Summary
Dette manuskript beskriver en enkel metode til at måle stress Behavioral hos voksne zebrafisk. Tilgangen udnytter den medfødte tendens, at: zebrafisk foretrækker den nederste halvdel af en tank, når den er i en stresset tilstand. Vi beskriver også metoder til at sammenkoble analysen med farmakologi.
Abstract
Reagerer hensigtsmæssigt på stressende stimuli er afgørende for overlevelse af en organisme. Omfattende forskning er blevet udført på et bredt spektrum af stress-relaterede sygdomme og psykiske lidelser, men endnu yderligere undersøgelser af den genetiske og neuronal regulering af stress er stadig nødvendige for at udvikle bedre terapeutisk. Den: zebrafisk giver en kraftfuld genetisk model til at undersøge neurale fundament af stress, da der findes en stor samling af mutante og transgene linjer. Desuden, farmakologi kan nemt anvendes til zebrafish, som de fleste stoffer kan tilsættes direkte til vand. Vi beskriver her brugen af ' roman tank test ' som en metode til at studere medfødte stress reaktioner i zebrafish, og demonstrere, hvordan potentielle angstdæmpende medicin kan valideres ved hjælp af analysen. Metoden kan nemt kombineres med zebrafiske linjer, der harkedeligt genetiske mutationer, eller dem, hvor transgene tilgange til manipulation af præcise neurale kredsløb anvendes. Analysen kan også anvendes i andre fiske modeller. Sammen bør den beskrevne protokol lette vedtagelsen af denne enkle analyse til andre laboratorier.
Introduction
Stress respons er ændret adfærdsmæssige og fysiologiske tilstande som følge af potentielt skadelige eller aversiv stimuli. Stress respons er bevaret i hele dyreriget, og er afgørende for overlevelsen af en organisme1. Årtiers forskning har i høj grad udvidet vores viden om nogle af de genetiske og neuronal mekanismer underliggende stress stater. I dag, områder af hjernen såsom amygdala og striatum2, og genetiske faktorer såsom kortikotropin releasing hormon (CRH), og glukokortikoid (gr) og mineralokortikoid receptorer ( Mr) er blevet undersøgtudførligt 3,4,5,6. På trods af disse kritiske fund, er meget stadig ukendt om genetiske og neuronal regulering af stress. Som sådan, mange stress relaterede lidelser lider af en mangel på terapeutika.
Genetisk ændrbare modelorganismer giver et nyttigt redskab i studiet af genetiske og neuronal kontrol af adfærd. Især fiske modeller er ekstremt kraftige: de er små organismer med korte genererings tider, deres anvendelse i laboratorieomgivelser er facile, deres genomer er nemme at ændre, og som hvirveldyr deler de ikke kun genetiske, men også Neuro anatomiske Homologi med deres pattedyr modparter7,8. Standard analyser til måling af stress kan kombineres med: zebrafisk linjer, der husly genetiske mutationer, eller dem, hvor manipulation af præcise neuronal delmængder er muligt, og virkningerne af enkelt gener eller definerede neuroner kan vurderes hurtigt og effektivt.
Behavioral, stress respons kan karakteriseres i fisk som perioder med Hyper-aktivitet eller længere perioder med inaktivitet (beslægtet med ' frysning ')9, reduceret udforskning10, hurtig vejrtrækning, reduceret fødeindtagelse11, og en sted-præference for bunden af en tank12. For eksempel, når de placeres i en ukendt tank, voksne: zebrafisk og andre små fisk modeller viser en indledende præference for den nederste halvdel af tanken, men med tiden, fiskene begynder at udforske top og bund halvdele med nær-lige frekvens12. Behandling af voksne med lægemidler kendt for at reducere angst forårsage fisk til at udforske umiddelbart den øverste halvdel10,13. Omvendt, lægemidler, der øger angst forårsage fisk til at vise stærk præference for den nederste halvdel af tanken12,14,15. Således, reduceret udforskning og præference for den nederste halvdel af tanken er enkle og pålidelige indikatorer for stress.
Som de fleste hvirveldyr drives stress respons i fisk af aktivering af hypothalamus-hypofyse-Inter-renal akse (HPI; analogt med hypothalamus-hypofyse-binyre [hPa]-aksen i pattedyr)14,16. Hypothalamus neuroner udtrykker hormonet kortikotropin-releasing hormon (CRH) signal til hypofysen, som igen frigiver adrenocorticotropt releasing hormon (ACTH). ACTH derefter signaler til den inter-renal kirtel til at producere og udskille cortisol, som har en række downstream mål16, en af dem er negativ feedback på den CRH-producerende hypothalamus neuroner3,17, 18,19.
Her beskriver vi en metode til at vurdere adfærdsmæssige målinger af medfødte stress. For den opførsel, vi detalje protokoller ved hjælp af roman tank dykning test12,14. Vi derefter demonstrere, som et eksempel, at en kendt angstdæmpende stof, buspiron, reducerer adfærdsmæssige målinger af stress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen er blevet godkendt af den institutionelle Animal Care og brug Committeeat Florida Atlantic University.
1. forberedelse af
- Udpege et isoleret rum til at udføre adfærdsmæssige undersøgelser, eller lukke en del af et rum, så det er isoleret.
