Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Ett Ex Vivo vävnadsodling modell för fibrovaskulär komplikationer i proliferativ diabetesretinopati

Published: January 25, 2019 doi: 10.3791/59090

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att studera patofysiologin av proliferativ diabetesretinopati med patientderiverade, kirurgiskt utskurna, fibrovaskulär vävnader för tredimensionella infödda karakterisering och ex vivo vävnadskultur. Detta ex vivo kultur modell är också mottaglig för att testa eller utveckla nya behandlingar.

Abstract

Diabetesretinopati (DR) är den vanligaste mikrovaskulära komplikationen av diabetes och en av ledande orsakerna till blindhet i arbetsföra vuxna. Ingen aktuell djurmodeller för diabetes och syre-inducerad retinopati utveckla fullrange-progressiva förändringar manifesteras i mänskliga proliferativ diabetesretinopati (PDR). Därför har förståelse för sjukdomspatogenes och patofysiologi åberopat i hög grad användningen av histologiska sektioner och glaskroppen prover i metoder som endast ger steady state information om de inblandade patogena faktorerna. Ökande bevis indikerar att dynamiska cell-cell och cell-extracellulär matrix (ECM) interaktioner inom ramen av tredimensionella (3D) mikromiljö är väsentliga för de mekanistiska och funktionella studierna mot utvecklingen av nya behandlingsstrategier. Därför hypotesen vi att den patologiska fibrovaskulär vävnaden kirurgiskt utskurna från ögonen med PDR kunde utnyttjas tillförlitligt nysta de cellulära och molekylära mekanismerna av denna förödande sjukdom och att testa potentialen för romanen kliniska interventioner. Mot detta syfte utvecklat vi en ny metod för 3D ex vivo kultur kirurgiskt utskurna patientderiverade fibrovaskulär vävnad (FT), som kommer att utgöra en relevant modell av mänskliga PDR patofysiologi. FTs är dissekeras i bladsticklingar och inbäddade i fibrin matris för ex vivo kultur och 3D karakterisering. Hela-mount immunofluorescens infödda FTs och slutpunkten kulturer gör grundlig utredning av vävnadssammansättning och flercelliga processer, belysa vikten av 3D vävnad-nivå karakterisering för avtäckning relevanta inslagen i PDR patofysiologi. Denna modell tillåter samtidiga bedömningen av molekylära mekanismer, cellulär/vävnad processer och behandlingssvar i komplexa samband med dynamisk biokemiska och fysiska interaktioner inom PDR vävnad arkitektur och mikromiljö. Eftersom denna modell recapitulates PDR patofysiologi, kommer det också vara mottaglig för att testa eller utveckla nya behandlingar.

Introduction

DR är en allvarlig okulär komplikation av diabetes, en sjukdom som har nått enorma proportioner i de senaste tre decennierna1. Tjugo år efter diagnos, praktiskt taget varje patient med typ 1-diabetes och 60% av patienter med typ 2-diabetes finns tecken på retinopati, att göra diabetes i sig. en av ledande orsakerna till blindhet i arbetar age vuxna2. Enligt nivån för mikrovaskulära degeneration och ischemisk skada indelas DR i icke-proliferativ DR (icke-PDR) och proliferativ DR (PDR). Slutstadiet sjukdomen, PDR, kännetecknas av ischemi - och inflammation-inducerad kärlnybildning och fibrotiska svar på vitreoretinala gränssnittet. I obehandlad villkor leder dessa processer till blindhet på grund av glaskroppshemorragi, retinal fibros, tractional näthinneavlossning och neovaskulära glaukom3,4. Trots senaste framsteg rikta nuvarande behandlingsalternativ endast DR stadier, inklusive Diabetiskt makulaödem och PDR, när skada på näthinnan har redan följde. Dessutom gynnar inte en stor del av DR patienter från nuvarande behandling Arsenal, som anger ett brådskande behov av förbättrade terapier4,5,6.

Flera andra jagn vivo sjukdom/utvecklingstoxicitet modeller och diabetiker djurmodeller har utvecklats hittills, men ingen av dem recapitulates hela skalan av patologiska funktioner hos mänskliga PDR7,8. Dessutom indikerar ökande bevis att behandlingssvar är tätt anslutna till ECM sammansättning och den rumsliga ordningen samt samspelet mellan den cellulära och acellulära mikromiljö9. Vi, därför anges för att utveckla en kliniskt relevant modell av mänskliga PDR genom att utnyttja det FT patologiska material som vanligen Bolts från ögon som genomgår vitrektomi som en del av den kirurgiska förvaltningen av PDR10.

Detta manuskript beskriver protokollet för 3D ex vivo kultur och karakterisering av de kirurgiskt-censurerade, PDR patientderiverade patologiska FT. Den metod som beskrivs här har använts i en ny publikation som visat framgångsrika dekonstruktion av infödda 3D PDR vävnad landskapet och rekapitulation av funktioner av PDR patofysiologi inklusive angiogena och fibrotiska reaktioner av det onormala vaskulära strukturer11. Denna modell har också avslöjat nya funktioner som inte kan enkelt uppskattas från histologiska tunnslip, såsom rumsligt begränsade apoptos och spridning samt vaskulär holme bildandet11. Glaskroppen vätska har använts framgångsrikt av andra på 3D endothelial sfäroid kulturer att utvärdera dess potentiella angiogena och effekten av angiostatiska molekyler12. Kombination med en in vitro- 3D lymfatiska endotelceller (LEC) sfäroid groning assay använder PDR glaskroppen som stimulerande, avslöjade vår modell bidrag både lösliga vitreal faktorer och lokala referenser inom neovaskulär vävnad till den som ännu dåligt förstådd LEC medverkan i PDR patofysiologi3,11. I förvaltningen av PDR är vitreoretinal kirurgi ett rutinmässigt utförda men utmanande förfarande. Som kirurgiska Instrumentation och tekniker ser fortlöpande befordran och förfining, lägligt och konservativa borttagning av fibrovaskulär proliferation exemplar förbättrar inte bara vision resultatet men ger också ovärderlig vävnadsmaterial för den utredning av PDR patofysiologi och behandling svaren i de komplexa translationella aspekterna av den levande mänsklig vävnad mikromiljö.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denna forskning godkändes av institutionella Review Board och etiska kommittén Helsingfors universitetssjukhus. Signerad informerat samtycke erhölls från varje patient.

