Summary
ここでは、三次元のネイティブの組織特性と ex vivo 文化患者由来, 外科的切除, 線組織を用いて増殖糖尿病網膜症の病態を検討するためのプロトコルを提案する.Ex vivo 文化モデルこれはテストや新しい治療法の開発の影響を受けやすいです。
Abstract
糖尿病性網膜症 (DR) は糖尿病の最も一般的な微小血管合併症と労働年齢の成人の失明の原因は有数。糖尿病と酸素誘起性網膜症モデル動物で現在は人間増殖糖尿病網膜症 (ラオス) に表わされたフルレンジの進歩的な変更を開発ないです。したがって、病気の発症や病態の理解は、組織切片と関与する病原因子に関する定常状態情報しか提供アプローチで硝子体のサンプルの使用に大きく頼っています。増加する証拠ことを示す動的細胞との三次元 (3 D) 微小において細胞-細胞外マトリックス (ECM) 相互作用の発展に向けた機構と機能の解明に不可欠な新しい治療戦略。したがって、我々 は確実にこの破壊的な疾患の分子・細胞メカニズムを解明するため、臨床の小説の可能性をテストするためにラオスで目から外科的切除病理線組織を利用できることを仮説介入。この終わりに向かって、手法の開発 3 D の ex vivo 文化外科的切除患者由来線組織 (フィート)、人間のラオス病態の関連するモデルとなります。FTs を植に切除し、ex vivo 文化と 3 D 特性のフィブリン マトリックスに埋め込まれました。ネイティブ FTs と終点文化全体マウントを蛍光抗体法により組織組成との発見の関連機能については 3 D の組織レベルの特性の重要性を強調、多細胞プロセスの徹底的な調査ラオスの病態生理。このモデルは、ラオスの組織構造と微小環境内にあるダイナミックな生化学的および物理的な相互作用の複雑なコンテキストでの分子機構、細胞・組織プロセスおよび治療応答の同時評価になります。以来、このモデルでは、ラオスの病態生理を繰り返す、それはまたテストや新しい治療法の開発に従うことが。
Introduction
DR は最後の三十年1の巨大な割合に達している疾患、糖尿病の重篤な眼合併症です。20 年後に診断、1 型糖尿病性網膜症、糖尿病自体1 つのリードを作るのタイプ 2 糖尿病存在徴候の患者の 60% とほぼすべての患者は年齢大人2の作業で失明の原因します。微小血管変性症と虚血性損傷のレベルにあわせて博士は、非増殖性博士 (非ラオス) と増殖博士 (ラオス) に分類されます。ラオス、末期疾患は、虚血、炎症による新生血管、網膜硝子体界面における線維応答が特徴です。未処理の状態でこれらのプロセス、硝子体出血、網膜線維化、伝達の網膜剥離、血管新生緑内障3,4による失明の予防に します。最近の進歩にもかかわらず現在の治療法の選択肢は唯一博士の段階、網膜の損傷が既に続いたとき糖尿病黄斑浮腫とラオスなどを対象します。また、DR 患者の大きい割合を改善療法4,5,6の緊急の必要性を示す現在の治療道具からメリットはありません。
日付、する他の複数の私n vivo 病/発達モデルと糖尿病モデル動物が開発されましたが、それらのどれもが人間ラオス7、8にみられる病理学的機能のフルレンジを繰り返します。また、増加する証拠には、治療反応が ECM 成分9細胞および無細胞性微小環境との相互作用、空間的な整理にしっかりと接続されていることを示します。我々 は、したがって、ラオス10の外科的管理の一環として硝子体手術を受けて目から切除は一般的 FT 病理材料を用いた人間のラオスの臨床的に関連するモデルの開発に着手します。
この原稿では、ex vivo 文化 3 D のプロトコル、および、手術・切除、ラオスの評価患者派生した病理学的フィート。ここで説明する方法は、ネイティブ 3 D ラオス組織風景の成功した解体・新生異常線維応答などラオス病態の特徴のまとめを示した最近の出版物で使用されています血管構造11。このモデルでは、評価すること容易に薄い組織切片からなど空間的斬新な機能限定アポトーシスと増殖と血管膵島形成11も明らかにしました。硝子体液は、血管新生、潜在的なを評価する 3 D の内皮細胞スフェロイド文化と angiostatic 分子12の有効性に関する他の人が正常に使用されています。我々 のモデルが両方水溶性 vitreal の貢献要因とする新生血管組織内だけでなく、地元の手がかりを明らかに、生体外で3 D リンパ内皮細胞 (LEC) 回転楕円体の刺激剤としてラオス硝子を使用してアッセイを発芽と組み合わせると、ラオス病態3,11まだかり LEC 関与。網膜硝子体手術は、ラオスの管理、定期的に実行まだ挑戦的な手順です。手術機器や技術は、連続的な進歩および洗練を見ている、線増殖試験片の除去をタイムリーかつ保守的なビジョン転帰は改善するだけでなく、また組織の非常に貴重な資料を提供します、ライブの人間組織微小環境の複雑な医療面でラオスの病態と治療反応の調査。
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Protocol
この研究は、制度検討委員会とヘルシンキ大学病院の倫理委員会によって承認されました。署名インフォームド コンセントは、患者から得られました。
1. ソリューション、メディアと装置の準備
- 迅速な処理を保証する線組織 (フィート) のコレクションの前に次の機器を準備します。
- 無菌オートクレーブ 2 レーザーマイクロダイ セクション ピンセット。
- 1 あらかじめ重量を量られた PBS タブレット (0.14 M NaCl、0.0027 M KCl、0.010 M PO4-3) 900 ml の脱イオン水と溶解する攪拌を溶解することにより、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) × 1 を準備します。1 L とオートクレーブ滅菌の準備ができてソリューションまで水の量を調整します。室温ストア
- 上記ソリューションと単回使用の滅菌メス、6 cm のセルを無菌培養皿 5 無菌 12 ウェルの細胞培養皿と、バスケットの機器を収集します。
- HBSS、37 ° c、1 時間、少なくとも水のお風呂に浸漬 50 mL のチューブを使用しての 5 mL にプラスミノーゲン枯渇フィブリノゲンの 30 mg を溶解することによりフィブリノーゲン ソリューションのハンクス平衡塩ソリューション (HBSS) 6 mg/mL を準備します。