Bemærk: rummet skal være uforstyrret og have lav trafik for at undgå at forstyrre den normale opførsel af fisken. - Flyt følgende materialer og udstyr ind i det adfærdsmæssige rum: (i) et kamera og objektiv, (II) et infrarødt filter, der kan fastgøres til linsen, (III) en kamera stander, (IV) en computer med kamera erhvervelse software, (v) en fast og stabil tabel til at udføre analysen på, (vi) infrarøde lygter (IR-lys; 850 nm eller 940 nm), (VII) en hvid akryl diffusor, som er længere end længden af kontrol tanken (VIII) 1,8 L trapezformet plast analyse tank (benævnt» den nye tank «, den, der bruges her, er 12 x 18 tommer) og (IX) en spand vand af fiske systemer.
Bemærk: for den nye kampvogn bruger vores laboratorium kommercielt tilgængelige plastikbeholdere, som er trapezformet. Tankens dimensioner er ca. 6 i x 9 (detaljerede dimensioner er angivet i figur 1A). Diffusoren vi bruger er lidt større end den roman tank (12 i x 18 i). Nye tank eksperimenter er blevet udført med tanke, der har forskellige former, såsom dem, der er rektangulære eller dem med forskellige trapezformede dimensioner20,21. Typisk, fisk opførsel er ens i alle tanke uanset deres dimensioner: for alle containere, fisk oprindeligt foretrækker den nederste halvdel, men med tiden begynde at udforske øverste halvdel med større hyppighed. - Fastgør det infrarøde filter til kameraets linse. Bølgelængder af infrarøde lysstrimler spænder typisk fra 850 nm til 940 nm. Filteret er en lang pass filter, der begrænser lys af bølgelængder mindre end 720 nm fra at sende igennem til kameraet.
- Vælg passende parametre for softwaren til kamera anskaffelse. For de fleste optagelser, skal du indstille kameraet erhvervelse til en hastighed på 30 frames-per-sekund, og optagelsen varighed til 10-min.
Bemærk: disse parametre kan variere afhængigt af eksperimentet. For eksempel, for at studere tilvænning i en roman tank22,23, længere optagelser kan være påkrævet.
2. opsætning af
Bemærk: trinene i dette afsnit beskriver opsætning af Novel tank assay. Et diagram over slutproduktet er angivet i figur 1B.
- Anbring romantanken midt i bordet.
- Anbring de infrarøde lamper bag tanken, og anbring den hvide akrylplade eller diffuser skærm i mellem tanken og LED-lyskilden.
- Placer diffusoren, så den maksimalt spreder lyset, der kommer fra lysdioder, og intensiteten af lyset er nok til at belyse roman tanken. Jo tættere brættet er på lyskilden, jo lysere vil lysene være, men jo mindre vil det sprede sig. I modsætning hertil vil placere diffuser brættet væk fra lyskilden reducere lysintensiteten, men sprede lyset bedre.
- Fyld ca. tre fjerdedele af romantanken med vand fra fiske systemet.
Bemærk: system vand genereres ved hjælp af omvendt osmose af postevand, efterfulgt af dosering, således at ledningsevne er lig med 900 ± 100 μS, at pH er neutral (7,2), og at temperaturen er 27 ± 1 °C. - Fastgør kameraet til kameraholderen, og kameraet til computeren. Åbn video erhvervelse software og justere kameraet til ansigt forsiden af tanken og sikre hele roman tanken kan ses, og at der ikke er skjulte områder i videoen. Juster tanken og de infrarøde lygter således, at der er tilstrækkelig og endda belysning i hele tanken, når observeret gennem kameraet.
Bemærk: før du fortsætter til eksperimenter, kan det ofte være nyttigt at udføre en prøvekørsel, hvor video af en fisk er fanget og sporing udføres. Dette vil sikre, at opsætningen er tilstrækkelig til eksperimenter af adfærd.
3. ny tank test setup
- Forbered et 250 mL bægerglas fyldt med vand fra fiske systemet og mindst to holde tanke.
- Om morgenen af testen, overføre mindst 10 test voksne: zebrafisk, der skal anvendes til hver eksperimentel tilstand (kontrol og eksperimentel voksne) fra fiske anlæg i en bedrift tank, overføre dem til opførsel rummet, og give dem mulighed for at akklime i mindst én Time.
Bemærk: en effektanalyse skal udføres før eksperimenter, men i vores hænder er en n = 10 normalt tilstrækkelig til at detektere Statistisk signifikans. Desuden bør holde tanken ikke indeholde mere end fem individer pr liter vand. En akklimatisering på en time er tilstrækkelig, da: zebrafisk voksne har vist sig at tilvænne inden for 30 minutter efter en ny tank22. Også, adfærdsmæssige rytmer er påvirket af cirkadiske processer, og dermed eksperimenterende replikater udført på forskellige dage bør udføres inden for de samme timer. Vi udfører typisk alle eksperimenter mellem timerne på 11:00 og 6:00 PM. - Mærk tankene således, at dyrenes tilstand eller genotype er blind for eksperimentatoren.