1. beredning av lösningar, Media och utrustning

  1. Förbered följande utrustning före samlingen av fibrovaskulär vävnad (FT) att säkerställa snabb behandling.
    1. Steril-autoklav två lokalt pincett.
    2. Bered 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom upplösning 1 Pre vägde PBS tablett (0,14 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0,010 M PO4-3) i 900 mL avjoniserat vatten och rör att upplösa. Volymen vatten upp till 1 L och sterila-autoklav redo lösningen. Butiken på RT.
    3. Samla de ovan nämnda lösning och utrustning i en korg, tillsammans med en steril skalpell för engångsbruk, en steril 6 cm cell kultur maträtt och fem sterila 12-väl cell kultur plattor.
  2. Bered en 6 mg/mL fibrinogen i Hanks balanserad Salt lösning (HBSS) av upplösning 30 mg plasminogen-utarmat humant fibrinogen i 5 mL HBSS, med en 50 mL tub nedsänkt i ett vattenbad vid 37 ° C, i minst 1 h.
    Obs: Denna lösning kan förvaras i vattenbad (37 ° C) för 7 h (max 10 h) före användning.
  3. Förbereda ex vivo odlingsmedium genom att lägga till 5% fetalt kalvserum (FCS) eller 5% humant serum, 0,4% endotelceller tillägg, 10 ng/mL rekombinant human epidermal tillväxtfaktor, 1 μg/mL hydrokortison och 50 μg/mL gentamycin till kommersiellt tillgängliga endotelcell odlingsmedium och hålla i vattenbad vid 37 ° C fram till användning. Förvaras vid 4 ° C i upp till en månad.

2. fibrovaskulär vävnad dissektion

  1. Samla in fibrovaskulär vävnad (FT) som har varit censurerade från mänskliga patienter som genomgick trans-konjunktival microincision vitreoretinal kirurgi, av 23 eller 20 gauge treportars pars plana vitrektomi som en del av vitreoretinal kirurgiska förvaltning av PDR.
    Obs: FT Bolts använder segmentering och delaminering, klippa om det behövs med microscissors, och bort från glaskroppsrummet med intraokulära slutet-gripande microforceps av erfarna vitreoretinal kirurg. Extrem försiktighet måste vidtas för att ta bort intakt, oskadade FT utan att orsaka skador på okulära strukturer inklusive synnerven eller temporal vaskulära arkad där den patologiska neovaskulär vävnaden ligger oftast. Storleken på exciderad vävnad är variabel, vanligtvis mellan 3 och 50 mm2.
  2. Hålla FT i en 6 cm cell kultur maträtt eller 1,5 mL tub innehållande 1 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning placeras på våt is, och överför det omedelbart för att forskning laboratorium för bearbetning.
    Obs: Det är viktigt att enheten (lab faciliteter) är fysiskt nära sjukhuset operationssalen (OR) att minimera överföringstider av små exciderad FT. I detta fall överföringen tar mindre än 5 minuter och bladsticklingar är inbäddade i fibrin vanligtvis i 1-1,5 h (max 2 h) efter kirurgiskt avlägsnande. Effekterna av längre överföringstider på 3D kulturen skulle behöva testas.
  3. Placera FT i en 6-cm cell kultur maträtt innehållande 1 mL PBS vid rumstemperatur (RT, 25 ° C) och förvärva bilder av vävnad med en inverterad epifluorescensmikroskop med ett 5 x mål.
    Obs: Bilder förvärvas för kvalitativ bedömning och dokumentation. Det blir möjligt att observera vävnad storlek, densitet och allmänna sammansättning (t.ex. vaskulära strukturer).
  4. Skär FT i ~ 1 mm2 bitar under en upprätt dissektion stereomikroskop, med en steril skalpell och lokalt pincett. Håll vävnad, väl nedsänkt i PBS, in med ett lokalt pincett, och utföra tydliga nedskärningar med en steril skalpell. Undvika att slita FT, eftersom detta skulle förändra de infödda fibrovaskulär strukturerna.
  5. Placera varje enskild bit i en väl 12-väl cell kultur platta innehållande 1 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning.
    Obs: Om det behövs, försiktigt sprida FT på plattan, med lokalt pincett, innan du utför nedskärningar.

3. gjutning upprätt Fibrin Gel droppar för karakterisering av infödda FT och Ex Vivo kultur

