Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Behavior

Beteendemässiga strategier för att studera innate stress i Zebrafish

doi: 10.3791/59092 Published: May 1, 2019

Summary

Detta manuskript beskriver en enkel metod för att mäta stress behaviorally hos vuxna Zebrafish. Metoden drar nytta av den inneboende tendensen att zebra fiskar föredrar den nedre halvan av en tank när i ett stressat tillstånd. Vi beskriver också metoder för att koppla analysen till farmakologi.

Abstract

Reagera på lämpligt sätt på stressande stimuli är viktigt för överlevnad av en organism. Omfattande forskning har gjorts på ett brett spektrum av stressrelaterade sjukdomar och psykiatriska störningar, men ytterligare studier av den genetiska och neuronala regleringen av stress krävs fortfarande för att utveckla bättre terapier. Den zebra fiskar ger en kraftfull genetisk modell för att undersöka neurala underbyggnad av stress, eftersom det finns en stor samling av muterade och transgena linjer. Dessutom kan farmakologi lätt appliceras på zebra fiskar, eftersom de flesta droger kan tillsättas direkt till vatten. Vi beskriver här användningen av den "nya tank test" som en metod för att studera medfödda stress svar i zebra fisk, och visa hur potentiella ångestdämpande läkemedel kan val IDE ras med hjälp av analysen. Metoden kan lätt kombineras med Zebra fiskar linjer hyser genetiska mutationer, eller de där transgena metoder för att manipulera exakta neurala kretsar används. Analysen kan också användas i andra fisk modeller. Tillsammans bör det beskrivna protokollet under lätta antagandet av denna enkla analys till andra laboratorier.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Stress reaktioner är förändrade beteendemässiga och fysiologiska tillstånd till följd av potentiellt skadliga eller aversiva stimuli. Stress reaktioner bevaras i hela djur riket, och är avgörande för överlevnaden av en organism1. Decennier av forskning har kraftigt utökat vår kunskap om några av de genetiska och neuronala mekanismerna bakom stress stater. Idag, områden i hjärnan som amygdala och striatum2, och genetiska faktorer såsom kortikotropin releasing hormon (CRH), och glukokortikoid (gr) och mineralokortikoid receptorer ( Mr) har studerats utförligt3,4,5,6. Trots dessa kritiska fynd, mycket är okänd om genetisk och neuronala reglering av stress. Som sådan, många stressrelaterade sjukdomar lider av en brist på Therapeutics.

Genetiskt modifierbara modellorganismer ger ett användbart verktyg i studiet av genetisk och neuronala kontroll av beteende. Fisk modeller, i synnerhet, är extremt kraftfulla: de är små organismer med korta produktions tider, deras användning i en laboratorie miljö är lättsmält, deras genom är lätt ändras, och som ett ryggradsdjur, de delar inte bara genetiska, men också neuroanatomiska homologi med deras däggdjur motsvarigheter7,8. Standard analyser för att mäta stress kan paras ihop med Zebra fiskar linjer som hyser genetiska mutationer, eller de där manipulering av exakta neuronala under grupper är möjligt, och effekterna av enskilda gener eller definierade nerv celler kan bedömas snabbt och effektivt.

Behaviorally, stress svar kan karakteriseras i fisk som perioder av hyper-aktivitet eller långvariga perioder av inaktivitet (besläktad med "frysning")9, minskad prospektering10, snabb andning, minskat födo intag11, och en plats-preferens för botten av en tank12. Till exempel, när placeras i en okänd tank, vuxen zebra fiskar och andra små fisk modeller visar en första preferens för den nedre halvan av tanken, men med tiden, fisken börja utforska topp och botten halvor med nästan lika frekvens12. Behandling av vuxna med läkemedel kända för att minska ångest orsaka fisk att utforska omedelbart den övre halvan10,13. Omvänt, droger som ökar ångest orsaka fisk att visa stark preferens för den nedre halvan av tanken12,14,15. Således, minskad prospektering och preferens för den nedre halvan av tanken är enkla och pålitliga indikatorer på stress.

Liksom de flesta ryggradsdjur, stress svar i fisk drivs av aktivering av hypotalamus-hypofys-Inter-renal axel (HPI; analog till hypotalamus-hypofys-adrenal [hPa] axel i däggdjur)14,16. Hypotalamus nerv celler uttrycker hormonet kortikotropin-releasing hormon (CRH) signal till hypofysen, som i sin tur frigör adrenokortikotropic releasing hormon (ACTH). ACTH signalerar sedan till Inter-renal körtel att producera och utsöndra kortisol, som har ett antal nedströms mål16, en av dem är negativ återkoppling av CRH-producerande hypotalamus nerv celler3,17, 18,19.

Här beskriver vi en metod för att bedöma beteendemässiga åtgärder av inneboende stress. För beteendet, vi detalj protokoll med hjälp av romanen tank dykning test12,14. Vi visar sedan, som ett exempel, att en känd ångestdämpande läkemedel, Buspirone, minskar beteendemässiga åtgärder av stress.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokollet har godkänts av den institutionella djur omsorg och användning Committeeat Florida Atlantic University.

