montage-medium.
Opmerking: Deze stap uitvoeren in de zuurkast als het medium van de montage snel uithardend gevaarlijk voor de gezondheid is. - Spoel de druppel door dompelen in een put van een 12-well plaat met 2 mL gedeïoniseerd water en breng op een microscoopglaasje, met behulp van een spatel ronde randen. Verwijder overtollig water met behulp van een klein stukje van absorberend papier.
- Afzien 15 μL van niet uithardend antifade montage medium op de druppel.
Opmerking: U kunt ook als Hoechst nucleaire vlek niet is gebruikt, montage opslagmedium met 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kan worden gebruikt. - Voorzichtig plaats de cover glas, met het snel uithardend montage medium tegenover de microscopische dia over de druppel en laten regelen.
Opmerking: Het snel uithardend medium zal vasthouden aan de microscopische dia en bewaar de druppel op plaats.
- Het toepassen van een smalle laag van snel uithardend montage medium op de randen van een dekglaasje vierkant-vormige 22 x 22 mm en laten drogen voor ~ 1 minuut. Voer deze stap voor elke daling individueel, om te voorkomen dat buitensporige verharding van het montage-medium.
- Herhaal stap 6.17 voor alle druppels. Mount twee druppels op elke microscoopglaasje.
- Laat de dia's op RT ~ 2 uur drogen en bewaren bij 4 ° C's nachts. Zorg ervoor dat de dia's worden horizontaal geplaatst en beschermd tegen licht.
- Afbeelding de gebeitst inheemse of eindpunt FT ex vivo culturen met behulp van een confocal microscoop of een rechtop epifluorescence Microscoop uitgerust met een optische vectorafbeeldingsbestanden functie en 20 x of 40 x doelstelling. Tegel-functie gebruiken om een groter gebied van het weefsel in een keer vastleggen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dieper begrip van de PDR fibrovascular weefsel eigenschappen en eiwit expressie heeft zich voornamelijk op glasvocht monsters en dunne histologische FT secties3,15,16,17. Voor de ontwikkeling van een methode voor het grondig onderzoek van de organisatie van 3D weefsel en meercellige pathofysiologische processen van PDR, zetten we uit voor het gebruik van de Operatief verwijderde, afgeleide patiënt-pathologische FTs voor 3D karakterisering en ex vivo cultuur. De verse FTs zijn overgebracht naar het onderzoekslaboratorium en verwerkt zoals geïllustreerd in de schematische workflow in Figuur 1.
De FTs kunnen worden beeld vóór dissectie voor kwalitatieve evaluatie en documentatie (Figuur 2). Zoals afgebeeld in Figuur 2, weer de FTs grote inter patiënt variatie in omvang, dichtheid en overvloed van vasculaire structuren. In sommige weefsels, losse cellen, vermoedelijk inflammatoire/immuun cellen of rode bloedcellen, evenals pervious vasculaire structuren van verschillende kaliber kunnen ook gemakkelijk worden onderscheiden (Figuur 2). Na dissectie dient een besluit te geschieden op de downstream gebruik van het beperkt aantal de verkregen explantaten. Een deel van de explantaten is ingebed binnen fibrine matrix en vastgesteld na de vorming van fibrine gel terwijl de resterende explantaten kunnen worden onderworpen aan ex vivo cultuur op een afzonderlijke plaat (Figuur 1). De verse FTs hebben ook met succes gebruikt voor Ultrastructurele karakterisering door elektronenmicroscopie. De monsters kunnen worden dat ofwel verwerkt voor conventionele transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) van uiterst dunne secties of voor seriële blok gezicht-scanning elektronen microscopie (SBF-SEM)3,11.