注: このソリューションは 7 時間 (最大 10 h) 水浴 (37 ° C) で使用する前に保存できます。 - Ex の準備 5% 牛胎児血清 (FCS) や 5% 人血、0.4% 血管内皮細胞用増殖サプリメント 10 ng/mL 組換えひと上皮成長因子、1 μ g/mL ヒドロコルチゾン、市販に 50 μ g/mL ゲンタマイシンを追加することで生体内培養培地内皮細胞成長培地と使用までの 37 ° C で水のお風呂にしてください。1 ヶ月最大 4 ° C で保存します。
2. 線組織切離
- 23 または 20 ゲージ 3 ポート時ラオスの網膜硝子体手術の一環として、トランス結膜時網膜硝子体手術を受ける被験者から摘出された線組織 (フィート) を収集します。
注: FT はセグメンテーションとはく離、経験豊富な網膜硝子体の外科医によって必要な刀、眼の端を握る microforceps を硝子体腔から削除された場合のカットを使用して摘出しました。細心の注意は、病的血管新生組織が最もよくある一時的な血管アーケードである視神経など眼球の構造を損なうことがなくそのまま、無傷のフィートを削除する必要があります。摘出組織のサイズは可変です、通常 3 と 50 mm2の間で及ぶ。 - 6 cm 細胞培養ディッシュまたはウェット氷上に置いた滅菌 PBS の 1 mL を含む 1.5 mL チューブで FT を維持し、研究所処理のためにすぐにそれを転送します。
注意:、研究ユニット (研究施設) が物理的に近くにあります病院手術室 (OR) 小さな摘出 FT の転送時間を最小限に抑えることが重要です。この場合転送は 5 分未満、茎頂に埋め込まれたフィブリン通常 1 〜 1.5 時間 (最大 2 時間) で摘出後。三次元培養に転送時間が長く影響をテストする必要があります。 - 室温 (RT、25 ° C) で 1 mL の PBS を含む 6 cm 細胞培養ディッシュ内 FT に置き 5 × 対物を用いた逆落射蛍光顕微鏡組織の画像を取得します。
注: 画像は、定性的な評価およびドキュメント取得されます。それはティッシュのサイズ、密度および一般成分 (例えば、血管構造) を観察することが可能になります。 - 生殖不能のメス、レーザーマイクロダイ セクション ピンセットを使用して直立した解剖顕微鏡の下で2枚 ~ 1 mm に FT を切ります。PBS、レーザーマイクロダイ セクション ピンセットを使用して場所に沈んでも、組織を保持し、滅菌メスによる明確なカットを実行します。これがネイティブの線構造に変更 FT を引き裂くことは避けてください。
- 1 mL の滅菌 PBS を含む 12 ウェルの細胞培養プレートのウェルにそれぞれの個々 の作品を配置します。
注: 必要な場合、カットを実行する前に、レーザーマイクロダイ セクション ピンセットを使用して、プレートの上にフィートを軽く広げ。
3. ネイティブ FT と Ex Vivo 文化の特性の直立したフィブリン ゲル液滴を鋳造
- 無菌フィルター ステップ 1.2 0.22 μ m フィルターで 10 mL のシリンジに取り付け、準備ができてフィブリノゲン溶液。
- ゲルの準備フィブリノゲン ソリューション (1.5 mL チューブあたり 25 μ L) で準備したフィブリンの因数の因数/郭清後に、得られるすべてのフィートの部分とフィブリンをテストのための余分な因数のカップル ゲル形成。
- トロンビンとアプロチニン、400 μ g/mL の 4 単位/ml を含む HBSS のソリューションの準備来世 TA ソリューションと呼ばれ、維持した準備で郭清後に得られた作品の数に応じて、必要な限り TA ソリューション (TA ソリューションの 25 μ L をそれぞれの使用はFT/fibrin ゲル)、および余分な量 (例えば250 μ L) フィブリンのゲル形成をテストして十分なソリューションがフィブリン ゲル液滴の鋳造を通して利用できることを保証します。
注: トロンビンはフィブリン重合に必要な FTs13,14によって表現される細胞のプロテアーゼによってフィブリン ゲルの劣化を防ぐためアプロチニンを追加している間。 - フィブリン ゲル形成のタイミングをテスト: 3.2 の手順で調製検体 25 μ L フィブリノゲン ソリューションに TA ソリューションの 25 μ L を追加し、50 μ L に設定別のピペットを使用して、ピペッティングによる管内ミックス 6 cm 細胞培養皿に分注、直立した液滴を形成します。
注: フィブリン ゲル形成で行われます 〜 1 分。1.5 分以上を要するよりトロンビン原液を追加することによって準備した 3.3 TA ソリューションでトロンビン濃度が上がります。トロンビン原液の最初使用のボリュームの 10 分の 1 を追加できます、繰り返し、1.5 分内フィブリン ゲル形成が発生するまで。フィブリン ゲル形成の時間は、文化の 3 つの次元の重要としてクイック ゲル (1.5 分) 以内の形成を防ぎますフィブリン ゲルの底に沈むし、細胞の 2 D プラスチック表面との接触から FT 作品培養プレートは、2 D の細胞接着と伸長につながることができます。 - 滅菌ピンセットを使用して 24 ウェル プレートの 1 つの井戸の中心に 1 つのフィートの部分を置き、FT に吸引力を避けるために 0.5-10 μ L ピペットでピペッティングして任意の余分な PBS を削除します。組織がピンセットに棒の場合、プレートの組織片の配置を支援するために追加のピンセットを使用します。
注: フィート/フィブリンは、試薬の使用量を削減する 48 ウェル プレートにもキャストできます。ただし、これは領域は制限されており、よく壁に接触する場合、フィブリンが広がっていくようより困難です。 - 3.2 の手順で検体 25 μ L のフィブリノゲン ソリューションに TA ソリューションの 25 μ L を追加し、ピペッティングにより管に 50 μ L ミックス別のピペットを使用して設定します。まあ、プレート上に配置フィート上に省略し、上下に 2-3 ピペット回 FT に 3 D 周囲のマトリックスを提供する、直立した液滴内で FT 作品を含めるために。
注:、FT はピペッティング時に吸引しないことと、空気の泡を形作らなかったことを確認します。混合、神の摂理とピペッティング実行されるようすぐに 1.5 分以内フィブリン ゲルを形成、3.4 の手順でテスト。48 ウェル プレートにフィブリンを鋳造がフィブリノゲン溶液 20 μ L と 20 μ L TA ソリューションの代わりに使用します。 - すべてのフィートの部分のため 3.5、3.6 の手順を繰り返します。