1. förberedelser

  1. Utse ett isolerat rum för att utföra beteende studier, eller stänga av en del av ett rum så att den är isolerad.
    Obs: rummet ska vara ostört och ha låg trafik för att undvika störa normalt beteende av fisken.
  2. Flytta följande material och utrustning till beteende rummet: (i) en kamera och ett objektiv, (II) ett infrarött filter som kan fästas på linsen, (III) ett kamera stativ, (IV) en dator med program vara för kamera förvärv, (v) en fast och stabil tabell för att utföra analysen på, (vi) infrarött ljus (IR-ljus, 850 nm eller 940 nm), (VII) en vit akryl diffusor, som är längre än längden på inspelnings tanken (VIII) 1,8 L trapetsformad plast analys tank (kallad "ny tank", den som används här är 12 x 18 inches) , och (IX) en hink med fisk system vatten.
    Obs: för den nya tanken, vår Lab använder kommersiellt tillgängliga plast kärl, som är trapetsformade i form. Dimensionerna av tanken är ungefär 6 i x 9 i (detaljerade dimensioner finns i figur 1a). Spridarens kartong vi använder är något större än den nya tanken (12 i x 18 in). Nya tank experiment har utförts med tankar som har olika former, till exempel de som är rektangulära eller de med olika trapetsformade dimensioner20,21. Typiskt, fisk beteende är liknande i alla tankar oavsett deras dimensioner: för alla behållare, fisk initialt föredrar den nedre halvan, men med tiden börja utforska övre halvan med större frekvens.
  3. Anslut IR-filtret till kamera linsen. Våg längderna i de infraröda ljus remsorna varierar vanligt vis från 850 nm till 940 nm. Filtret är ett långt pass filter som begränsar ljuset av våg längder mindre än 720 nm från att sända igenom till kameran.
  4. Välj lämpliga parametrar för kamera insamlings programmet. För de flesta inspelningar, Ställ in kamera förvärvet till en hastighet av 30 bilder per sekund, och inspelningen varaktighet till 10-min.
    Obs: dessa parametrar kan variera beroende på experimentet. Till exempel, för att studera tillvändhet i en ny tank22,23, längre inspelningar kan krävas.

2. inställning av

Obs: stegen i det här avsnittet beskriver hur du ställer in den nya tank analysen. Ett diagram över produkten ges i figur 1B.

  1. Placera den nya tanken i mitten av bordet.
  2. Placera IR-lamporna bakom tanken och placera den vita akryl plåten eller spridarskärmen mellan tanken och LED-ljuskällan.
    1. Placera spridaren så att den maximalt sprider ljuset som kommer från lysdioderna, och ljusets intensitet är tillräcklig för att belysa den nya tanken. Ju närmre brädet är för ljus källan, desto ljusare blir belysningen, men desto mindre kommer den att sprida sig. Att placera spridarbrädan från ljus källan minskar däremot ljusintensiteten, men sprider ljuset bättre.
  3. Fyll ungefär tre fjärdedelar av den nya tanken med fisk system vatten.
    Anmärkning: system vatten genereras med hjälp av omvänd osmos av kran vatten, följt av dosering så att konduktivitet motsvarar 900 ± 100 μS, att pH är neutralt (7,2), och att temperaturen är 27 ± 1 ° c.
  4. Fäst kameran på kamera stativet och Anslut kameran till datorn. Öppna video förvärvet program vara och justera kameran för att möta fram sidan av tanken och se till att hela romanen tanken kan ses och att det inte finns några skymda områden i videon. Justera tanken och de infraröda lamporna så att det finns tillräcklig och jämn belysning i hela tanken när den observeras genom kameran.
    Obs: innan du fortsätter till experiment, det kan ofta vara bra att utföra en provkörning, där video av en fisk fångas och spårning utförs. Detta kommer att säkerställa att installationen är tillräcklig för experimenterande av beteende.

3. nya tank provnings inställningar

  1. Förbered en 250 mL-bägare som är förfylld med fisk system vatten och minst två hållartankar.
  2. På morgonen av testet, överföra minst 10 test vuxen zebra fiskar som skall användas för varje försöks tillstånd (kontroller och experimentella vuxna) från fisk anläggning i en anläggning tank, överföra dem till beteende rummet, och ge dem möjlighet att vänja i minst en Timme.
    Anmärkning: en effekt analys bör utföras innan experiment, men i våra händer, en n = 10 är oftast tillräckligt för att upptäcka statistisk signifikans. Dessutom bör tanken inte innehålla mer än fem personer per liter vatten. En acklimatisering av en timme är tillräcklig eftersom zebra fiskar vuxna har visat sig vänja inom 30 minuter efter en ny tank22. Även beteende rytmer påverkas av dygns rytm processer, och därmed experimentella replikat görs på olika dagar bör utföras inom samma timmar. Vi utför vanligt vis alla experiment mellan timmarna av 11:00 am och 6:00 PM.
  3. Märk tankarna så att djurens tillstånd eller genotyp är blind för försöks ledaren.
    Obs: experiment kan lätt för blinkas till experimenteraren genom att märka tankar med hjälp av ett brev eller nummer system (dvs, en tank är märkt "A", en annan "B", etc.). En part som inte är inblandad i experimenten märker tankarna med ett sådant system och döljer identiteterna från försöks ledaren tills efter analys är slutförd.
  4. Använd ett nät och placera försiktigt en enda vuxen i den förfyllda bägaren från steg 3,1. Låt den vuxna fisken vänja sig vid bägaren i 10 minuter.
    Notera: spela in könet på den vuxna, eftersom det kan vara viktigt efter analys för att leta efter könsspecifika skillnader.
  5. Efter acklimatisering i bägaren, introducera fisken i den nya tanken (som inrättats i avsnitt 1) genom att försiktigt hälla ut vatten och vuxen från bägaren.
  6. Efter att ha infört den vuxna i romanen tanken, starta kameran inspelningen, och flytta bort från setup för att förhindra ytterligare ångest för fisken.
  7. Efter inspelningen är klar, ta bort individen från den nya tanken och placera i en ny anläggning tank.
    Anmärkning: en annan hålltank från den i steg 3,2 bör användas för att förhindra upprepad testning på samma individer.
  8. Upprepa steg 3,4 till 3,7 för varje vuxen tills alla djur har testats.
    Obs: förutom bländande tillstånd eller genotyper, randomisera prövningar. Använd en slump generator eller något verktyg som gör att man kan randomisera mellan försöken. Detta bör göras före experiment så att varje rättegång bestäms innan experimenten börjar.
  9. I slutet av alla tester, returnera fisken tillbaka till fisk anläggningen.