  1. Steril-filter redo fibrinogen lösningen bereddes i steg 1.2 med 0,22 μm filter monteras i en 10 mL-spruta.
  2. Förbereda alikvoter av fibrinogen lösningen (25 μl per 1,5 mL rör) och hålla på RT. förbereda en alikvot för fibrin gel / varje FT bit erhålls efter dissektion, och ett par extra alikvoter för testning fibrin gel bildas.
  3. Förbered en lösning av HBSS innehållande 4 enheter/mL av trombin och 400 μg/mL av aprotinin, kallas härefter TA lösning, och hålla på RT. förbereda så mycket TA lösning som behövs, beroende på antalet bitar som erhålls efter dissektion (25 μL TA lösning används för varje FT/fibrin gel), och ett extra belopp (t.ex. 250 μL) för att testa fibrin gel bildandet och att säkerställa att det finns tillräckligt lösning i hela gjutning av fibrin gel droppar.
    Obs: Trombin krävs för fibrin polymerisation medan aprotinin läggs till förhindra nedbrytning av fibrin gel av cellulära proteaser uttryckt FTs13,14.
  4. Testa tidpunkten för fibrin gel bildandet: Tillsätt 25 μl TA lösning till aliquoted 25 μL fibrinogen lösningen bereddes i steg 3,2 och, med hjälp av en annan pipett inställd på 50 μL, blanda i röret genom pipettering och fördela i en 6 cm cell kultur maträtt , utgör en upprätt droplet.
    Obs: Fibrin gel bildandet bör äga rum i ~ 1 min. Om detta tar över 1,5 min, kan koncentrationen av trombin i TA lösningen bereddes i steg 3.3 ökas genom att lägga till mer trombin stamlösning. En tiondel av den ursprungligen använda volymen av trombin stamlösning kan läggas, upprepade gånger tills fibrin gel bildandet sker inom 1,5 min. Tiden av fibrin gel bildandet är avgörande för de tre dimensionerna av kultur, som snabb gel bildandet (inom 1,5 minuter) förhindrar FT bit från sjunka till botten av fibrin gelen, och därmed kommer i kontakt med 2D plastytan cellens kultur plattan, vilket kan leda till 2D celladhesion och utväxt.
  5. Placera en FT bit i mitten av en väl 24-well platta med hjälp av en steril pincett och ta bort eventuella överskott PBS genom pipettering med 0,5-10 μl pipett att undvika sugstyrka på FT. I fall vävnaden pinnar till denna pincett, använda en ytterligare pincett för att underlätta placeringen av vävnad lappa på plattan.
    Obs: FT/fibrin geler kan också gjutas på 48-bra platta att minska användningen av reagenser. Detta är dock mer utmanande eftersom utrymmet är mer begränsade och fibrin kommer att sprida sig om det kommer i kontakt med väl väggen.
  6. Tillsätt 25 μl TA lösning till 25 μL fibrinogen lösningen aliquoted i steg 3.2, och med hjälp av en annan pipett 50 μL mix i röret av pipettering. Fördela på de FT bit placeras på plattan väl, och pipett upp och ner 2 - 3 gånger för att inkludera den FT bit inom upprätt droplet-programmet, som ger en 3D omgivande matris till FT.
    Observera: Kontrollera att FT inte är aspirerade under pipettering och att inga luftbubblor bildas. Se också till att blanda, dispens och pipettering utförs snabbt som fibrin gelen bildar inom 1,5 min, som testas i steg 3,4. Om casting fibrin geler på 48-väl tallrik, Använd istället 20 μL av fibrinogen lösning och 20 μL av TA lösning.
  7. Upprepa steg 3.5 och 3.6 för alla FT bitar.
  8. Tillåta de fibrin gelerna att stelna av ruvning plattorna i en cell kultur inkubator vid 37 ° C i en fuktad atmosfär med 5% CO2.
  9. Efter 0,5-1 luta h, kontrollera att fibrin gelen bildas helt av försiktigt plattan. Fortsätt till steg 3.10 när gelen inte flytta när plåten lutas, vilket indikerar att fibrin gel bildandet är komplett.
  10. Överlagra de FT/fibrin geler med ex vivo odlingsmedium (600 μL/brunn i 24-well plate) eller 300 μL/brunn i 48-väl plattan kompletteras med 100 μg/mL aprotinin. Pipettera medlet försiktigt av och dispens.
    Obs: Här, aprotinin används för att förhindra nedbrytning av fibrin gel av cellulära proteaser uttryckt FTs13,14. De ex vivo odlingsmedium kan dessutom kompletteras med rekombinant tillväxt faktorer, såsom VEGFA, VEGFC, bFGF, TGFβ (se Tabell för material)11.
  11. Placera FT ex vivo kultur plattan tillbaka in i 37 ° C, 5% CO2 cell kultur inkubator och kultur för önskad tidsperiod (t.ex., 2 - 18 dagar, längre kultur perioder kommer att behöva testas). Ersätta 50% av medium med färska ex vivo odlingsmedium var tre dagar.

4 "i Matrix” Imaging

  1. Förvärva bilder av FT ex vivo kulturer på samma dag (dag 0) och med jämna mellanrum (t.ex. varannan dag), med en inverterad epifluorescensmikroskop, för att följa 3D tillväxten.
    Obs: Bilderna erhålls kan användas för kvantifiering av FT utväxten som den totala längden av två vinkelräta diametrar över explant11.

5. infödda FT och Ex Vivo kultur slutpunkten

Obs: De FT/fibrin gelerna kan vara odlade ex vivo för önskad tidsperiod (FT ex vivo kulturer) eller fast på samma dag (native FT) för infödda FT karakterisering11.

  1. Fixa den infödda FT eller FT ex vivo kulturer genom att byta ut odlingssubstratet med 1 mL/väl av 4% PARAFORMALDEHYD i PBS-lösning, för 1 h på RT. För de infödda FT/fibrin gelerna, fix 0,5-1 h efter tillsats av ex vivo kultur medium (om de fibrin gelerna inte har varit indränkt i medium, fixering kommer skada dem).
    Obs: Utföra det här steget i dragskåp eftersom PARAFORMALDEHYD är frätande, giftiga och cancerframkallande.
  2. Skölj de FT/fibrin gelerna med tre 5 min tvättar i PBS (2 mL per brunn).
  3. Ersätta PBS med 2 mL/väl av PBS som innehåller 0,02% natriumazid och lagra de fasta fibrin gelerna vid 4 ° C tills vidare bearbetning. Förslut plattorna med paraffin film att se till att FT/fibrin gelerna inte torka i lager.
    Obs: Utföra det här steget i dragskåp eftersom Natriumazid är giftiga.

6. hela-Mount immunofluorescens färgning

Obs: Detta protokoll varar i 5 dagar och kan avbrytas med övernattning inkubationer där anges. Låt inte fibrin geler torka när som helst. Alla åtgärder utförs på RT om inget annat anges.