De vaste fibrine gels kunnen worden opgeslagen voor enkele weken en gekleurd door geheel-mount immunofluorescentie18,19. De gekleurde monsters zijn ook stabiel wanneer opgeslagen bij 4 ° C in het donker. De dikke FT/fibrine gels kunnen tijd-efficiënt worden beeld met epifluorescence Microscoop uitgerust met een optische vectorafbeeldingsbestanden functie, handig voor het verwijderen van de verstrooide licht van de out-of-focus. Beeldbewerking met deze methode biedt een goede visualisatie van de structuren. U kunt ook confocale microscopie, hoewel de tijd-veeleisender, kunt het vastleggen van de fijnere details. De karakterisering van de vers fibrine-embedded en vaste, onbeschaafd, inheemse FTs met geheel-mount immunofluorescentie kunt de karakterisatie van meerdere celtypen, vasculaire structuren en hun wederzijdse regeling binnen de 3D PDR weefsel landschap11. Bijvoorbeeld, CD31 antilichamen kunnen worden gebruikt voor het weergeven van het endotheel en NG2 pericytes (Figuur 3) worden weergegeven terwijl Lyve1 antilichamen nieuw visualiseren ontdekte lymfatisch-achtige endothelial structuren (Figuur 4)11. Meerdere combinaties van antilichamen kunnen worden gebruikt voor het visualiseren van verschillende structuren en celtypes (Zie Tabel van materialen); bijvoorbeeld kunt ERG ook visualiseren het endotheel, die een discontinuos-expressiepatroon in de abnormale PDR neovasculature heeft. De vasculaire structuren gekleurd met een membraan marker (bijvoorbeeld, CD31 en Lyve1) kunnen kwantitatief worden geanalyseerd voor behoud en de dichtheid met behulp van Angiotool, een gratis-source software ontwikkeld door de NIH National Cancer Institute11, 20. 3D volumes kunnen ook worden gegenereerd op basis van de verkregen dataset (Zie Video 1). Als een antilichaam niet geschikt voor hele-mount immunofluorescentie is, kunnen de druppels fibrine als alternatief worden ingesloten in paraffine, gesneden dunne secties en geanalyseerd door immunohistochemistry. In dit geval profiteren de druppels van overnachting fixatie bij 4 ° C in plaats van de 1 h op RT.
Ex vivo voedt cultuur de groei van het fibrine-embedded FTs, ontwikkeling van cellulaire uitwassen al na twee dagen (Figuur 5). De in vitro fibrine gel wordt gebruikt als de matrix voor ex vivo cultuur, omdat het typeert de in vivo voorlopige ECM, gevormd na trombine splitsing van serum fibrinogeen op de sites van vasculaire lekkage, in direct contact met de lekkende PDR neovessels in de ontstoken fibrotische milieu15,21,22.
PDR is gekenmerkt door een angiogenic en fibrotische reacties microvasculaire complicaties, en de FT explantaten behouden dit cellulaire repertoire in cultuur, evenals efficiënt inspelen op de exogene prikkels aan de voedingsbodems11toegevoegd. De representatieve gegevens in Figuur 6 blijkt dat de PDR ex vivo culturen kiemen van de CD31-positieve endotheel en therapieën behoud in reactie op VEGFA geïnduceerde, terwijl TGFβ een fibrotische reactie weerspiegeld door de uitgroei veroorzaakte op Ng2-positieve pericytes/SMCs. Verscheidene exogene prikkels kunnen worden getest en, wanneer geïnformeerd door metingen van hun overvloed van in vivo vitreal, de hierin ontwikkelde PDR ex vivo cultuur model kan onthullen nieuwe communicatie en context afhankelijke PDR pathologische mechanismen die niet kunnen worden gevisualiseerd in vaste weefsel materiaal.