Bemærk: eksperimenter kan nemt være blændet til experimentoren ved at mærke tanke ved hjælp af et bogstav eller nummersystem (dvs., en tank er mærket ' A ', en anden ' B ', etc.). En part, der ikke er involveret i forsøgene etiketter tanke med et sådant system, og masker identiteter fra eksperimentatoren indtil efter post-analyse er afsluttet. - Ved hjælp af et net anbringes en enkelt voksen forsigtigt i det fyldte bægerglas fra trin 3,1. Lad den voksne fisk acclimere i bægerglasset i 10 minutter.
Bemærk: Optag sex af den voksne, da det kan være vigtigt post-analyse for at lede efter kønsspecifikke forskelle. - Efter akklimatisering i bægerglasset skal du introducere fiskene i den nye tank (oprettet i punkt 1) ved forsigtigt at hælde vandet og voksen fra bægerglasset.
- Efter at have indført den voksne i romanen tank, starte kameraet optagelsen, og bevæge sig væk fra opsætningen for at forhindre yderligere angst for fiskene.
- Når optagelsen er færdig, fjernes den enkelte fra den nye tank og anbringes i en ny holde tank.
Bemærk: der bør anvendes en anden holde tank end den i trin 3,2 til at forhindre gentagen testning på de samme individer. - Gentag trin 3,4 til 3,7 for hver voksen, indtil alle dyr er blevet testet.
Bemærk: ud over blændende betingelser eller genotyper, randomisere forsøg. Brug en tilfældig nummer generator eller et værktøj, der tillader en at randomisere mellem forsøgene. Dette bør gøres før eksperimenter, således at hvert forsøg er bestemt, før forsøgene begynder. - Ved afslutningen af alle tests returneres fiskene tilbage til fiske anlægget.
4. forbehandling med medicin
Bemærk: Formålet med følgende trin er at sammenligne adfærden af en person før og efter brug af narkotika. Denne sammenligning opnås ved først at udføre en ny tank test som i trin 3,4 til 3,6, efterfulgt af narkotikabehandling, og derefter en anden roman tank test (figur 3a).
- Forbered en stamopløsning af lægemidlet, herunder positive og negative kontroller.
Bemærk: hvis lægemidlet tidligere har været anvendt i litteraturen, skal du finde en passende arbejds dosis og bruge dette. For eksempel, for buspiron i de repræsentative resultater, laver vi en 100x stamopløsning og bruger 0,05 mg/ml som den endelige koncentration, som beskrevet i litteraturen13,20. Hvis den foreslåede dosis er ukendt, skal der udføres en dosisrespons kurve ved at undersøge flere koncentrationer. Indstil flere bægerglas med seriefortyndinger af lægemidlet. Hvis lægemidlet ikke er opløseligt i vand, skal du bruge dimethylsulfoxid (DMSO) som opløsningsmiddel. - Fortynde lægemidler til arbejds koncentration i 250 mL bægerglas med system vand. For eksempel, hvis en 100x løsning blev lavet, fortyndes 1:100 i systemet vand. Opret et bæger med kun system vand som kontrol.
Bemærk: Hvis DMSO blev brugt som opløsningsmiddel i trin 3,1, skal du bruge en tilsvarende mængde DMSO i kontrol bægerglasset. - Med hjælp fra en anden forsker, maskere identiteten af stoffet og kontrol bægerglas for at sikre, at testeren er blind over for behandlingen betingelser indtil efter analyse.
Bemærk: der kan anvendes et nummer-eller bogstav system. - Udfør en ny tank test ved at følge trin 3,1 til 3,6 for at opnå en baseline adfærdsmæssige stress respons.
- Efter baseline optagelsen, skal du bruge et net til straks at fjerne den voksne fisk fra romanen tanken og placere den i bægerglasset doseret med stof eller køretøj, som beskrevet i trin 4,2. Lad den voksne opholde sig i bægerglasset i 10 min.
Bemærk: Sørg for, at nettet ikke rører ved vandet i bægerglas for at forhindre krydskontaminering af stoffer. Sikre korrekt dosering og administration tid afhængigt af det anvendte stof. En 10 min behandling tid kan ikke arbejde for alle lægemidler. - Efter behandlingen skal man bruge et net til at fjerne den voksne fra bægerglasset i trin 4,5 og anbringe det i et andet bægerglas fyldt med frisk vand. Dette er udvaskelsestid for at minimere yderligere dosering under den anden roman tank test. Lad den voksne blive i skylle bægerglasset i yderligere 10 minutter.
Bemærk: separate net bør anvendes til hver lægemiddel tilstand for at forhindre uønsket kryds behandling med lægemidlet. Udvaskelsestid kan springes over, hvis eksperimentatoren ønsker det. - Udfør den nye tank dykning test en anden gang ved at fjerne den voksne fra bægerglasset i forrige trin, placere den i en ny roman tank, og følg trin 3,5 til 3,6.
- Efter den anden roman tank test, fjerne den enkelte i en separat bedrift tank. Hæld vand fra systemet i den anden roman tank og fyld det med frisk system vand til næste test. Dette trin forhindrer krydskontaminering af ethvert stof.