  1. Förbered följande lösningar innan färgning protokollet.
    1. Efter fixering lösning: Förbered 50: 50 aceton: metanol lösningen genom att blanda lika mängder aceton och metanol (t.ex. 50 mL). Förvaras vid-20 ° C. Bered lösningen senast dagen före färgningen. Denna lösning kan förvaras tillbaka vid-20 ° C och användas för efterföljande infärgning.
      Obs: Bered lösningen i dragskåp som aceton och metanol är brandfarliga och farligt för hälsan.
    2. Blockerar lösning: förbereda ett fetalt bovint serum för 15% (FBS), 0,3% octyl fenol ethoxylate lösning i PBS med första lägga 15% FBS till PBS. Tillsätt octyl fenol ethoxylate och rör för att upplösa. Förvaras vid 4 ° C.
      Obs: Denna lösning kan beredas i stor mängd i förväg, lagras i 15 mL aliquotes vid-20 ° C och tinas före användning, den dagen när färgning protokollet startas. Använd en nygjord eller nymalen upptinade aliquote för varje färgning protokoll.
    3. Tvättlösningen: förbereda 1 L PBS kompletteras med 0,45% octyl fenol ethoxylate genom att lägga till 4,5 mL av octyl fenol ethoxylate 995,5 mL PBS. Rör för att upplösa. Butiken på RT.
  2. Lyft droppar noggrant från plattan med hjälp av en rostfritt stål square-edged spatel. Loss droplet-programmet först från kanterna innan du lyfter centrum och överföra till en brunn av 12-well platta innehållande 1 mL PBS.
    Obs: Utföra efter fixering, tvättar och blockerande steg i denna platta format.
  3. Efter fixa droppar med 1 mL iskallt 50: 50 aceton: metanol lösning för ~ 1 min (gränsa av dropparna blir vit).
    Obs: Utföra det här steget i dragskåp som aceton och metanol är farligt för hälsan.
  4. Skölj med 3-5 tvättar i 2 mL PBS (droppar kommer att sjunka i PBS lösningen när rehydrering är klar).
    Obs: Undvik att vidröra droppar med pipettspetsen som, efter efter fixering, de är klibbig till plast. I hela protokollet, undvika sug efter fix, antikropp, blockering och tvättning lösningar av sug, eftersom detta kan skada eller helt förstöra droppar. Istället luta plattan och ta försiktigt bort lösningar med 500-5000 μl pipett.
  5. Centrifugera blockerande lösningen för 15 min på 21 000 x g och 4 ° C för att ta bort skräp.
    Obs: Lösningen kan vara aliquoted i 1,5 mL tuber för centrifugering. Oanvända lösningen kan lagras vid 4 ° C och används för alla relevanta efterföljande steg.
  6. Inkubera droppar i 500 μL blockerar lösning för 2 h på RT.
    Obs: För att minska volymen av blockering lösning används, plattan kan vinklas på ett stöd och så lite som 300 μL av lösning/droplet kan användas.
  7. Förbereda primär antikropp blandningen (minst 30 μL/droplet) på lämplig utspädning i att blockera lösning och Centrifugera i 15 min på 21 000 x g och 4 ° C.
  8. Överföra droppar in runda (U)-botten plattan med 96 brunnar med hjälp av en runda kanter spatel och inkubera med minst 30 μL/droplet av primär antikropp blandningen över natten vid 4 ° C.
  9. Följande dag, överföring droppar in 12-väl plåt innehållande 2 mL tvätt lösning per brunn, tvättar skölj med tre 5 min först och sedan med nio 30 min tvättar. Lämna den sista tvättningen (2 mL) över natten vid 4 ° C.
  10. Följande dag, skölj tre gånger med PBS och överföra droppar in runda (U)-botten plattan med 96 brunnar.
  11. Under tvättarna, förbereda lämpliga fluorophore-konjugerad sekundär antikropp blandningen (utspädd 1: 500, minst 30 μL/droplet) blockera lösning och Centrifugera under 15 minuter vid 21 000 x g och 4 ° C.
  12. Överföra droppar in en runda (U)-botten plattan med 96 brunnar med hjälp av en runda kanter spatel och inkubera med minst 30 μL av sekundär antikropp blandningen i 4 h på RT, skyddas från ljus.
    Obs: Utför alla efterföljande inkubationer och tvätt steg skyddas från ljus.
  13. Överföra droppar in 12-väl pläterar innehållande 2 mL av tvätt lösning per brunn med runda kanter spatel, skölj med tre 5 min tvättar först och sedan med fyra 30 min tvättar. Lämna den sista tvättningen (2 mL) över natten vid 4 ° C.
  14. Följande dag, skölj gelerna med fem 30 min tvättar och sedan tre gånger med PBS. Lämna den sista tvättningen (2 mL) över natten vid 4 ° C.
  15. Följande dag, överföra droppar in en runda (U)-botten plattan med 96 brunnar med en runda kanter spatel och motfärg kärnor genom inkubation med 10 μg/mL Hoechst nukleära fläcken (minst 30 μL/droplet) i 30 minuter vid RT.
    Obs: Montering medium kompletteras med 4', kan 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) för kärnor från alternativt användas. I vilket fall, detta steg och steg 6.16 hoppas över, går direkt till steg 6.17.
  16. Överföra droppar in 12-väl pläterar innehållande 2 mL PBS per brunn med en runda kanter spatel och skölj tre gånger med PBS.
  17. Montera droppar på objektglas som följer:
    1. Applicera en smal lager av quick-härdning monteringsmedium på kanterna av ett fyrkantigt 22 x 22 mm täckglas och låt torka i ~ 1 minut. Utföra detta steg för varje droppe individuellt, för att undvika överdriven härdning av monteringsmedium.
      Obs: Utföra det här steget i dragskåp eftersom den snabb-härdning monteringsmedium är farligt för hälsan.
    2. Skölj droplet-programmet genom att doppa i en brunn i en 12-well platta innehållande 2 mL avjoniserat vatten och överföra på ett objektglas, med hjälp av en spatel med runda kanter. Avlägsna överskottsvatten med hjälp av en liten bit av absorberande papper.
    3. Fördela 15 μL av icke-härdande antifade monteringsmedium på droplet-programmet.
      Obs: Alternativt om Hoechst nukleära fläcken inte har använts, montering medium innehållande 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) kan användas.
    4. Försiktigt placera skyddsglaset, med snabb-härdning monteringsmedium inför mikroskopiska bilden över droplet-programmet och låt kvitta.
      Obs: Quick-härdning mediet kommer att hålla sig till den mikroskopiska bilden och hålla droplet-programmet på plats.
  18. Upprepa steg 6.17 för alla droppar. Montera två droppar på varje objektglas.
  19. Låt bilderna lufttorka på RT för ~ 2 h och förvaras vid 4 ° C över natten. Se till att bilderna är placerad horisontellt och skyddas från ljus.
  20. Bild färgas infödingen eller slutpunkten FT ex vivo kulturerna med confocal Mikroskop eller ett upprätt epifluorescensmikroskop utrustad med en optisk snittning funktion och 20 x eller 40 x-objektiv. Kakel funktionen för att fånga ett större område av vävnad på en gång.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Djupare förståelse av PDR fibrovaskulär vävnad egenskaper och proteinuttryck har främst åberopat glaskroppen prover och tunn histologiska FT avsnitt3,15,16,17. För att utveckla en metod för grundlig utredning av 3D vävnad organisationen och flercelliga physiopathological processer av PDR, vi satt för att utnyttja den kirurgiskt exciderad, patientderiverade patologiska FTs för 3D karakterisering och ex vivo kultur. De färska FTs överförs till forskningslaboratoriet och bearbetas som illustreras i arbetsflödet schematiskt i figur 1.