Figuur 1. Ex vivo PDR fibrovascular weefselkweek model. Schematische weergave van de workflow van de vitreoretinal chirurgie (pars plana Vitrectomie) voor de besnijdenis van de FT tot haar dissectie in explantaten en inbedding in fibrine voor driedimensionale karakterisering en ex vivo cultuur. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Vers weggesneden PDR fibrovascular weefsels vóór dissectie. Fase contast microfoto van vers verwijderde FTs genomen vóór dissectie. De FTs zijn zeer variabel in grootte, dichtheid en overvloed van vasculaire structuren. Pijlpunten geven vasculaire structuren van verschillende kaliber. De rode deels transparante lijn wijst op twee individuele vaartuigen van verschillende kaliber. De beelden werden genomen met behulp van een omgekeerde epifluorescence Microscoop met een 5 x 0,15 numerieke diafragma (nvt), de doelstelling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Geheel-mount immunofluorescentie van een inheemse fibrovascular weefsel van de PDR. Epifluorescence opname voor een native PDR FT gekleurd met geheel-mount immunofluorescentie. CD31 (A, groen) visualiseert het endotheel terwijl NG2 (B, rode) visualiseert de pericytes binnen de structuren van de onregelmatige neovascular. Samengevoegde afbeeldingen staan in (C). DAPI (blauw) counterstain visualiseert kernen. Het beeld werd genomen met behulp van een Microscoop rechtop epifluorescence met optische vectorafbeeldingsbestanden functie en gecombineerd met een computergestuurde 1.3 megapixel monochroom CCD camera en beeld acquisitie software, met behulp van een 40 x, 1.4 nb, olie doelstelling. Negen optische secties werden met behulp van beeld processing software ImageJ gecombineerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Geheel-mount immunofluorescentie van een inheemse fibrovascular weefsel van de PDR. Epifluorescence opname voor een native PDR FT gekleurd met geheel-mount immunofluorescentie. CD31 (A, groen) visualiseert het endotheel terwijl Lyve1 (B, rode) visualiseert de nieuw ontdekte lymfatisch-achtige endothelial structuren. Samengevoegde afbeeldingen staan in (C). Hoechst-33342 (blauw) counterstain visualiseert kernen. Het beeld werd genomen met behulp van een Microscoop rechtop epifluorescence met optische vectorafbeeldingsbestanden functie en gecombineerd met een computergestuurde 1.3 megapixel monochroom CCD camera en afbeelding acquisitie software, met behulp van een 20 x 0.8 nb, doelstelling. Vier optische onderdelen werden samengevoegd met behulp van beeld processing software ImageJ. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5. Ex vivo groei van de PDR fibrovascular weefsels. Fase contrast microfoto van twee FT ex vivo culturen op aangegeven tijd punten (dag). De FTs groeien op ex vivo cultuur, ontwikkeling van cellulaire uitwassen al na twee dagen. De beelden werden genomen met behulp van een omgekeerde epifluorescence Microscoop met een 5 x, 0,15 nb, doelstelling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6. Geheel-mount immunofluorescentie fibrovascular weefsels PDR gekweekte ex vivo onbehandeld (CTRL) of in aanwezigheid van VEGFA of TGFβ. Epifluorescence opname van FT gekweekte ex vivo onbehandeld (CTRL) of in aanwezigheid van VEGFA of TGFβ voor 9 dagen en vervolgens gekleurd met geheel-mount immunofluorescentie. CD31 (groen) visualiseert het endotheel terwijl NG2 (rood) de pericytes visualiseert. DAPI (blauw) counterstain visualiseert kernen. VEGFA gestabiliseerd de therapieën, terwijl TGFβ een fibrotische reactie veroorzaakte. De beelden werden genomen met behulp van een Microscoop rechtop epifluorescence met optische vectorafbeeldingsbestanden functie en gecombineerd met een computergestuurde 1.3 megapixel monochroom CCD camera en afbeelding acquisitie software, een 20 x 0.8 nb, streven naar betere coördinatie. Negen optische secties werden met behulp van beeld processing software ImageJ gecombineerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Video 1. wederopbouw van het 3D-volume van een inheemse FT gekleurd met geheel-mount immunofluorescentie. CD31 (groen), Lyve1 (rood). Hoechst-33342 counterstain (blauw) visualiseert kernen. Het beeld werd genomen met behulp van een Microscoop rechtop epifluorescence met optische vectorafbeeldingsbestanden functie en gecombineerd met een computergestuurde 1.3 megapixel monochroom CCD camera en afbeelding acquisitie software, met behulp van een 20 x 0.8 nb, doelstelling. Video rendering en 3D-volume wederopbouw werd uitgevoerd met behulp van een commerciële software. Een gedeelte van de video is herdrukt met toestemming van Gucciardo et al. 11. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gezien het belang van relevante weefsel communicatie voor betrouwbare functionele cel- en moleculaire mechanistische resultaten is het noodzakelijk om te vinden van de juiste experimentele modellen waarmee deze weefsel omgeving. De hierin beschreven ex vivo PDR cultuur model voor de FTs fibrine-embedded kan het onderzoek van de mechanismen van de PDR pathofysiologie in het kader van het inheemse, complexe en meercellige van de PDR klinische monsters.