Bemærk: afhængigt af halveringstiden af lægemidlerne, bør friske bægerglas, der indeholder lægemidler, foretages hver 3. For buspiron, lave friske opløsninger hver 3 timer. Desuden, efter noten i trin 3,8, prøverne skal være randomiseret mellem kontrol og Drug behandlinger. - I slutningen af alle forsøg, returnere individer tilbage i fiske anlægget.
Bemærk: afhængigt af typen af stof, der anvendes, virkningerne af disse behandlinger på enkeltpersoner kan være langvarig. Brug derfor ikke disse personer i andre eksperimenter.
5. video analyse
- Efter alle forsøg, indlæse videofiler i tracking software valg.
Bemærk: vi bruger typisk kommercielt tilgængelige tracking software, men flere frit tilgængelige softwarepakker kan bruges. Trinnene til at opnå sporing kan variere afhængigt af den anvendte softwarepakke. - Ved hjælp af en stillbillede fra videoen, definere imaginære grænser omkring (i) hele roman tank Arena, der er fyldt med vand, og grænser omkring (II) den øverste tredjedel, (III) midterste tredjedel, og (IV) nederste tredjedel af tanken. Brug disse til at fastlægge tid, at fiskene brugt i hver del af romanen tanken.
- Beregn x-y forskydning pr. ramme for hver Arena, der er defineret i trin 5,2.
- Definer top, midterste og nederste områder af tanken. Hver region bør have samme størrelse. En kort metode til bestemmelse af disse regioner er at beregne længden af tanken i y-retning, og dividere dette med 3.
Bemærk: der findes variationer i den generelle protokol. For eksempel bruger nogle laboratorier halvdelen i stedet for tredjedele14. - Bestem den tid, der er brugt i hver Arena, distancen og hastigheden.
Bemærk: de fleste tracking pakker vil automatisk beregne disse for brugeren. Men hvis tracking software ikke, kan disse beregnes nemt fra x-y forskydningsværdier. For eksempel kan afstanden bestemmes ved hjælp af formlen:
og hastighed kan bestemmes efter formlen:
- Gentag trin 5,2 til 5,4 for at hente spor og målinger til alle forsøg.
Bemærk: variationer i denne generelle protokol
6. afprøvning for normalitet
- Udfør statistik, før du fortsætter med at beregne statistiske differencer. Kontrollér, om dataene normalt distribueres ved hjælp af en Shapiro-Wilk-test.
- Hvis nulhypotesen om, at dataene normalt distribueres, afvises (dvs. at dataene ikke følger en Gaussisk fordeling), skal du udføre alle test ved hjælp af ikke-parametriske tests. Hvis det derimod viser sig, at man følger en normal fordeling, skal man fortsætte med at anvende parametriske tests.
Bemærk: vi bruger kommercielt tilgængelig software til at udføre statistik; dog kan R-programmeringssproget også anvendes. En Shapiro-Wilk analyse kan udføres ved hjælp af r's Shapiro. test funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Undersøgelse af stress i: zebrafisk
For at undersøge stress adfærd over tid i vild-type zebrafish, testede vi voksne fisk fra AB stamme24 i roman tank test. AB-voksne blev underkastet protokollen som beskrevet ovenfor. Kort, fisk blev givet en 1-h akklimatisering periode i en tank i opførsel værelse. En person blev placeret i et bæger i 10-min, og derefter placeret forsigtigt i en ukendt tank (Roman tank) fyldt med frisk system vand. Lokomotor aktivitet blev indspillet i 10-min, og tracking blev udført offline ved hjælp af kommercielt tilgængelige software. Sammenligningen af lokomotor aktivitet mellem første og sidste minut viste dramatiske forskelle (figur 2A, B). Når først introduceret i tanken, fisk brugt størstedelen af tiden i bunden (figur 2b), men med tiden, voksne havde en gradvis stigning i mængden af tid tilbragt i toppen (figur 2b, C). Samlet varighed brugt i toppen i det første minut i forhold til sidste minut afslørede betydelige forskelle (6,29 ± 8,21 s vs. 23,23 ± 9,02 s; parret t-test, p < 0,05) (figur 2C). Den samlede distance, der er rejst mellem første og sidste minut, afslørede derimod ingen signifikante forskelle (440,4 ± 110,3 cm vs. 405,5 ± 49,71 cm; parret t-test, p = 0,375) (figur 2D). Fordi medfødt præference var forskellig mellem første og sidste minut, og ikke distance rejste, vi mener, at ændringen i adfærd repræsenterer en stress respons, og ikke blot en ændring i lokomotor aktivitet. Disse resultater viser, at: zebrafisk udviser en let målelig iboende stress respons. Denne fremgangsmåde etablerer også et grundlag for at sammenligne stress forskelle mellem forskellige grupper af dyr og vurdere forskellene i stress mellem dem.