4. förbehandling med läkemedel

Anmärkning: Syftet med följande steg är att jämföra beteendet hos en individ före och efter användning av droger. Denna jämförelse uppnås genom att först utföra ett nytt tank test som i steg 3,4 till 3,6, följt av läkemedels behandling, och sedan en andra roman tank test (figur 3a).

  1. Förbered en stam lösning av drogen, inklusive positiva och negativa kontroller.
    Anmärkning: om läkemedlet tidigare har använts i litteraturen, hitta en lämplig arbets DOS och använda detta. Till exempel, för Buspirone i representativa resultat, vi gör en 100x stam lösning och använda 0,05 mg/ml som den slutliga koncentrationen, som beskrivs i litteraturen13,20. Om föreslagen dos är okänd ska en dosresponskurva utföras genom undersökning av flera koncentrationer. Ställ in fler bägare med seriella utspädningar av drogen. Om läkemedlet inte löses upp i vatten, Använd dimetylsulfoxid (DMSO) som lösnings medel.
  2. Späd ut läkemedel till arbets koncentration i 250 mL bägare med system vatten. Till exempel, om en 100x lösning gjordes, späd 1:100 i system vatten. Ställ upp en bägare med endast system vatten som kontroll.
    Anmärkning: om DMSO användes som ett lösnings medel i steg 3,1, Använd en lika volym av DMSO i kontroll bägaren.
  3. Med hjälp av en annan forskare, maskera identiteten hos drogen och kontroll bägare för att säkerställa att testaren är blind för behandlings förhållandena fram till efter analys.
    Obs: ett siffer-eller bokstavs system kan användas.
  4. Utför ett nytt tank test genom att följa steg 3,1 till 3,6 för att få en Baseline beteendemässiga stress svar.
  5. Efter bas linjen inspelningen, använda ett nät för att omedelbart ta bort den vuxna fisken från den nya tanken och placera den i bägaren doseras med drog eller fordon, som beskrivs i steg 4,2. Låt den vuxna stanna i bägaren i 10 min.
    Anmärkning: se till att nätet inte vidrör vattnet i bäckar för att förhindra korskontaminering av droger. Säkerställ korrekt dosering och administrerings tid beroende på vilket läkemedel som används. En 10 min behandlings tid kanske inte fungerar för alla droger.
  6. Efter behandling, Använd ett nät för att ta bort den vuxna från bägaren i steg 4,5 och placera den i en annan bägare fylld med färskt system vatten endast. Detta är washout-perioden för att minimera ytterligare dosering under det andra nya tank provet. Låt den vuxna stanna i tvätt bägaren i ytterligare 10 minuter.
    Obs: separata nät bör användas för varje narkotika tillstånd för att förhindra oönskade kors behandling med läkemedel. Washout-perioden kan hoppas över om försöks ledaren önskar.
  7. Utför den nya tanken dyktest en andra gång genom att ta bort den vuxna från bägaren i föregående steg, placera den i en ny roman tank, och följ steg 3,5 till 3,6.
  8. Efter den andra nya tanken test, ta bort individen i en separat hålltank. Häll bort systemet vatten i den andra romanen tanken och fyll den med färskt system vatten för nästa test. Detta steg förhindrar korskontaminering av någon drog.
    Observera: beroende på halverings tiden för läkemedlen bör färska bägare som innehåller droger göras var 3: e timme. För buspiron, gör färska lösningar var 3 timmar. Dessutom, efter anteckningen i steg 3,8, försöken bör vara randomiserade mellan kontroller och läkemedels behandlingar.
  9. I slutet av alla prövningar, återvända individer tillbaka till fisk anläggningen.
    Obs: beroende på vilken typ av läkemedel som används, effekterna av dessa behandlingar på individer kan vara långvarig. Därför, Använd inte dessa individer i andra experiment.