- 37 ° c 5% CO2加湿雰囲気で細胞文化のインキュベーターでプレートの孵化によって固めるためフィブリンを許可します。
- 0.5-1 後は完全に慎重にによって形成されるフィブリン ゲル h チェック傾斜プレートです。ゲルは移動しませんフィブリン ゲル形成が完了したことを示すプレートが傾いているとき、3.10 の手順に進みます。
- 100 μ g/mL アプロチニンを添加した生体内培養培地 (24 ウェル プレートで 600 μ L/ウェル) または 48 ウェル プレートで 300 μ L/ウェル ex で、FT/フィブリン ゲルをオーバーレイします。伝神の摂理によって媒体を優しくピペットします。
注: ここ、アプロチニン使用されるフィブリン ゲルの劣化を防ぐために FTs13,14によって表現される細胞のプロテアーゼによって。前のヴィヴォ培養培地はさらに VEGFA、VEGFC、bFGF、TGFβ などの遺伝子組み換え成長因子を補充する (参照材料表)11。 - 目的の期間 (例えば2-18 日期間は、テストする必要があります長い文化) の 37 ° C、5% CO2セル文化振興、文化に戻って生体内培養プレート ex フィートを配置します。媒体の 50% 新鮮な生体内培養培地 ex 3 日ごとに置き換えます。
4.「マトリックス」の画像
- 同じ日 (0 日) に ex vivo 文化フィートの画像を取得し、設定した間隔 (例えば、一日おき) で 3 D の成長に従うために逆落射蛍光顕微鏡を使用します。
注: 得られる画像は 2 つの垂直な直径の長さの合計として FT 副産物の定量化のため植11間で使用できます。
5. ネイティブ FT と Ex Vivo 文化終点
注: フィート/フィブリンが希望時間帯 (ex vivo 文化フィート) の体外培養またはネイティブ FT 解析11同じ日 (ネイティブ フィート) に固定します。
- 1 ml/PBS 溶液、室温 1 時間 4% パラホルムアルデヒドの培養液を置き換えることによってネイティブ フィートまたは ex vivo 文化フィートを修正します。ネイティブ FT/フィブリンの修正 0.5-1 の元の添加後 h 生体内培養液 (場合は、フィブリンない浸漬されている媒体、固定、それらを損傷)。
注: は、パラホルムアルデヒドは腐食性、有毒で発がん性発煙のフードでこの手順を実行します。 - PBS で 3 つの 5 分洗浄と FT/フィブリンをすすぎ (2 mL/よく)。
- 2 ml/0.02% アジ化ナトリウムを含む PBS の PBS を交換し、さらに処理まで 4 ° C で固定フィブリンを格納します。FT/フィブリンがストレージで乾かさないようにパラフィン フィルムでプレートをシールします。
注: は、アジ化ナトリウムは有毒な発煙のフードこの手順を実行します。
6. ホール マウント免疫組織染色法
注: このプロトコル 5 日間続き、夜通し孵化で中断することができますここで示されています。任意の時点でゲル乾燥フィブリンをてはいけないです。すべての手順は、特に明記しない限り、RT で行われます。
- 汚損のプロトコルを開始する前に、次のソリューションを準備します。
- ポスト固定ソリューション: アセトンとメタノールの同量を混合することによって 50: 50 アセトン: メタノール溶液を準備 (例えば、 50 mL)。-20 ° C にてストア最新染色前に、の日にこのソリューションを準備します。このソリューションは、-20 ° C で保存することができます、その後染色に使用します。
注: は、アセトン、メタノール、可燃性、健康に有害な発煙のフードでこのソリューションを準備します。 - 解決を妨げる: 準備、15% ウシ胎児血清 (FBS)、0.3% のオクチルは PBS での追加の最初の 15% でレート溶液をフェノール PBS に FBS。オクチル フェノール レートを追加し、溶解する攪拌します。4 ° C でのストア
注: このソリューションで用意できます大量前もって、-20 ° C で 15 mL aliquotes に格納され、汚損のプロトコルは開始した日に、使用する前に解凍。各汚損のプロトコルに作りたてまたは新鮮な解凍 aliquote を使用します。 - 洗浄ソリューション: 995.5 mL の PBS にオクチル フェノール レート 4.5 mL を追加して 0.45% オクチル フェノール レートを添加した PBS の 1 L を準備します。溶解する攪拌します。室温ストア
- ポスト固定ソリューション: アセトンとメタノールの同量を混合することによって 50: 50 アセトン: メタノール溶液を準備 (例えば、 50 mL)。-20 ° C にてストア最新染色前に、の日にこのソリューションを準備します。このソリューションは、-20 ° C で保存することができます、その後染色に使用します。
- ステンレス鋼正方形研がれたヘラを使って、プレートから慎重に液滴を持ち上げます。中心部を持ち上げる前に端から最初液滴をデタッチして、1 mL の PBS を含む 12 ウェル プレートのウェルに転送します。
注: は、このプレート形式のポスト固定、洗浄およびブロックの手順を実行します。 - (水滴の境界線が白になります) ~ 1 分冷たい 50: 50 アセトン: メタノール溶液の 1 mL を滴を修正後。
注: は、アセトンとメタノールが健康に有害な発煙のフードでこの手順を実行します。 - 2 mL の PBS (水滴は、補水が完了ときに PBS 溶液中シンクされます) で 3-5 洗浄ですすいでください。
注: は、ポスト固定後、プラスチックへの粘着にピペット チップ液滴は触れないでください。プロトコルを通して吸引後の修正、抗体、ブロックとこれが損傷したり、水滴を完全に破壊する、洗浄溶液を吸引、することは避けてください。代わりに、プレートを傾け、500 5,000 μ L ピペットを使用してソリューションを慎重に取り外します。 - 残骸を取除くために 21,000 x g と 4 ° C で 15 分間のブロッキング液を遠心します。
注: ソリューションは 1.5 mL 遠心チューブに検体することができます。未使用のソリューションは、4 ° C で保存し、関連する以降のすべての手順で使用できます。 - 500 μ L の液滴を孵化させなさい室温 2 時間のためのソリューションをブロック