Virkningerne af angstdæmpende medicin på stress adfærd i: zebrafisk
Zebrafish er et kraftfuldt system til screening narkotika, da anvendelsen af narkotika kan anvendes i ikke-invasive måder ved blot at tilføje til vandet25,26,27. For at validere, at bunden bolig i: zebrafisk repræsenterer en medfødt stress respons, vi sammenlignede adfærd i grupper af voksne: zebrafisk testet før og efter udsættelse for en angstdæmpende stof; som en kontrol, vi håndteret en separat af voksne på samme måde, men kun anvendes køretøj (system vand) i stedet for narkotika. Vi brugte 5HT1a receptor agonist buspiron, som ikke er et kontrolleret stof og er ordineret til humane patienter, der lider af generaliseret angst28. Buspiron er blevet valideret til at forårsage reduktion i adfærdsmæssige stress respons i forskellige fisk og pattedyr modeller10,13,21,29,30, 31af32,33,34 . Som beskrevet i protokollen, blev: zebrafisk først registreret i roman tank testen, derefter hentet og placeret i et bæger af stof eller køretøj i 10 min. fiskene fik derefter en "udvaskningsperiode", hvor de blev anbragt i et nyt bægerglas i 10 minutter og derefter optages igen i den nye tank prøve (figur 3a).
Analyse af lokomotor stier afslørede en lille forskel før og efter behandling for grupper af voksne, der er udsat for køretøjet alene (figur 3B). I modsætning hertil tilbragte voksne udsat for buspiron en stor mængde tid i toppen i forhold til de bevægelige stier af samme fisk før stof eksponering (figur 3B, C). Kvantificeringen af varigheden af den tid, der er brugt i toppen, afslørede ingen signifikante forskelle mellem før og efter behandling hos kontroldyr (183,9 ± 90,46 s før vs. 113,8 ± 81,88 s efter; envejs-ANOVA efterfulgt af Sidaks multiple sammenligningstest, p = 0,4254), men dyr udsat for buspiron brugt betydeligt mere tid i toppen i forhold til forbehandling, og kontrollere enkeltpersoner efter behandling (buspiron: 201,4 ± 49,95 s før vs. 552,2 ± 42,97 s efter; One-Way ANOVA efterfulgt af Sidaks multiple sammenligning test, p < 0,0001; Kontrol vs. buspiron efter behandling: p < 0,0001.) (Figur 3C). For at undersøge, om forskellene skyldtes mindre bevægelse i almindelighed, målte vi den samlede distance, der var rejst. Disse data viste ingen signifikante forskelle for nogen af grupperne (4134 ± 601,9 cm før vs. 3471 ± 766 cm efter kontrol; Kruskal-Wallis test, p > 0,05; 3904 ± 301,3 cm før vs. 3644 ± 566,3 cm efter buspiron; Kruskal-Wallis-testen, p > 0,05) (figur 3D). Tilsammen viser disse data, at bunden bolig i voksne zebrafisk er et mål for medfødt stress, og etablere et fundament for yderligere farmakologiske eksperimenter i voksne: zebrafisk.
Figur 1 . Diagram over opsætningen af Novel tank. A) dimensionerne af den 1,8 L trapezformede roman tank set fra indregistrerings siden af tanken. (B) diagram over opsætningen, herunder positioner af infrarøde lygter, kamera og barrierer, der anvendes til at minimere menneskelig interferens. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Undersøge medfødte stress reaktioner i vildtype zebrafish. A) repræsentative svømme stier for en individuel voksen i den nye tank prøve i det første minut (venstre) og sidste minut (højre) af en 10-minutters optagelse. Imaginære linjer, der definerer tankens top-, midter-og bund zoner, er angivet med punkterede streger. (B) kvantificering af samlet tidsforbrug i den øverste zone for hvert minut af 10 minutters optagelse. c &Amp; D) Sammenligninger af den samlede varighed brugt i den øverste zone (C) og den samlede tilbagelagte distance (D) i det første og sidste minut af alle forsøg. Parret t-tests blev brugt til analyse, da data bestået Shapiro-Wilk test for normalitet. n = 5; *: p = 0,028. Fejllinjer indikerer standardfejl i middelværdien. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Undersøgelse af virkningerne af angstdæmpende medicin på stress adfærd. (A) skematisk af eksperimentelt flow. B) repræsentative svømme stier før og efter behandling af en person fra en kontrol person, der kun er behandlet med system vand, og en anden person, der er behandlet med buspiron i den nye tank prøve. Stiplede linjer definerer adskillelse af top, midterste og nederste zoner af tanken. Grå spor repræsenterer den enkelte kontrol person, og blå spor repræsenterer den buspirone-behandlede person. c &Amp; D) Sammenligninger af samlet varighed brugt i den øverste zone (C) og samlet tilbagelagt distance (D) mellem kontrol (CTRL) og buspiron-behandlede (busp) forsøg. En test for normalitet ved hjælp af Shapiro-Wilk test blev først gjort. Hvis testen for normalitet mislykkedes, blev Kruskal-Wallis-testen efterfulgt af Dunns multiple sammenligningstest anvendt (C). og hvis data overskredet normalitet, en-vejs ANOVA efterfulgt af Sidaks multiple sammenligning test blev anvendt til analyse (D). n = 5 for hver betingelse; : p = 0,001. Fejllinjer indikerer standardfejl i middelværdien. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebrafish udviser en robust stress respons i en ny tank
Her beskriver vi en simpel adfærdsmæssig tilgang til at undersøge stress responser i voksne zebrafisk, og validere tilgangen som en simpel måling af stress ved hjælp af farmakologi.
