Summary
Este manuscrito describe un método simple para medir el estrés de forma oral en el pez cebra adulto. El enfoque aprovecha la tendencia innata que el pez cebra prefiere la mitad inferior de un tanque cuando está en un estado estresante. También describimos métodos para acoplar el ensayo con farmacología.
Abstract
Responder apropiadamente a estímulos estresantes es esencial para la supervivencia de un organismo. Se ha realizado una extensa investigación sobre un amplio espectro de enfermedades relacionadas con el estrés y trastornos psiquiátricos, pero aún se requieren más estudios sobre la regulación genética y neuronal del estrés para desarrollar una mejor terapéutica. El pez cebra proporciona un poderoso modelo genético para investigar los fundamentos neurales del estrés, ya que existe una gran colección de líneas mutantes y transgénicas. Además, la farmacología se puede aplicar fácilmente al pez cebra, ya que la mayoría de los fármacos se pueden agregar directamente al agua. Describimos aquí el uso de la ' prueba de tanque de novela ' como un método para estudiar las respuestas de estrés innata en el pez cebra, y demostrar cómo los fármacos ansiolíticos potenciales pueden ser validados utilizando el ensayo. El método se puede acoplar fácilmente con las líneas de pez cebra que albergan mutaciones genéticas, o aquellos en los que se utilizan enfoques transgénicos para manipular circuitos neuronales precisos. El ensayo también se puede utilizar en otros modelos de peces. En conjunto, el protocolo descrito debería facilitar la adopción de este sencillo ensayo a otros laboratorios.
Introduction
Las respuestas de estrés son estados fisiológicos y conductuales alterados resultantes de estímulos potencialmente dañinos o aversivos. Las respuestas al estrés se conservan en todo el reino animal, y son fundamentales para la supervivencia de un organismo1. Décadas de investigación han ampliado en gran medida nuestro conocimiento de algunos de los mecanismos genéticos y neuronales subyacentes Estados de estrés. En la actualidad, las áreas del cerebro, como la amígdala y el estriado2, y los factores genéticos como la hormona liberadora de corticotropina (CRH) y los receptores glucocorticoides (gr) y mineralocorticoides ( Mr) se han estudiado extensamente3,4,5,6. A pesar de estos hallazgos críticos, todavía se desconoce mucho sobre la regulación genética y neuronal del estrés. Como tal, muchos trastornos relacionados con el estrés sufren de una falta de terapias.
Los organismos modelo genéticamente modificables proporcionan una herramienta útil en el estudio del control genético y neuronal del comportamiento. Los modelos de peces, en particular, son extremadamente poderosos: son pequeños organismos con tiempos de generación corta, su uso en un entorno de laboratorio es Facile, sus genomas son fácilmente modificados, y, como vertebrados, comparten no sólo genética, sino también neuroanatómico homología con sus homólogosdemamífero7,8. Los ensayos estándar para medir el estrés se pueden emparejar con las líneas de pez cebra que albergan mutaciones genéticas, o aquellas en las que es posible manipular subconjuntos neuronales precisos, y los efectos de genes individuales o neuronas definidas pueden evaluarse de forma rápida y eficiente.
El comportamiento, las respuestas de estrés se pueden caracterizar en el pescado como períodos de hiper-actividad o períodos prolongados de inactividad (similar a ' congelación ')9, reducción de la exploración10, respiración rápida, reducción de la ingesta de alimentos11, y un lugar-preferencia para el fondo de un tanque12. Por ejemplo, cuando se coloca en un tanque desconocido, pez cebra adulto y otros modelos de peces pequeños muestran una preferencia inicial para la mitad inferior del tanque, sin embargo, con el tiempo, los peces comienzan a explorar las mitades superior e inferior con la frecuencia casi igual12. El tratamiento de los adultos con fármacos conocidos para reducir la ansiedad causa que los peces exploren inmediatamente la mitad superior10,13. Por el contrario, los fármacos que aumentan la ansiedad causan que los peces muestren una fuerte preferencia por la mitad inferior del tanque12,14,15. Por lo tanto, la exploración reducida y la preferencia por la mitad inferior del tanque son indicadores simples y confiables de estrés.