Kritische stappen in het protocol zijn de juiste fibrine gel vorming, de positionering van de FT en adequaat wassen tijdens de kleuring. Omdat de vorming van fibrine gel is meestal afhankelijk van de activiteit van trombine, beïnvloed door de concentratie en de temperatuur, moet de hoeveelheid trombine worden aangepast voor elke batch van de voorbereiding van het gel van de fibrine. Fibrine gel vorming moet snel genoeg om te voorkomen dat 2D groei van de FT explantaten maar ook langzaam genoeg dat de positionering van de FT naar het midden van de druppels verticaal en horizontaal. In het geval dat de FT gebeurt te vinden aan de rand van de druppel, zou extra pipetteren helpen de plaatsing van de FT naar het midden. FTs die nog steeds aan de rand van de druppels of die groeien in 2D zal moeten worden uitgesloten. Voldoende wassen tijdens kleuring en het vermijden van drogen van de druppels zijn op hun beurt kritisch te optimaliseren kleuring en achtergrond signaal te minimaliseren. Overdrachtstijden kunnen ook van doorslaggevend belang. We hebben de FTs ingesloten omhoog tot twee uur na Vitrectomie en dit beïnvloedde niet de ex vivo groei. De impact van langere overdrachtstijden op het succes van de cultuur zou moeten worden getest.
Dit protocol kan worden gewijzigd met behulp van alternatieve matrices voor het insluiten van FT. In vivo de PDR neovessels groeien naar de glasvocht cortex rijk aan collageen23. Echter bij vasculaire lekkage serum componenten, met inbegrip van fibrinogeen, los in het glasvocht dicht bij de schepen waarbij het fibrotische antwoord wordt gestart. Daarom de in vitro fibrine clot werd gebruikt hier voor de ex vivo cultuur om de kenmerken van de voorlopige ECM vormden in de ontstoken fibrotische milieu van PDR15,21,22. Als alternatief, de fibrine stolsels kunnen aangevuld worden met laminin en fibronectine te wijzigen van de stabiliteit van het kiemen van de haarvaten, of de explantaten kon worden ingebed binnen controletype I, collageen en andere gemengde matrices om de kenmerken van de meest fibrotische microenvironments in neovascular weefsels. Deze matrices zijn over het algemeen geschikt voor 3D cultuur en geheel-mount immunofluorescentie maar de effecten daarvan op de PDR FTs blijven te beproeven en beschouwingen over de timing van 3D matrix formatie zal moeten worden gemaakt om te blijven binnen de grenzen voor het voorkomen van 2D groei18,19. Wanneer de fysieke nabijheid van de research unit naar het ziekenhuis een beperking voorstelt, zouden kunnen langere overdrachtstijden worden gecompenseerd met teamwerk; TA oplossing voorbereiding, fibrinogeen steriele-Filtertechniek en fibrine gel vorming testen kunnen worden uitgevoerd tijdens de overdracht van de FT. Als de fibrine gels geen zelfs na 1 uur vormen, zou kunnen een probleem met de fibrinogeen of TA oplossing voorbereiding hebben voorgedaan. In dit geval kunnen niet de FT/fibrine gels worden gebruikt.
Beperkingen van deze aanpak, zoals bij elke ex vivo benadering, zijn de variabele kwaliteit van primaire weefsel specimen over individuen evenals intra geduldig en inter patiënten weefsel heterogeniteit. In het geval van diabetische patiënten omvat een deel van deze variabiliteit de omvang van vascularisatie en fibrose die afhankelijk zijn van talrijke factoren zoals de duur van de ziekte, metabole conditie, genetische/epigenetische factoren, type van diabetes en systemische therapie. De grootte van de chirurgische PDR FT hersteld is ook een beperkende factor bij het bepalen van het aantal voorwaarden dat voor elk specimen kunnen worden onderzocht. Terwijl het verstrekken van wederzijdse ruimtelijke informatie, kan geheel-mount immunofluorescentie het onderzoek van slechts een beperkte hoeveelheid functies/merkpennen per druppel. Als een compromis, kunnen de druppels fibrine als alternatief worden ingesloten in paraffine, gesneden dunne secties en geanalyseerd met behulp van immunohistochemie.