Den nye tank test er en meget anvendt test for at undersøge medfødte stress i: zebrafisk og andre arter af fisk12,14,21,35,36, og: zebrafisk har vist sig at være en kraftfuld at undersøge de farmakologiske virkninger af angst-relaterede lægemidler. Svarende til mennesker, disse undersøgelser har vist, at lægemidler såsom buspiron, nikotin, fluoxetin, og Scopolamin har angstdæmpende virkninger i: zebrafisk12,13,14,37. Desuden, stoffer såsom Scopolamin, der typisk ikke anvendes til behandling af angst hos mennesker kan have yderligere angstdæmpende virkninger37. Drug skærme demonstrerer disse angstdæmpende virkninger i: zebrafisk kan lette studiet af bivirkninger og deres farmakologiske mekanismer. Yderligere, den: zebrafisk har en sammenlignelig stress respons vej til mennesker, dermed parring analysen med kvantificering af frigivelsen af cortisol efter en stressor eller narkotikabehandling kan bruges til at validere de adfærdsmæssige svar14. Endelig vil vi gerne påpege, at denne analyse ikke er specifik for zebrafisk, og at den også er blevet udvidet til andre fiskearter som den mexicanske blinde cavefish, Astyanax mexicanus21. Det er sandsynligt, at analysen kan udvides til cichlider38, myg fisk39, Killifish40, og andre Piscine systemer.
En vigtig fordel ved den nye tank test er dens økologiske relevans; som analysen foranstaltninger medfødte præference for den nederste halvdel af tanken, reaktionen er sandsynligvis en, der ville forekomme i naturen. Ud over den nye tank test, andre adfærdsmæssige analyser, der har været anvendt i andre modelorganismer kan bruges til yderligere at validere den adfærdsmæssige stress respons, såsom en åben felttest eller en lys/mørk assay41,42. Disse analyser er baseret på tendensen til et dyr til at følge siderne af arenaen (thigmotaxis), og præference for udforskning i mørket (scototaxis) efter at være blevet udsat for en stressende cue42,43. Desuden er elektrisk stød blevet brugt til at måle enten medfødte eller konditionerede frygt svar9,44,45, selv om den økologiske relevans af denne tilgang er uklar.
Når man overvejer en analyse for hans/hendes undersøgelse, er det vigtigt at tage hensyn til medfødte bias inden for stammer eller arter. Ud over at opretholde og reducere miljømæssige udsving i adfærdsmæssige assays, at holde den genetiske baggrund af test voksne konsekvent vil være afgørende, da forskning har vist variation inden for og mellem individer af samme genotype41 af46. En omfattende gennemgang af fordele, ulemper, gyldighed af hver fælles adfærdsmæssige assay bruges til at studere angst, og også variationer i adfærd inden for fælles dværg linjer kan findes andetsteds41.
Zebrafish som model for at undersøge stress
Zebrafish er ved at blive en populær model for undersøgelse af genetiske og neuronal veje, der moduleere præcise opførsel47,48, og nyligt udviklede hjernen Atlas giver mulighed for kortlægning neuroner regulerende adfærd med præcision49 ,50,51,52,53. Den tilgang, vi beskriver her for at måle medfødt angst er i stand til at udnytte kraftfulde genetiske og neurale kredsløb værktøjer i zebrafish. To forudsigelige tilgange er afhængige af den store samling af mutante linjer og transgene driver linjer. Mutant linjer, for eksempel, vil lette undersøgere til at undersøge den rolle, som præcise gener har i modulethed stress. Derudover, transgene Gal4/UAS og QF/quas system er blevet grundigt anvendt til: zebrafisk54,55, og når krydset til UAS eller quas Effector Lines, funktionen af præcise neuronal kredsløb kan manipuleres og adfærd Vurderet. Disse tilgange udgør et supplement til genetiske mutante linjer og gør det muligt at undersøge, hvordan præcise neurale kredsløb bidrager til stress.
Nye teknikker til at undersøge neurale aktivitet kan være fuldt integreret med denne analyse. Kvantificering af c-FOS mRNA eller protein er almindeligt anvendt til at undersøge neuronal aktivitet56. Dette gen er et umiddelbart tidligt gen, hvis transskription aktiveres af neuronal aktivitet. Der er udviklet nyere tilgange baseret på lignende metoder. For eksempel blev den ekstracellulære-signalregulerede kinase (Erk) for nylig udviklet til at undersøge neuronal aktivitet i: zebrafisk50. ERK-proteinet findes i næsten alle cellerne i det centrale nervesystem. Ved neuronal aktivering bliver ERK-peptid fosforyleret. Desuden er der udviklet pålidelige antistoffer mod både un-phosphoryleret ERK (total ERK, tERK) og phosphoryleret ERK (pERK), som fungerer godt i zebrafish. Ved samtidig mærkning med antistoffer, der er specifikke for tERK og pERK, kan neuronal aktivitet måles pålideligt. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, voksne, der markant vise mere bund bolig i romanen tank test kan fjernes efter optagelse, plettet for enten c-FOS eller tERK/pERK, og resulterende hjerne sektioner imaged.