注: ソリューションの使用ブロックの量を減らすためには、プレートを傾けることがサポートとソリューション/液滴として 300 μ L を使用ことができます。 - ブロッキング、および 21,000 × g で 15 分と 4 ° C、遠心分離で適切な希釈で一次抗体の混合物 (少なくとも 30 μ L/滴) を準備します。
- (U) ラウンドに液滴を転送-ラウンド エッジのヘラを使用して、96 ウェル プレートを下にし、少なくとも 30 μ L/4 ° C で一晩一次抗体の混合物の液滴と孵化
- 次の日、12 ウェルに水滴プレート含む 2 mL ソリューション/ウェルを洗浄の転送に 3 5 分すすぎ洗う最初とし、9 つの 30 分の洗浄。4 ° C で一晩最後の洗浄 (2 mL) を残す
- 次の日に 3 回を PBS で洗いし、(U) ラウンドに液滴を転送-96 ウェル プレートの下します。
- 洗浄中に準備ソリューションと 21,000 x g と 4 ° C で 15 分間遠心ブロックに適切な蛍光標識二次抗体混合物 (希釈 1: 500、少なくとも 30 μ L/滴)
- ラウンドに水滴を転送 (U)-丸角のヘラを使用して、96 ウェル プレートを底し、を光から保護、常温 4 時間の二次抗体の混合物の少なくとも 30 μ l インキュベートします。
注: は、すべての後続の孵化および洗浄のステップ ライトから保護を実行します。 - 2 mL ソリューション/ウェル最初丸角のへらの 3 つの 5 分洗浄とリンスに使用して洗濯し、4 つの 30 分の洗浄を含む 12 ウェル プレートに水滴を転送します。4 ° C で一晩最後の洗浄 (2 mL) を残す
- 次の日に 5 つの 30 分の洗浄とゲルおよび PBS で、3 回をすすいでください。4 ° C で一晩最後の洗浄 (2 mL) を残す
- 次の日にラウンドに水滴を転送 (U)-10 G/ml ヘキスト核染色 (少なくとも 30 μ L/滴) で室温 30 分間インキュベートして丸角のヘラと対比染色の核を用いた 96 ウェル プレートを下
メモ: マウント 4 ' 培、6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) counterstaining 核の代わりに使用できます。その場合、この手順と手順 6.16 はスキップされます、ステップ 6.17 に直接進むこと。 - 丸角のへらを使用して PBS/井戸の 2 mL を含む 12 ウェル プレートに水滴を転送し、3 回を PBS で洗い。
- 顕微鏡スライド上に滴をマウントするには、次のとおり。
- 正方形 22 mm × 22 mm のカバーグラスのエッジに迅速な硬化剤の狭い層を適用し、〜 1 分乾燥させます。取付中の過度の硬化を避けるために個別に各ドロップのこの手順を実行します。
注: は、速硬性取付中は健康に有害な発煙のフードでこの手順を実行します。 - 2 mL の脱イオン水を含む 12 ウェル プレートのウェルに浸漬した液滴を洗い、丸角のへらを使用して、顕微鏡のスライドに転送。余分な水分を削除するには、吸水紙の小片を使用します。
- 液滴に非硬化 antifade 取付中の 15 μ L を分注します。
注: また、ヘキスト核染色が使用されていない場合マウント培 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 使用できます。 - 優しく、液滴に顕微鏡のスライドに直面してメディアをマウントする速硬性をカバー ガラスを配置し、解決。
注: クイック硬化中は顕微鏡のスライドに固執し、場所に液滴を保ちます。
- 正方形 22 mm × 22 mm のカバーグラスのエッジに迅速な硬化剤の狭い層を適用し、〜 1 分乾燥させます。取付中の過度の硬化を避けるために個別に各ドロップのこの手順を実行します。
- すべての液滴の 6.17 のステップを繰り返します。顕微鏡スライドごとに 2 つの滴をマウントします。
- スライドの ~ 2 時間常温空気乾燥一晩 4 ° C で保存をしましょう。スライドが水平方向に配置され、光から保護されていることを確認します。
- ステンド グラスのネイティブ イメージまたは ex 光学セクショニング機能や 20 x 40 x 目的を搭載した垂直落射蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡を用いた生体内文化エンドポイント フィート。タイル関数を使用して、組織の大きい領域をすぐにキャプチャします。
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Representative Results
ラオス線組織プロパティおよび蛋白質の表現のより深い理解は、主に硝子体のサンプルと薄い組織フィート セクション3,15,16,17に頼っています。外科的に切除し, 活用する我々 は着手した 3 D 組織の徹底的な調査と、ラオスの多細胞の physiopathological プロセスの手法を開発するには、患者由来病理 FTs 3 D 評価と ex vivo 文化。新鮮な FTs が研究所に転送され、図 1に概略のワークフローで示すように処理されます。
FTs は、定性的な評価およびドキュメント (図 2) 郭清前にイメージングすることができます。図 2に示すとおり、FTs はサイズ、密度、血管構造の豊富な偉大な患者間の変化を表示します。いくつかの組織、バラセル、おそらく炎症性/免疫細胞や赤血球にも口径の異なる透水性の血管構造が簡単になることも (図 2) を区別しました。郭清後、決定は得られた植の制限数の下流の使用でなされる必要があります。外植片の部分はフィブリン マトリックスに埋め込まれ、残りの植は、ex vivo 文化別プレート (図 1) を受けることが、フィブリン ゲル形成後固定します。新鮮な FTs も利用されている正常に微細構造キャラクタリゼーションの電子顕微鏡法による。サンプルはどちらか処理超薄切片の従来の透過型電子顕微鏡 (TEM) または連続ブロック面走査電子顕微鏡観察 (SBF SEM)3,11することができます。