FTs kan avbildas före dissektion för kvalitativ bedömning och dokumentation (figur 2). Som visas i figur 2, visar FTs stor mellan patienter variation i storlek, densitet och överflöd av vaskulära strukturer. I vissa vävnader, lös, förmodligen inflammatoriska/immun cellerna eller röda blodkroppar, liksom genomsläppligt vaskulära strukturer av olika kaliber kan också enkelt distingerat (figur 2). Efter dissektion måste ett beslut göras på nedströms användning av begränsande antal de erhållna bladsticklingar. En del av bladsticklingar är inbäddade i fibrin matris och fast efter fibrin gel bildas medan de återstående bladsticklingar kan utsättas för ex vivo kultur på en separat plåt (figur 1). De färska FTs har också framgångsrikt använts för ultrastrukturella karakterisering av elektronmikroskopi. Proverna kan vara antingen bearbetas för konventionella transmissionselektronmikroskopi (TEM) av ultratunna sektioner eller seriell block ansikte-scanning elektronmikroskopi (SBF-SEM)3,11.

De fasta fibrin gelerna kan lagras i flera veckor och färgas av hela-mount immunofluorescens18,19. De färgade proverna är jämväl stabila när de lagras vid 4 ° C i mörker. De tjocka FT/fibrin gelerna kan avbildas tid-effektivt med epifluorescensmikroskop utrustad med en optisk snittning funktion, användbar för att ta bort spridda out-of-fokus ljuset. Imaging med denna metod ger bra visualisering av strukturerna. Alternativt, konfokalmikroskopi, men mer tid-krävande, kan tillåta fångst av finare Detaljer. Karakterisering av nymalen fibrin-embedded och fasta, obildade, infödda FTs genom hela-mount immunofluorescens tillåter karakterisering av vaskulära strukturer, flera celltyper och deras ömsesidiga arrangemang inom 3D PDR vävnaden landskap11. Till exempel CD31 antikroppar kan användas för att Visa endotelet och NG2 att Visa pericyter (figur 3) medan Lyve1 antikroppar visualisera nyligen upptäckte lymfatiska endothelial strukturer (figur 4)11. Flera kombinationer av antikroppar kan användas för att visualisera flera strukturer och celltyper (se Tabell för material); till exempel kan ERG också visualisera endotelet, som har ett mönster med discontinuos i uttryck i den onormala PDR-neovasculature. De vaskulära strukturer som färgas med en membran-markör (t.ex., CD31 och Lyve1) kan analyseras kvantitativt för bevarande och densitet genom att använda Angiotool, en gratis-source programvara utvecklad av NIH National Cancer Institute11, 20. 3D volymer kan också återges från den datamängd som fått (se Video 1). Om en antikropp inte är lämplig för hela-mount immunofluorescens, kan fibrin droppar alternativt vara inbäddade i paraffin, klipp till tunnslip och analyseras av immunohistokemi. I detta fall nytta droppar övernattning fixering vid 4 ° C istället för 1 h på RT.

Ex vivo upprätthåller kultur tillväxten av de fibrin-embedded FTs, utveckla cellulära utväxter redan efter två dagar (figur 5). In vitro- fibrin gelen används som matrisen för ex vivo kultur, eftersom det kännetecknar invivo provisoriska ECM, bildas efter trombin klyvning av serum fibrinogen på platser för vaskulär läckage, i direkt kontakt med den läckande PDR kärlnybildning i den inflammerad fibrotiska milieu15,21,22.

PDR är ett mikrovaskulära komplikationer som kännetecknas av en angiogena och fibrotiska svar, och de FT bladsticklingar behålla denna cellulära repertoar i kultur, liksom reagera effektivt på exogena stimuli till kultur media11. Representativa data i figur 6 visar att PDR ex vivo kulturerna inducerad groning CD31-positiv endotel och kärlsystemet bevarandet svar på VEGFA, medan TGFβ inducerad fibrotiska svar reflekteras av utväxten NG2-positiv pericyter/SMCs. Flera exogena stimuli kan testas och, när informeras av mätningar av deras invivo vitreal överflöd, häri utvecklade PDR ex vivo kultur modell kan avslöja nya närmiljön och sammanhang beroende PDR patologiska mekanismer som inte kan visualiseras i fasta vävnadsprover.