Bestaande diabetische muis modellen ontwikkelen vele functies van vroeg stadium DR maar niet uitvoerig recapituleren de geleidelijke veranderingen in menselijke PDR, dus het belemmeren van de studies van de PDR ziekte mechanismen7,8. Bovendien, het lymfkliertest oog is fundamenteel verschillend van het menselijk oog, in die zin dat het ontbreekt aan de macula, verder wijzend op het belang van het bestuderen van de ziekte bij de mens-24. De chirurgische PDR FTs eerder ofwel zijn ongedaan gemaakt, of gebruikt voor paraffine secties, transmissie-elektronenmicroscopie, seriële blok gezicht-scanning elektronenmicroscopie, bulk RNA sequencing of 2D cultuur van gedissocieerde cellen3,25 . De hierin beschreven model kunt u de 3D karakterisering van dit kostbare chirurgisch materiaal, en het onderzoek van pathofysiologie van de PDR in de inheemse zieke weefsel communicatie. Wanneer gecombineerd met het gebruik van glasvocht vloeistof, kan dit model ook het onderzoek van de bijdrage van zowel de cellulaire en Acellulair PDR-communicatie. Aangezien de culturen reageren efficiënt tot groeifactoren gedetecteerd in het glasvocht, zoals VEGFA, bFGF, is VEGFC en TGFβ, dus Recapitulerend kenmerken van PDR pathofysiologie, deze PDR ex vivo cultuur model vatbaar voor het testen of ontwikkelen van nieuwe behandelingen van de PDR 11. in dit model, anti-VEGFA voorkomen dat capillaire kiemen en geïnduceerde tekenen van capillaire regressie, antwoorden die met het verwachte klinische resultaten van anti-VEGFA behandeling26,27 stroken. Dit model kan daarom ook worden gebruikt om beter inzicht te krijgen in de gevolgen van de huidige therapieën, met inbegrip van anti-VEGFA en corticosteroïd behandelingen.
Met live-cel imaging instrumentatie, de hierin beschreven ex vivo cultuur model kan onderhevig zijn aan time-lapse microscopie om real-time onderzoek van processen zoals vasculaire regressie, gekiemde en cellulaire plasticiteit. Wanneer gecombineerd met in vitro en in vivo modellen, evenals klinische gegevens, dit ex vivo PDR model zal helpen bij het onderzoek van de patiënt reacties op basis van bepaalde soorten markeringen te identificeren, een stap dichter naar de avenue voor gepersonaliseerde geneeskunde. Het identificeren van patiënt-specifieke reacties en/of reactie-specifieke markeringen is vooral relevant in het geval van PDR, oftewel een multifactoriële aandoening met een complex samenspel van microvasculaire, neurodegeneratieve, metabole, genetische/epigenetische, immunologische en ontsteking-gerelateerde factoren, waarvoor derhalve een steeds meer multidisciplinair inspanningen voor de ontwikkeling van verbeterde therapeutische targeting en ziekte management. Naast geheel-mount immunofluorescentie analyseert de ex vivo gekweekte FTs kunnen ook worden opgehaald uit de fibrine door Plasmine/nattokinase behandeling en onderworpen aan transcriptomic en Proteoom28. De geschiktheid van de hierin beschreven model voor ex vivo studies van fibrovascular weefsels ontwikkeld in andere oogbeschadigingen en/of omstandigheden, zoals in ernstige gevallen van sikkelcel retinopathie, kon ook in de toekomst worden onderzocht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs zijn heel dankbaar dat hij de medische en chirurgische netvlies collega's, de verpleegkundigen en de hele staf van de diabetische eenheid en Vitreoretinal chirurgie eenheid op het departement van oogheelkunde, Helsinki University Hospital voor actief deelnemen aan de aanwerving van patiënten. Wij danken Biomedicum Molecular Imaging eenheid voor imaging faciliteiten. Wij danken Anastasiya Chernenko voor uitstekende technische bijstand. Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Academie van Finland (KL), Universiteit van Helsinki (KL), Sigrid Juselius Foundation (KL), K. Albin Johansson Foundation (KL), Fins kanker instituut (KL), Karolinska Institutet (KL), Finse Eye Foundation (SL), Eye en Weefsel Bank Foundation (SL), Mary en Georg C. Ehrnrooth Foundation (SL) en HUCH klinische Research Grants (TYH2018127 na TYH2016230, SL), Diabetes Research Foundation (SL, KL, AK, EG), alsmede het doctoraatsprogramma in biogeneeskunde (EG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Microforceps | Medicon | 07.60.03 | Used for handling the FTs |
| Disposable Scalpels - Sterile | Swann-Morton | 0513 | Used for FT dissection |
| Culture dish, vented, 28 ml (60mm) | Greiner Bio-One | 391-3210 | Used for dissection and for testing fibrin gel formation |