固定のフィブリンを数週間保存し、ホール マウント免疫蛍光18,19で染色できます。ステンド グラス サンプル、同様に暗闇の中で 4 ° C で保存する場合は安定しました。厚いフィート/フィブリンは、アウト フォーカスの散乱光を除去するために役立つ、光学断面機能を搭載した落射蛍光顕微鏡と時間効率的にイメージすることができます。このメソッドを用いたイメージングは、構造の良い可視化を提供します。また、共焦点の顕微鏡検査の細部の捕獲が許可することができますより時間厳しいが。特性、新鮮なフィブリン埋め込み、固定のホール マウント免疫組織によって、開墾されていないネイティブの FTs により、血管構造、複数セル型の 3 D のラオス組織内の相互配置の評価11をを風景します。たとえば、CD31 抗体を使用して血管内皮細胞を表示できます、Lyve1 抗体を視覚化新しく中ペリサイト (図 3) に表示する NG2 発見リンパのような内皮構造 (図 4)11。いくつかの構造および細胞型 (材料の表を参照) を視覚化する抗体の複数の組み合わせを使用できます。たとえば、エルグは、discontinuos 式のパターンは、異常なラオス新生微小血管内皮細胞を視覚化することも。膜マーカー (例えばCD31 と Lyve1) で染色血管構造は Angiotool、NIH 国立がん研究所11、によって開発された無料のソース ソフトウェアを使用して保存と密度の定量的分析すること 20。3 D ボリュームは、データセット得られた (ビデオ 1参照) からも表示できます。抗体をホール マウント免疫組織に適していない場合フィブリン滴またはパラフィンに埋め込まれた、薄片にカットでき免疫組織化学による分析します。この場合、液滴の恩恵室温 1 h の代わりに 4 ° C で一晩固定
前のヴィヴォ文化はフィブリンに埋め込まれた FTs、2 日 (図 5) 後既に細胞増生の開発の成長を支えています。マトリックス以来 ex vivo 文化を生体内で仮 ECM 象徴の形成後トロンビンで漏れのラオスの neovessels との直接接触での血管漏れのサイトで血清フィブリノーゲンの胸の谷間に体外フィブリン ゲルを使用、炎症線維化環境15,21,22。
ラオスは血管新生と線維応答によって特徴づけられる微小血管合併症、FT 植文化では、この細胞のレパートリーを保持し同様、文化メディア11に追加外因性の刺激に効率的に対応します。図 6に代表的なデータは、ラオスex vivo文化が TGFβ の副産物でリフレクションされた線維応答を誘導しながら VEGFA、に応えて CD31 陽性血管内皮細胞と血管系保全の発芽を誘導することを示しています。NG2 陽性ペリサイト/平滑筋細胞。いくつか外因性の刺激をテストすることができ、生体内で vitreal に多量の測定によるメッセージが表示されたら、ex vivo 文化モデル開発ここラオスできます解明新規微小環境とコンテキスト依存ラオス病理学的することはできません。固定ティッシュ材料に可視化。
図 1。前のヴィヴォラオス線培養モデル。植にその郭清と三次元解析と体外培養のフィブリンに埋め込みに FT の切除に網膜硝子体手術 (時) からワークフローの模式図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。新鮮な郭清の前にラオス線組織を切除します。解剖前に撮影した新鮮な摘出の FTs の相 contast 顕微鏡。FTs は、サイズ、密度と血管構造の豊かさで大きく変動。矢印は、異なる口径の血管の構造を示します。部分的に透明な赤色の線は、口径の異なる 2 つの個別容器を強調表示します。画像は、5 x、0.15 開口数 (NA)、目的と逆落射蛍光顕微鏡を使用して撮影されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。ホール マウント ネイティブ ラオス線組織の蛍光します。ネイティブの落射蛍光顕微鏡写真ラオス FT ホール マウント免疫組織染色。CD31 (Aグリーン) NG2 中血管内皮細胞を可視化する (B、赤) 不規則な新生血管構造の中で血管を可視化します。差し込み画像は、(C) に表示されます。対比染色 DAPI (青) では、核を可視化します。イメージは光学セクショニング機能垂直落射蛍光顕微鏡を使って撮影し、コンピューター制御 1.3 メガピクセル モノクロ CCD カメラと画像集録ソフトウェア、40 x、1.4 NA、オイルの目的を使用すると組み合わせます。画像処理ソフトウェア ImageJ を用いた光の 9 つのセクションに結合されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。ホール マウント ネイティブ ラオス線組織の蛍光します。ネイティブの落射蛍光顕微鏡写真ラオス FT ホール マウント免疫組織染色。CD31 (Aグリーン) Lyve1 中血管内皮細胞を可視化する (B、赤) が新たに発見されたリンパのような内皮構造を可視化します。差し込み画像は、(C) に表示されます。ヘキスト 33342 (青) 対比染色では、核を可視化します。イメージは光学セクショニング機能垂直落射蛍光顕微鏡を使用して撮影され、コンピューター制御 1.3 メガピクセル モノクロ CCD カメラと画像集録ソフトウェア、20 x、0.8 NA 目的を使用しています。画像処理ソフトウェア ImageJ を用いた光の 4 つのセクションに結合されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5。ラオス線組織の生体成長 ex.示された時点 (日) で 2 つの FT ex vivo 文化の位相コントラスト顕微鏡。FTs は、2 日後にすでに細胞増生を開発 ex vivo 文化に成長します。画像は、5 x、0.15 NA 目的と逆落射蛍光顕微鏡を使用して撮影されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6。ホール マウント ラオス線組織培養前のヴィヴォ未処理 (ctrl キー)、または VEGFA または TGFβ の存在下での蛍光抗体法。FT 9 日間前のヴィヴォ未処理 (ctrl キー) または VEGFA または TGFβ の存在下で培養し、その後ホール マウント免疫組織染色の落射蛍光顕微鏡像。CD31 (緑) は、血管内皮細胞を可視化する NG2 (赤) は、血管を可視化しながら。対比染色 DAPI (青) では、核を可視化します。VEGFA は、TGFβ は線維応答を誘導しながら血管系を安定化。画像は、光学セクショニング機能垂直落射蛍光顕微鏡を使用して撮影され、コンピューター制御 1.3 メガピクセル モノクロ CCD カメラと画像集録ソフトウェア、20 x、0.8 NA 目的を使用しています。画像処理ソフトウェア ImageJ を用いた光の 9 つのセクションに結合されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ビデオ 1 ネイティブの FT の 3 d ボリューム データの再構成ホール マウント免疫組織染色。 。CD31 (緑)、Lyve1 (赤)。ヘキスト 33342 対比染色 (青) では、核を可視化します。イメージは光学セクショニング機能垂直落射蛍光顕微鏡を使用して撮影され、コンピューター制御 1.3 メガピクセル モノクロ CCD カメラと画像集録ソフトウェア、20 x、0.8 NA 目的を使用しています。3 D ボリューム データの再構成とビデオのレンダリングは、商用ソフトウェアを用いて行われた.ビデオの部分は Gucciardoらから許可を得て転載します。11.してくださいこのビデオを見るにはこちらから。(右クリックしてダウンロード)