5. video analys

  1. Efter alla prövningar, ladda videofiler till spårnings program vara val.
    Obs: vi använder vanligt vis kommersiellt tillgängliga spårnings program, men flera fritt tillgängliga mjukvaru paket kan användas. Stegen för att uppnå spårning kan variera beroende på vilket program varu paket som används.
  2. Med hjälp av en stillbild från videon, definiera imaginära gränser runt (i) hela romanen tanken arenan som är fylld med vatten, och gränser runt (II) den övre tredjedelen, (III) mellersta tredjedelen, och (IV) nedre tredjedel av tanken. Använd dessa för att fastställa tid som fisken tillbringade i varje del av den nya tanken.
  3. Beräkna x-y förskjutning per ram för varje Arena som definieras i steg 5,2.
  4. Definiera övre, mellersta och nedre delarna av tanken. Varje region bör ha samma storlek. En kort metod för att bestämma dessa regioner är att beräkna längden på tanken i y-riktningen, och dela upp detta med 3.
    Anm: variationer i det allmänna protokollet existerar. Till exempel använder vissa labb halvor i stället för tredjedelar14.
  5. Bestäm den tid som tillbringas i varje Arena, avståndet och hastigheten.
    Obs: de flesta spårnings paketen beräknar automatiskt dessa för användaren. Men om spårnings programmet inte gör det kan dessa beräknas enkelt från x-y förskjutning värden. Till exempel kan avståndet bestämmas med formeln:
    Equation 1
    och hastighet kan bestämmas enligt formeln:
    Equation 2
  6. Upprepa steg 5,2 till 5,4 för att hämta spår och mätningar för alla prövningar.
    Anm.: ändringar av detta allmänna protokoll

6. testning för normalitet

  1. Utföra statistik innan du fortsätter att beräkna statistiska skillnader. Kontrol lera om data normalt distribueras med ett Shapiro-Wilk-test.
  2. Om nollhypotesen att data normalt distribueras avvisas (dvs. data inte följer en Gaussian distribution), utföra alla tester med icke-parametriska tester. Omvänt, om uppgifterna visar sig följa en normal fördelning, Fortsätt att använda parametriska tester.
    Obs: vi använder kommersiellt tillgänglig program vara för att utföra statistik; R-programmeringsspråket kan dock också användas. En Shapiro-Wilk-analys kan utföras med hjälp av R: s Shapiro. test funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Undersöka stress i zebra fiskar
För att undersöka stress beteendet över tid i vildtyps-zebrafisk testade vi vuxna fiskar från AB-stammen24 i det nya tank provet. AB vuxna utsattes för protokollet enligt beskrivningen ovan. Kort, fisk fick en 1-h acklimatisering period i en tank i beteende rummet. En individ placerades i en bägare i 10 minuter och placerades sedan försiktigt i en obekant tank (ny tank) fylld med friskt system vatten. Rörelse aktivitet spelades in i 10 minuter och spårningen utfördes offline med hjälp av kommersiellt tillgänglig program vara. Jämförelse av rörelse aktivitet mellan första och sista minuten visade dramatiska skillnader (figur 2A, B). När fisken först infördes i tanken, tillbringade fisk merparten av tiden i botten (figur 2b), men med tiden hade vuxna en gradvis ökning av den tid som tillbringas i toppen (figur 2b, C). Total längd som tillbringades högst upp i första minuten jämfört med sista minuten visade signifikanta skillnader (6,29 ± 8,21 s jämfört med 23,23 ± 9,02 s; parat t-test, p < 0,05) (figur 2C). Däremot visade den totala tillryggalagda sträckan mellan första och sista minuten inga signifikanta skillnader (440,4 ± 110,3 cm jämfört med 405,5 ± 49,71 cm; parat t-test, p = 0,375) (figur 2D). Eftersom medfödda preferens var annorlunda mellan den första och sista minuten, och inte avståndet reste, tror vi förändringen i beteende representerar en stress svar, och inte bara en förändring i rörelse aktivitet. Dessa resultat visar att zebra fiskar uppvisar en lätt mätbar medfödda stress svar. Detta tillvägagångs sätt skapar också en grund för att jämföra stress skillnader mellan olika grupper av djur, och bedöma skillnaderna i stress mellan dem.

Effekter av ångestdämpande läkemedel på stress beteende i zebra fiskar
Zebra fisk är ett kraftfullt system för screening av droger, eftersom tillämpningen av drogen kan appliceras på icke-invasiva sätt genom att helt enkelt lägga till vatten25,26,27. Att validera att botten bostad i zebra fisk representerar en inneboende stress svar, vi jämförde beteende i grupper av vuxna zebra fiskar testas före och efter exponering för en ångestdämpande läkemedel; som en kontroll, hanterade vi en separat av vuxna på samma sätt, men tillämpas endast fordon (system vatten) i stället för droger. Vi använde 5HT1a receptoragonist Buspirone, som inte är ett kontrollerat ämne och ordineras till mänskliga patienter som lider av generaliserat ångest syndrom28. Buspirone har validerats för att orsaka minskning av beteendemässiga stress svar i olika fisk-och däggdjurs modeller10,13,21,29,30, 31,32,33,34 . Som beskrivits i protokollet, zebra fiskar registrerades först i den nya tanken testet, sedan hämtas och placeras i en bägare av narkotika eller fordon för 10 min. fisken fick sedan en "Wash-out"-period, där de placerades i en ny bägare i 10 min och återregistreras sedan i det nya tank provet (figur 3a).