Figure 1
Figur 1. Ex vivo PDR fibrovaskulär vävnadsodling modell. Schematisk bild av arbetsflödet från den vitreoretinal kirurgin (pars plana vitrektomi) för excision av FT till dess dissektion i bladsticklingar och inbäddning till fibrin för tredimensionella karakterisering och ex vivo kultur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Nymalen censurerade PDR fibrovaskulär vävnader före dissektion. Fas contast micrographs av nymalen exciderad FTs tagen före dissektion. FTs är mycket varierande i storlek, densitet och överflöd av vaskulära strukturer. Pilspetsar visar vaskulära strukturer av olika kaliber. Den röda delvis genomskinliga linjen belyser två enskilda fartyg av olika kaliber. Bilderna togs med en inverterad epifluorescensmikroskop med 5 x, 0,15 numeriska bländaröppningen (NA), mål. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Hela-mount immunofluorescens en native PDR fibrovaskulär vävnad. Epifluorescence Mikrograf av en infödd PDR FT färgas genom hela-mount immunofluorescens. CD31 (A, grön) visualiserar endotelet medan NG2 (B, röd) visualiserar pericyter inom oregelbundna neovaskulär strukturer. Sammanslagna bilder visas i (C). DAPI (blå) motfärg visualiserar atomkärnor. Bilden togs med ett upprätt epifluorescensmikroskop med optisk snittning funktion och kombinerat med en datorstyrd 1,3 megapixel svartvit CCD kamera och bild förvärv programvara, använder en 40 x, 1,4 NA, olja mål. Nio optiska delar kombinerades med hjälp av programvara bildbehandling ImageJ. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. Hela-mount immunofluorescens en native PDR fibrovaskulär vävnad. Epifluorescence Mikrograf av en infödd PDR FT färgas genom hela-mount immunofluorescens. CD31 (A, grön) visualiserar endotelet medan Lyve1 (B, röd) visualiserar de nyupptäckta lymfatiska endothelial strukturerna. Sammanslagna bilder visas i (C). Hoechst-33342 (blå) motfärg visualiserar atomkärnor. Bilden togs med ett upprätt epifluorescensmikroskop med optisk snittning funktion och kombinerad med en datorstyrd 1,3 megapixel svartvit CCD-kamera och bild förvärv programvara, med ett 20 x, 0.8 NA, mål. Fyra optiska delar kombinerades med hjälp av programvara bildbehandling ImageJ. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5. Ex vivo tillväxten av PDR fibrovaskulär vävnader. Fas kontrast micrographs av två FT ex vivo kulturer vid angivna tidpunkter (dag). FTs växa ex vivo kultur, utveckla cellulära utväxter redan efter två dagar. Bilderna togs med en inverterad epifluorescensmikroskop med ett 5 x, 0,15 NA, mål. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6. Hela-mount immunofluorescens av PDR fibrovaskulär vävnader odlade ex vivo obehandlad (CTRL) eller i närvaro av VEGFA eller TGFβ. Epifluorescence Mikrograf ft odlade ex vivo obehandlad (CTRL) eller i närvaro av VEGFA eller TGFβ i 9 dagar och därefter målat av hela-mount immunofluorescens. CD31 (grön) visualiserar endotelet medan NG2 (röd) visualiserar pericyter. DAPI (blå) motfärg visualiserar atomkärnor. VEGFA stabiliserad i kärlsystemet medan TGFβ inducerad fibrotiska svar. Bilderna togs med ett upprätt epifluorescensmikroskop med optisk snittning funktion och kombinerad med en datorstyrd 1,3 megapixel svartvit CCD-kamera och bild förvärv programvara, med ett 20 x, 0.8 NA, mål. Nio optiska delar kombinerades med hjälp av programvara bildbehandling ImageJ. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Video
Video 1. 3D-volym återuppbyggnaden av en infödd FT färgas genom hela-mount immunofluorescens. CD31 (grön), Lyve1 (röd). Hoechst-33342 motfärg (blå) visualiserar atomkärnor. Bilden togs med ett upprätt epifluorescensmikroskop med optisk snittning funktion och kombinerad med en datorstyrd 1,3 megapixel svartvit CCD-kamera och bild förvärv programvara, med ett 20 x, 0.8 NA, mål. 3D-volym återuppbyggnad och videoåtergivning utfördes med hjälp av en kommersiell programvara. En del av videon återges med tillstånd från Gucciardo et al. 11. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som beaktar betydelsen av relevanta vävnad närmiljön för tillförlitlig funktionella cell och molekylär mekanistiska resultat är det absolut nödvändigt att hitta lämpliga experimentella modeller som ger denna vävnad miljö. Häri beskrivna ex vivo PDR kultur modellen för de fibrin-embedded FTs tillåter undersökningen av PDR patofysiologi mekanismer inom ramen för infödda, komplexa och flercelliga PDR kliniska prover.

Kritiska steg inom protokollet är korrekt fibrin gel bildandet, placeringen av FT och tvättas ordentligt under färgningen. Eftersom fibrin gel bildas beror mestadels på aktiviteten trombin, påverkas av koncentration och temperatur, måste mängden trombin justeras för varje parti av fibrin gel förberedelser. Fibrin gel bildandet bör vara tillräckligt snabb för att förhindra 2D tillväxt av de FT bladsticklingar men också långsam nog att tillåta positionering av FT till mitten av droppar vertikalt och horisontellt. I det fallet FT råkar hitta vid kanten av droplet-programmet kunde ytterligare pipettering stöd placeringen av FT till centrum. FTs som fortfarande finns kvar vid kanten av droppar eller att växa i 2D måste uteslutas. Adekvata tvätt under färgning och undvika torkning av dropparna är i sin tur avgörande för att optimera färgning och minimera bakgrund signal. Överföringstider kan också vara kritiska. Vi har bäddat in FTs upp till två timmar efter vitrektomi och detta påverkade inte ex vivo tillväxten. Effekterna av längre överföringstider på kultur framgången skulle behöva testas.

Detta protokoll kan ändras genom att använda alternativa matriser för FT inbäddning. In vivo, de PDR kärlnybildning växa mot glaskroppen cortex rik på kollagen23. Dock vid vaskulär läckage serum komponenter, inklusive fibrinogen, lös upp i glaskroppen i nära närhet till fartyg varigenom den fibrotiska Svaren initieras. Därför in vitro-fibrin koagel var utnyttjas här för ex vivo kultur för att kännetecknar provisoriska ECM bildades den inflammerade fibrotiska milieu PDR15,21,22. Alternativt de fibrin blodproppar kan kompletteras med laminin och Fibronektin att ändra stabilitet groning kapillärer eller bladsticklingar kunde vara inbäddade inom typ I kollagen och andra blandade matriser till kännetecknar de mest fibrotiska mikromiljö i neovaskulär vävnad. Dessa matriser är generellt sett lämpligt för 3D kultur och hela-mount immunofluorescens men deras inverkan på den PDR FTs kvarstår ska testas och överväganden om timingen av 3D matrix bildandet måste göras för att hålla sig inom gränserna för att förhindra 2D tillväxt18,19. När den fysiska närheten forskningsmiljöns till sjukhuset representerar en begränsning, kunde längre överföringstider kompenseras med grupparbete; TA lösning förberedelse, steril fibrinogen-filtrering och fibrin gel bildandet provning kan utföras under FT överföring. Om fibrin gelerna inte utgör även efter 1 timme, kan ett problem med fibrinogen eller TA lösning förberedelse ha inträffat. I det här fallet kan inte de FT/fibrin gelerna användas.

Begränsningarna med denna metod, som med varje ex vivo förhållningssätt, är den varierande kvaliteten av primära vävnad exemplar över individer samt inom patient och mellan patienter vävnad heterogenitet. När det gäller diabetiker omfattar del av denna variation omfattning vaskularisering och fibros som beror på många faktorer som varaktighet av sjukdomen, metabola tillstånd, genetiska/epigenetiska faktorer, typ av diabetes och systemisk behandling. Storleken på den kirurgiska PDR FT återhämtat sig är också en begränsande faktor vid fastställandet av antalet villkor som kan utredas för varje exemplar. Samtidigt som den ger ömsesidigt rumslig information, kan hela-mount immunofluorescens utredningen av endast en begränsad mängd funktioner/markörer per droppe. Som en kompromiss, kan fibrin droppar alternativt vara inbäddade i paraffin, klipp till tunnslip och analyseras av immunohistokemi.