Tilsammen bør disse tilgange lette en facile tilgang til dissekering af de genetiske og neuronale mekanismer, der ligger til grund for stress i zebrafisk. Desuden, på grund af den høje bevarelse af genetiske og neuronal veje i: zebrafisk og pattedyr, vi forventer, at disse metoder til at afsløre bevaret mekanismer underliggende stress adfærd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende eller økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af finansiering fra Jupiter Life Science Initiative på Florida Atlantic University til ERD og ACK. Dette arbejde blev også støttet af tilskud R21NS105071 (tildelt ACK og ERD) og R15MH118625 (tildelt ERD) fra National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera | We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics. | ||
| Infrared filter | Edmund Optics | ||
| Video Acquisition Program | Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set. | ||
| Infrared LED lights | |||
| Assay tank | Aquaneering | Part number ZT180 | Size: M3 1.8 liter |
| Stand and clamp, or standard tripod for camera | |||
| 250mL beaker | |||
| Tracking software | We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology | ||
| Buspirone chloride | Sigma-Aldrich | B7148 | |
| Randomized trial generator | We use the RANDBETWEEN function in Microsoft Excel |
References
- McEwen, B. S. Stress, adaptation, and disease. Allostasis and allostatic load. Annals of the New York Academy of Sciences. 840, 33-44 (1998).
- Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
- Facchinello, N., et al. Nr3c1 null mutant zebrafish are viable and reveal DNA-binding-independent activities of the glucocorticoid receptor. Scientific Reports. 7 (4371), (2017).
- Ziv, L., et al. An affective disorder in zebrafish with mutation of the glucocorticoid receptor. Molecular Psychiatry. , (2013).
- Grone, B. P., Maruska, K. P. Divergent evolution of two corticotropin-releasing hormone (CRH) genes in teleost fishes. Frontiers in Neuroscience. , (2015).
- Fuller, P. J., Lim-Tio, S. S., Brennan, F. E. Specificity in mineralocorticoid versus glucocorticoid action. Kidney International. , (2000).
- Zhdanova, I. V. Sleep and its regulation in zebrafish. Reviews in the Neurosciences. 22 (1), 27-36 (2011).
- Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nature Reviews Genetics. , (2001).
- Duboué, E. R. E. R., Hong, E., Eldred, K. C. K. C., Halpern, M. E. M. E. Left Habenular Activity Attenuates Fear Responses in Larval Zebrafish. Current Biology. 27 (14), 2154-2162 (2017).
- Facchin, L., Duboue, E. R., Halpern, M. E. Disruption of Epithalamic Left-Right Asymmetry Increases Anxiety in Zebrafish. Journal of Neuroscience. 35 (48), 15847-15859 (2015).
- Øverli, Ø, Sørensen, C., Nilsson, G. E. Behavioral indicators of stress-coping style in rainbow trout: Do males and females react differently to novelty. Physiology and Behavior. , (2006).
- Levin, E. D., Bencan, Z., Cerutti, D. T. Anxiolytic effects of nicotine in zebrafish. Physiology & behavior. 90 (1), 54-58 (2007).
- Bencan, Z., Sledge, D., Levin, E. D. Buspirone, chlordiazepoxide and diazepam effects in a zebrafish model of anxiety. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 94 (1), 75-80 (2009).
- Cachat, J., et al. Measuring behavioral and endocrine responses to novelty stress in adult zebrafish. Nature Protocols. 5 (11), 1786-1799 (2010).
- Mathuru, A. S., et al. Chondroitin fragments are odorants that trigger fear behavior in fish. Current Biology. , (2012).
- Alsop, D., Vijayan, M. The zebrafish stress axis: Molecular fallout from the teleost-specific genome duplication event. General and Comparative Endocrinology. , (2009).
- Evans, A. N., Liu, Y., MacGregor, R., Huang, V., Aguilera, G. Regulation of Hypothalamic Corticotropin-Releasing Hormone Transcription by Elevated Glucocorticoids. Molecular Endocrinology. , (2013).
- Fenoglio, K. A., Brunson, K. L., Avishai-Eliner, S., Chen, Y., Baram, T. Z. Region-specific onset of handling-induced changes in corticotropin- releasing factor and glucocorticoid receptor expression. Endocrinology. , (2004).
- Liposits, Z., et al. Ultrastructural localization of glucocorticoid receptor (GR) in hypothalamic paraventricular neurons synthesizing corticotropin releasing factor (CRF). Histochemistry. , (1987).
- Facchin, L., Duboué, E. R., Halpern, M. E. Disruption of epithalamic left-right asymmetry increases anxiety in Zebrafish. Journal of Neuroscience. 35 (48), (2015).
- Chin, J. S., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. , (2018).
- Wong, K., et al. Analyzing habituation responses to novelty in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 208 (2), 450-457 (2010).
- Matsunaga, W., Watanabe, E. Habituation of medaka (Oryzias latipes) demonstrated by open-field testing. Behavioural Processes. 85 (2), 142-150 (2010).
- Walker, C. Chapter 3 Haploid Screens and Gamma-Ray Mutagenesis. Methods in Cell Biology. , (1998).
- Rihel, J., et al. Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation. Science. 327, New York, N.Y. 348-351 (2010).
- Peal, D. S., Peterson, R. T., Milan, D. Small molecule screening in zebrafish. Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2010).