Analys av rörelse vägar visade liten skillnad före och efter behandling för grupper av vuxna som exponerats för enbart vehikel (figur 3B). Däremot tillbringade vuxna som exponerades för Buspirone en stor del av tiden i toppen jämfört med rörelse vägarna för samma fisk före läkemedels exponeringen (figur 3B, C). Kvantifiering av varaktigheten av den tid som tillbringades i toppen visade inga signifikanta skillnader mellan pre-och efter behandling hos kontroll djur (183,9 ± 90,46 s före jämfört med 113,8 ± 81,88 s efter; enkelriktad ANOVA följt av Sidaks multipla jämförelse test, p = 0,4254), men djur som exponerades för buspiron tillbringade betydligt mer tid i topp i förhållande till förbehandling, och kontrol lera individer efter behandling (Buspirone: 201,4 ± 49,95 s före vs 552,2 ± 42,97 s efter; enkelriktad ANOVA följt av Sidaks multipla jämförelse test, p < 0,0001; Kontroll kontra Buspirone efter behandling: p < 0,0001.) (Figur 3C). För att undersöka om skillnaderna berodde på mindre rörelse i allmänhet, vi mätt totala tillryggalagd sträcka. Dessa data visade inga signifikanta skillnader för någon av grupperna (4134 ± 601,9 cm före jämfört med 3471 ± 766 cm efter kontroll; Kruskal-Wallis test, p > 0,05; 3904 ± 301,3 cm före vs 3644 ± 566,3 cm efter för buspiron; Kruskal-Wallis-testet, p > 0,05) (figur 3D). Sammantaget visar dessa data att botten bostaden i vuxen zebra fiskar är ett mått på medtagen stress och etablerar en grund för ytterligare farmakologiska experiment hos vuxna Zebrafiskar.

Figure 1
Figur 1 . Diagram över den nya tanken setup. (A) dimensioner av 1,8 L trapetsformad roman tank sett från inspelnings sidan av tanken. (B) diagram över inställningen inklusive positioner av IR-ljus, kamera, och hinder som används för att minimera mänsklig inblandning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Undersöka medfödda stress svar i vildtyps Zebrafish. (A) representativa SIM stigar för en individuell vuxen i det nya tank provet i första minuten (vänster) och sista minuten (höger) av en 10-minuters inspelning. Imaginära linjer som definierar de övre, mellersta och nedersta zonerna i tanken indikeras med prickade linjer. (B) kvantifiering av den totala tids kostnaden i den övre zonen för varje minut av 10-minuters inspelningen. (C &Amp; D) Jämförelser av total längd som tillbringats i den övre zonen (C) och total sträcka (D) i den första och sista minuten av alla prövningar. Parade t-tester användes för analys eftersom data passerade Shapiro-Wilk-testet för normalitet. n = 5; *: p = 0,028. Felstaplar anger standard fel för medelvärdet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . Undersöka effekterna av ångestdämpande läkemedel på stress beteende. (A) Schematisk av experimentellt flöde. Brepresentativa simleder före och efter behandling av en individ från en kontroll individ som endast behandlats med system vatten och en annan individ som behandlats med buspiron i det nya tank provet. Prickiga linjer definiera separation av övre, mellersta och nedre zoner av tanken. Grå spår representerar kontroll individen, och blå spår representerar den Buspirone-behandlade individen. (C &Amp; D) Jämförelser av total längd tillbringas i den övre zonen (C) och total sträcka reste (D) mellan kontroll (Ctrl) och Buspirone-behandlade (busp) prövningar. Ett test för normalitet med hjälp av Shapiro-Wilk testet gjordes först. Om testet för normalitet misslyckades användes Kruskal-Wallis-testet följt av Dunns multipla jämförelse test (c). och om uppgifterna passerade normalitet, enkelriktad ANOVA följt av Sidaks flera jämförelser test användes för analys (D). n = 5 för varje villkor; : p = 0,001. Felstaplar anger standard fel för medelvärdet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Zebrafish uppvisar en robust stress reaktion i en ny tank
Här beskriver vi en enkel beteendemässiga strategi för att undersöka stress reaktioner hos vuxna zebra fiskar, och validera metoden som ett enkelt mått på stress med hjälp av farmakologi.

Den nya tanken testet är ett allmänt använt test för att undersöka inneboende stress i zebra fisk och andra arter av fisk12,14,21,35,36, och zebra fisk har visat sig vara en kraftfull modell för att undersöka de farmakologiska effekterna av ångestrelaterade läkemedel. Liknar människor, dessa studier har visat att läkemedel såsom Buspirone, nikotin, fluoxetin, och Skopolamin har ångestdämpande effekter i zebra fiskar12,13,14,37. Dessutom, läkemedel såsom Skopolamin som vanligt vis inte används för att behandla ångest hos människor kan ha ytterligare ångestdämpande effekter37. Drog skärmar som visar dessa ångestdämpande effekter i zebra fisk kan under lätta studiet av biverkningar och deras farmakologiska mekanismer. Ytterligare, den zebra fiskar har en jämförbar stress respons väg till människor, därför para ihop analysen med kvantifiering av frisättning av kortisol efter en stressfaktor eller drog behandling kan användas för att validera beteendemässiga svar14. Slutligen vill vi påpeka att denna analys inte är specifik för zebra fisk, och har också utvidgats till andra fisk arter som den mexikanska blind cavefish, Astyanax mexicanus21. Det är troligt att analysen kan utvidgas till cichlocken38, myggor fisk39, killifish40, och andra Piscine system.