Como la mayoría de los vertebrados, las respuestas de estrés en los peces son impulsadas por la activación del eje hipotalámico-pituitario-inter-renal (HPI; análogo al eje hipotalámico-pituitario-suprarrenal [hPa] en mamíferos)14,16. Las neuronas hipotalámicas que expresan la hormona liberadora de corticotropina hormonal (CRH) la señal a la hipófisis, que a su vez libera la hormona liberadora adrenocorticotropa (ACTH). ACTH entonces señala a la glándula Interrenal para producir y secretar cortisol, que tiene una serie de objetivos descendentes16, uno de ellos siendo retroalimentación negativa de las neuronas hipotalámicas que producen CRH3,17, 18,19.
Aquí describimos un método para evaluar las medidas conductuales del estrés innato. Para el comportamiento, detallamos los protocolos usando la nueva prueba de buceo de tanque12,14. A continuación, demostramos, como ejemplo, que un fármaco ansiolítico conocido, la buspirona, reduce las medidas conductuales del estrés.
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Protocol
El protocolo ha sido aprobado por el Comité institucional de cuidado de animales y uso de la Universidad atlántica de Florida Atlantic.
1. preparación
- Designe una habitación aislada para realizar estudios de comportamiento o cierre una sección de una habitación para que se aísla.
Nota: la habitación debe estar sin perturbaciones y tener poco tráfico para evitar alterar el comportamiento normal de los peces. - Mueva los siguientes materiales y equipos a la sala de comportamiento: (i) una cámara y una lente, (II) un filtro infrarrojo que se puede adjuntar a la lente, (III) un soporte de cámara, (IV) un ordenador con software de adquisición de cámara, (v) una mesa firme y estable para realizar el ensayo on, (VI) luces infrarrojas (luces IR; 850 nm o 940 nm), (VII) un difusor de acrílico blanco, que es más largo que la longitud del tanque de grabación (VIII) 1,8 L tanque de ensayo de plástico trapezoidal (conocido como el "tanque de novela"; el que se utiliza aquí es 12 x 18 pulgadas) , y (IX) un cubo de agua del sistema de peces.
Nota: para el tanque de novela, nuestro laboratorio utiliza recipientes de plástico disponibles comercialmente, que son de forma trapezoidal. Las dimensiones del tanque son aproximadamente 6 en x 9 en (las dimensiones detalladas se proporcionan en la figura 1A). La placa difusora que utilizamos es ligeramente más grande que el nuevo tanque (12 en x 18 pulg). Se han llevado a cabo experimentos con tanques que tienen diferentes formas, como las que son rectangulares o las que tienen distintas dimensiones trapezoidales20,21. Típicamente, el comportamiento de los peces es similar en todos los tanques independientemente de sus dimensiones: para todos los recipientes, los peces prefieren inicialmente la mitad inferior, pero con el tiempo comienzan a explorar la mitad superior con mayor frecuencia. - Conecte el filtro infrarrojo a la lente de la cámara. Las longitudes de onda de las tiras de luz infrarroja suelen oscilar entre 850 nm y 940 nm. El filtro es un filtro de paso largo que restringe la luz de longitudes de onda menos de 720 nm de transmitir a través de la cámara.
- Seleccione los parámetros adecuados para el software de adquisición de cámara. Para la mayoría de las grabaciones, establezca la adquisición de la cámara a una velocidad de 30 fotogramas por segundo y la duración de la grabación a 10 minutos.
Nota: estos parámetros pueden diferir, dependiendo del experimento. Por ejemplo, para estudiar la habituación en un nuevo tanque22,23, es posible que se requieran grabaciones más largas.
2. configuración
Nota: los pasos descritos en esta sección describen la configuración del ensayo del nuevo tanque. Un diagrama del producto final se da en la figura 1B.
- Coloque el tanque de novela en el centro de la mesa.
- Coloque las luces infrarrojas detrás del tanque y coloque la lámina acrílica blanca o la pantalla del difusor entre el tanque y la fuente de luz LED.
- Colocar el difusor de manera que se extienda al máximo la luz procedente de los LEDs, y la intensidad de la luz es suficiente para iluminar el nuevo tanque. Cuanto más cerca esté el tablero de la fuente de luz, más brillantes serán las luces, pero menos se difundiran. Por el contrario, colocar la placa difusora lejos de la fuente de luz reducirá la intensidad de la luz, pero esparcirá mejor la luz.
- Llene aproximadamente tres cuartas partes del tanque de novela con agua del sistema de peces.
Nota: el agua del sistema se genera utilizando ósmosis inversa de agua del grifo, seguida de dosificación tal que la conductividad equivale a 900 ± 100 μS, que el pH es neutro (7,2), y que la temperatura es de 27 ± 1 ° c. - Fije la cámara al soporte de la cámara y conecte la cámara al ordenador. Abra el software de adquisición de vídeo y ajuste la cámara para que se enfrente al frente del tanque y asegúrese de que se puede ver todo el tanque de novela y que no hay áreas ocultas en el video. Ajuste el tanque y las luces infrarrojas de tal forma que haya suficiente e incluso la iluminación en todo el tanque cuando se observa a través de la cámara.
Nota: antes de continuar con los experimentos, a menudo puede ser útil realizar una ejecución de prueba, en el que se captura el vídeo de un pez y se realiza el seguimiento. Esto garantizará que la configuración sea suficiente para la experimentación de comportamiento.
3. configuración de prueba de tanque novedoso
- Prepare un vaso de precipitados de 250 mL precargada con agua del sistema de peces y al menos dos tanques de retención.
- En la mañana de la prueba, transferir al menos 10 peces cebra adultos para ser utilizado para cada condición experimental (controles y adultos experimentales) de la instalación de pescado en un tanque de retención, transferirlos a la sala de comportamiento, y les permiten aclimatarse para al menos un Hora.
Nota: un análisis de potencia debe realizarse antes de la experimentación, sin embargo, en nuestras manos, un n = 10 es generalmente suficiente para detectar significancia estadística. Por otra parte, el tanque de retención debe contener no más de cinco individuos por litro de agua. Una aclimatación de una hora es suficiente ya que se ha demostrado que los adultos de pez cebra se acostumbran a los 30 minutos de un nuevo tanque22. También, los ritmos de comportamiento se ven afectados por los procesos circadianos, y por lo tanto las réplicas experimentales realizadas en diferentes días deben realizarse dentro de las mismas horas. Normalmente realizamos todos los experimentos entre las horas de 11:00 AM y 6:00 pm. - Etiquetar los tanques de tal forma que la condición o el genotipo de los animales sea ciego al experimentante.
Nota: los experimentos pueden ser fácilmente cegados al experimentador mediante el etiquetado de tanques utilizando un sistema de letras o números (es decir, un tanque está etiquetado como ' A ', otro ' B ', etc.). Una parte que no participe en los experimentos etiqueta a los tanques con un sistema de este tipo, y enmascara las identidades del experimentante hasta que finalice el análisis posterior. - Con una red, Coloque suavemente un solo adulto en el vaso de precipitados precargada del paso 3,1. Permitir que los peces adultos aclimatarse en el vaso de precipitados durante 10 minutos.
Nota: Registre el sexo del adulto, ya que podría ser importante después del análisis para buscar diferencias específicas de sexo. - Después de la aclimatación en el vaso de precipitados, introducir el pez en el tanque de la novela (establecido en la sección 1) derramando suavemente el agua y el adulto del vaso de precipitados.
- Después de introducir al adulto en el tanque de la novela, iniciar la grabación de la cámara, y alejarse de la configuración para evitar la angustia adicional a los peces.
- Después de que la grabación haya finalizado, retire el individuo del tanque de novela y colóquelo en un nuevo tanque de sujeción.
Nota: se debe utilizar un tanque de retención diferente al del paso 3,2 para evitar pruebas repetidas en las mismas personas. - Repita los pasos 3,4 a 3,7 para cada adulto hasta que todos los animales hayan sido probados.
Nota: además de las condiciones de ceguera o genotipos, aleatorizar los ensayos. Utilice un generador de números aleatorios o cualquier herramienta que permita aleatorizarse entre las pruebas. Esto debe hacerse antes de la experimentación para que cada ensayo se determine antes de que comiencen los experimentos. - Al final de todas las pruebas, devuelva el pez de vuelta a la instalación de pescado.
4. pretratamiento con fármacos
Nota: el objetivo de los siguientes pasos es comparar el comportamiento de un individuo antes y después del uso de drogas. Esta comparación se logra mediante la realización en primer lugar de una nueva prueba de tanque como en el paso 3,4 a 3,6, seguido por el tratamiento de drogas, y luego una segunda prueba de tanque de novela (figura 3a).
- Preparar una solución de acción de la droga, incluyendo controles positivos y negativos.
Nota: Si el fármaco se ha utilizado previamente en la literatura, encontrar una dosis de trabajo adecuada y utilizar esto. Por ejemplo, para buspirona en los resultados representativos, hacemos una solución stock 100x y utilizamos 0,05 mg/ml como la concentración final, como se describe en la literatura13,20. Si se desconoce la dosis sugerida, se debe realizar una curva de respuesta de dosis examinando varias concentraciones. Establecer más vasos con diluciones seriales de drogas. Si el fármaco no es soluble en agua, utilice sulfóxido de dimetilo (DMSO) como disolvente. - Diluir los fármacos a la concentración de trabajo en vasos de 250 mL con agua del sistema. Por ejemplo, si se hizo una solución 100x, diluir 1:100 en agua del sistema. Configure un vaso de precipitados con sólo agua del sistema como control.
Nota: si se usó DMSO como disolvente en el paso 3,1, utilice un volumen igual de DMSO en el vaso de control. - Con la ayuda de otro investigador, enmascarar las identidades de la droga y el control de vasos para asegurarse de que el probador es ciego a las condiciones de tratamiento hasta el post-análisis.
Nota: se puede utilizar un sistema de números o letras. - Realice una nueva prueba de tanque siguiendo los pasos 3,1 a 3,6 para obtener una respuesta de tensión de comportamiento basal.
- Después de la grabación de línea de base, utilice una red para retirar inmediatamente el pez adulto del tanque de novela y colocarlo en el vaso dosificador con droga o vehículo, como se describe en el paso 4,2. Deje que el adulto permanezca en el vaso durante 10 min.
Nota: Asegúrese de que la red no toque el agua de los vasos para evitar la contaminación cruzada de los fármacos. Asegurar la dosis adecuada y el tiempo de administración dependiendo de la droga utilizada. Un tiempo de tratamiento de 10 minutos podría no funcionar para todos los fármacos. - Después del tratamiento, utilice una red para retirar al adulto del vaso de precipitados en el paso 4,5 y colóquelo en otro vaso lleno con agua fresca del sistema solamente. Este es el período de lavado para minimizar la dosificación adicional durante la segunda prueba de tanque de novela. Deje que el adulto permanezca en el vaso de precipitados de lavado durante 10 minutos adicionales.
Nota: se deben utilizar redes separadas para cada condición de fármaco para prevenir cualquier tratamiento cruzado no deseado con drogas. El período de lavado puede omitirse si el experimentante lo desea. - Realice la nueva prueba de buceo del tanque por segunda vez quitando ese adulto del vaso en el paso anterior, colóquelo en un nuevo tanque de novela y siga los pasos 3,5 a 3,6.
- Después de la segunda prueba de tanque de novela, retire el individuo en un tanque de retención independiente. Vierta el agua del sistema en el segundo tanque de novela y llénelo con agua fresca del sistema para la siguiente prueba. Este paso evita la contaminación cruzada de cualquier fármaco.
Nota: dependiendo de la vida media de los fármacos, vasos frescos que contienen fármacos deben hacerse cada 3 horas. Para buspirone, hacer soluciones frescas cada 3 horas. Además, siguiendo la nota en el paso 3,8, los ensayos deben ser aleatorizados entre controles y tratamientos farmacológico. - Al final de todas las pruebas, devuelva a las personas a las instalaciones de peces.
Nota: dependiendo del tipo de fármaco utilizado, los efectos de estos tratamientos en las personas pueden ser de larga duración. Por lo tanto, no utilice estos individuos en otros experimentos.
5. Análisis de vídeo
- Después de todas las pruebas, cargue los archivos de vídeo en el software de seguimiento de elección.
Nota: normalmente utilizamos software de rastreo disponible comercialmente, pero se pueden usar varios paquetes de software disponibles de libre uso. Los pasos para lograr el seguimiento pueden diferir según el paquete de software utilizado. - Usando un marco inmóvil del video, defina los límites imaginarios alrededor de (i) la nueva arena de tanques que está llena de agua, y los límites alrededor de (II) el tercio superior, (III) el tercio medio, y (IV) tercio inferior del tanque. Utilice estos para establecer el tiempo que el pez gastado en cada porción del tanque de novela.
- Calcule el desplazamiento x-y por trama para cada arena definida en el paso 5,2.
- Defina las áreas superior, media e inferior del tanque. Cada región debe tener un tamaño similar. Un método breve para determinar estas regiones es calcular la longitud del tanque en la dirección y, y dividirlo por 3.
Nota: existen variaciones en el protocolo general. Por ejemplo, algunos laboratorios usan mitades en lugar de los tercios14. - Determine el tiempo invertido en cada arena, la distancia y la velocidad.
Nota: la mayoría de los paquetes de rastreo los calcularán automáticamente para el usuario. Sin embargo, si el software de seguimiento no lo hace, estos se pueden calcular fácilmente a partir de los valores de desplazamiento x-y. Por ejemplo, la distancia se puede determinar utilizando la fórmula:
y la velocidad se pueden determinar siguiendo la fórmula:
- Repita los pasos 5,2 a 5,4 para adquirir pistas y mediciones para todos los ensayos.
Nota: las variaciones de este protocolo general
6. pruebas de normalidad
- Realice las estadísticas antes de proceder a calcular las diferencias estadísticas. Compruebe si los datos se distribuyen normalmente mediante una prueba de Shapiro-Wilk.
- Si se rechaza la hipótesis nula de que los datos se distribuyen normalmente (es decir, los datos no siguen una distribución gaussiana), realice todas las pruebas mediante pruebas no paramétricas. Por el contrario, si se encuentra que los datos siguen una distribución normal, proceda a utilizar pruebas paramétricas.
Nota: Utilizamos software comercialmente disponible para realizar estadísticas; sin embargo, también se puede utilizar el lenguaje de programación R. Un análisis de Shapiro-Wilk se puede realizar utilizando la función Shapiro. test de R.
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Representative Results
Examinar el estrés en el pez cebra
Para examinar el comportamiento del estrés a lo largo del tiempo en el pez cebra silvestre, probamos el pescado adulto de la cepa AB24 en la prueba del tanque novel. Los adultos AB fueron sometidos al Protocolo como se describió anteriormente. Brevemente, a los peces se les dio un período de aclimatación de 1-h en un tanque en la sala de comportamiento. Un individuo fue colocado en un vaso de precipitados durante 10 minutos, y luego colocado suavemente en un tanque desconocido (tanque nuevo) lleno de agua del sistema fresco. La actividad locomotriz se registró durante 10 minutos, y el seguimiento se realizó sin conexión mediante software disponible comercialmente. La comparación de la actividad locomotriz entre el primer y el último minuto mostró diferencias dramáticas (figura 2a, B). Cuando se introdujo por primera vez en el tanque, los peces pasaron la mayor parte del tiempo en el fondo (figura 2B), sin embargo, con el tiempo, los adultos tuvieron un aumento gradual en la cantidad de tiempo que pasó en la parte superior (figura 2B, C). La duración total gastada en la parte superior en el primer minuto en comparación con el último minuto reveló diferencias significativas (6,29 ± 8,21 s vs. 23,23 ± 9,02 s; prueba t emparejada, p < 0,05) (figura 2C). Por el contrario, la distancia total recorrida entre el primer y el último minuto no reveló diferencias significativas (440,4 ± 110,3 cm frente a 405,5 ± 49,71 cm; prueba t emparejada, p = 0,375) (figura 2D). Debido a que la preferencia innata era diferente entre el primer y el último minuto, y no la distancia recorrida, creemos que el cambio de comportamiento representa una respuesta de estrés, y no simplemente un cambio en la actividad locomotriz. Estos resultados demuestran que el pez cebra exhibe una respuesta de estrés innata fácilmente medible. Este enfoque también establece una base para comparar las diferencias de estrés entre diferentes grupos de animales, y evaluar las diferencias en el estrés entre ellos.
Efectos de los fármacos ansiolíticos en el comportamiento del estrés en el pez cebra
El pez cebra es un potente sistema para la detección de fármacos, ya que la aplicación del fármaco se puede aplicar de manera no invasiva simplemente añadiendo al agua25,26,27. Para validar que la vivienda inferior en el pez cebra representa una respuesta de estrés innata, comparamos el comportamiento en grupos de peces cebra adultos probados antes y después de la exposición a un fármaco ansiolítico; como un control, manejamos un separado de adultos de manera similar, pero sólo se aplica el vehículo (agua del sistema) en lugar de drogas. Usamos la buspirona del receptor 5HT1A , que no es una sustancia controlada y se prescribe a pacientes humanos que sufren de trastorno de ansiedad generalizada28. La buspirona ha sido validada para causar reducción en las respuestas de estrés conductual en varios modelos de peces y mamíferos10,13,21,29,30, 31,32,33,34 . Como se describe en el protocolo, el pez cebra se registró por primera vez en la prueba del tanque novel, luego se recuperó y se colocó en un vaso de droga o vehículo durante 10 minutos. luego se le dio a los peces un período de "lavado", donde fueron colocados en un nuevo vaso de precipitados durante 10 minutos , y luego re-grabado en la prueba del tanque de novela (figura 3a).
El análisis de los caminos locomotores reveló poca diferencia antes y después del tratamiento para grupos de adultos expuestos al vehículo solo (figura 3B). Por el contrario, los adultos expuestos a la buspirona pasaron una gran cantidad de tiempo en la parte superior en comparación con los caminos locomotores del mismo pez antes de la exposición al fármaco (figura 3B, C). La cuantificación de la duración del tiempo invertido en la parte superior no reveló diferencias significativas entre el pre y el post-tratamiento en animales de control (183,9 ± 90,46 s antes vs. 113,8 ± 81,88 s después; ANOVA de una vía seguida por la prueba de comparaciones múltiples de Sidak, p = 0,4254), sin embargo, los animales expuestos a la buspirona pasaron mucho más tiempo en la parte superior en relación con el pre-tratamiento, y controlan a las personas después del tratamiento (buspirona: 201,4 ± 49,95 s antes de 552,2 ± 42,97 s después de; ANOVA unidireccional seguida de múltiples de Sidak prueba de comparaciones, p < 0,0001; Control contra buspirona después del tratamiento: p < 0,0001.) (Figura 3C). Para examinar si las diferencias se debieron a una menor locomoción en general, se midió la distancia total recorrida. Estos datos no revelaron diferencias significativas para ninguno de los grupos (4134 ± 601,9 cm antes frente a 3471 ± 766 cm después del control; Prueba de Kruskal-Wallis, p > 0,05; 3904 ± 301,3 cm antes frente a 3644 ± 566,3 cm después de la buspirona; Prueba de Kruskal-Wallis, p > 0,05) (figura 3D). Tomados en conjunto, estos datos demuestran que la vivienda de fondo en el pez cebra adulto es una medida de estrés innato, y establecer una base para otros experimentos farmacológicos en el pez cebra adulto.
Figura 1 . Diagrama de la configuración del tanque novel. (A) dimensiones del tanque de novela trapezoidal 1,8 L visto desde el lado de grabación del tanque. (B) diagrama de la configuración, incluidas las posiciones de las luces infrarrojas, la cámara y las barreras utilizadas para minimizar la interferencia humana. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Examinando las respuestas de estrés innatas en el pez cebra silvestre. (A) rutas de natación representativas de un adulto individual en la prueba del tanque novel en el primer minuto (izquierda) y último minuto (derecha) de una grabación de 10 minutos. Las líneas imaginarias que definen las zonas superior, media e inferior del tanque se indican con líneas de puntos. (B) cuantificación del tiempo total de gasto en la zona superior por cada minuto de la grabación de 10 min. (C &Amp; D) Comparaciones de la duración total gastada en la zona superior (C) y la distancia total recorrida (D) en el primer y último minuto de todos los ensayos. Las pruebas t emparejadas se utilizaron para el análisis ya que los datos pasaron la prueba de Shapiro-Wilk para la normalidad. n = 5; *: p = 0,028. Las barras de error indican un error estándar de la media. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Examinar los efectos de los fármacos ansiolíticos en el comportamiento de estrés. (A) esquema del flujo experimental. (B) caminos de natación representativos previos y posteriores al tratamiento de un individuo de un individuo de control tratado únicamente con agua del sistema, y otro individuo tratado con buspirona en la prueba del tanque de novela. Las líneas de puntos definen la separación de las zonas superior, media e inferior del tanque. Las pistas grises representan el individuo del control, y las pistas azules representan el individuo tratado con buspirona. (C &Amp; D) Comparaciones de la duración total gastada en la zona superior (C) y la distancia total recorrida (D) entre el control (Ctrl) y las pruebas de buspirona tratadas (busp). Se realizó por primera vez una prueba de normalidad utilizando el test de Shapiro-Wilk. Cuando la prueba de normalidad falló, se usó la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Dunn (C); y si los datos pasaban la normalidad, el ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Sidak se usó para el análisis (D). n = 5 para cada condición; : p = 0,001. Las barras de error indican un error estándar de la media. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El pez cebra exhibe una respuesta de estrés robusta en un nuevo tanque
Aquí describimos un enfoque de comportamiento simple para examinar las respuestas de estrés en el pez cebra adulto, y validar el enfoque como una medida simple de estrés usando farmacología.
La prueba de tanque novel es una prueba ampliamente utilizada para examinar el estrés innato en el pez cebra y otras especies de peces12,14,21,35,36, y el pez cebra ha demostrado ser un poderoso modelo para examinar los efectos farmacológicos de los fármacos relacionados con la ansiedad. Similar a los seres humanos, estos estudios han demostrado que los fármacos como la buspirona, la nicotina, la fluoxetina y la escopolamina tienen efectos ansiolíticos en el pez cebra12,13,14,37. Por otra parte, fármacos como la escopolamina que por lo general no se utilizan para tratar la ansiedad en los seres humanos pueden tener efectos ansiolíticos adicionales37. Las pantallas de fármacos que demuestran estos efectos ansiolíticos en el pez cebra pueden facilitar el estudio de los efectos secundarios y sus mecanismos farmacológicos. Además, el pez cebra tiene una vía de respuesta de estrés comparable a los seres humanos, por lo tanto, emparejar el ensayo con la cuantificación de la liberación de cortisol después de un estresante o tratamiento farmacológico se puede utilizar para validar las respuestas conductuales14. Por último, deseamos señalar que este ensayo no es específico del pez cebra, y también se ha extendido a otras especies de peces como el pez ciego de la ciega mexicana, Astyanax mexicanus21. Es probable que el ensayo se pueda extender a cichpárpados38, mosquito39, killis40y otros sistemas Piscine.
Una ventaja importante de la nueva prueba de tanques es su relevancia ecológica; como el ensayo mide la preferencia innata para la mitad inferior del tanque, la respuesta es probablemente una que ocurra en la naturaleza. Además de la nueva prueba de tanques, se pueden utilizar otros ensayos de comportamiento que se han utilizado en otros organismos modelo para validar aún más la respuesta de estrés conductual, como una prueba de campo abierto o un ensayo claro/oscuro41,42. Estos ensayos se basan en la tendencia de un animal a seguir los lados de la arena (thigmotaxis), y la preferencia por la exploración en la oscuridad (scototaxis) después de estar expuesto a una señal estresante42,43. Además, se ha utilizado una descarga eléctrica para medir las respuestas de miedo innatas o condicionadas9,44,45, aunque la relevancia ecológica de este enfoque no está clara.
Cuando uno está considerando un ensayo para su estudio, es importante tener en cuenta el sesgo innato dentro de cepas o especies. Además de mantener y reducir las fluctuaciones ambientales en los ensayos de comportamiento, mantener el trasfondo genético de la prueba de adultos consistentes será vital ya que la investigación ha demostrado variabilidad dentro y entre individuos del mismo genotipo41 ,46. Una revisión exhaustiva de las ventajas, desventajas, validez de cada ensayo común de comportamiento utilizado para estudiar la ansiedad, y también las variaciones en el comportamiento dentro de las líneas de tipo wildcommon se pueden encontrar en otros lugares41.
El pez cebra como modelo para examinar el estrés
El pez cebra se está convirtiendo en un modelo popular para examinar las vías genéticas y neuronales que modulan los comportamientos precisos47,48, y los Atlas cerebrales recientemente desarrollados permiten mapear las neuronas que regulan el comportamiento con precisión49 ,50,51,52,53. El enfoque que Describimos aquí para medir la ansiedad innata es capaz de aprovechar poderosas herramientas genéticas y de circuitos neuronales en el pez cebra. Dos enfoques previsibles se basan en la gran colección de líneas mutantes y líneas de conductor transgénicos. Las líneas mutantes, por ejemplo, facilitarán a los investigadores que examinen el papel que tienen los genes precisos en la modulación del estrés. Adicionalmente, el sistema transgénico Gal4/UAS y QF/Quas se han aplicado extensivamente a la pez cebra54,55, y cuando se cruza a UAS o Quas efector Lines, la función de circuitos neuronales precisos se puede manipular y el comportamiento Evaluó. Estos enfoques proporcionan un complemento a las líneas de mutantes genéticos, y permiten la investigación de cómo los circuitos neuronales precisos contribuyen al estrés.
Las técnicas novedosas para examinar la actividad neuronal pueden integrarse completamente con este ensayo. Cuantificación de c-Fos mRNA o proteína se utilizan ampliamente para examinar la actividad neuronal56. Este gen es un gen temprano inmediato, cuya transcripción es activada por la actividad neuronal. Se han desarrollado enfoques más nuevos basados en una metodología similar. Por ejemplo, la quinasa regulada por la señal extracelular (ERK) fue desarrollada recientemente para examinar la actividad neuronal en el pez pez cebra50. La proteína ERK existe en casi todas las células del sistema nervioso central. Tras la activación neuronal, el péptido ERK se convierte en fosforilado. Además, se han desarrollado y funcionan bien en peces cebra anticuerpos fiables tanto para la ERK (ER total ERK, tERK) como la fosforilada ERK (pERK). Por lo tanto, mediante el co-etiquetado con anticuerpos específicos de tERK y pERK, la actividad neuronal puede medirse de forma fiable. Usando este enfoque, los adultos que muestran significativamente más la vivienda inferior en la prueba del tanque de novela se pueden quitar después de la grabación, manchado para c-Fos o tERK/pERK, y las secciones cerebrales resultantes imaged.
Tomados en conjunto, estos enfoques deben facilitar un enfoque fácil para diseccionar los mecanismos genéticos y neuronales subyacentes al estrés en el pez cebra. Además, debido a la alta conservación de las vías genéticas y neuronales en los peces cebra y los mamíferos, esperamos que estos métodos revelen mecanismos conservados que subyacen al comportamiento de estrés.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses competidores o financieros.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el financiamiento de la iniciativa de ciencia de vida de Júpiter en la Universidad atlántica de Florida a ERD y ACK. Este trabajo también fue apoyado por subvenciones R21NS105071 (otorgadas a ACK y ERD) y R15MH118625 (otorgadas a ERD) de los institutos nacionales de salud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera | We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics. | ||
| Infrared filter | Edmund Optics | ||
| Video Acquisition Program | Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set. | ||
| Infrared LED lights | |||
| Assay tank | Aquaneering | Part number ZT180 | Size: M3 1.8 liter |
| Stand and clamp, or standard tripod for camera | |||
| 250mL beaker | |||
| Tracking software | We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology | ||
| Buspirone chloride | Sigma-Aldrich | B7148 | |
| Randomized trial generator | We use the RANDBETWEEN function in Microsoft Excel |
References
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