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Discussion
信頼性の高い機能を細胞・分子の機構の結果の関連性の高い組織微小環境の重要性を考慮したこの組織環境を提供する適切な実験モデルを見つけることが不可欠です。フィブリン埋め込み FTs のラオスここに記述された前のヴィヴォ文化モデルは、ラオスの臨床サンプルのネイティブ、複雑な多細胞のコンテキストでラオス病態のメカニズムの調査をできます。
プロトコルの中で重要なステップは、FT と染色中に適切な洗濯の位置、適切なフィブリン ゲル形成です。フィブリン ゲル形成は濃度と温度によって影響を受ける、トロンビン活性ほとんど決まるのでトロンビンの量はフィブリンのゲルの準備のバッチごとに調整する必要があります。フィブリン ゲル形成は FT 植の 2 D の成長を防ぐためにもゆっくりと垂直方向と水平方向に、水滴の中心にフィートの位置決めを許可するように十分に十分に速くする必要があります。FT 起こる液滴の端を検索する場合は、追加のピペッティング中心にフィートの配置を支援しました。液滴の端に残っているまたは 2 D で成長する FTs は、除外する必要があります。十分な染色と、回避中に洗浄液滴の乾燥は、ターンで染色を最適化し、バック グラウンド信号を最小化するために重要です。転送時間は重要な場合もあります。硝子体手術後の 2 時間を FTs が埋め込まれている我々 と ex は影響しませんでした生体成長。文化成功の長い転送時間の影響をテストする必要があります。
このプロトコルは、FT を埋め込むため代替の行列を使用して、変更でした。生体内で、ラオス neovessels 硝子体皮質に向かって豊かな成長コラーゲン23。ただし、フィブリノゲンを含む、血管漏れ血清成分に溶解する硝子体線維応答を開始という血管に近接。In vitro におけるフィブリン血栓を用いているため、ここで ex の仮の ECM を代表するために生体内文化をラオス15,21,22の炎症線維化環境の中で形成します。また、ラミニン、フィブロネクチン、毛細血管を発芽の安定性を変更すると、フィブリン血栓を補うことができるまたは外植片を埋め込むことができる内 I 型コラーゲンと他の混合行列で最も線維の微小を類型化するには新生血管組織。これらの行列は一般に三次元培養に適しているし、テストするも、ホール マウント免疫組織がラオス FTs に及ぼす 3 D マトリックス形成のタイミングについての考察は、2 D を防止するための制限内にとどまるために行われる必要があります。成長18,19。チームワークと転送時間が長くを償うことができる病院に研究ユニットの物理近接は、制限を表すときFT の転送中には、TA に調製した溶液、無菌 - フィブリノゲン、フィブリン ゲル形成テストを実行できます。1 時間後でさえも、フィブリンを形成しません、フィブリノーゲンや TA に調製した溶液で問題が発生した可能性があります。この場合、FT/フィブリンは使用できません。
このアプローチの限界ごとの ex と同様に生体内患者と患者間の組織の不均一性と同様に、個人間でのアプローチ、主組織標本の変数の品質。糖尿病患者の場合は、この可変性の一部には血管新生と線維化疾患、代謝の状態、遺伝的・後成的要因、糖尿病や全身療法の種類の期間のような多くの要因に依存しているの範囲が含まれています。回復手術ラオス FT のサイズはまた各試料に対する調査することができる条件の数を決定する際に制限要因です。相互の空間情報を提供しながらホール マウント免疫組織により液滴あたりの機能/マーカーの限られた量の調査ができます。妥協案としてフィブリン滴またはパラフィンに埋め込まれた、薄片にカットでき免疫組織化学による分析します。
既存の糖尿病マウス モデル初期博士の多くの機能を開発、総合的に人間ラオス、ラオス疾患メカニズム7,8の研究を妨げてで発生する進歩的な変更を要約するが失敗します。また、さらにひと疾患24を調査する重要性を強調し、黄斑を欠いているという点で、ネズミ目は人間の目から根本的に異なる。手術のラオス FTs はどちらか破棄されて以前、または RNA シーケンスまたは解離細胞3,25 の二次元文化シリアル ブロック面走査電子顕微鏡、透過型電子顕微鏡パラフィン セクション使用、一括.ここに記述されたモデルでは、ネイティブの罹病組織微小環境でこの貴重な手術材料の 3 D の特性だけでなく、ラオスの病態の検討をできます。硝子体液の使用と組み合わせると、このモデルは細胞および無細胞ラオス環境の両方の貢献の調査も可能です。文化対応を効率的に bFGF、硝子体、VEGFA などで検出された成長因子 VEGFC と TGFβ、従って ex vivo 文化モデルこのラオス ラオス病態の特徴を概説はテストや治療法を中心に新しいの開発の影響を受けやすい11です。 このモデルで抗 VEGFA キャピラリー発芽を防止、キャピラリー回帰の兆し、反 VEGFA 治療26,27の期待される臨床成果と一致している応答を誘発します。したがって、このモデルより良い抗 VEGFA とステロイド治療を含む、現在の治療法の効果を理解するため使用もできます。