Befintliga diabetiker mus modeller utvecklar många funktioner i tidigt skede DR men misslyckas med att utförligt sammanfatta de progressiva förändringar som sker i människors PDR, således hindrar studierna av PDR sjukdom mekanismer7,8. Dessutom är murina ögat fundamentalt annorlunda från det mänskliga ögat, att det saknar gula fläcken, ytterligare betonar vikten av att studera den mänskliga sjukdom24. Den kirurgiska PDR-FTs ha antingen tidigare kastats eller används för paraffin avsnitt, transmissionselektronmikroskopi, seriell block ansikte-scanning elektronmikroskopi, bulk RNA-sekvensering eller 2D kultur dissocierade celler3,25 . Häri beskrivna modellen tillåter 3D karakterisering av detta dyrbara kirurgiska material samt utredning av PDR patofysiologi i den infödda sjuk vävnad mikromiljö. Kombination med användning av glaskroppen vätska, kan denna modell också utredning av bidrag från både den cellulära och acellulära PDR-mikromiljö. Eftersom kulturerna svarar effektivt på tillväxtfaktorer upptäcks i glaskroppen, såsom VEGFA, bFGF, är VEGFC och TGFβ, således går igenom funktioner i PDR patofysiologi, detta PDR ex vivo kultur modell mottaglig för att testa eller utveckla nya PDR behandlingar 11. i denna modell, anti-VEGFA hindrade kapillär groning och inducerad tecken på kapillär regression, svar som stämmer överens med de förväntade kliniska resultat av anti-VEGFA behandling26,27. Denna modell kan därför också användas för att bättre förstå effekterna av nuvarande behandlingar, inklusive anti-VEGFA och kortikosteroid behandlingar.