| Cell culture plates, 12-well | Greiner Bio-One | 392-0049 | Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL | Greiner Bio-One | 391-3477 | |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL | Greiner Bio-One | 525-0384 | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF | Millipore | SLGV033RS | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Syringe, 10 mL | Braun | 4606108V | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Fisher | FB74031 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well | Nunc | 142475 | Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture |
| Cell culture plates, 96-well, U-bottom | Greiner Bio-One | 392-0019 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Coverslips 22x22mm #1 | Menzel/Fisher | 15727582 | Used for mounting |
| Microscope slides | Fisher | Kindler K102 | Used for mounting |
| Absorbent paper | VWR | 115-0202 | Used for mounting |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | Used for preparing 1x PBS |
| Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Calbiochem | 341578 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H9394-500ML | Used for preparing the fibrinogen and TA solution |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | Used for preparing the blocking solution |
| Human Serum | Sigma-Aldrich | H4522 | Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media |
| Gentamicin Sulfate 10mg/ml | Biowest | L0011-100 | |
| Endothelial cell media MV Kit | Promocell | C-22120 | Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement, 500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-2.5L-M | Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | T9284 | Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. |
| Hoechst 33342, 20mM | Life Technologies | 62249 | For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Eukitt Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 03989-100ml | TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | T9549-500UN | Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder | Sigma | A3428 | Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth factors | |||
| Recombinant human VEGFA | R&D Systems | 293-VE-010 | 50 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human VEGFC | R&D Systems | 752-VC-025 | 200 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human TGFβ | Millipore | GF346 | 1 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human bFGF | Millipore | 01-106 | 50 ng/ mL final concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary antibodies | |||
| CD31 (JC70A) | Dako | M0823 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD34 (QBEND10) | Dako | M716501-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD45 (2B11+PD7/26) | Dako | M070129-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD68 | ImmunoWay | RLM3161 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| Cleaved caspase-3 (5A1E) | Cell Signalling | 9664 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| ERG (EP111) | Dako | M731429-2 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| GFAP | Dako | Z0334 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Ki67 | Leica Microsystems | NCL-Ki67p | Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Lyve1 | R&D Systems | AF2089 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab |
| NG2 | Millipore | AB5320 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Prox1 | ReliaTech | 102-PA32 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab |
| Prox1 | R&D Systems | AF2727 | Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab |
| VEGFR3 (9D9F9) | Millipore | MAB3757 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| α-SMA (1A4) | Sigma | C6198 | Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG | Life Technologies | A-21202 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-11012 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG | Thermo Scientific | A-11057 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG | Thermo Scientific | A-11036 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG | Molecular Probes | A-21468 | Used at 1:500 dilution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope | Zeiss | For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT | |
| SZX9 upright dissection stereomicroscope | Olympus | For FT dissection | |
| LSM 780 confocal microscope | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT | |
| AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT |
References
- Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Liew, G., Wong, V. W., Ho, I. V. Mini Review: Changes in the Incidence of and Progression to Proliferative and Sight-Threatening Diabetic Retinopathy Over the Last 30 Years. Ophthalmic Epidemiology. 24 (2), 73-80 (2017).