生細胞イメージング計測のため、ここに記述されたと前のヴィヴォ文化モデルの血管回帰、発芽と細胞の可塑性などのプロセスの実時間観察を許可する微速度顕微鏡観察を受けることができます。臨床データと同様に、in vitro および in vivo モデルと組み合わせることにより、ex vivo PDR モデルこれはマーカーを識別する特定のセットに基づいて患者の応答を調査に役立つ、一歩の通りにカスタマイズ ・医学。患者固有の応答および/または応答特定のマーカーを識別する、血管の複雑な相互作用と多因子疾患であるラオスの場合特に関連神経変性、代謝、遺伝的・後成的、免疫学的、および炎症関連要因、従って治療ターゲットと疾患管理の向上の開発にますます学際的な努力を必要とします。ホール マウント免疫組織のほか生体内培養 FTs、ナットウキナーゼのプラスミン/処理によるフィブリンから取得・ トランスクリプトーム ・ プロテオームを受ける可能性があります元は28を分析します。鎌状赤血球網膜症の重症例でなど、他の眼の条件で開発線組織の生体を ex のためここに記述されたモデルの適合性は、将来的にも検討できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は医療および外科手術網膜同僚、看護師、糖尿病単位の募集に積極的に参加するためヘルシンキ大学病院眼科で網膜硝子体手術ユニット全体のスタッフに最も感謝しています患者。イメージング施設ありがとう Biomedicum 分子イメージング ユニット。私たちは優れたテクニカル サポート アナスタシヤ チェルネンコを感謝します。本研究は、フィンランド アカデミー (KL)、ヘルシンキ大学 (KL)、ねんどろいど Juselius 財団 (KL)、K. アルビン ・ ヨハンソン財団 (KL)、フィンランドがん研究所 (KL)、カロリンスカ研究所 (KL)、フィンランド目財団 (SL)、目からの補助金によって支えられた、組織銀行財団 (SL)、マリアとゲオルク ・ c. Ehrnrooth 財団 (SL) とも臨床研究助成 (TYH2018127 TYH2016230、SL 後)、生物医学 (EG) の博士課程のプログラムと同様、糖尿病研究財団 (SL、KL、AK、例えば)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Microforceps | Medicon | 07.60.03 | Used for handling the FTs |
| Disposable Scalpels - Sterile | Swann-Morton | 0513 | Used for FT dissection |
| Culture dish, vented, 28 ml (60mm) | Greiner Bio-One | 391-3210 | Used for dissection and for testing fibrin gel formation |
| Cell culture plates, 12-well | Greiner Bio-One | 392-0049 | Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL | Greiner Bio-One | 391-3477 | |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL | Greiner Bio-One | 525-0384 | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF | Millipore | SLGV033RS | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Syringe, 10 mL | Braun | 4606108V | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Fisher | FB74031 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well | Nunc | 142475 | Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture |
| Cell culture plates, 96-well, U-bottom | Greiner Bio-One | 392-0019 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Coverslips 22x22mm #1 | Menzel/Fisher | 15727582 | Used for mounting |
| Microscope slides | Fisher | Kindler K102 | Used for mounting |
| Absorbent paper | VWR | 115-0202 | Used for mounting |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | Used for preparing 1x PBS |
| Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Calbiochem | 341578 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H9394-500ML | Used for preparing the fibrinogen and TA solution |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | Used for preparing the blocking solution |
| Human Serum | Sigma-Aldrich | H4522 | Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media |
| Gentamicin Sulfate 10mg/ml | Biowest | L0011-100 | |
| Endothelial cell media MV Kit | Promocell | C-22120 | Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement, 500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-2.5L-M | Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | T9284 | Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. |