- Murphey, R., Zon, L. Small molecule screening in the zebrafish. Methods. 39 (3), 255-261 (2006).
- Gammans, R. E., et al. Use of buspirone in patients with generalized anxiety disorder and coexisting depressive symptoms. A meta-analysis of eight randomized, controlled studies. Neuropsychobiology. 25 (4), 193-201 (1992).
- Maaswinkel, H., Zhu, L., Weng, W. The immediate and the delayed effects of buspirone on zebrafish (Danio rerio) in an open field test: A 3-D approach. Behavioural Brain Research. , (2012).
- Gebauer, D. L., et al. Effects of anxiolytics in zebrafish: Similarities and differences between benzodiazepines, buspirone and ethanol. Pharmacology Biochemistry and Behavior. , (2011).
- Maximino, C., et al. Fingerprinting of psychoactive drugs in zebrafish anxiety-like behaviors. PLoS ONE. , (2014).
- Horváth, J., Barkóczi, B., Müller, G., Szegedi, V. Anxious and nonanxious mice show similar hippocampal sensory evoked oscillations under urethane anesthesia: Difference in the effect of buspirone. Neural Plasticity. , (2015).
- Costall, B., Kelly, M. E., Naylor, R. J., Onaivi, E. S. Actions of buspirone in a putative model of anxiety in the mouse. Pharm Pharmacol. 40 (7), 494-500 (1988).
- Barros, M., Mello, E. L., Huston, J. P., Tomaz, C. Behavioral effects of buspirone in the marmoset employing a predator confrontation test of fear and anxiety. Pharmacology Biochemistry and Behavior. , (2001).
- Heinen-Kay, J. L., et al. Predicting multifarious behavioural divergence in the wild. Animal Behaviour. 121, 3-10 (2016).
- Thompson, R. R. J., Paul, E. S., Radford, A. N., Purser, J., Mendl, M. Routine handling methods affect behaviour of three-spined sticklebacks in a novel test of anxiety. Behavioural Brain Research. 306, 26-35 (2016).
- Hamilton, T. J., et al. Establishing zebrafish as a model to study the anxiolytic effects of scopolamine. Scientific Reports. , (2017).
- York, R. A., Fernald, R. D. The Repeated Evolution of Behavior. Frontiers in Ecology and Evolution. 4, 143 (2017).
- Jakka, N. M., Rao, T. G., Rao, J. V. Locomotor behavioral response of mosquitofish (Gambusia affinis) to subacute mercury stress monitored by video tracking system. Drug and Chemical Toxicology. , (2007).
- Hu, C. K., Brunet, A. The African turquoise killifish: A research organism to study vertebrate aging and diapause. Aging Cell. , (2018).
- Maximino, C., et al. Measuring anxiety in zebrafish: A critical review. Behavioural Brain Research. 214 (2), 157-171 (2010).
- Maximino, C., Marques de Brito, T., Dias, C. A. G., Gouveia, A., Morato, S. Scototaxis as anxiety-like behavior in fish. Nature protocols. 5 (2), 209-216 (2010).
- Godwin, J., Sawyer, S., Perrin, F., Oxendine, S., Kezios, Z. Adapting the Open Field Test to assess anxiety related behavior in zebrafish. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. , 181-189 (2012).
- Agetsuma, M., et al. The habenula is crucial for experience-dependent modification of fear responses in zebrafish. Nature Neuroscience. 13 (11), 1354-1356 (2010).
- Valente, A., Huang, K. H., Portugues, R., Engert, F. Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish. Learning and Memory. , (2012).
- Baker, M. R., Goodman, A. C., Santo, J. B., Wong, R. Y. Repeatability and reliability of exploratory behavior in proactive and reactive zebrafish, Danio rerio. Scientific Reports. , (2018).
- Friedrich, R. W., Genoud, C., Wanner, A. A. Analyzing the structure and function of neuronal circuits in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. , 7 (2013).
- Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit Neuroscience in Zebrafish. Current Biology. 20 (8), (2010).
- Marquart, G. D., et al. A 3D Searchable Database of Transgenic Zebrafish Gal4 and Cre Lines for Functional Neuroanatomy Studies. Frontiers in Neural Circuits. , (2015).
- Randlett, O., et al. Whole-brain activity mapping onto a zebrafish brain atlas. Nature Methods. 12 (11), 1039-1046 (2015).
- Gupta, T., et al. Morphometric analysis and neuroanatomical mapping of the zebrafish brain. Methods. 1046 (18), 30011-30012 (2018).
- Marquart, G. D., et al. High-precision registration between zebrafish brain atlases using symmetric diffeomorphic normalization. GigaScience. , (2017).
- Ronneberger, O., et al. ViBE-Z: A framework for 3D virtual colocalization analysis in zebrafish larval brains. Nature Methods. , (2012).
- Subedi, A., et al. Adoption of the Q transcriptional regulatory system for zebrafish transgenesis. Methods. 66 (3), 433-440 (2014).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
- Chatterjee, D., Tran, S., Shams, S., Gerlai, R. A Simple Method for Immunohistochemical Staining of Zebrafish Brain Sections for c-fos Protein Expression. Zebrafish. , (2015).