- Loukovaara, S., et al. Indications of lymphatic endothelial differentiation and endothelial progenitor cell activation in the pathology of proliferative diabetic retinopathy. Acta Ophthalmologica. 93 (6), 512-523 (2015).
- Stitt, A. W., et al. The progress in understanding and treatment of diabetic retinopathy. Progress in Retinal and Eye Research. 51, 156-186 (2016).
- Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies. JCI Insight. 2 (14), (2017).
- Gross, J. G., et al. Five-Year Outcomes of Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial. JAMA Ophthalmology. 136 (10), 1138-1148 (2018).
- Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Disease Models, Mechanisms. 5 (4), 444-456 (2012).
- Villacampa, P., Haurigot, V., Bosch, F. Proliferative retinopathies: animal models and therapeutic opportunities. Current Neurovascular Research. 12 (2), 189-198 (2015).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models, Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
- Sharma, T., et al. Surgical treatment for diabetic vitreoretinal diseases: a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 44 (4), 340-354 (2016).
- Gucciardo, E., et al. The microenvironment of proliferative diabetic retinopathy supports lymphatic neovascularization. The Journal of Pathology. 245 (2), 172-185 (2018).
- Rezzola, S., et al. 3D endothelial cell spheroid/human vitreous humor assay for the characterization of anti-angiogenic inhibitors for the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Angiogenesis. 20 (4), 629-640 (2017).
- Pepper, M. S., Montesano, R., Mandriota, S. J., Orci, L., Vassalli, J. D. Angiogenesis: a paradigm for balanced extracellular proteolysis during cell migration and morphogenesis. Enzyme, Protein. 49 (1-3), 138-162 (1996).
- Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs). Journal of Cell Science. 115 (Pt 17), 3427-3438 (2002).
- Loukovaara, S., et al. Quantitative Proteomics Analysis of Vitreous Humor from Diabetic Retinopathy Patients. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5131-5143 (2015).
- Abu El-Asrar, A. M., Struyf, S., Opdenakker, G., Van Damme, J., Geboes, K. Expression of stem cell factor/c-kit signaling pathway components in diabetic fibrovascular epiretinal membranes. Molecular Vision. 16, 1098-1107 (2010).
- Loukovaara, S., et al. Ang-2 upregulation correlates with increased levels of MMP-9, VEGF, EPO and TGFbeta1 in diabetic eyes undergoing vitrectomy. Acta Ophthalmologica. 91 (6), 531-539 (2013).
- Sugiyama, N., et al. EphA2 cleavage by MT1-MMP triggers single cancer cell invasion via homotypic cell repulsion. Journal of Cell Biology. 201 (3), 467-484 (2013).
- Tatti, O., et al. MMP16 Mediates a Proteolytic Switch to Promote Cell-Cell Adhesion, Collagen Alignment, and Lymphatic Invasion in Melanoma. Cancer Research. 75 (10), 2083-2094 (2015).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
- Senger, D. R. Molecular framework for angiogenesis: a complex web of interactions between extravasated plasma proteins and endothelial cell proteins induced by angiogenic cytokines. American Journal of Pathology. 149 (1), 1-7 (1996).
- Senger, D. R., Davis, G. E. Angiogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (8), a005090 (2011).
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
- Marmorstein, A. D., Marmorstein, L. Y. The challenge of modeling macular degeneration in mice. Trends in Genetics. 23 (5), 225-231 (2007).
- Kim, L. A., et al. Characterization of cells from patient-derived fibrovascular membranes in proliferative diabetic retinopathy. Molecular Vision. 21, 673-687 (2015).
- Avery, R. L., et al. Intravitreal bevacizumab (Avastin) in the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Ophthalmology. 113 (10), e1691-e1615 (2006).
- Zhao, L. Q., Zhu, H., Zhao, P. Q., Hu, Y. Q. A systematic review and meta-analysis of clinical outcomes of vitrectomy with or without intravitreal bevacizumab pretreatment for severe diabetic retinopathy. The British Journal of Ophthalmology. 95 (9), 1216-1222 (2011).
- Carrion, B., Janson, I. A., Kong, Y. P., Putnam, A. J. A safe and efficient method to retrieve mesenchymal stem cells from three-dimensional fibrin gels. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (3), 252-263 (2014).