En viktig fördel med det nya tank provet är dess ekologiska relevans. som analysen åtgärder medfödda preferens för den nedre halvan av tanken, är svaret sannolikt en som skulle inträffa i naturen. Förutom den nya tanken test, andra beteendemässiga analyser som har använts i andra modellorganismer kan användas för att ytterligare validera beteendemässiga stress svar, såsom ett öppet fält test eller en ljus/mörk analys41,42. Dessa analyser är baserade på tendensen för ett djur att följa sidorna av arenan (thigmotaxis), och preferens för prospektering i mörker (scototaxis) efter att ha utsatts för en stressande Cue42,43. Dessutom har elektrisk stöt använts för att mäta antingen medfödda eller konditioneras rädsla svar9,44,45, även om den ekologiska relevansen av detta tillvägagångs sätt är oklart.

När man överväger ett test för hans/hennes studie, det är viktigt att ta hänsyn till medfödda bias inom stammar eller arter. Förutom att bibehålla och minska miljö variationer i beteendemässiga analyser, att hålla den genetiska bakgrunden av testet vuxna konsekvent kommer att vara avgörande eftersom forskning har visat variationer inom och mellan individer av samma genotyp41 ,46. En omfattande översyn av fördelar, nack delar, giltigheten av varje gemensam beteendemässiga analys som används för att studera ångest, och även variationer i beteende inom vanliga vildtyp linjer kan hittas någon annan stans41.

Zebrafish som modell för att undersöka stress
Zebrafish blir en populär modell för att undersöka genetiska och neuronala vägar som modulera exakt beteenden47,48, och nyligen utvecklade hjärnan atlaser möjliggöra kart läggning neuroner reglera beteende med precision49 ,50,51,52,53. Det tillvägagångs sätt vi beskriver här för att mäta medfödda ångest är kunna utnyttja kraftfulla genetiska och neurala kretsar verktyg i zebra fisk. Två förutsägbara metoder förlitar sig på den stora samlingen av muterade linjer och transgena driv rutins linjer. Mutant linjer, till exempel, kommer att under lätta utredarna att undersöka den roll som exakta gener har i modulerande stress. Dessutom, transgena Gal4/UAS och QF/quas systemet har i stor utsträckning tillämpats på zebra fiskar54,55, och när korsade till UAS eller quas effektor Lines, funktionen av exakta neuronala kretsar kan manipuleras och beteende Bedömas. Dessa metoder ger ett komplement till genetiska muterade linjer, och möjliggör utredning av hur exakta neurala kretsar bidrar till stress.

Nya tekniker för att undersöka neural aktivitet kan helt integreras med denna analys. Kvantifiering av c-FOS mRNA eller protein används i stor utsträckning för att undersöka neuronala aktivitet56. Denna gen är en omedelbar tidig gen, vars transkription aktive ras av neuronala aktivitet. Nyare metoder baserade på liknande metodik har utvecklats. Till exempel, den extracellulära-signal-reglerade Kinas (Erk) utvecklades nyligen för att undersöka neuronala aktivitet i zebra fiskar50. ERK-proteinet finns i nästan alla celler i centrala nerv systemet. Vid neuronala aktivering blir ERK peptid fosforyleras. Dessutom har pålitliga anti kroppar för både un-fosforylerad ERK (total ERK, tERK) och fosforylerad ERK (pERK) utvecklats och fungerar bra i zebra fiskar. Således, genom co-märkning med anti kroppar som är specifika för tERK och pERK, neuronala aktivitet kan mätas tillförlitligt. Med hjälp av denna metod, vuxna som betydligt visar mer botten bostad i romanen tanken testet kan avlägsnas efter inspelningen, färgas för antingen c-FOS eller tERK/pERK, och resulterande hjärn sektioner avbildas.

Sammantaget bör dessa metoder under lätta en lättsamt metod för dissekera de genetiska och neuronala mekanismerna bakom stress i zebra fiskar. Dessutom, på grund av den höga bevarandet av genetiska och neuronala vägar i zebra fiskar och däggdjur, förväntar vi oss dessa metoder för att avslöja bevarade mekanismer underliggande stress beteende.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande eller ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av finansiering från Jupiter Life Science Initiative vid Florida Atlantic University till ERD och ACK. Detta arbete stöddes också av bidrag R21NS105071 (tilldelas ACK och ERD) och R15MH118625 (tilldelas ERD) från National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Camera We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics.
Infrared filter Edmund Optics
Video Acquisition Program Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set.
Infrared LED lights
Assay tank Aquaneering Part number ZT180 Size: M3 1.8 liter
Stand and clamp, or standard tripod for camera
250mL beaker
Tracking software We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology
Buspirone chloride Sigma-Aldrich B7148
Randomized trial generator We use the RANDBETWEEN function in Microsoft Excel