| Hoechst 33342, 20mM | Life Technologies | 62249 | For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Eukitt Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 03989-100ml | TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | T9549-500UN | Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder | Sigma | A3428 | Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth factors | |||
| Recombinant human VEGFA | R&D Systems | 293-VE-010 | 50 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human VEGFC | R&D Systems | 752-VC-025 | 200 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human TGFβ | Millipore | GF346 | 1 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human bFGF | Millipore | 01-106 | 50 ng/ mL final concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary antibodies | |||
| CD31 (JC70A) | Dako | M0823 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD34 (QBEND10) | Dako | M716501-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD45 (2B11+PD7/26) | Dako | M070129-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD68 | ImmunoWay | RLM3161 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| Cleaved caspase-3 (5A1E) | Cell Signalling | 9664 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| ERG (EP111) | Dako | M731429-2 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| GFAP | Dako | Z0334 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Ki67 | Leica Microsystems | NCL-Ki67p | Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Lyve1 | R&D Systems | AF2089 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab |
| NG2 | Millipore | AB5320 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Prox1 | ReliaTech | 102-PA32 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab |
| Prox1 | R&D Systems | AF2727 | Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab |
| VEGFR3 (9D9F9) | Millipore | MAB3757 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| α-SMA (1A4) | Sigma | C6198 | Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG | Life Technologies | A-21202 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-11012 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG | Thermo Scientific | A-11057 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG | Thermo Scientific | A-11036 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG | Molecular Probes | A-21468 | Used at 1:500 dilution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope | Zeiss | For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT | |
| SZX9 upright dissection stereomicroscope | Olympus | For FT dissection | |
| LSM 780 confocal microscope | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT | |
| AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT |
References
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