Med live-cell imaging instrumentering, den häri beskrivna ex vivo kultur modell kunde utsättas för time-lapse mikroskopi att möjliggöra realtid undersökning av processer såsom vaskulär regression, groning och cellulär plasticitet. Kombination med in vitro- och in vivo modeller, samt kliniska data, detta ex vivo PDR modell hjälper utreda patientens svar utifrån vissa uppsättningar för att identifiera markörer, ett steg närmare till avenyn för personlig medicin. Identifiera patientspecifika svaren och/eller svar-specifika markörer är särskilt relevant när det gäller PDR, som är en multifaktoriell sjukdom med ett komplext samspel av mikrovaskulära, neurodegenerativa, metabola, genetiska/epigenetiska, immunologiska och inflammation-relaterade faktorer, vilket kräver alltmer multidisciplinära insatser för utveckling av förbättrade terapeutiska inriktning och sjukdom. Förutom hela-mount immunofluorescens analyserar ex vivo odlade FTs kunde också vara Hämtad från fibrin av plasmin/nattokinase behandling och utsätts för transcriptomic och proteomiska28. Lämpligheten av de häri beskrivna modellen för ex vivo studier av fibrovaskulär vävnader utvecklas i andra okulära tillstånd, som i svåra fall av sickle cell retinopati, skulle också kunna undersökas i framtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna är mycket tacksamma till medicinsk och kirurgisk retina kollegor, sjuksköterskor och hela personalen för Vitreoretinal kirurgi enheten på den Department of Ophthalmology, Helsingfors universitetssjukhus för att aktivt delta i rekryteringen och diabetiker enhet av patienterna. Vi tackar Biomedicum molekylär Imaging Unit för imaging faciliteter. Vi tackar Anastasiya Chernenko för utmärkt tekniskt bistånd. Denna studie stöddes av bidrag från Akademin i Finland (KL), Helsingfors universitet (KL), Sigrid Juselius stiftelse (KL), K. Albin Johansson Foundation (KL), finska Cancer Institute (KL), Karolinska Institutet (KL), finska Eye Foundation (SL), ögat och Tissue Bank Foundation (SL), Maria och Georg C. Ehrnrooths stiftelse (SL) och HUCH kliniska forskningsanslag (TYH2018127 efter TYH2016230, SL), Diabetes Research Foundation (SL, KL, AK, EG) samt doktorandprogrammet i biomedicin (EG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Microforceps Medicon 07.60.03 Used for handling the FTs
Disposable Scalpels - Sterile Swann-Morton 0513 Used for FT dissection
Culture dish, vented, 28 ml (60mm) Greiner Bio-One 391-3210 Used for dissection and for testing fibrin gel formation
Cell culture plates, 12-well Greiner Bio-One 392-0049 Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL Greiner Bio-One 391-3477
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL Greiner Bio-One 525-0384
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF Millipore SLGV033RS Used to sterile-filter the fibrinogen solution
Syringe, 10 mL Braun 4606108V Used to sterile-filter the fibrinogen solution
Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL Fisher FB74031
Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well Nunc 142475 Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture
Cell culture plates, 96-well, U-bottom Greiner Bio-One 392-0019 Used for whole-mount immunofluorescence
Round/Flat Spatulas, Stainless Steel VWR 82027-528 Used for whole-mount immunofluorescence
Coverslips 22x22mm #1 Menzel/Fisher 15727582 Used for mounting
Microscope slides Fisher Kindler K102 Used for mounting
Absorbent paper VWR 115-0202 Used for mounting
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
PBS tablets Medicago 09-9400-100 Used for preparing 1x PBS
Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma Calbiochem 341578
Hanks Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich H9394-500ML Used for preparing the fibrinogen and TA solution
Fetal bovine serum Gibco 10270106 Used for preparing the blocking solution
Human Serum Sigma-Aldrich H4522 Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media
Gentamicin Sulfate 10mg/ml Biowest L0011-100
Endothelial cell media MV Kit Promocell C-22120 Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement,  500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL)
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood.
Acetone Sigma-Aldrich 32201-2.5L-M Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.
Methanol Sigma-Aldrich 32213 Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.
Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate) Sigma-Aldrich T9284 Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing.
Hoechst 33342, 20mM Life Technologies 62249 For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Laboratories H-1000 Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200 Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
Eukitt Quick-hardening mounting medium Sigma-Aldrich 03989-100ml TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder Sigma-Aldrich T9549-500UN  Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw
Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder Sigma A3428 Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw
Name Company Catalog Number Comments
Growth factors
Recombinant human VEGFA R&D Systems 293-VE-010 50 ng/ mL final concentration
Recombinant human VEGFC R&D Systems 752-VC-025 200 ng/ mL final concentration
Recombinant human TGFβ Millipore GF346 1 ng/ mL final concentration
Recombinant human bFGF Millipore 01-106 50 ng/ mL final concentration
Name Company Catalog Number Comments
Primary antibodies
CD31 (JC70A) Dako M0823 Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD34 (QBEND10) Dako M716501-2 Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD45 (2B11+PD7/26) Dako M070129-2 Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD68 ImmunoWay RLM3161 Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
Cleaved caspase-3 (5A1E) Cell Signalling 9664 Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
ERG (EP111) Dako M731429-2 Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
GFAP Dako Z0334 Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Ki67 Leica Microsystems NCL-Ki67p Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Lyve1 R&D Systems AF2089 Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab
NG2 Millipore AB5320 Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Prox1 ReliaTech 102-PA32 Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab
Prox1 R&D Systems AF2727 Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab
VEGFR3 (9D9F9) Millipore MAB3757 Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
α-SMA (1A4) Sigma C6198 Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated
Name Company Catalog Number Comments
Secondary antibodies
Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG Life Technologies A-21202 Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG Invitrogen A-11012 Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG Thermo Scientific A-11057 Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG Thermo Scientific A-11036 Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG Molecular Probes A-21468 Used at 1:500 dilution
Name Company Catalog Number Comments
Microscopes
Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope Zeiss For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT
SZX9 upright dissection stereomicroscope Olympus For FT dissection
LSM 780 confocal microscope Zeiss For imaging of whole-mount immunostained FT
AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome Zeiss For imaging of whole-mount immunostained FT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
  2. Liew, G., Wong, V. W., Ho, I. V. Mini Review: Changes in the Incidence of and Progression to Proliferative and Sight-Threatening Diabetic Retinopathy Over the Last 30 Years. Ophthalmic Epidemiology. 24 (2), 73-80 (2017).
  3. Loukovaara, S., et al. Indications of lymphatic endothelial differentiation and endothelial progenitor cell activation in the pathology of proliferative diabetic retinopathy. Acta Ophthalmologica. 93 (6), 512-523 (2015).
  4. Stitt, A. W., et al. The progress in understanding and treatment of diabetic retinopathy. Progress in Retinal and Eye Research. 51, 156-186 (2016).
  5. Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies. JCI Insight. 2 (14), (2017).
  6. Gross, J. G., et al. Five-Year Outcomes of Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial. JAMA Ophthalmology. 136 (10), 1138-1148 (2018).
  7. Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Disease Models, Mechanisms. 5 (4), 444-456 (2012).
  8. Villacampa, P., Haurigot, V., Bosch, F. Proliferative retinopathies: animal models and therapeutic opportunities. Current Neurovascular Research. 12 (2), 189-198 (2015).
  9. Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models, Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
  10. Sharma, T., et al. Surgical treatment for diabetic vitreoretinal diseases: a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 44 (4), 340-354 (2016).
  11. Gucciardo, E., et al. The microenvironment of proliferative diabetic retinopathy supports lymphatic neovascularization. The Journal of Pathology. 245 (2), 172-185 (2018).
  12. Rezzola, S., et al. 3D endothelial cell spheroid/human vitreous humor assay for the characterization of anti-angiogenic inhibitors for the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Angiogenesis. 20 (4), 629-640 (2017).
  13. Pepper, M. S., Montesano, R., Mandriota, S. J., Orci, L., Vassalli, J. D. Angiogenesis: a paradigm for balanced extracellular proteolysis during cell migration and morphogenesis. Enzyme, Protein. 49 (1-3), 138-162 (1996).
  14. Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs). Journal of Cell Science. 115 (Pt 17), 3427-3438 (2002).
  15. Loukovaara, S., et al. Quantitative Proteomics Analysis of Vitreous Humor from Diabetic Retinopathy Patients. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5131-5143 (2015).
  16. Abu El-Asrar, A. M., Struyf, S., Opdenakker, G., Van Damme, J., Geboes, K. Expression of stem cell factor/c-kit signaling pathway components in diabetic fibrovascular epiretinal membranes. Molecular Vision. 16, 1098-1107 (2010).
  17. Loukovaara, S., et al. Ang-2 upregulation correlates with increased levels of MMP-9, VEGF, EPO and TGFbeta1 in diabetic eyes undergoing vitrectomy. Acta Ophthalmologica. 91 (6), 531-539 (2013).
  18. Sugiyama, N., et al. EphA2 cleavage by MT1-MMP triggers single cancer cell invasion via homotypic cell repulsion. Journal of Cell Biology. 201 (3), 467-484 (2013).
  19. Tatti, O., et al. MMP16 Mediates a Proteolytic Switch to Promote Cell-Cell Adhesion, Collagen Alignment, and Lymphatic Invasion in Melanoma. Cancer Research. 75 (10), 2083-2094 (2015).
  20. Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
  21. Senger, D. R. Molecular framework for angiogenesis: a complex web of interactions between extravasated plasma proteins and endothelial cell proteins induced by angiogenic cytokines. American Journal of Pathology. 149 (1), 1-7 (1996).
  22. Senger, D. R., Davis, G. E. Angiogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (8), a005090 (2011).
  23. Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
  24. Marmorstein, A. D., Marmorstein, L. Y. The challenge of modeling macular degeneration in mice. Trends in Genetics. 23 (5), 225-231 (2007).
  25. Kim, L. A., et al. Characterization of cells from patient-derived fibrovascular membranes in proliferative diabetic retinopathy. Molecular Vision. 21, 673-687 (2015).
  26. Avery, R. L., et al. Intravitreal bevacizumab (Avastin) in the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Ophthalmology. 113 (10), e1691-e1615 (2006).
  27. Zhao, L. Q., Zhu, H., Zhao, P. Q., Hu, Y. Q. A systematic review and meta-analysis of clinical outcomes of vitrectomy with or without intravitreal bevacizumab pretreatment for severe diabetic retinopathy. The British Journal of Ophthalmology. 95 (9), 1216-1222 (2011).
  28. Carrion, B., Janson, I. A., Kong, Y. P., Putnam, A. J. A safe and efficient method to retrieve mesenchymal stem cells from three-dimensional fibrin gels. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (3), 252-263 (2014).

Tags

Indragning fråga 143 Ex vivo kultur fibrovaskulär vävnad proliferativ diabetesretinopati patientderiverade kliniska prover kärlsystemet sjukdom patofysiologi tredimensionell hela-mount immunofluorescens vitrektomi neovessel.
Ett Ex Vivo vävnadsodling modell för fibrovaskulär komplikationer i proliferativ diabetesretinopati
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gucciardo, E., Loukovaara, S.,More

Gucciardo, E., Loukovaara, S., Korhonen, A., Lehti, K. An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy. J. Vis. Exp. (143), e59090, doi:10.3791/59090 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter