Summary
Dit manuscript beschrijft een eenvoudige methode om stress gedrag in volwassen zebravis te meten. De aanpak maakt gebruik van de aangeboren tendens dat zebravis de voorkeur aan de onderste helft van een tank, wanneer in een stressvolle toestand. Wij beschrijven ook methodes om de analyse met farmacologie te koppelen.
Abstract
Adequaat reageren op stress prikkels is essentieel voor het voortbestaan van een organisme. Uitgebreid onderzoek is gedaan op een breed spectrum van stress-gerelateerde ziekten en psychiatrische stoornissen, maar verder onderzoek naar de genetische en neuronale regulering van stress zijn nog steeds nodig om betere therapeutische ontwikkeling. De zebravis biedt een krachtig genetisch model om de neurale fundamenten van stress te onderzoeken, want er bestaat een grote collectie van mutant en transgene lijnen. Bovendien kan de farmacologie gemakkelijk worden toegepast op zebravis, aangezien de meeste drugs direct aan water kunnen worden toegevoegd. We beschrijven hier het gebruik van de ' novel tank test ' als een methode om aangeboren stress responsen in zebravis te bestuderen en te demonstreren hoe potentiële anxiolytische medicijnen kunnen worden gevalideerd met behulp van de assay. De methode kan gemakkelijk worden gekoppeld aan zebravis lijnen harboring genetische mutaties, of die waarin transgene benaderingen voor het manipuleren van nauwkeurige neurale circuits worden gebruikt. De assay kan ook gebruikt worden in andere vissen modellen. Samen, zou het beschreven protocol de goedkeuring van deze eenvoudige analyse aan andere laboratoria moeten vergemakkelijken.
Introduction
Stress reacties zijn veranderd gedrags-en fysiologische staten als gevolg van potentieel schadelijke of aversieve prikkels. De reacties van de spanning worden behouden door het dierlijke Koninkrijk, en zijn kritiek voor het voortbestaan van een organisme1. Decennia van onderzoek hebben sterk uitgebreid onze kennis van een aantal van de genetische en neuronale mechanismen ten grondslag liggen aan stress Staten. Vandaag, gebieden van de hersenen, zoals de amygdala en de striatum2, en genetische factoren zoals Corticotropin releasing hormoon (CRH), en de glucocorticoïd (gr) en Mineralocorticoid receptoren ( de heer) zijn uitgebreid bestudeerd3,4,5,6. Ondanks deze kritische bevindingen, veel blijft onbekend over genetische en neuronale regulering van stress. Als zodanig, veel stress gerelateerde aandoeningen lijden aan een gebrek aan therapeutische.
Genetisch te wijzigen modelorganismen bieden een nuttig instrument in de studie van genetische en neuronale controle van gedrag. Vis modellen, in het bijzonder, zijn zeer krachtig: ze zijn kleine organismen met korte generatie tijden, het gebruik ervan in een laboratoriumomgeving is gemakkelijk, hun genomen zijn eenvoudig te wijzigen, en, als een gewervelde, ze delen niet alleen genetische, maar ook neuroanatomische homologie met hun tegenhangers van zoogdieren7,8. Standaard assays voor het meten van stress kan worden gekoppeld aan zebravis lijnen harboring genetische mutaties, of die waarin manipulatie van nauwkeurige neuronale deelverzamelingen mogelijk is, en de effecten van enkelvoudige genen of gedefinieerde neuronen kunnen snel en efficiënt worden beoordeeld.
Gedragsmatige, stressreacties kunnen worden gekenmerkt in vis als periodes van Hyper-activiteit of langdurige periodes van inactiviteit (verwant aan ' bevriezen ')9, verminderde exploratie10, snelle ademhaling, verminderde voedselinname11, en een plaats-voorkeur voor de bodem van een tank12. Bijvoorbeeld, wanneer geplaatst in een onbekende tank, volwassen zebravis en andere kleine vissen modellen tonen een eerste voorkeur voor de onderste helft van de tank, maar toch, na verloop van tijd, de vis beginnen met het verkennen boven-en onderkant helften met bijna-gelijke frequentie12. Behandeling van volwassenen met geneesmiddelen bekend om angst te verminderen veroorzaken vissen om onmiddellijk te verkennen de bovenste helft van10,13. Omgekeerd, drugs die angst te verhogen veroorzaken vis om sterke voorkeur voor de onderste helft van de tank12,14,15te tonen. Zo, verminderde exploratie en voorkeur voor de onderste helft van de tank zijn eenvoudige en betrouwbare indicatoren van stress.
Net als de meeste gewervelde dieren, stressreacties in vissen worden gedreven door activering van hypothalamic-hypofyse-Inter-renale as (HPI; analoog aan de hypothalamic-hypofyse-bijnier [hpa] as bij zoogdieren)14,16. Hypothalamic neuronen het uitdrukken van het hormoon Corticotropin-releasing hormoon (CRH) signaal aan de hypofyse, die op zijn beurt releases adrenocorticotroop releasing hormoon (ACTH). Acth vervolgens signalen naar de Inter-renale klier te produceren en afscheiden cortisol, die een aantal van de downstream-doelstellingen heeft16, een van hen negatief feedback van de CRH-producerende hypothalamic neuronen3,17, 18,19.
Hier beschrijven we een methode om gedrags maatregelen van aangeboren stress te beoordelen. Voor het gedrag, we detail protocollen met behulp van de nieuwe tank duiken test12,14. We tonen dan, als voorbeeld, dat een bekende anxiolytische drug, buspirone, vermindert gedragsmatige maatregelen van stress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol is goedgekeurd door de institutionele Dierenzorg en het gebruik Committeeat Florida Atlantic University.
1. voorbereiding
- Wijs een geïsoleerde ruimte voor het uitvoeren van gedrags-studies, of sluit een gedeelte van een kamer, zodat het geïsoleerd is.
Opmerking: de kamer moet worden ongestoord en hebben weinig verkeer om te voorkomen dat het normale gedrag van de vis te verstoren. - Verplaats de volgende materialen en apparatuur in de gedrags kamer: (i) een camera en lens, (II) een infrarood filter die kan worden aangesloten op de lens, (III) een camerastand, (IV) een computer met camera acquisitie software, (v) een stevige en stabiele tafel om de test uit te voeren on, (VI) infraroodverlichting (IR verlichting; 850 nm of 940 nm), (VII) een witte acryl diffuser, die langer is dan de lengte van de opname tank (VIII) 1,8 L trapeziumvormige plastic assay tank (aangeduid als de ' nieuwe tank '; de een hier gebruikt is 12 x 18 inches) , en (IX) een emmer vis systeem water.
Opmerking: voor de nieuwe tank, ons Lab maakt gebruik van commercieel verkrijgbare plastic vaten, die zijn trapeziumvormig in vorm. De afmetingen van de tank zijn ongeveer 6 in x 9 in (gedetailleerde afmetingen zijn voorzien in Figuur 1a). De diffuser boord die we gebruiken is iets groter dan de nieuwe tank (12 in x 18 in). Nieuwe tank experimenten zijn uitgevoerd met tanks met verschillende vormen, zoals die welke zijn rechthoekig of die met andere trapeziumvormige afmetingen20,21. Typisch, vis gedrag is vergelijkbaar in alle tanks, ongeacht hun afmetingen: voor alle containers, vis in eerste instantie de voorkeur aan de onderste helft, maar na verloop van tijd beginnen met het verkennen van de bovenste helft met een grotere frequentie. - Bevestig het infrarood filter op de camera lens. De golflengten van de infrarode lichte stroken variëren typisch van 850 nm aan 940 nm. Het filter is een lange pass filter dat het licht van golflengten beperkt minder dan 720 nm van de overdracht door naar de camera.
- Selecteer geschikte parameters voor de camera acquisitie software. Voor de meeste opnames, zet de camera acquisitie tot een snelheid van 30 frames per seconde, en de opnameduur tot 10-min.
Opmerking: deze parameters kunnen verschillen, afhankelijk van het experiment. Bijvoorbeeld, om te studeren gewenning in een nieuwe tank22,23, langere opnames kunnen worden verlangd.
2. Setup
Opmerking: de stappen in deze sectie beschrijven het opzetten van de nieuwe tank assay. Een diagram van het eindproduct wordt gegeven in Figuur 1B.
- Plaats de nieuwe tank in het midden van de tafel.
- Positie van de infraroodverlichting achter de tank en plaats de witte acryl blad of diffuser scherm in tussen de tank en LED lichtbron.
- Plaats de diffuser, zodat het maximaal verspreidt het licht afkomstig van de Led's, en de intensiteit van het licht is genoeg om de nieuwe tank te verlichten. Hoe dichter het bord is om de lichtbron, hoe helderder de lichten zal worden, maar hoe minder het zal diffuse. Daarentegen, het plaatsen van de diffuser bord uit de buurt van de lichtbron zal verminderen lichtintensiteit, maar verspreid het licht beter.
- Vul ongeveer drie kwart van de nieuwe tank met het water van het vissen systeem.
Opmerking: systeem water wordt gegenereerd met omgekeerde osmose van leidingwater, gevolgd door dosering zodanig dat geleidbaarheid gelijk is aan 900 ± 100 µS, dat de pH neutraal is (7,2), en dat de temperatuur is 27 ± 1 °C. - Bevestig de camera op de camerastand en sluit de camera aan op de computer. Open de video acquisitie software en pas de camera aan de voorkant van de tank gezicht en zorgen voor de hele nieuwe tank kan worden gezien en dat er geen obscure gebieden in de video. Pas de tank en de infraroodverlichting zodanig dat er voldoende en zelfs verlichting in de gehele tank wanneer waargenomen door de camera.
Nota: alvorens aan experimenten over te gaan, kan het vaak nuttig zijn om een proeflooppas uit te voeren, waarin de video van een vissen wordt gevangen en het volgen wordt uitgevoerd. Dit zal ervoor zorgen dat de Setup voldoende is voor het experimenteren van gedrag.
3. nieuwe tank test Setup
- Bereid een 250 mL bekerglas vooraf gevuld met vis systeem water, en ten minste twee Holding tanks.
- Op de ochtend van de test, breng minstens 10 test volwassen zebravis voor elke experimentele voorwaarde (controles en experimentele volwassenen) van vissen faciliteit in een holdingstank over, breng hen naar de gedrags ruimte over, en laat hen aan acclimatiseren voor minstens één Uur.
Opmerking: een Power analyse moet worden uitgevoerd voordat experimenten, maar in onze handen, een n = 10 is meestal voldoende om statistische significantie te detecteren. Bovendien mag de vuilwatertank niet meer dan vijf personen per liter water bevatten. Een acclimatisatie van een uur is voldoende als zebravis volwassenen zijn aangetoond dat wennen binnen 30 minuten van een nieuwe tank22. Ook, gedrags ritmes worden beïnvloed door de dag van de processen, en dus experimentele replicaties gedaan op verschillende dagen moet worden uitgevoerd binnen dezelfde uren. We voeren meestal alle experimenten tussen de uren van 11:00 am en 6:00 pm. - Label de tanks zodanig dat de toestand of het genotype van de dieren is blind voor de experimenter.
Nota: de experimenten kunnen gemakkelijk aan de Experimenteer worden verblind door tanks te etiketteren gebruikend een brief of een systeem van het aantal (d.w.z., één tank is geëtiketteerde "A", een andere "B", enz.). Een partij die niet betrokken is bij de experimenten labels van de tanks met een dergelijk systeem, en maskers de identiteiten van de experimenter tot na de post-analyse is voltooid. - Met behulp van een net, plaats een alleenstaande volwassene in de voorgevulde Beker van stap 3,1. Laat de volwassen vis acclimatiseren in het bekerglas gedurende 10 minuten.
Nota: Neem het geslacht van de volwassene op, aangezien het belangrijke post-analyse zou kunnen zijn om geslacht-specifieke verschillen te zoeken. - Na acclimatisatie in het bekerglas, Introduceer de vis in de nieuwe tank (opgericht in sectie 1) door het water en de volwassene voorzichtig uit het bekerglas te gieten.
- Na de invoering van de volwassene in de nieuwe tank, start de camera-opname, en ga weg van de Setup om extra nood te voorkomen dat de vis.
- Na de opname is voltooid, verwijder het individu uit de nieuwe tank en plaats in een nieuwe holding tank.
Opmerking: een andere holding tank van de een in stap 3,2 moet worden gebruikt om herhaalde testen te voorkomen op dezelfde personen. - Herhaal stap 3,4 tot 3,7 voor elke volwassene totdat alle dieren zijn getest.
Opmerking: in aanvulling op verblindende voorwaarden of genotypes, randomize Trials. Gebruik een random number generator of een tool die het mogelijk maakt een willekeurig tussen de proeven. Dit moet worden gedaan voordat experimenten, zodat elke proef wordt bepaald voordat de experimenten beginnen. - Aan het einde van alle tests, terug de vis terug naar de vis faciliteit.
4. voor behandeling met drug
Opmerking: het doel van de volgende stappen is om het gedrag van een individu te vergelijken voor en na het gebruik van drugs. Deze vergelijking wordt bereikt door eerst het uitvoeren van een nieuwe tank test als in stap 3,4 tot 3,6, gevolgd door medicamenteuze behandeling, en vervolgens een tweede roman tank test (Figuur 3a).
- Bereid een voorraad oplossing van het geneesmiddel, met inbegrip van positieve en negatieve controles.
Nota: als het medicijn eerder in de literatuur is gebruikt, vind een aangewezen het werk dosis en gebruik dit. Bijvoorbeeld, voor buspirone in de representatieve resultaten, maken we een 100x voorraad oplossing en het gebruik 0,05 mg/ml als de uiteindelijke concentratie, zoals beschreven in de literatuur13,20. Als de voorgestelde dosis onbekend is, moet een dosis Response curve worden uitgevoerd door het onderzoeken van verschillende concentraties. Stel meer bekers met seriële verdunningen van drugs. Als het medicijn niet oplosbaar is in water, gebruik dan dimethyl sulfoxide (DMSO) als oplosmiddel. - Verdunnen van geneesmiddelen tot werkende concentratie in 250 mL bekers met systeem water. Bijvoorbeeld, als een 100x oplossing werd gemaakt, Verdun 1:100 in systeem water. Stel een bekerglas met alleen het systeem water als een controle.
Opmerking: als DMSO werd gebruikt als oplosmiddel in stap 3,1, gebruik dan een gelijk volume van DMSO in de controle beker. - Met de hulp van een andere onderzoeker, masker de identiteit van het medicijn en de controle bekers om ervoor te zorgen dat de tester is blind voor de behandeling voorwaarden tot na de analyse.
Opmerking: er kan een nummer-of letter systeem worden gebruikt. - Voer een nieuwe tank test uit door de stappen 3,1 tot en met 3,6 te volgen om een basislijn gedragsmatige stress respons te verkrijgen.
- Na de baseline-opname, gebruik dan een netto om onmiddellijk verwijderen van de volwassen vis uit de nieuwe tank en plaats deze in het bekerglas gedoseerd met drugs of voertuig, zoals beschreven in stap 4,2. Laat de volwassene in het bekerglas blijven gedurende 10 minuten.
Opmerking: Zorg ervoor dat het net het water in de bekers niet raakt om kruisbesmetting van drugs te voorkomen. Zorgen voor een goede dosering en administratietijd, afhankelijk van het gebruikte medicijn. Een 10 min behandeling tijd kan niet werken voor alle drugs. - Na de behandeling, gebruik dan een net om de volwassene te verwijderen uit het bekerglas in stap 4,5 en plaats deze in een andere beker gevuld met vers systeem water alleen. Dit is de Wash periode om verdere dosering te minimaliseren tijdens de tweede nieuwe tank test. Laat de volwassene in de afwas beker blijven voor een extra 10 min.
Nota: de afzonderlijke netten zouden voor elke drug voorwaarde moeten worden gebruikt om om het even welke ongewenste dwars behandeling met drug te verhinderen. De Wash periode kan worden overgeslagen als de experimenter wenst. - Voer de nieuwe tank Diving test een tweede keer door het verwijderen van die volwassene uit het bekerglas in de vorige stap, plaats deze in een nieuwe roman tank, en volg de stappen 3,5 tot 3,6.
- Na de tweede nieuwe tank test, verwijder het individu in een aparte holding tank. Giet het systeem water in de tweede nieuwe tank en vul het met vers systeem water voor de volgende test. Deze stap voorkomt kruisbesmetting van een geneesmiddel.
Opmerking: afhankelijk van de halfwaardetijd van de drugs, verse bekers die drugs bevatten moet worden gemaakt om de 3 uur. Voor buspirone, maak verse oplossingen om de 3 uur. Bovendien, na de nota in stap 3,8, moeten de proeven worden gerandomiseerd tussen de controles en medicamenteuze behandelingen. - Aan het einde van alle proeven, terug te keren individuen terug in de vis faciliteit.
Opmerking: afhankelijk van het type geneesmiddel dat wordt gebruikt, kunnen de effecten van deze behandelingen op individuen langdurig zijn. Gebruik deze personen daarom niet in andere experimenten.
5. video analyse
- Na alle proeven, laad video bestanden in tracking software van keuze.
Nota: wij gebruiken typisch commercieel beschikbare het volgen software, nog kunnen verscheidene vrij beschikbare softwarepakketten worden gebruikt. De stappen om tracking te bereiken kunnen verschillen naargelang het gebruikte software pakket. - Met behulp van een stilstaand beeld van de video, definieer denkbeeldige grenzen rond (i) de hele nieuwe tank Arena die is gevuld met water, en de grenzen rond (II) de bovenste derde, (III) middelste derde, en (IV) onderste derde van de tank. Gebruik deze om de tijd vast te stellen dat de vis doorgebracht in elk gedeelte van de nieuwe tank.
- Bereken x-y verplaatsing per frame voor elke Arena gedefinieerd in stap 5,2.
- Definieer de bovenste, middelste en onderste gebieden van de tank. Elke regio moet gelijk zijn in grootte. Een korte methode voor het bepalen van deze regio's is het berekenen van de lengte van de tank in de y-richting, en verdeel dit met 3.
Opmerking: er bestaan variaties in het algemene protocol. Sommige Labs gebruiken bijvoorbeeld de helften in plaats van de derde14. - Bepaal de tijd doorgebracht in elke Arena, de afstand, en de snelheid.
Nota: de meeste het volgen pakketten zullen automatisch deze voor de gebruiker berekenen. Echter, als de tracking software niet, kunnen deze gemakkelijk worden berekend van de x-y verplaatsing waarden. De afstand kan bijvoorbeeld worden bepaald met behulp van de formule:
en snelheid kan worden bepaald volgens de formule:
- Herhaal stap 5,2 tot en met 5,4 om tracks en metingen voor alle tests te verkrijgen.
Opmerking: variaties op dit algemene protocol
6. testen op normaliteit
- Statistieken uitvoeren voordat u statistische verschillen berekent. Controleer of de gegevens normaalgesproken worden gedistribueerd met een Shapiro-Wilk-test.
- Als de null-hypothese dat de gegevens normaliter worden gedistribueerd wordt afgewezen (d.w.z. dat de gegevens geen Gauss-verdeling volgen), voert u alle tests uit met niet-parametrische tests. Omgekeerd, als de gegevens worden gevonden om een normale verdeling te volgen, ga verder met parametrische tests te gebruiken.
Nota: wij gebruiken commercieel beschikbare software om statistieken uit te voeren; de programmeertaal R kan echter ook worden gebruikt. Een Shapiro-Wilk analyse kan uitgevoerd worden met behulp van de Shapiro. test functie van R.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het onderzoeken van spanning in zebravis
Om stress gedrag na verloop van tijd te onderzoeken in wild-type zebravis, testten we volwassen vis uit de AB strain24 in de novel tank test. AB volwassenen werden onderworpen aan het protocol zoals hierboven beschreven. Kort, vis kregen een 1-h acclimatisatie periode in een tank in het gedrag kamer. Een individu werd geplaatst in een bekerglas voor 10-min, en vervolgens voorzichtig geplaatst in een onbekende tank (nieuwe tank) gevuld met vers systeem water. Bewegings activiteit werd geregistreerd voor 10-min, en tracking werd uitgevoerd offline met behulp van commercieel beschikbare software. Vergelijking van de bewegings activiteit tussen de eerste en de laatste minuut toonde dramatische verschillen (Figuur 2A, B). Toen voor het eerst geïntroduceerd in de tank, vis bracht de meerderheid van de tijd in de bodem (Figuur 2b), maar na verloop van tijd, volwassenen hadden een geleidelijke toename van de hoeveelheid tijd die in de top (Figuur 2b, C). Totale duur in de top in de eerste minuut ten opzichte van de laatste minuut bleek significante verschillen (6,29 ± 8,21 s VS 23,23 ± 9,02 s; gepaarde t-toets, p < 0,05) (Figuur 2C). De totale afstand die tussen de eerste en de laatste minuut is afgelegd, heeft daarentegen geen significante verschillen geopenbaard (440,4 ± 110,3 cm vs. 405,5 ± 49,71 cm; gepaarde t-toets, p = 0,375) (Figuur 2D). Omdat de ingeboren voorkeur verschillend tussen de eerste en laatste minuut was, en niet afgelegde afstand, geloven wij de verandering in gedrag een spanningsreactie, en niet slechts een verandering in bewegings activiteit vertegenwoordigt. Deze resultaten tonen aan dat zebravis een gemakkelijk meetbare aangeboren spanningsreactie tentoonstelt. Deze aanpak stelt ook een fundament om de stress verschillen tussen verschillende groepen van dieren te vergelijken, en de verschillen in stress tussen hen te beoordelen.
Effecten van anxiolytische drugs op stress gedrag in zebravis
Zebravis zijn een krachtig systeem voor het screenen van drugs, omdat de toepassing van de drug kan worden toegepast in niet-invasieve manieren door simpelweg toe te voegen aan het water25,26,27. Om te valideren dat de bodem woning in zebravis een aangeboren spanningsreactie vertegenwoordigt, vergeleken wij gedrag in groepen volwassen zebravis die vóór en na blootstelling aan een anxiolytische drug worden getest; Als een controle, we behandeld een aparte van volwassenen op dezelfde manier, maar toegepast alleen voertuig (systeem water) in plaats van drugs. We gebruikten de 5HT1a receptor agonist buspirone, die niet is een gecontroleerde stof en wordt voorgeschreven aan menselijke patiënten die lijden aan gegeneraliseerde angststoornis28. Buspirone is gevalideerd voor vermindering van gedragsmatige stressreacties in verschillende vissen en zoogdieren modellen10,13,21,29,30, 31,32,33,34 . Zoals beschreven in het Protocol, zebravis werden voor het eerst opgenomen in de roman tank test, vervolgens teruggewonnen en geplaatst in een beker van drugs of voertuig voor 10 min. vis kreeg vervolgens een ' wash-out ' periode, waar ze werden geplaatst in een nieuw bekertje voor 10 min , en vervolgens opnieuw opgenomen in de nieuwe tank test (Figuur 3a).
Analyse van bewegingspaden bleek weinig verschil voor en na de behandeling voor groepen van volwassenen blootgesteld aan het voertuig alleen (Figuur 3B). Daarentegen, volwassenen blootgesteld aan buspirone bracht een grote hoeveelheid tijd in de top in vergelijking met de bewegingspaden van dezelfde vis voor blootstelling aan drugs (Figuur 3B, C). Kwantificering van de duur van de tijd doorgebracht in de Top bleek geen significante verschillen tussen pre-en post-behandeling in controledieren (183,9 ± 90,46 s vóór VS 113,8 ± 81,88 s na; one-way ANOVA, gevolgd door Monica meerdere vergelijkingen test, p = 0,4254), maar nog dieren blootgesteld aan buspirone besteed aanzienlijk meer tijd in de top ten opzichte van voor behandeling, en controlepersonen na de behandeling (buspirone: 201,4 ± 49,95 s vóór VS 552,2 ± 42,97 s na; one-way ANOVA, gevolgd door Monica 's multiple de test van vergelijkingen, p < 0,0001; Controle versus buspirone post-behandeling: p < 0,0001.) (Figuur 3C). Om te onderzoeken of de verschillen te wijten waren aan minder motoriek in het algemeen, hebben we gemeten totale afstand gereisd. Deze gegevens toonden geen significante verschillen voor een van de groepen (4134 ± 601,9 cm voor VS. 3471 ± 766 cm na voor controle; Kruskal-de test van Wallis, p > 0,05; 3904 ± 301,3 cm voor VS. 3644 ± 566,3 cm na voor buspirone; Kruskal-Wallis test, p > 0,05) (Figuur 3D). Samen genomen, tonen deze gegevens aan dat de bodem woning in volwassen zebravis een maatregel van ingeboren spanning is, en vestigt een Stichting voor verdere farmacologische experimenten in volwassen zebravis.
Figuur 1 . Diagram van de nieuwe tank opstelling. (A) afmetingen van de 1,8 L trapeziumvormige nieuwe tank gezien vanaf de opname kant van de tank. (B) schema van de opstelling met inbegrip van posities van de infrarode lichten, de camera, en de barrières die worden gebruikt om menselijke interferentie te minimaliseren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 . Het onderzoeken van ingeboren spanningsreacties in wild-type zebravis. (A) representatieve zwem paden van een individuele volwassene in de nieuwe tank test in de eerste minuut (links) en last minute (rechts) van een 10-min opname. Denkbeeldige lijnen die de bovenste, middelste en onderste zones van de tank definiëren, worden aangeduid met stippellijnen. (B) kwantificering van de totale tijd besteden in de bovenste zone voor elke minuut van de 10-min opname. (C &Amp; D) Vergelijkingen van de totale bestede duur in de bovenste zone (C) en de totale afgelegde afstand (D) in de eerste en de laatste minuut van alle proeven. De gepaarde t-tests werden gebruikt voor analyse aangezien de gegevens de test Shapiro-Wilk voor normaliteit overgingen. n = 5; *: p = 0,028. Foutbalken geven standaardfout van het gemiddelde aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 . Onderzoek naar de effecten van anxiolytische drugs op stress gedrag. (A) schema van de experimentele stroming. (B) representatieve zwem paden pre-en post-behandeling van een individu van een controle-persoon alleen behandeld met het systeem water, en een ander individu behandeld met buspirone in de roman tank test. Gestippelde lijnen definiëren de scheiding van de bovenste, middelste en onderste zones van de tank. De grijze sporen vertegenwoordigen het controle individu, en de blauwe sporen vertegenwoordigen het buspirone-behandelde individu. (C &Amp; D) Vergelijkingen van de totale duur die in de bovenste zone (C) en totale afstand gereisd (D) tussen controle (CTRL) en buspirone-behandeld (Busp) proeven. Een test voor normaliteit met behulp van de Shapiro-Wilk test werd voor het eerst gedaan. Wanneer de test voor normaliteit ontbroken, Kruskal-de test van Wallis die door de veelvoudige vergelijkingen test van Dunn wordt gevolgd werd gebruikt (C); en als de gegevens doorgegeven normaliteit, one-way ANOVA, gevolgd door meerdere vergelijkingen Monica test werd gebruikt voor de analyse (D). n = 5 voor elke voorwaarde; : p = 0,001. Foutbalken geven standaardfout van het gemiddelde aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebravis vertonen een robuuste stress respons in een nieuwe tank
Hier, beschrijven wij een eenvoudige gedrags benadering voor het onderzoeken van spanningsreacties in volwassen zebravis, en valideren de benadering als eenvoudige maatregel van spanning gebruikend farmacologie.
De roman tank test is een wijd gebruikte test voor het onderzoeken van ingeboren spanning in zebravis en andere soorten vissen12,14,21,35,36, en zebravis is aangetoond om een krachtige model om de farmacologische effecten van angst-gerelateerde drugs te onderzoeken. Gelijkaardig aan mensen, hebben deze studies aangetoond dat de drugs zoals buspirone, nicotine, Fluoxetine, en scopolamine anxiolytische gevolgen in zebravis12,13,14,37hebben. Bovendien, drugs zoals scopolamine die meestal niet worden gebruikt om angst te behandelen bij de mens kan hebben extra anxiolytische effecten37. Drug schermen die deze anxiolytische effecten aantonen in zebravis kunnen de studie van neveneffecten en hun farmacologische mechanismen vergemakkelijken. Verder, de zebravis heeft een vergelijkbare stress response pad naar de mens, vandaar het koppelen van de assay met kwantificering van de afgifte van cortisol na een stressor of medicamenteuze behandeling kan worden gebruikt om de gedrags-reacties te valideren14. Tot slot willen wij erop wijzen dat deze analyse niet specifiek is voor zebravis, en ook is uitgebreid naar andere vissoorten zoals de Mexicaanse blinde cavefish, Astyanax mexicanus21. Het is waarschijnlijk dat de assay kan worden uitgebreid tot cichliden38, mosquitofish39, Killifish40, en andere piscine systemen.
Een belangrijk voordeel van de nieuwe tank test is de ecologische relevantie ervan; Als de assay maatregelen aangeboren voorkeur voor de onderste helft van de tank, de reactie is waarschijnlijk een die zou optreden in het wild. In aanvulling op de nieuwe tank test, andere gedrags-analyses die zijn gebruikt in andere modelorganismen kunnen worden gebruikt om verder te valideren van de gedrags-stress reactie, zoals een open veldtest of een licht/donker assay41,42. Deze analyses zijn gebaseerd op de tendens voor een dier om de kanten van de Arena (thigmotaxis) te volgen, en voorkeur voor exploratie in Dark (scototaxis) na wordt blootgesteld aan een stressvolle Cue42,43. Bovendien is de elektrische schok gebruikt om of aangeboren of geconditioneerde vrees reacties9,44,45te meten, hoewel de ecologische relevantie van deze benadering onduidelijk is.
Wanneer men overweegt een test voor zijn/haar studie, is het belangrijk om rekening te houden met aangeboren bias binnen stammen of soorten. Naast het behoud en de vermindering van het milieu fluctuaties in gedrags-analyses, het houden van de genetische achtergrond van de test volwassenen consistent zal van vitaal belang zijn, omdat onderzoek heeft aangetoond variabiliteit binnen en tussen individuen van hetzelfde genotype41 ,46. Een uitvoerig overzicht van de voordelen, de nadelen, de geldigheid van elke gemeenschappelijke gedragsanalyse die wordt gebruikt om bezorgdheid te bestuderen, en ook variaties in gedrag binnen gemeenschappelijke wild type lijnen kan elders41worden gevonden.
Zebravis als model voor de behandeling van stress
Zebravis zijn steeds een populair model voor de behandeling van genetische en neuronale paden die moduleren nauwkeurig gedrag47,48, en recent ontwikkelde hersenen atlassen maken het mogelijk voor het in kaart brengen van neuronen reguleren gedrag met precisie49 ,50,51,52,53. De benadering die wij hier aan het meten van ingeboren bezorgdheid hebben beschreven kan krachtige genetische en neurale kringen hulpmiddelen in zebravis benutten. Twee te verwachten benaderingen vertrouwen op de grote verzameling van mutant lijnen en transgene driver lijnen. Mutant lijnen, bijvoorbeeld, zal vergemakkelijken onderzoekers om de rol die precieze genen hebben in modulerende stress te onderzoeken. Bovendien, transgene Gal4/UAS en QF/QUAS systeem zijn uitgebreid toegepast op zebravis54,55, en wanneer gekruist naar UAS of QUAS effect lijnen, de functie van nauwkeurige neuronale circuits kunnen worden gemanipuleerd en gedrag Beoordeeld. Deze benaderingen bieden een aanvulling op genetische Mutant lijnen, en laten onderzoeken hoe nauwkeurige neurale circuits bijdragen aan stress.
Nieuwe technieken voor de behandeling van neurale activiteit kan volledig worden geïntegreerd met deze test. De kwantificering van c-fos mRNA of proteïne wordt wijd gebruikt om neuronale activiteit56te onderzoeken. Dit gen is een onmiddellijk vroeg gen, waarvan de transcriptie wordt geactiveerd door Neuronale activiteit. De nieuwere benaderingen die op gelijkaardige methodologie worden gebaseerd zijn ontwikkeld. Bijvoorbeeld, de extracellulaire-Signal-gereguleerde kinase (ERK) werd onlangs ontwikkeld voor de behandeling van neuronale activiteit in zebravis50. De ERK proteïne bestaat in bijna alle cellen van het centrale zenuwstelsel. Bij neuronale activering, de ERK peptide geworden phosphorylated. Bovendien, betrouwbare antilichamen voor zowel un-phosphorylated ERK (Total ERK, tERK) en phosphorylated ERK (pERK) zijn ontwikkeld en werken goed in zebravis. Zo, door co-labeling met antilichamen die specifiek zijn voor tERK en pERK, neuronale activiteit betrouwbaar kan worden gemeten. Met behulp van deze aanpak, volwassenen die aanzienlijk meer bodem woning weer te geven in de nieuwe tank test kan worden verwijderd na de opname, gekleurd voor zowel c-fos of tERK/pERK, en de daaruit voortvloeiende hersen secties beeld.
Tezamen moeten deze benaderingen een gemakkelijke aanpak vergemakkelijken voor het ontleden van de genetische en neuronale mechanismen die aan stress ten grondslag liggen in zebravis. Bovendien, als gevolg van de hoge instandhouding van genetische en neuronale paden in zebravis en zoogdieren, verwachten we dat deze methoden te onthullen geconserveerde mechanismen onderliggende stress gedrag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende of financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de financiering van de Jupiter Life Science Initiative aan de Florida Atlantic University naar ERD en ACK. Dit werk werd ook ondersteund door subsidies R21NS105071 (toegekend aan ACK en ERD) en R15MH118625 (toegekend aan ERD) van de nationale instituten van de gezondheid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera | We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics. | ||
| Infrared filter | Edmund Optics | ||
| Video Acquisition Program | Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set. | ||
| Infrared LED lights | |||
| Assay tank | Aquaneering | Part number ZT180 | Size: M3 1.8 liter |
| Stand and clamp, or standard tripod for camera | |||
| 250mL beaker | |||
| Tracking software | We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology | ||
| Buspirone chloride | Sigma-Aldrich | B7148 | |
| Randomized trial generator | We use the RANDBETWEEN function in Microsoft Excel |
References
- McEwen, B. S. Stress, adaptation, and disease. Allostasis and allostatic load. Annals of the New York Academy of Sciences. 840, 33-44 (1998).
- Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
- Facchinello, N., et al. Nr3c1 null mutant zebrafish are viable and reveal DNA-binding-independent activities of the glucocorticoid receptor. Scientific Reports. 7 (4371), (2017).
- Ziv, L., et al. An affective disorder in zebrafish with mutation of the glucocorticoid receptor. Molecular Psychiatry. , (2013).
- Grone, B. P., Maruska, K. P. Divergent evolution of two corticotropin-releasing hormone (CRH) genes in teleost fishes. Frontiers in Neuroscience. , (2015).
- Fuller, P. J., Lim-Tio, S. S., Brennan, F. E. Specificity in mineralocorticoid versus glucocorticoid action. Kidney International. , (2000).
- Zhdanova, I. V. Sleep and its regulation in zebrafish. Reviews in the Neurosciences. 22 (1), 27-36 (2011).
- Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nature Reviews Genetics. , (2001).
- Duboué, E. R. E. R., Hong, E., Eldred, K. C. K. C., Halpern, M. E. M. E. Left Habenular Activity Attenuates Fear Responses in Larval Zebrafish. Current Biology. 27 (14), 2154-2162 (2017).
- Facchin, L., Duboue, E. R., Halpern, M. E. Disruption of Epithalamic Left-Right Asymmetry Increases Anxiety in Zebrafish. Journal of Neuroscience. 35 (48), 15847-15859 (2015).
- Øverli, Ø, Sørensen, C., Nilsson, G. E. Behavioral indicators of stress-coping style in rainbow trout: Do males and females react differently to novelty. Physiology and Behavior. , (2006).
- Levin, E. D., Bencan, Z., Cerutti, D. T. Anxiolytic effects of nicotine in zebrafish. Physiology & behavior. 90 (1), 54-58 (2007).
- Bencan, Z., Sledge, D., Levin, E. D. Buspirone, chlordiazepoxide and diazepam effects in a zebrafish model of anxiety. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 94 (1), 75-80 (2009).
- Cachat, J., et al. Measuring behavioral and endocrine responses to novelty stress in adult zebrafish. Nature Protocols. 5 (11), 1786-1799 (2010).
- Mathuru, A. S., et al. Chondroitin fragments are odorants that trigger fear behavior in fish. Current Biology. , (2012).
- Alsop, D., Vijayan, M. The zebrafish stress axis: Molecular fallout from the teleost-specific genome duplication event. General and Comparative Endocrinology. , (2009).
- Evans, A. N., Liu, Y., MacGregor, R., Huang, V., Aguilera, G. Regulation of Hypothalamic Corticotropin-Releasing Hormone Transcription by Elevated Glucocorticoids. Molecular Endocrinology. , (2013).
- Fenoglio, K. A., Brunson, K. L., Avishai-Eliner, S., Chen, Y., Baram, T. Z. Region-specific onset of handling-induced changes in corticotropin- releasing factor and glucocorticoid receptor expression. Endocrinology. , (2004).
- Liposits, Z., et al. Ultrastructural localization of glucocorticoid receptor (GR) in hypothalamic paraventricular neurons synthesizing corticotropin releasing factor (CRF). Histochemistry. , (1987).
- Facchin, L., Duboué, E. R., Halpern, M. E. Disruption of epithalamic left-right asymmetry increases anxiety in Zebrafish. Journal of Neuroscience. 35 (48), (2015).
- Chin, J. S., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. , (2018).
- Wong, K., et al. Analyzing habituation responses to novelty in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 208 (2), 450-457 (2010).
- Matsunaga, W., Watanabe, E. Habituation of medaka (Oryzias latipes) demonstrated by open-field testing. Behavioural Processes. 85 (2), 142-150 (2010).
- Walker, C. Chapter 3 Haploid Screens and Gamma-Ray Mutagenesis. Methods in Cell Biology. , (1998).
- Rihel, J., et al. Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation. Science. 327, New York, N.Y. 348-351 (2010).
- Peal, D. S., Peterson, R. T., Milan, D. Small molecule screening in zebrafish. Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2010).
- Murphey, R., Zon, L. Small molecule screening in the zebrafish. Methods. 39 (3), 255-261 (2006).
- Gammans, R. E., et al. Use of buspirone in patients with generalized anxiety disorder and coexisting depressive symptoms. A meta-analysis of eight randomized, controlled studies. Neuropsychobiology. 25 (4), 193-201 (1992).
- Maaswinkel, H., Zhu, L., Weng, W. The immediate and the delayed effects of buspirone on zebrafish (Danio rerio) in an open field test: A 3-D approach. Behavioural Brain Research. , (2012).
- Gebauer, D. L., et al. Effects of anxiolytics in zebrafish: Similarities and differences between benzodiazepines, buspirone and ethanol. Pharmacology Biochemistry and Behavior. , (2011).
- Maximino, C., et al. Fingerprinting of psychoactive drugs in zebrafish anxiety-like behaviors. PLoS ONE. , (2014).
- Horváth, J., Barkóczi, B., Müller, G., Szegedi, V. Anxious and nonanxious mice show similar hippocampal sensory evoked oscillations under urethane anesthesia: Difference in the effect of buspirone. Neural Plasticity. , (2015).
- Costall, B., Kelly, M. E., Naylor, R. J., Onaivi, E. S. Actions of buspirone in a putative model of anxiety in the mouse. Pharm Pharmacol. 40 (7), 494-500 (1988).
- Barros, M., Mello, E. L., Huston, J. P., Tomaz, C. Behavioral effects of buspirone in the marmoset employing a predator confrontation test of fear and anxiety. Pharmacology Biochemistry and Behavior. , (2001).
- Heinen-Kay, J. L., et al. Predicting multifarious behavioural divergence in the wild. Animal Behaviour. 121, 3-10 (2016).
- Thompson, R. R. J., Paul, E. S., Radford, A. N., Purser, J., Mendl, M. Routine handling methods affect behaviour of three-spined sticklebacks in a novel test of anxiety. Behavioural Brain Research. 306, 26-35 (2016).
- Hamilton, T. J., et al. Establishing zebrafish as a model to study the anxiolytic effects of scopolamine. Scientific Reports. , (2017).
- York, R. A., Fernald, R. D. The Repeated Evolution of Behavior. Frontiers in Ecology and Evolution. 4, 143 (2017).
- Jakka, N. M., Rao, T. G., Rao, J. V. Locomotor behavioral response of mosquitofish (Gambusia affinis) to subacute mercury stress monitored by video tracking system. Drug and Chemical Toxicology. , (2007).
- Hu, C. K., Brunet, A. The African turquoise killifish: A research organism to study vertebrate aging and diapause. Aging Cell. , (2018).
- Maximino, C., et al. Measuring anxiety in zebrafish: A critical review. Behavioural Brain Research. 214 (2), 157-171 (2010).
- Maximino, C., Marques de Brito, T., Dias, C. A. G., Gouveia, A., Morato, S. Scototaxis as anxiety-like behavior in fish. Nature protocols. 5 (2), 209-216 (2010).
- Godwin, J., Sawyer, S., Perrin, F., Oxendine, S., Kezios, Z. Adapting the Open Field Test to assess anxiety related behavior in zebrafish. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. , 181-189 (2012).
- Agetsuma, M., et al. The habenula is crucial for experience-dependent modification of fear responses in zebrafish. Nature Neuroscience. 13 (11), 1354-1356 (2010).
- Valente, A., Huang, K. H., Portugues, R., Engert, F. Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish. Learning and Memory. , (2012).
- Baker, M. R., Goodman, A. C., Santo, J. B., Wong, R. Y. Repeatability and reliability of exploratory behavior in proactive and reactive zebrafish, Danio rerio. Scientific Reports. , (2018).
- Friedrich, R. W., Genoud, C., Wanner, A. A. Analyzing the structure and function of neuronal circuits in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. , 7 (2013).
- Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit Neuroscience in Zebrafish. Current Biology. 20 (8), (2010).
- Marquart, G. D., et al. A 3D Searchable Database of Transgenic Zebrafish Gal4 and Cre Lines for Functional Neuroanatomy Studies. Frontiers in Neural Circuits. , (2015).
- Randlett, O., et al. Whole-brain activity mapping onto a zebrafish brain atlas. Nature Methods. 12 (11), 1039-1046 (2015).
- Gupta, T., et al. Morphometric analysis and neuroanatomical mapping of the zebrafish brain. Methods. 1046 (18), 30011-30012 (2018).
- Marquart, G. D., et al. High-precision registration between zebrafish brain atlases using symmetric diffeomorphic normalization. GigaScience. , (2017).
- Ronneberger, O., et al. ViBE-Z: A framework for 3D virtual colocalization analysis in zebrafish larval brains. Nature Methods. , (2012).
- Subedi, A., et al. Adoption of the Q transcriptional regulatory system for zebrafish transgenesis. Methods. 66 (3), 433-440 (2014).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
- Chatterjee, D., Tran, S., Shams, S., Gerlai, R. A Simple Method for Immunohistochemical Staining of Zebrafish Brain Sections for c-fos Protein Expression. Zebrafish. , (2015).