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McEwen, B. S. Stress, adaptation, and disease. Allostasis and allostatic load. Annals of the New York Academy of Sciences. 840, 33-44 (1998).
  2. Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16, (6), 317-331 (2015).
  3. Facchinello, N., et al. Nr3c1 null mutant zebrafish are viable and reveal DNA-binding-independent activities of the glucocorticoid receptor. Scientific Reports. 7, (4371), (2017).
  4. Ziv, L., et al. An affective disorder in zebrafish with mutation of the glucocorticoid receptor. Molecular Psychiatry. (2013).
  5. Grone, B. P., Maruska, K. P. Divergent evolution of two corticotropin-releasing hormone (CRH) genes in teleost fishes. Frontiers in Neuroscience. (2015).
  6. Fuller, P. J., Lim-Tio, S. S., Brennan, F. E. Specificity in mineralocorticoid versus glucocorticoid action. Kidney International. (2000).
  7. Zhdanova, I. V. Sleep and its regulation in zebrafish. Reviews in the Neurosciences. 22, (1), 27-36 (2011).
  8. Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nature Reviews Genetics. (2001).
  9. Duboué, E. R. E. R., Hong, E., Eldred, K. C. K. C., Halpern, M. E. M. E. Left Habenular Activity Attenuates Fear Responses in Larval Zebrafish. Current Biology. 27, (14), 2154-2162 (2017).
  10. Facchin, L., Duboue, E. R., Halpern, M. E. Disruption of Epithalamic Left-Right Asymmetry Increases Anxiety in Zebrafish. Journal of Neuroscience. 35, (48), 15847-15859 (2015).
  11. Øverli, Ø, Sørensen, C., Nilsson, G. E. Behavioral indicators of stress-coping style in rainbow trout: Do males and females react differently to novelty. Physiology and Behavior. (2006).
  12. Levin, E. D., Bencan, Z., Cerutti, D. T. Anxiolytic effects of nicotine in zebrafish. Physiology & behavior. 90, (1), 54-58 (2007).
  13. Bencan, Z., Sledge, D., Levin, E. D. Buspirone, chlordiazepoxide and diazepam effects in a zebrafish model of anxiety. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 94, (1), 75-80 (2009).
  14. Cachat, J., et al. Measuring behavioral and endocrine responses to novelty stress in adult zebrafish. Nature Protocols. 5, (11), 1786-1799 (2010).
  15. Mathuru, A. S., et al. Chondroitin fragments are odorants that trigger fear behavior in fish. Current Biology. (2012).
  16. Alsop, D., Vijayan, M. The zebrafish stress axis: Molecular fallout from the teleost-specific genome duplication event. General and Comparative Endocrinology. (2009).
  17. Evans, A. N., Liu, Y., MacGregor, R., Huang, V., Aguilera, G. Regulation of Hypothalamic Corticotropin-Releasing Hormone Transcription by Elevated Glucocorticoids. Molecular Endocrinology. (2013).
  18. Fenoglio, K. A., Brunson, K. L., Avishai-Eliner, S., Chen, Y., Baram, T. Z. Region-specific onset of handling-induced changes in corticotropin- releasing factor and glucocorticoid receptor expression. Endocrinology. (2004).
  19. Liposits, Z., et al. Ultrastructural localization of glucocorticoid receptor (GR) in hypothalamic paraventricular neurons synthesizing corticotropin releasing factor (CRF). Histochemistry. (1987).
  20. Facchin, L., Duboué, E. R., Halpern, M. E. Disruption of epithalamic left-right asymmetry increases anxiety in Zebrafish. Journal of Neuroscience. 35, (48), (2015).
  21. Chin, J. S., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. (2018).
  22. Wong, K., et al. Analyzing habituation responses to novelty in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 208, (2), 450-457 (2010).
  23. Matsunaga, W., Watanabe, E. Habituation of medaka (Oryzias latipes) demonstrated by open-field testing. Behavioural Processes. 85, (2), 142-150 (2010).
  24. Walker, C. Chapter 3 Haploid Screens and Gamma-Ray Mutagenesis. Methods in Cell Biology. (1998).
  25. Rihel, J., et al. Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation. Science. 327, New York, N.Y. 348-351 (2010).
  26. Peal, D. S., Peterson, R. T., Milan, D. Small molecule screening in zebrafish. Journal of Cardiovascular Translational Research. (2010).
  27. Murphey, R., Zon, L. Small molecule screening in the zebrafish. Methods. 39, (3), 255-261 (2006).
  28. Gammans, R. E., et al. Use of buspirone in patients with generalized anxiety disorder and coexisting depressive symptoms. A meta-analysis of eight randomized, controlled studies. Neuropsychobiology. 25, (4), 193-201 (1992).
  29. Maaswinkel, H., Zhu, L., Weng, W. The immediate and the delayed effects of buspirone on zebrafish (Danio rerio) in an open field test: A 3-D approach. Behavioural Brain Research. (2012).
  30. Gebauer, D. L., et al. Effects of anxiolytics in zebrafish: Similarities and differences between benzodiazepines, buspirone and ethanol. Pharmacology Biochemistry and Behavior. (2011).
  31. Maximino, C., et al. Fingerprinting of psychoactive drugs in zebrafish anxiety-like behaviors. PLoS ONE. (2014).
  32. Horváth, J., Barkóczi, B., Müller, G., Szegedi, V. Anxious and nonanxious mice show similar hippocampal sensory evoked oscillations under urethane anesthesia: Difference in the effect of buspirone. Neural Plasticity. (2015).
  33. Costall, B., Kelly, M. E., Naylor, R. J., Onaivi, E. S. Actions of buspirone in a putative model of anxiety in the mouse. Pharm Pharmacol. 40, (7), 494-500 (1988).
  34. Barros, M., Mello, E. L., Huston, J. P., Tomaz, C. Behavioral effects of buspirone in the marmoset employing a predator confrontation test of fear and anxiety. Pharmacology Biochemistry and Behavior. (2001).
  35. Heinen-Kay, J. L., et al. Predicting multifarious behavioural divergence in the wild. Animal Behaviour. 121, 3-10 (2016).
  36. Thompson, R. R. J., Paul, E. S., Radford, A. N., Purser, J., Mendl, M. Routine handling methods affect behaviour of three-spined sticklebacks in a novel test of anxiety. Behavioural Brain Research. 306, 26-35 (2016).
  37. Hamilton, T. J., et al. Establishing zebrafish as a model to study the anxiolytic effects of scopolamine. Scientific Reports. (2017).
  38. York, R. A., Fernald, R. D. The Repeated Evolution of Behavior. Frontiers in Ecology and Evolution. 4, 143 (2017).
  39. Jakka, N. M., Rao, T. G., Rao, J. V. Locomotor behavioral response of mosquitofish (Gambusia affinis) to subacute mercury stress monitored by video tracking system. Drug and Chemical Toxicology. (2007).
  40. Hu, C. K., Brunet, A. The African turquoise killifish: A research organism to study vertebrate aging and diapause. Aging Cell. (2018).
  41. Maximino, C., et al. Measuring anxiety in zebrafish: A critical review. Behavioural Brain Research. 214, (2), 157-171 (2010).
  42. Maximino, C., Marques de Brito, T., Dias, C. A. G., Gouveia, A., Morato, S. Scototaxis as anxiety-like behavior in fish. Nature protocols. 5, (2), 209-216 (2010).
  43. Godwin, J., Sawyer, S., Perrin, F., Oxendine, S., Kezios, Z. Adapting the Open Field Test to assess anxiety related behavior in zebrafish. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. 181-189 (2012).
  44. Agetsuma, M., et al. The habenula is crucial for experience-dependent modification of fear responses in zebrafish. Nature Neuroscience. 13, (11), 1354-1356 (2010).
  45. Valente, A., Huang, K. H., Portugues, R., Engert, F. Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish. Learning and Memory. (2012).
  46. Baker, M. R., Goodman, A. C., Santo, J. B., Wong, R. Y. Repeatability and reliability of exploratory behavior in proactive and reactive zebrafish, Danio rerio. Scientific Reports. (2018).
  47. Friedrich, R. W., Genoud, C., Wanner, A. A. Analyzing the structure and function of neuronal circuits in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7 (2013).
  48. Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit Neuroscience in Zebrafish. Current Biology. 20, (8), (2010).
  49. Marquart, G. D., et al. A 3D Searchable Database of Transgenic Zebrafish Gal4 and Cre Lines for Functional Neuroanatomy Studies. Frontiers in Neural Circuits. (2015).
  50. Randlett, O., et al. Whole-brain activity mapping onto a zebrafish brain atlas. Nature Methods. 12, (11), 1039-1046 (2015).
  51. Gupta, T., et al. Morphometric analysis and neuroanatomical mapping of the zebrafish brain. Methods. 1046, (18), 30011-30012 (2018).
  52. Marquart, G. D., et al. High-precision registration between zebrafish brain atlases using symmetric diffeomorphic normalization. GigaScience. (2017).
  53. Ronneberger, O., et al. ViBE-Z: A framework for 3D virtual colocalization analysis in zebrafish larval brains. Nature Methods. (2012).
  54. Subedi, A., et al. Adoption of the Q transcriptional regulatory system for zebrafish transgenesis. Methods. 66, (3), 433-440 (2014).
  55. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80, (2), 153-158 (1999).
  56. Chatterjee, D., Tran, S., Shams, S., Gerlai, R. A Simple Method for Immunohistochemical Staining of Zebrafish Brain Sections for c-fos Protein Expression. Zebrafish. (2015).
Beteendemässiga strategier för att studera innate stress i Zebrafish
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chin, J. S. R., Albert, L. T., Loomis, C. L., Keene, A. C., Duboué, E. R. Behavioral Approaches to Studying Innate Stress in Zebrafish. J. Vis. Exp. (147), e59092, doi:10.3791/59092 (2019).More

Chin, J. S. R., Albert, L. T., Loomis, C. L., Keene, A. C., Duboué, E. R. Behavioral Approaches to Studying Innate Stress in Zebrafish. J. Vis. Exp. (147), e59092, doi:10.3791/59092 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter